ĐỊNH DANH các VI KHUẨN CHUYỂN hóa đạm BẰNG PHÉP THỬ SINH hóa và kỹ THUẬT SINH học PHÂN tử

Các chủng thuần được nuôi tăng sinh trong môi trường chuyên biệt LB và ADN được ly trích để định danh bằng kỹ thuật giải trình tự.. Các chỉ tiêu sinh hóa được áp dụng để xác định vi khuẩ

ĐỊNH DANH CÁC VI KHUẨN CHUYỂN HÓA ĐẠM

BẰNG PHÉP THỬ SINH HÓA

VÀ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

Phạm Thị Tuyết Ngân 1 và Nguyễn Hữu Hiệp 2

ABSTRACT

Nutrient accumulation affects the quality and sustainability of many aquaculture products Significant research indicates that three groups of bacteria (Nitrosomonas, Nitrobacter and Bacillus) consume excess nutrients very efficiently Identification of the bacteria was performed by biochemical tests and molecular techniques Nice isolated bacteria strains from shrimp intensive ponds were tested It was indicated positive effected on shrimp performance on tanks experiments Testing by the Griess-Ilosway biochemical test resulted in positive scores for the 05 strains of Bacillus and the 04 strains

of Nitrosomonas sp and a negative score for the 05 strain of Nitrobacter sp Analysis of DNA sequences and homology was completed with the BLAST server of the National Center for Biotechnology Information using the BLAST algorithm This molecular analysis showed that: the B9 strain of Bacillus is homologous with Bacillus cereus BRL02-43 (97%); B37 and B38 strains are homologous with Bacillus cereus G9842 (100% and 99%); the B41 strain is homologous with Bacillus amyloliquefaciens SB3297 (100%); and the B67 strain is homologous with Bacillus subtilis BL10 (99%) S6 homology with Uncultured Nitrosomonadaceae bacterium 3CC11 (98%); S8 and S12 homology with Nitrosomonas nitrosa (90% và 91%); N10 and N12 homology with Nitrobacter winogradskyi ATCC 25381 (99% và 100%)

Keywords: DNA, Sequencing, Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter

Title: Identification of nitrifying bacteria by biochemical test and molecular technique

TÓM TẮT

Tích lũy đạm ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng các đối tượng nuôi thủy sản Nhiều nghiên cứu cho thấy ba nhóm vi khuẩn (Nitrosomonas, Nitrobacter và Bacillus) tham gia khử đạm rất hiệu quả Vì vậy định danh các dòng vi khuẩn này là rất cần thiết Chín chủng vi khuẩn được phân lập từ ao nuôi tôm sú, trên môi trường chuyên biệt đã qua các bước thử nghiệm thành

1 Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ

công trong phòng thí nghiệm trên qui mô bể nuôi Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa cho thấy 05 dòng chọn định danh có đặc điểm giống Bacillus, 04 dòng Nitrosomonas dương tình với thuốc thử Griess- Ilosway và 05 dòng Nitrobacter cho kết quả âm tính với thuốc thử Griess- Ilosway Kết quả giải trình tự và so sánh với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu gen chương trình BLAST cho thấy: B9 đồng hình với dòng Bacillus cereus BRL02-43 (97%), 02 dòng B37, B38 đồng hình giống với dòng Bacillus cereus G9842 (100% và 99%), Dòng B41 đồng hình giống với dòng Bacillus amyloliquefaciens SB3297 (100%) và dòng B67 có mức độ đồng hình với dòng Bacillus subtilis BL10 (99%) Dòng S6 đồng hình với dòng Nitrosomonadaceae 3CC11 (98%), 02 dòng S8 và S12 đồng hình với dòng Nitrosomonas nitrosa (90% và 91%) Cả

02 dòng N10 và N12 đều có mức độ đồng hình với dòng vi khuẩn Nitrobacter winogradskyi ATCC 25381 (99% và 100%)

Từ khóa: DNA, trình tự, Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter

1 GIỚI THIỆU

Tổng sản lượng tôm nuôi trên thế giới tăng liên tục từ năm 1985, đến năm 2006

đạt gần 3,2 triệu tấn trong đó tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) chiếm tỉ lệ khoảng 67% và tôm sú (Penaeus monodon) chỉ chiếm khoảng 30% (Le Hong Phuoc et al., 2008) Trong năm 2010 mặc dù người nuôi tôm trong

nước gặp không ít khó khăn nhưng vẫn thu được lợi nhuận, sản xuất và tiêu thụ tôm vẫn thu được kết quả khả quan Diện tích nuôi tôm nước lợ cả nước trong năm 2010 đạt trên 639.000 ha, sản lượng đạt gần 470.000 tấn Sản xuất tôm giống tuy còn nhiều bất cập nhưng nhìn chung chất lượng giống tôm nước lợ trong năm 2010 được kiểm soát chặt chẽ, sản xuất giống tôm sú, tôm thẻ chân trắng đạt 43 tỷ con, cung cấp tại chỗ ở các tỉnh có điều kiện tự nhiên, môi trường phù hợp

Theo Tổng cục Thủy sản (Bộ NN & PTNT), năm 2010 diện tích nuôi tôm nước

lợ trong cả nước bị thiệt hai hơn 60.000 ha, trong đó diện tích tôm bị bệnh là 26.000 ha chiếm hơn 4% diện tích nuôi cả nước Bên cạnh thiệt hại về dịch bệnh, người nuôi tôm còn đối diện với không ít khó khăn do giá thức ăn thủy sản liên lục tăng (hoinghecavietnam.org.vn, 2011)

Tốc độ tăng trưởng nhanh đã dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi trường, gây thiệt hại rất lớn cho người sản xuất Mặt khác sản phẩm thủy sản xuất khẩu không đạt tiêu chuẩn do dư lượng thuốc kháng sinh, thuốc bảo vệ thực vật và vi sinh

vật gây bệnh (Đặng Đình Kim và ctv, 2006) Hiện nay xu hướng sử dụng vi

khuẩn hữu ích được áp dụng rộng rãi trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng nhằm giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường theo hướng bền vững Để hiểu rõ hơn nữa các thành phần giống loài tham gia xử lý môi trường, góp phần xây dựng môi trường nuôi thủy sản bền vững và đạt hiệu quả, một nghiên cứu

về việc xác định vị trí phân loại các nhóm vi khuẩn chuyển hóa đạm bằng kỹ

thuật sinh học phân tử và phép thử sinh hóa được thực hiện nhằm làm cơ sở cho các nghiên cứu về vi khuẩn chuyển hóa đạm tiếp theo

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu thí nghiệm

Các chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus, Nitrosomonas và Nitrobacter có nguồn gốc từ ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon) thâm canh tại Sóc Trăng

được chọn lọc để định danh Các chủng vi khuẩn này đã qua thử nghiệm và đánh giá thành công về khả năng làm sạch môi trường nước giúp tôm tăng trưởng và tăng tỉ lệ sống trên ương và nuôi tôm sú trong điều kiện phòng thí

nghiệm (Phạm Thị Tuyết Ngân và Trương Quốc Phú, 2010; Lê Đông Cung và

ctv, 2010)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn (được bảo quản trong tủ âm sâu -80ºC) đã được phục hồi trên môi trường TSA, sau đó tiếp tục nuôi tăng sinh bằng môi trường Luria Bertani (LB) Các phép thử sinh hóa được thực hiện trên từng nhóm vi khuẩn Các chủng thuần được nuôi tăng sinh trong môi trường chuyên biệt (LB) và ADN được ly trích để định danh bằng kỹ thuật giải trình tự

2.2.1 Phép thử sinh hóa

Các chỉ tiêu sinh hóa được áp dụng cho các chủng vi khuẩn Bacillus: B9, B37,

B38, B41 và B67 thuần được nuôi tăng sinh trong môi trường chuyên biệt sau

đó lần lượt thực hiện các phép thử sinh hóa theo mô tả của tác giả Andretta et

al., (2004) Các chỉ tiêu được kiểm tra trong phép thử sinh hóa bao gồm: xác

định tính di động của vi khuẩn, khả năng sản sinh catalase, phản ứng khử nitrate, khả năng phát triển ở các nồng độ muối, nhiệt độ khác nhau, phương pháp nhuộm gram được thực hiện theo mô tả của tác giả Sharmin và Rahman (2007) Phương pháp nhuộm bào tử, khả năng phát triển ở các pH khác nhau áp dụng theo Brown (2005) Khả năng thủy phân Casein dựa theo tác giả Elnasser

et al., (2007)

Các chỉ tiêu sinh hóa được áp dụng để xác định vi khuẩn nitrate hóa: Bốn

chủng vi khuẩn S6, S8, S10, S12 và N6, N7, N8, N10, N12 đã được chọn nuôi tăng sinh để tiến hành kiểm tra phản ứng sinh hóa nhằm xác định nhóm vi

khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter bằng thuốc thử Griess- Ilosway Lấy 20

mL môi trường chuyên biệt (Lewis và Pramer, 1958) cho vào trong 1.000 mL nước cất bổ sung các hóa chất theo công thức sau: Na2HPO4 (13,5 g/L);

KH2PO4 (0,7 g/L); MgSO4.7H2O (0,1g/L); NaHCO3 (0,5 g/L); (NH4)2SO4 (2,5 g/L); FeCl3.6H2O (0,0142 g/L); CaCl2.2H2O (0,0184g/L) Sau đó cho vào các ống falcon Sau cùng chuyển 1 mL dung dịch vi khuẩn vào các ống falcon này,

ủ trong bóng tối ở 28ºC trên máy lắc (150 vòng/phút) trong vòng 2-4 tuần Sau

2 tuần kiểm tra sự có mặt của NO2- ở các ống falcon chứa môi trường vi khuẩn

bằng thuốc thử Griess – Ilosvay Nếu dòng vi khuẩn nuôi là Nitrosomonas thì

chúng sẽ khử ammonium trong môi trường nuôi Phản ứng màu chứng tỏ đó là

vi khuẩn Nitrosomonas

2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử

Ly trích ADN từ vi khuẩn dựa theo phương pháp được mô tả bởi Boon et al.,

(2000): Vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong môi trường LB Lấy 1,8 mL vi khuẩn cho vào ống eppendorf và đem ly tâm với vận tốc 8000 vòng/phút trong

25 phút thu lấy phần kết tủa và loại bỏ phần dung dịch Sau đó cho vào 400 µl nước khử ion đã khử trùng, trộn đều, rồi lấy 400 µl dung dịch vi khuẩn này cho vào ống eppendorf đã có sẵn 0,6 g hạt thủy tinh (đường kính 0,1-0,11) (B Braun Biotech International, Melsungel, Germany) Sau đó 0,8 mL Na3PO4

(0.1M có pH=8) được thêm vào ống eppendorf, tiếp tục lắc đều và dập hỗn hợp bằng máy đập trong 1 phút 30 giây, 5 lần với tốc độ 27.000 vòng/phút (máy sử dụng Model MM.200) Sau đó thêm vào 32 µl dung dịch lysozyme (nồng độ

50 mg lysozyme/1 mL Tris-HCL 10 mM, pH =9) và lắc đều Đảo hỗn hợp trong 30 phút bằng tủ đảo tự động Thêm vào 60 µl dung dịch SDS 20% và 0,2

mL dung dịch CH3COOCH4 (8M có pH=7,2) rồi trộn đều hỗn hợp bằng tủ đảo

tự động trong 10 phút Tiếp tục ly tâm với vận tốc 7.000 vòng/phút trong 15 phút Lấy phần dung dịch phía trên sang một tuýp khác Tiếp tục tinh sạch bằng cách cho vào 800µl dung dịch chloroform: isoanyalcohol (Tỉ lệ 24:1) và lắc đều Trộn hỗn hợp bằng tủ đảo tự động trong 60 phút Sau đó ly tâm với vận tốc 15.000 vòng/phút trong 15 phút Hút lấy phần dung dịch lỏng trên cùng chuyển sang tuýp khác Thêm vào 0,8thế tích isoprobannol (100%) so với thể tích dung dịch đã lấy rồi lắc đều Giữ ở -20○C qua đêm Sau đó ly tâm 12.0000 vòng/phút trong 30 phút Bỏ phần nước, lấy phần kết tủa để khô ớ nhiệt độ phòng trong 30 phút hoặc sấy khô bằng máy sấy chân không trong 10 phút Hòa tan ADN kết tủa bằng 250-500 µl dung dịch TE (pH=8, Tris 10 mM, EDTA 1 mM) tùy thuộc vào lượng ADN Thêm vào 10 µl RNase ủ ở 37○C trong 10 phút Giữ DNA ở -20○C để sử dụng cho các bước tiếp theo

Tinh sạch ADN (Boon et al., 2002): Cho 500 µl dung dịch tinh sạch vào tuýp

có chứa ADN Cho hỗn hợp vào bộ làm sạch Hút sạch nước bằng máy hút, lấy phần ống có chứa ADN để sang ống khác Cho vào 25 µl TE (pH=8, Tris - HCl

10 mM, EDTA 1 mM) TE trước khi sử dụng giữ ấm ở 65 -70○C Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút Đây là sản phẩm tinh sạch

Quy trình khuếch đại (phản ứng PCR): phản ứng bằng máy PCR Perkin Elmer

9700 với cặp mồi chung 16S rRNA (Bacillus) và mồi chuyên biệt (Nitrosomonas, Nitrobacter) Trộn hỗn hợp chạy PCR trong các týp PCR, mỗi

một phản ứng có thể tích 50 µl gồm các thành phần sau:

Bacillus: nồng độ các thành phần trong phản ứng PCR bao gồm các hóa chất

sau: Bufer ABgene (1X); MgCl2 (2 mM); dNTPs (0,4mM); Primer 16F8 (0,5 µM); mồi 16R1391 (0,5 µM); Taq ADN polymerase (1,25U); ADN (100 ng) Thêm nước cất cho đủ 50 µl

Nitrosomonas: nồng độ các thành phần trong phản ứng PCR bao gồm các hóa

chất sau: Bufer ABgene (1X); MgCl2 (2 mM); dNTPs (0,4 mM); Primer AmoA 1F (0,4 µM); Primer AmoA 2R (0,4µM); Taq (1,25U); ADN (100 ng) Thêm nước cất cho đủ 50 µl

Nitrobacter: nồng độ các thành phần trong phản ứng PCR bao gồm các hóa

chất sau: bufer ABgene (1X), MgCl2 (2 Mm), primer 1F (0,7 µM), primer 2R (0,7 µM) Taq ADN polymerase (0,5 mM), Taq (1,25U), ADN (100 ng), thêm nước cho đủ 50 µl Cho các tuýp PCR vào máy PCR Perkin Elmer 9700 và thiết lập chu kỳ phản ứng như ở Bảng 1

Điện di và đọc kết quả: Các sản phẩm PCR được bảo quản ở 4ºC, điện di trên gel 1,5% agarose bằng bộ điện di một chiều Embi-Tec có bổ sung 10 mg/mL Ethium Bromide (EtBr) Sản phẩm PCR được quan sát bằng hệ thống chụp hình gel Bio –Rad UV 2000 và so sánh độ dài vạch ADN vi khuẩn với độ dài vạch ADN vi khuẩn đối chứng khuếch đại tương ứng với độ dài ADN của thang chuẩn Sau đó chụp hình gel chứa sản phẩm PCR các vi khuẩn chọn định dạng Sản phẩm PCR nào rõ đẹp được giữ lại và sau đó được chọn giải trình tự Giải trình tự xác định loài: Định danh bằng phương pháp giải trình tự được thực hiện tại Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ và Phòng xét nghiệm Biotech thuộc Công ty Nam Khoa, TP Hồ Chí Minh Tại Đại học Cần Thơ, giải trình tự các dòng vi khuẩn bằng máy giải trình tự ABI 3130, sau đó so sánh với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu của NCBI trên trang Web http://www.ebi.ac.uk (National Center for Biotechnology Information) bằng chương trình BLAST xác định mức độ đồng hình của các dòng vi khuẩn đó với các dòng vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu của NCBI Chuẩn bị mẫu giải trình tự ADN: Gắn ADN: Hút 50-100 μl sản phẩm PCR vào tuýp 1,5 mL Thêm 4 lần thể tích dung dịch gắn ADN đã bổ sung isopropanol, trộn đều Lấy một cột tinh sạch Hút hết thể tích ở bước 1 cho vào cột tinh sạch (cho giữa cột) Ly tâm ở nhiệt độ phòng với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 3 phút Đổ bỏ nước trong tuýp bên dưới (hoặc thay tuýp bên dưới khác)

Rửa: Thêm 650 μl dung dịch rửa đã bổ sung cồn vào cột Ly tâm ở nhiệt độ phòng với tốc độ 10.000 rpm trong 6 phút Đổ bỏ nước trong tuýp Ly tâm ở nhiệt độ phòng với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 3 phút để loại tất cả dung dịch rửa

Tách ADN: Đặt cột vào tuýp 1,7 ml sạch Cho vào 50 μl dung dịch hòa tan Ủ

ở nhiệt độ phòng trong vòng 5 phút Ly tâm ở nhiệt độ phòng với tốc độ 13.000

vòng/phút trong 6 phút Lúc này tuýp sẽ chứa sản phẩm PCR đã được tinh sạch Trữ sản phẩm thu được ở -20○C

Bảng 1: Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại ADN của vùng 16S rADN với các

đoạn mồi

Loài vi khuẩn Bước phản ứng Nhiệt độ

( 0 C)

Thời gian (giây)

SL chu kỳ

Bacillus sp 1 Biến tính

Biến tính

2 Gắn mồi

3 Kéo dài Kéo dài

94 94 60 72 72

120 60 90 80 180

35

35

35

Nitrosomonas sp 1 Biến tính

Biến tính

2 Bắt cặp

3 Kéo dài Kéo dài

95 95 55 72 72

600 60 60 60 600

35

35

35

Nitrobacter sp 1 Biến tính

Biến tính

2 Gắn mồi

3 Kéo dài Kéo dài

95 95 47 72 72

180 45 40 120 300

35

35

35

Thực hiện phản ứng gắn huỳnh quang: Phản ứng PCR (gắn huỳnh quang) được thực hiện trong thể tích 10 μl với các thành phần BiH2O khử ion (5); Big.Dye Buffer (1); PCR primer (1); Big.Dye Terminater v3.1 (2); Sản phẩm PCR (1) Tinh sạch sản phẩm phản ứng gắn huỳnh quang: Sau khi kết thúc phản ứng PCR, lấy các tuýp ra khỏi máy Thêm 2,5 μl EDTA 125 mM Thêm 30 μl cồn tuyệt đối, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Ly tâm với tốc độ 1.000 vòng/phút trong 45 phút, rút bỏ nước Thêm nhẹ nhàng 30 μl cồn 70% Ly tâm với tốc độ 1.000 rpm trong 20 phút Rút bỏ dịch Lặp lại 2 lần Sấy khô chân không ở

30○C khoảng 20 phút Các bước làm nên hạn chế ánh sáng trực tiếp

Biến tính: Thêm 20μl HiDye Formamide Biến nạp trên máy PCR 9700 ở 95oC trong 7 phút Để ngay trên nước đá trong 2 phút

Giải trình tự: mẫu được đưa vào máy ABI 3130 Chạy chương trình giải trình

tự ADN Đọc kết quả

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phép thử sinh hóa

3.1.1 Các đặc tính sinh hóa của Bacillus

Kết quả xác định các đặc tính sinh hóa 05 chủng vi khuẩn Bacillus chọn lọc cho thấy các chỉ tiêu kiểm tra gần giống với các chỉ tiêu định danh B subtilis của các tác giả sau Andretta et al., (2004), Sharmin và Rahman (2007)

Hình dạng khuẩn lạc: tròn, hơi rìa, khuẩn lạc phẳng Bề mặt nhẵn hoặc hơi

nhăn Màu trắng đục đến hơi vàng Sau thời gian nuôi lâu khuẩn lạc có hiện tượng bám sát vào thạch của môi trường (Hình 1) Kết quả nhuộm bào tử cho thấy bào tử bắt màu xanh của thuốc nhuộm Malachite Green và thành tế bào vi khuẩn bắt màu hồng của Safranin (Hình 2) Qua kết quả phân tích cho thấy thời gian nuôi vi khuẩn càng lâu thì bào tử hình thành càng nhiều Theo Banwart (2000) trong tất cả các loài không phải tất cả các tế bào đều hình thành bào tử

dù ở trong bất kì điều kiện nào

Kết quả các phản ứng tinh bột, Casein, Gelatin, Methyl Red, khử nitrate, V-P,

sử dụng carbohydrate cho thấy chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân tinh bột, Casein và Gelatin Enzyme hoạt động tối ưu ở pH 8,5 và hoạt tính của enzyme tăng khi nhiệt độ tăng, cao nhất ở nhiệt độ 55oC Qua xác định đặc tính sinh

hóa cho thấy Bacillus sp có khả năng thích nghi với các điều kiện môi trường

khác nhau (Bảng 2) Vi khuẩn có khả năng sống và có thể phát triển ở môi trường khắc nghiệt Do đó vi khuẩn này có khả năng phân bố rộng và chiếm ưu thế

3.1.2 Khả năng khử ammonium và urea của vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter

Khả năng khử ammonium: Kết quả khảo sát khả năng khử ammonium bằng thuốc thử Griess-Ilosvay các chủng vi khuẩn S6, S8, S10, S12 cho thấy cả 4 chủng vi khuẩn đều có khả năng khử mạnh ammonium ở giai đoạn 10 ngày

nuôi Như vậy, 4 chủng vi khuẩn trên có thể là Nitrosomonas Kết quả này chứng minh mật độ vi khuẩn Nitrosomonas đã tăng cao nên khả năng chuyển

hóa ammonium sang NO2- nhanh Kết quả hoàn toàn phù hợp với kết quả

Hình 1: khuẩn lạc sau 48 giờ trên môi trường Hình 2: Bào tử Bacillus

nghiên cứu của Lewis và Pramer (1958), Heselsoe et al., (1999) và Hoàng

Phương Hà và ctv (2008)

Bảng 2: Kết quả xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa vi khuẩn

Chủng vi khuẩn định danh Các chỉ tiêu

B9 B37 B38 B41 B67

Ghi chú: (+) dương tính; (-) âm tính

Khảo sát khả năng khử urea: Khả năng khử urea của 4 chủng vi khuẩn khảo sát

cho kết quả như sau: chủng S8 không có khả năng khử được urea điều này

chứng tỏ chủng vi khuẩn này không sống được trong môi trường có chứa urea

Các dòng còn lại S6, S10, S12 đều sử dụng được urea sau 10 ngày nuôi

3.1.3 Khả năng nitrate hóa, ảnh hưởng của Biotin lên tăng trưởng của

Nitrobacter sp

Khả năng nitrate hóa: Chủng N6 và N7 đã khử nitrite hoàn toàn ở giai đoạn 10

ngày nuôi Điều này chứng tỏ 2 chủng vi khuẩn trên là Nitrobacter sp., có khả

năng khử nitrite mạnh, đã chuyển hóa hoàn toàn lượng nitrite trong môi trường

thành nitrate Đối với 3 chủng vi khuẩn N8, N10 và N12 đều có khả năng khử

nitrite yếu và chậm nên sau 10 ngày nuôi, môi trường chỉ chuyển từ màu nâu

đỏ sang màu hồng, nitrite vẫn còn trong môi trường nuôi Cho đến ngày thứ 15,

quan sát NO2- không còn, điều này có thể giải thích do có sự hiện diện của

Nitrobacter sp đã chuyển hoá hoàn toàn NO2- thành NO3-, môi trường nuôi trở

nên trong suốt Từ kết quả trên cho thấy khả năng nitrate hóa của các chủng vi

khuẩn là khác nhau trong cùng một điều kiện môi trường nuôi Kết quả nghiên

cứu phù hợp với Aleem & Alexander (1960), Block và koops (1992),

Grundman và Gappe (2000) khi phân lập Nitrobacter từ đất

3.2 Định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử

3.2.1 Kết quả định danh vi khuẩn Bacillus bằng kỹ thuật PCR

Kết quả điện di và sản phẩm PCR cho thấy tất cả 5 chủng vi khuẩn B9, B41, B67 đều có vạch hiện ở vị trí 1.500bp cùng với vị trí của vạch vi khuẩn đối

chứng dương Bacillus subtilis S19 (Bộ môn di truyền Sinh học và Động vật,

trường Đại học Florence, Italia và thang chuẩn (Hình 3) Điều này chứng tỏ 3

chủng vi khuẩn trên thuộc giống Bacillus Dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh

lý và sinh hóa kết hợp với kết quả PCR các chủng trên thuộc giống Bacillus Kết quả giải trình tự 5 chủng vi khuẩn Bacillus: Trình tự của 5 chủng vi khuẩn

B9, B37, B38, B41, B67 được so sánh với trình tự của vi khuẩn trong ngân hàng gen (gen vạch) bằng chương trình BLAST trên trang web http://www.ebi.ac.uk Kết quả cho thấy chủng B9 có mức độ tương đồng về

trình tự ADN với dòng Bacillus cereus BRL02-43 là 97%; 2 dòng B37, B38 có mức độ tương đồng về trình tự ADN với dòng Bacillus cereus G9842 lần lượt

là 100% và 99%; Dòng vi khuẩn B41 có mức độ tương đồng về trình tự ADN

với dòng Bacillus amyloliquefaciens SB3297 là 100% và dòng B67 có mức độ tương đồng về trình tự ADN với dòng Bacillus subtilis là 99%

B67 B41 B9 ĐC+ ĐC- Thang chuẩn

Hình 3: Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện Bacillus

Dòng B9 có tổng số nucleotide giải được là 881, cho kết quả đồng hình với

dòng Bacillus cereus BRL02-43 là 97% (862/882), có 16 vị trí bị ngắt quãng,

mức độ sai biệt không đáng kể (1%) Dòng B37 có tổng số nucleotide giải

được là 539, cho kết quả đồng hình với dòng Bacillus cereus G9842 là 100%

(539/539), không có vị trí bị ngắt quãng, mức độ sai sai biệt không đáng kể (0%)

Từ kết quả giải trình tự có thể kết luận có ít nhất 3 loài vi khuẩn Bacillus (B

cereus, B subtilis và B amyloliquefaciens) tồn tại trong môi trường ao nuôi

tôm đã tham gia vào quá trình khử đạm cho môi trường Trong 5 chủng

1500bp

400bp

Bacillus được chọn để định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử chỉ có 1 dòng

được định danh là loài Bacillus subtilis BL10 với mức độ đồng dạng tới 99%

Như vậy, kết quả phân tích các chuỗi trình tự trên ngân hàng gen đã khẳng định

được 3 chủng vi khuẩn B9, B37, B38 là B cereus Chủng B41 là B

amyloliquefaciens, và chủng B67 là B subtilis

3.2.2 Kết quả giải trình tự vi khuẩn nitrate hóa

Kết quả nhận diện vi khuẩn Nitrosomonas sp bằng kỹ thuật PCR: Kết quả điện

di cho thấy tất cả 3 dòng vi khuẩn S6, S8 và S12 đều có vạch hiện ở vị trí

490bp (Hình 4) Điều này chứng tỏ 3 dòng vi khuẩn trên thuộc loài vi khuẩn

Nitrosomonas sp

Kết quả giải trình tự 4 dòng vi khuẩn Nitrosomonas: Kết quả đã giải trình tự

ADN được 3 dòng trong tổng số 4 được chọn, kết quả như sau: Dòng vi khuẩn

S6 có mức độ đồng hình với dòng Uncultured Nitrosomonadaceae bacterium

3CC11 là 98%; 2 dòng vi khuẩn S8 và S12 có mức độ đồng hình với dòng

Nitrosomonas nitrosa lần lượt là 90% và 91% Dòng vi khuẩn S6 có tổng số

nucleotide giải được là 415, cho kết quả đồng hình với dòng

Nitrosomonadaceae bacterium 3CC11 là 99%

Thang ĐC- S6 S8 S12

Hình 4: Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện Nitrosomonas

Dòng S6 trình tự giải được khi so trên ngân hàng dữ liệu chỉ xác định được đến

họ (Nitrosomonadaceae) Kết quả cho biết chúng thuộc nhóm vi khuẩn nitrate hóa Dòng S8 và S12 trình tự giải được đồng hình với Nitrosomonas nitrosa

(90-91%) Như vậy, kết quả phân tích các chuỗi trình tự trên ngân hàng gen đã khẳng định được 3 dòng vi khuẩn S6, S8 và S12 thuộc nhóm vi khuẩn nitrate hóa

3.2.3 Kết quả giải trình tự Nitrobacter

Kết quả nhận diện vi khuẩn Nitrobacter bằng kỹ thuật PCR: Kết quả điện

di cho thấy tất cả 2 dòng vi khuẩn N10 và N12 đều có vạch hiện ở vị trí khoảng