nâng cao khả năng tổng hợp chất màu carotenoid từ nấm sợị blakeslea trispora.

Nắm đợc vai trò quan trọng của chất màu tự nhiên đợc tổng hợp bằng con đờng sinh học cũng nh để bắt kịp với xu thế của thời đại, chúng tôi đã tham gia nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu nâng

Lời nói đầu

Việc bảo đảm chất lợng vệ sinh an toàn thực phẩm có một tầm quan trọng đặc biệt, không chỉ đối với sức khoẻ, mà còn tác động tới phát triển kinh

tế, phát triển văn hoá xã hội, an ninh chính trị và quan hệ quốc tế

Trong tình hình dân số ngày càng gia tăng, ngày nay để đảm bảo đủ thực phẩm cho con ngời, công nghệ sinh học trong trồng trọt, chăn nuôi đã góp phần quan trọng để giải quyết nạn đói cho các nớc nghèo Song những công nghệ ấy, cùng với sự phát triển đa dạng của nền công nghiệp thực phẩm, đang

đặt ra những mối lo ngại đối với chất lợng vệ sinh an toàn thực phẩm không chỉ ở một quốc gia mà ở khắp hành tinh của chúng ta

Hơn một nửa dân Châu Âu cho rằng đồ ăn, thức uống ngày nay là “cực kì nguy hiểm” Quan niệm ẩm thực hiện nay của ngời Châu Âu là “ăn uống

đúng và an toàn” thay cho “ăn uống ngon” trớc đây Ăn uống an toàn là không gây ngộ độc, còn ăn uống đúng là phòng các bệnh ung th, tim mạch, béo phì

và đái tháo đờng

Để tự bảo vệ mình và góp phần bảo vệ sức khoẻ cộng đồng, mỗi quốc gia đều phải có những chính sách, chiến lợc để bảo đảm chất lợng vệ sinh an toàn thực phẩm của mình Vì vậy, ngày nay công nghiệp thực phẩm đợc xem

là nhà bếp của thế giới và cha bao giờ các tiêu chuẩn về độ tinh khiết, độ ổn

định và tính vô hại của các chất phụ gia thực phẩm trong đó có các chất màu thực phẩm đối với sức khoẻ con ngời lại đợc quan tâm cao nh ngày nay ở Việt Nam, có nhiều loại phẩm màu đã đợc dùng tuỳ tiện không đúng với qui

định của Bộ Y tế (hoặc là không đợc phép, hoặc là quá liều lợng qui định cho phép…) đã gây thiệt hại không nhỏ cho ngời tiêu dùng nói riêng và xã hội nói

chung Theo thống kê về ngộ độc thức ăn của ngành Y tế, chỉ đứng sau các vụ ngộ độc do ô nhiễm thuốc trừ sâu hoá học, nhiễm vi sinh vật gây bệnh thì điển

nghiệp Ví dụ nh hiện tợng ăn xôi gấc nhuộm phẩm màu công nghiệp giả màu gấc bị ngộ độc phải đi cấp cứu đã xảy ra tại Vĩnh Phức (60 ngời bị ngộ độc),

tại Bình Thuận (115 trong số 136 khách dự tiệc cới phải đi cấp cứu) Đó là

những vụ điển hình có thể nhìn thấy hậu quả tức thì Trong thực tế, còn có nhiều trờng hợp ngộ độc thể nhẹ không gây triệu chứng cấp tính nhng lại ảnh hởng tới sức khoẻ lâu dài cho con ngời do tích luỹ từ từ những liều lợng nhỏ khi ăn các loại thực phẩm sử dụng phẩm màu thực phẩm không cho phép trong thời gian dài và có thể gây nhiều ảnh hởng tai biến cho sức khoẻ về sau Phẩm màu có thể thu nhận bằng nhiều con đờng: khai thác từ nguyên liệu tổng hợp tự nhiên và tổng hợp hoá học Nhiều công trình khoa học cho thấy các chất màu tự nhiên đợc tổng hợp bằng con đờng sinh học có rất nhiều

u thế nh không độc hại tới sức khoẻ con ngời, chịu đợc nhiệt độ, ánh sáng, có tác dụng ngăn ngừa quá trình ôxy hoá Mặc dù trên thị trờng, sản phẩm chất màu β- carotene thơng phẩm đợc tổng hợp hoá học chiếm u thế, nhng sự a thích lại đang có xu hớng dành cho những sản phẩm tự nhiên đợc chiết xuất từ nguồn vi sinh vật phong phú trong tự nhiên Chất màu caroteneoid mà tiêu biểu là β-carotene có thể đợc tổng hợp từ: Tảo lam (dunaliella salina), nấm ascomycetes và zygomycetes, nấm men đỏ rhodotorula và vi khuẩn quang hợp cyanobacteria, deuteromycetes, một số nấm sợi thuộc bộ mucorales, họ choanephoraceae bao gồm blakeslea, choanophora, parasitella, phycomycetes và pilaria là những chủng đợc biết nhiều về khả năng tổng hợp

β-carotene [1] Nắm đợc vai trò quan trọng của chất màu tự nhiên đợc tổng hợp bằng con đờng sinh học cũng nh để bắt kịp với xu thế của thời đại, chúng tôi đã tham gia nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp

chất màu thực phẩm carotenoid của các chủng nấm sợi Blakeslea trispora”.

PHầN I TổNG QUAN TàI LIệU

I - Khái quát về carotenoid

1 Cấu trúc của nhóm các carotenoid

Carotenoid là một nhóm của hơn 600 loại hợp chất tự nhiên có cùng kiểu cấu trúc hoá học và đều đợc tổng hợp bằng con đờng sinh học từ một tiền chất chung là geranylgeranyl-pyrophosphate

Carotenoid là nhóm chất béo không tan trong nớc, tan trong chất béo, có màu từ vàng, da cam đến đỏ, bao gồm 65 - 70 sắc tố tự nhiên Những sắc tố chủ yếu ở nấm là các carotene, carotenoid acid, torularhodin torutene, keto-carotenoid, licopene, capxanthin và citrocapxanthin

Cấu trúc cơ bản của các carotenoid là một mạch thẳng, gồm 40 cacbon

đợc cấu thành từ 8 đơn vị 5-cacbon isoprenoid liên kết nhau, đối xứng qua trung tâm Điểm nổi bật và đặc biệt trong cấu trúc là hệ thống nối đôi liên hợp, xen kẽ nối đơn, nối đôi tạo chuỗi polyen Chính cấu trúc này đã tạo nên các đặc tính quan trọng nh: dễ bị oxy hoá, đồng phân hoá, hấp thụ ánh sáng

(đặc biệt là ánh sáng tử ngoại) và thể hiện màu của hợp chất (màu càng đậm khi hệ thống dây nối càng dài)

Từ cấu trúc cơ bản này có thể biến đổi theo các cách: cộng hợp H2 hoặc dehydro hoá, hydroxyl hoá, cacboxyl hoá, di chuyển nối đôi, đóng vòng, cắt

quả là có khoảng 600 hợp chất khác nhau, đã đợc tách chiết và xác định đặc tính Một số cấu trúc chính đợc trình bày dới đây:

1.1 phytofluen

1.2 licopene

licopene có trong quả cà chua và một số quả khác Mầu đỏ của cà chua

chín chủ yếu là do có mặt của licopene mặc dầu trong cà chua còn một loạt

trong các carotenoid khác nữa

Trong quá trình chín, hàm lợng licopene trong cà chua tăng lên 10

lần.Tuy nhiên chất mầu này không có hoạt tính vitamin licopene có cấu tạo

nh sau:

Phytofluen

Bằng cách tạo vòng ở một đầu hoặc cả hai đầu của phân tử licopene thì

sẽ đợc các đồng phân α, β, γ-carotene

1.3 Carotene

Màu da cam của cà rốt, quả mơ chủ yếu là do nhóm các carotene Trong

nhóm carotene thì β-carotene có vai trò quan trọng nhất

β-carotene hấp thụ cực đại ở bớc sóng 450

Dới đây là cấu tạo của carotene:

Lycopene

γ− Carotene

1.4 crypthoxanthin

crypthoxanthin có công thức nguyên là C40H56O (3 hoặc 4- hydroxyl-β

-carotene) Màu da cam rất đẹp của quýt, của cam chủ yếu là do

Trong lòng đỏ trứng gà có hai xanthophyll là hydroxyl-α-carotene và

hydroxyl-β-carotene với tỉ lệ là (2:1) xanthophyll cùng với carotene có chứa trong rau xanh, cùng với carotene và licopene có trong cà chua

cho hai phân tử vitamin A Vì vậy β-carotene đợc đánh giá là chất có hoạt tính

sinh học mạnh và quan trọng nhất của nhóm các carotenoid

2 Tính chất lý học của β-carotene và carotenoid

- Trong thực vật, động vật carotenoid có thể ở dạng tinh thể chất rắn vô

định hình

- Carotenoid không tan trong nớc, tan trong dung môi hữu cơ và dầu

béo thành dung dịch, phân tán keo hoặc tạo phức với protein trong môi

tr-ờng nớc

- Rất dễ bị oxy hoá dới tác dụng của oxy không khí, ánh sáng, nhiệt độ

và enzyme

- Rất nhậy cảm với axit và chất oxy hoá, bền với kiềm

- β-carotene là tinh thể hình kim, màu nâu đỏ tan trong dầu và các dung môi hữu cơ nh axeton, alcohol, ethyl-ether, tetrahydrofuran, đặc biệt tan tốt…trong dầu, ether và hexan, không tan trong nớc

Nhờ có hệ thống dây nối đôi liên hợp dài mà β-carotene có ái lực mạnh với oxy đơn bội (

Trong tự nhiên, cơ thể sinh vật có thể tự tổng hợp carotenoid nhằm mục

đích bảo vệ, chống lại các tác động bất lợi của môi trờng (các gốc tự do, tia tử ngoại, ánh sáng mặt trời.v.v )

Một số carotene là tiền vitamin A Đối với động vật có vú, nó giữ chức

năng sinh học quan trọng trong quá trình phát triển cá thể nh: phát triển thị

ái lực cao với

oxy đơn bội

Hấp thụ ánh sáng

Oxy hoá, đồng phân hoá

Tan trong dầu, không tan

trong nước

Chống gốc tự do

Carotenoid

động chủ yếu của carotenoid không chỉ là chống oxy hoá mà còn trao đổi

thông tin từ tế bào này đến tế bào khác, tác động tới cấu trúc và chức năng của

màng tế bào, tăng cờng sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể Chính vì vậy mà

carotenoid đợc xác định là chất điều hoà dinh dỡng

Đặc biệt β-carotene không độc với cơ thể khi sử dụng liều cao và kéo dài Dùng vitamin A kéo dài và liều cao sẽ gây rối loạn thị giác, rối loạn chức năng

gan Nguyên nhân là do cơ thể chuyển hoá β-carotene chuyển thành vitamin A

khi có nhu cầu Chỉ 1/6 lợng β-carotene chuyển thành vitamin A [2]

CH2OH Carotenase

2

Vitamin A

Có hàng trăm nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, trong đó tế bào đợc

cho tiếp xúc với những chất gây ung th, virus và các tia phóng xạ vitamin A

và β-carotene cho thấy chúng có khả năng ngăn cản các tế bào chuyển thành các tế bào gây ung th

β-carotene cũng có những tác dụng chống ung th riêng cho nó, không phụ thuộc vào vitamin A Các nghiên cứu invitro đã cho thấy rằng β-carotene

và capthaxanthin, một carotenoid không phải tiền chất của vitamin A, có tác

dụng ức chế sự chuyển sang dạng tân sản của các tế bào invitro dới tác dụng

của các tác nhân vật lí và hoá học Điều này có nghĩa là tác dụng chống oxy

hoá là một tính chất quan trọng của các carotenoid

Trong các nghiên cứu trên động vật, vitamin A cũng cho thấy sự ngăn

cản sự thành lập khối u trên động vật thử nghiệm khi tiếp xúc với các chất gây

ung th và làm chậm lại sự phát triển của khối u đã bị biến đổi

Ngoài bệnh ung th phổi, rất nhiều nghiên cứu trên những tập thể ngời

sống ở khắp nơi trên thế giới từ Mỹ, Anh, Nhật, Phần Lan đã cho thấy mối…

liên hệ giữa nguồn thực phẩm giàu vitamin A và β-carotene với tỉ lệ thấp mắc các bệnh ung th khác nh: ung th khí quản, màng trong dạ con, bàng quang, cổ

tử cung, vú, tuyến tiền liệt, trực tràng, manh tràng và dạ dày, kể cả melanoma

(một loại ung th da nguy hiểm) Các kết quả thay đổi từ giảm 8 lần trong ung

th phổi đến giảm 80% trong ung th cổ tử cung

Theo bendich và cộng sự khi thử nghiệm trên cơ thể ngời và động vật tại

Mỹ, đã nhận thấy β-carotene và carotenoid đều có khả năng làm tăng đáp ứng miễn dịch Khi sử dụng liều cao β-carotene trên bệnh nhân nhiễm hiv đã làm tăng tỷ lệ tế bào CD4: CD*, tác động kìm hãm sự phát triển virus.[3]

4 Cơ chế chống oxy hoá

Trong cơ thể, carotenoid nói chung và β-carotene nói riêng có khả năng chống lại các gốc tự do, dập tắt chuỗi phản ứng dây chuyền Nhờ có hệ thống

dây nối liên hợp, nó vô hiệu hóa đặc biệt với phân tử oxy bị kích hoạt (

Tác dụng sinh học của β-carotene đợc tóm tắt theo sơ đồ:

II - Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của β-carotene

1 Tình hình nghiên cứu

1.1 Những nghiên cứu thu nhận hợp chất carotenoid trên thế giới

ức chế ung thư

Provitamin A hoạt động

β-carotene sản xuất theo con đờng hoá học hiện nay chiếm khoảng 70%- 80% sản lợng trên thế giới, tập trung chủ yếu ở: Thuỵ sỹ, Mỹ (Công ty hofmanroche) và ở Đức (Công ty basf) Sản lợng của các nhà máy này đợc xây

dựng vào những năm đầu của thập kỷ 90 đạt khoảng 400- 500 tấn β-carotene tinh khiết chiếm khoảng 98% năm Các nghiên cứu trích ly β-carotene từ nguyên liệu thực vật đã đợc nghiên cứu và sản xuất với quy mô nhỏ tại Mỹ,

Nhật, Phần Lan, Anh từ các loại cà rốt chuyển gene chứa khoảng 5,2 - 12,2

mg/100 gam cà rốt tơi, dầu cọ chứa hàm lợng carotenoid khoảng 5 mg/100 gam dầu cọ thô với khoảng 1/2 là β-carotene và α-carotene

Trên thế giới ở một số nớc: Đức, Hàn Quốc, ý, Nhật, Anh, Nga, úc, Bồ

Đào Nha, Hy lạp, Trung Quốc đã có những nghiên cứu sản xuất carotenoid…

đặc biệt là β- carotene từ vi sinh vật Một số vi tảo nh tảo lam Dunaliella

salina, Heamatococcuss pluvialis, Mantoniella squamata đã đợc nghiên cứu

nuôi cấy, tách chiết các hợp chất carotenoid có chứa β-carotene và các dẫn

xuất nh: asthaxanthin, zeaxanthin, violaxanthin (Công ty Nutralite Ltd, Microalgae International Company, Cyanotech Inc- Mỹ; Betatene Ltd,

western biotechnology- úc) Tuy nhiên nuôi cấy tảo cần điều kiện chiếu sáng,

khí CO

2

, thể tích nuôi cấy lớn và đặc biệt là hiệu xuất tổng hợp β-carotene không cao Các chủng nấm nem tự nhiên hoặc là gây đột biến có sắc tố đỏ nh:

rhodotorula glutinis, R mucilaginosa, R rubra cũng đợc nghiên cứu nhiều ở

các nớc nh : ấn Độ, canada, Pháp, Nga song còn gặp nhiều hạn chế

Trong các nguồn vi sinh vật có thể sử dụng để sản xuất β-carotene, chủng nấm sợi blakeslea trispora đợc chú ý nhất vì khả năng tổng hợp carotenoid với

hàm lợng β-carotene cao chiếm (85%-95%) và có thể sản xuất ở qui mô công

nghiệp sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền ở Hy Lạp, Tây Ban Nha, Mỹ, Trung

Quốc hiệu suất tổng hợp, thu nhận β-carotene từ Blakeslea trispora ở phòng

thí nghiệm trên qui mô máy lắc với các môi trờng tổng hợp đạt 1300-2880 mg

β-carotene/lit Tại Hàn Quốc và Nga ngời ta sử dụng các phụ phẩm của nông

nghiệp và công nghiệp chế biến thực phẩm làm môi trờng lên men nấm sợi

Blakeslea trispora Kết quả thu đợc carotenoid với 92-95% là β-carotene

(485-1500 mg/lit) và 5-7% là γ-carotene, cypthoxanthin và β-zeacarot

1.2 Những nghiên cứu thu nhận hợp chất carotenoid ở nớc ta

Để có đợc các sản phẩm có chứa hợp chất carotenoid thiên nhiên,

các nhà khoa học ở nớc ta cũng đã nghiên cứu khai thác từ nhiều nguồn

khác nhau

Từ nguồn động vật: Từ đầu thập kỷ 70 nớc ta đã tận dụng nguồn khai

thác cá biển để tạo ra dợc phẩm vitamin A từ dầu gan cá biển.[4]

Từ nguồn thực vật: Khoảng những năm 60-70 nghành Quân Y đã sản

xuất thuốc Gacavit sử dụng dầu màng gấc để phòng và điều trị một số bệnh

ung th ở Việt Nam

Công ty Dợc Biopha tại Tp.HCM phối hợp với trung tâm phát triển Hoá

sinh (QEDEB) Hà Nội chế biến mứt gấc Viga và thuốc viên nén có bổ sung

dầu màng gấc

Công ty TNHH chế biến dầu thực vật và thực phẩm Việt Nam

(VNPOFOOD) Đại diện tại Tp.HCM: Công ty Dợc phẩm Quận 10 đã sản

xuất dầu gấc viên nang VINAGA chiết xuất từ gấc có chứa β-carotene 1,5

mg/g và lycopene 0,12 mg/g.

Gần đây Viện Lúa ĐBSCL đã thông báo chọn lựa đợc nhiều dòng lúa mà

trong phôi nhũ có hàm lợng carotene cao Những dòng lúa này đang đợc khảo

nghiệm trên diện rộng, hy vọng những năm tới sẽ có những giống lúa vừa cho

năng suất cao vừa giàu vitamin A [5]

Từ nguồn tảo: Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Trung tâm Dinh dỡng Trẻ em

Tp.HCM đã nghiên cứu nuôi cấy tảo Spirulina có hàm lợng β-carotene 1,7

mg/g sinh khối khô và Viện Công nghệ Sinh học nuôi cấy tảo Dunaliella salina 5,4mg/g β-carotene.

2 ứng dụng của β-carotene

Hầu hết những màu sắc hấp dẫn mà ta thấy trong cuộc sống đặc biệt là

dải màu từ vàng tới đỏ thì đó là màu do nhóm các carotenoid tạo nên Chính

điều này đã giúp con ngời chúng ta đa ra ý tởng ứng dụng carotenoid làm chất

màu cho thực phẩm và mỹ phẩm

β-carotene có hai đồng phân: trans β-carotene và cis β-carotene, trong đó trans β-carotene có thể chuyển thành dạng cis β-carotene Trong hai đồng phân trên thì trans β-carotene có vai trò quan trọng, còn cis β-carotene hầu

nh không có tác dụng nên không đợc ứng dụng nhiều Nấm sợi Blakeslea trispora, β-carotene tồn tại chủ yếu ở dạng trans β-carotene

Trans Cis

R2H

H R

1

R2M

0

H R

H H

2.1 ứng dụng của β-carotene trong công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi gia súc

Bột β-carotene theo phơng pháp vi sinh đã đợc sử dụng làm chất tạo màu, chất chống oxy hoá, chất phụ gia trong sản xuất các loại mì, mì ăn liền,

bánh kẹo, kem, nớc ngọt, mỹ phẩm, thuốc viên nang, viên nén Ngoài ra

sản phẩm bột β-carotene tinh khiết, sinh khối khô nấm sợi B.trispora chứa

β-carotene còn đợc sử dụng để bổ sung vào thức ăn cho ngời và thức ăn gia cầm

Hội đồng khoa học Châu Âu về thực phẩm, sức khoẻ đã cho phép sử

dụng β-carotene đợc chiết tách từ sinh khối nấm sợi B.trispora nuôi cấy theo

phơng pháp lên men chìm có sục khí nh là một vi chất dinh dỡng thực phẩm

có hoạt tính sinh học cao với liều lợng không hạn chế (trên 5% trong thực đơn thức ăn) nh đối với các chất màu tổng hợp.

2.2 ứng dụng trong y học

Nh chúng ta đã biết Carotenoid là chất tiền Vitamin A và đợc đa vào cơ

thể theo con đờng ăn uống Trong cơ thể nó chuyển hoá thành Vitamin A là

chất có vai trò xúc tác cho nhiều phản ứng diễn ra bên trong tế bào, đặc biệt

nó nh là đồng enzyme, nh là thành phần cấu thành nên hệ hoocmôn và dễ cố

định các gốc tự do

Carotenoid và Vitamin A cần thiết cho sinh sản và phát triển của tế bào,

tham gia vào việc tạo thành các tổ chức mô, khung xơng, làm chức năng màng

bảo vệ của các niêm mạc

Vitamin A còn tham gia vào các quá trình trao đổi protein, gluxit, lipit và

muối khoáng, nó rất cần thiết cho sự hoạt động bình thờng của mắt Vì vậy,

carotenoid cũng nh vitamin A trớc hết dùng để đề phòng và điều trị bệnh

không có hay thiếu vitamin A Khi thiếu Vitamin A xuất hiện bệnh quáng gà,

rối loạn nhìn màu sắc, khô và sừng hoá giác mạc của mắt và da làm thay đổi

biểu mô trên các niêm mạc, do vậy làm giảm sức đề kháng của các cơ quan

t-ơng ứng đối với bệnh nhiễm khuẩn (gây viêm phế quản, viêm niêm mạc, đờng tiểu tiện…) Riêng đối với trẻ em, nếu thiếu Vitamin A gây chậm lớn do có sự

ảnh hởng đến sự hình thành khung xơng của trẻ, gây quáng gà thậm chí có thể

dẫn tới mù loà Vì vậy, các nhà sản xuất đã bổ sung β-carotene vào sữa bột cho trẻ ăn

Đối với β-carotene khi ở dạng tiền Vitamin A, nó bảo vệ nhiễm sắc tố da

để chống lại hiệu ứng có hại của các tia tử ngoại Ngời ta khuyên nên dùng bổ

sung β-carotene trớc khi làm việc lâu dài dới ánh nắng mặt trời Nó có thể giúp da phòng chống không những các tia tử ngoại gây hại mà còn phòng

chống lại bệnh ung th da khi dùng trong thời gian dài

Dựa trên các nghiên cứu những gốc tự do ngời ta thấy rằng, gốc tự do là

một phân tử nguy hiểm, bởi vì nó không bền và rất hoạt động, Thật vậy, nó có

khả năng kết hợp rất nhanh đối với các phân tử khác đặc biệt là lipit và có thể

gây nên một phản ứng dây chuyền cực kì nguy hiểm đối với tế bào Chính các

gốc tự do này là nguyên nhân gây nên phản ứng dị ứng, ung th, các bệnh tim

mạch, tai mũi họng, da, niệu bộ, các trạng thái suy nhợc, mệt mỏi, giảm trí

nhớ, giảm khả năng t duy, quá trình lão hoá

Cùng với Vitamin C, E, ngoài ra cùng với đồng, mangan, thì Vitamin A và

β-carotene có vai trò quyết định đến sự ngăn ngừa, chống lại các gốc tự do này

III - Nguồn thu nhận carotenoid và tổng hợp carotenoid

ở nấm sợi

1 Nguồn thu nhận carotenoid

Hợp chất carotenoid đợc thu nhận từ hai nguồn:

* Tổng hợp hoá học chiếm 70%-80%

* Nguồn tự nhiên đợc thu nhận từ nhiều nguồn:

− Thực vật, hàm lợng β-carotene có trong nhiều loại rau, trái cây nh ở bí

khuẩn quang hợp Cyanobacteria, Deuteromycetes, một số nấm sợi thuộc bộ Mucorales họ Choanephoraceae bao gồm Blakeslea, Choanophora, Parasitella, Phycomycetes và Pilaria.

2 Tổng hợp carotenoid ở nấm sợi

2.1 Đặc tính của nấm sợi Blakeslea trispora

2.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu tạo

Nấm sợi là loại tế bào Eukaryote có cấu tạo tơng đối phức tạp, có cấu tạo

từ các bộ phận chính nh: vỏ tế bào, nhân, ty lạp thể, nguyên sinh chất và

không bào là những thành phần có thể nhìn thấy dới kính hiển vi quang học,

còn các phần khác nh: màng nguyên sinh chất, lới nội chất chỉ nhìn thấy đ… ợc dới kính hiển vi điện tử Tế bào của nấm là một tế bào thực sự (eucyte) bao

gồm màng tế bào, chất nguyên sinh, tế bào chất, thể hạt nhỏ, ribôxôm, nhân,

không bào, các hạt dự trữ

Thành tế bào là một cấu trúc hai lớp với thành phần hoá học chủ yếu là

kitin, kitoxan.Trên thành tế bào có nhiều lỗ nhỏ, các chất dinh dỡng đi vào

trong tế bào và các sản phẩm trao đổi chất đi từ tế bào ra môi trờng xung

quanh qua những lỗ nhỏ này Bên ngoài thành tế bào không có lớp nhầy vì thế

mà các tế bào không bị dính lại với nhau

Nguyên sinh chất của tế bào bao gồm màng nguyên sinh chất, tế bào

chất và nhân:

+ Màng nguyên sinh chất nằm sát bên trong thành tế bào và làm nhiệm

vụ hấp thụ các chất dinh dỡng

+ Tế bào chất là hệ thống keo phức tạp đợc tạo thành từ protein, gluxit,

lipit, các chất khoáng phân tán trong môi trờng nớc Trong tế bào chất có các

ty thể, riboxom, thể golgi, mạng lới nội chất, thể màng biên (thể màng biên là một kết cấu màng đặc biệt nằm giữa thành tế bào và màng tế bào chất, đợc bao bọc bởi một lớp màng đơn có hình dạng biến hoá rất đặc biệt nh hình ống, hình túi, hình cầu, hình trứng hay hình nhiều lớp ).

+ Nhân của tế bào là hình cầu có màng bao bọc, trong nhân có nhân con

(nucleolus) bao gồm có protein, ADN, ARN và enzyme Chức năng của nhân

là quyết định tính di truyền và tham gia điều kiện hoạt động sống

+ Ty thể của tế bào nấm nhiều và đa dạng Không bào chứa dịch tế bào.

Mầu sắc của nấm do các chất mầu có thành phần và tính chất khác nhau

tạo ra Chất mầu thờng tan trong không bào, trong tế bào chất và màng tế bào

Chất mầu không bao giờ là diệp lục, phycobilin mà thờng là các chất mầu loại

quinon, (anthraqiunon, naptaquinon), dÉn xuÊt cña phenonxaron

(xinnabarin), carotenoit vµ melanin

2.1.2 Ph©n lo¹i nÊm sîi Blakeslea trispora

Giíi (Kingdom) Fungi

Ngµnh (Phylum) Zygomycota

Líp (Class) Zygomycetes

Bé (Order ) Mucorales

Hä (Family) Choanephoraceae

Chi (Genus) Blakeslea

Loµi (Species) Trispora

2.1.3 §Æc ®iÓm sinh s¶n

Nấm sợi Blakeslea trispora có cả hai hình thức sinh sản: sinh sản vô

tính và hữu tính

* Trong sinh sản vô tính, bào tử đợc hình thành ở phía trong hoặc phía

ngoài, phù hợp với đặc điểm đó mà có cấu tạo túi bào tử hay túi bào tử đính

Túi bào tử có cấu trúc điển hình hơn cả chúng có dạng hình cầu nhỏ đờng kính

khoảng 80-120 àm chứa từ một đến hàng nghìn bào tử Những bào tử chứa

đầy ở bên trong khoang của túi

* Sinh sản hữu tính (theo lối tiếp hợp):

Sinh sản hữu tính ở đây theo lối tiếp hợp bằng sự kết hợp nội chất của hai

tế bào đặc biệt ở trên một hoặc hai tản khác nhau và hình thành hợp tử hay bào

tử tiếp hợp Quá trình này phụ thuộc vào nhiều điều kiện Khi hai sợi nấm có

giới tính đối lập tiếp xúc với nhau, chúng có thể mọc ra hai mấu lồi Hai mấu

lồi này tiến dần lại gặp nhau, dần dần mỗi mấu lồi sẽ xuất hiện một vách

ngăn, phân cách phần đầu ra thành một tế bào nhiều nhân Hai tế bào sau đó

sẽ tiếp hợp với nhau thành một hợp tử nhiều nhân thờng có màng dày và có

mầu tối Phần mấu lồi còn lại về sau phát triển thành hai cái cuống treo giữ

hợp tử hay bào tử tiếp hợp và đợc gọi là cuống bào tử tiếp hợp Quá trình kếp

hợp nhân của hợp tử chia thành hai trờng hợp :

- Có hiện tợng kết hợp nhân ngay từ khi hình thành hợp tử

- Hợp tử sau khi hình thành cha có sự kết hợp nhân mà xếp thành đôi đợc

gọi là hiện tợng song nhân, sau đó mới phát triển thành hợp tử tiếp hợp 2n

Sau thời gian nghỉ, bào tử tiếp hợp nảy mầm, phá vỡ màng và mọc ra một

ống mầm Đầu ống mầm về sau phát triển thành một cái túi vô tính chứa rất

nhiều bào tử kín Khi đã hình thành túi, ống mầm trở thành cuống túi Phần

cuống túi đâm sâu vào trong túi đợc gọi là trụ túi Các nhân của bào tử tiếp

hợp đều có sự phân chia giảm nhiễm để hình thành các bào tử kín

2.2 Quá trình tổng hợp carotenoid ở nấm sợi Blakeslea trispora

Các terpenoids đều bắt nguồn từ tiền chất chung là isopentenyl

pyrophosphate Chất này có thể đợc tổng hợp theo chu trình Mevalonate hoặc

là chu trình Rohmer 3-Hydroxymethylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) và

mevalonate là các chất trung gian của chu trình thứ nhất (chu trình mevalonate) và D-1-deoxyxylulose 1-phosphate là chất trung gian của chu

trình thứ hai Chu trình Rohmer không có ở ngành nấm Gene mã hoá cho hai

enzyme đầu tiên của chu trình mevalonate là CoA synthase và

HMG-CoA reductase đã đợc tách dòng ở Phycomycetes và nó đã đợc giải trình tự từ

bốn chủng thuộc bộ Mucorales Sinh tổng hợp Terpenoid đợc hình thành

thông qua quá trình trùng ngng mạch 5 cacbon tạo thành các phân tử lớn hơn

nh geranyl pyrophosphate, farnesyl pyrophosphate, geranylgeranyl

pyrophosphate Qúa trình tổng hợp carotenoid cần 2 phân tử

geranylgeranyl-PP giống nh quá trình tạo squalene đợc liên kết bởi phản ứng trùng ngng Sau

khi giải phóng nhóm pyrophosphate đầu tiên sẽ tạo ra tiền phytoene

pyrophosphate và giải phóng nhóm pyropohossphate thứ hai tạo nên phytoene

ở đây ta có hai gốc prenyl liên kết với nhau bởi cầu nối kép C-C, phytoene sau đó chuyển hoá thành lycopene, quá trình này đợc xúc tác bởi hai enzyme

desaturase khác nhau Theo các tài liệu nghiên cứu công bố gần đây, quá trình

bão hoà đợc tạo nên thông qua các phản ứng dehydrogen trong đó hydrogen

chuyển đến phân tử NADP hoặc FAD Sự vòng hoá lycopene sau đó gây nên

sự hình thành β-carotene Một enzyme khác là cyclase tạo α-carotene Sự hydroxy hoá β-carotene dẫn đến sự hình thành Xanthophyll zeaxanthin và sự tạo thành chất này từ zeaxanthin

3 Hớng nghiên cứu nhằm nâng cao khả năng tổng hợp chất màu carotenoid từ nấm sợị Blakeslea trispora.

Chủng Blakeslea trispora có khả năng tổng hợp carotenoid trong đó quan

trọng là β-carotene với hàm lợng cao Để nâng cao khả năng tổng hợp chất

màu carotenoid của chủng Blakeslea trispora chúng tôi đa ra các giải pháp

công nghệ sau:

- Lựa chọn nguồn cacbon thích hợp

- Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp

- Lựa chọn pH thích hợp

- Tỉ lệ phối giống thích hợp

- Lựa chọn thể tích môi trờng lên men:

- Bổ sung các tiền chất và chất hoạt động bề mặt với nồng độ thích hợp

* Xử lí đột biến chủng Blakeslea trispora.

(+) là kí hiệu của chủng giống có giới tính đực.

(-) là kí hiệu của chủng giống có giới tính cái.

2 Hoá chất và thiết bị

2.1 Hoá chất: