Nghiên cứu tính an toàn và công hiệu Văcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt từ não chuột chủng Beijing-1 do việt nam sản xuất

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) hiện đang là mối quan tâm lớn của ngành y tế các nước châu Á vì mức độ nguy hiểm của nó. Bệnh lưu hành ở châu Á bao gồm Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Philipin, Triều Tiên, Ấn Độ, vùng viễn đông Nga và tất cả các nước Đông Nam Á, với khoảng 50.000 trường hợp mỗi năm, trong đó 10.000 ca tử vong, 15.000 ca mang di chứng thần kinh suốt đời [52]. Từ thập kỷ 90 của thế kỷ 20 virut VNNB đã lan đến các vùng khác ngoài châu Á như vùng Torres của Australia [34, 44] . Ở Việt Nam dịch xảy ra hàng năm, rải rác khắp các tỉnh thành từ đồng bằng đến miền núi, miền Bắc có tỷ lệ mắc cao nhất. Hiện nay khi việc tiêu diệt vectơ truyền bệnh là muỗi Culex hoặc tiêm phòng cho lợn là ổ chứa virut còn rất khó khăn thì gây miễn dịch cho người là biện pháp duy nhất để ngăn ngừa bệnh VNNB.Tuy nhiên với sự thay đổi của các chủng virut như VNNB genotyp 1 được phát hiện ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Việt Nam... báo động cho chúng ta cần dự phòng bệnh tích cực hơn bằng các chủng loại vắc xin VNNB có diện đáp ứng kháng thể rộng với nhiều chủng, lưu hành ở nhiều vùng khác nhau. Theo nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy chủng Beijing-1 được coi là chủng đại diện nhất, có thể bảo vệ chéo với nhiều chủng VNNB lưu hành ở nhiều địa phương và khả năng miễn dịch cao hơn chủng Nakayama. Sau khi chuyển giao công nghệ của Nhật Bản, Việt Nam đã sản xuất thành công văcxin VNNB từ chủng Nakayama. Hiện nay, Công ty văcxin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) đã sản xuất văcxin VNNB ở cả 2 chủng Nakayama và Beijing-1 để đáp ứng nhu cầu thị trường trong và ngoài nước. Kiểm tra chất lượng văcxin là một vấn đề hết sức quan trọng, có tính chất khẳng định chất lượng của văcxin về tính an toàn và công hiệu của nó. Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu tính an toàn và công hiệu văcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt từ não chuột chủng Beijing-1 do Việt Nam sản xuất”

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

-W—X -

ĐỖ THỊ DIỆP LAN

NGHIÊN CỨU TÍNH AN TOÀN VÀ CÔNG HIỆU VĂCXIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TỪ NÃO CHUỘT CHỦNG BEIJING-1 DO VIỆT NAM SẢN XUẤT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

-W—X -

ĐỖ THỊ DIỆP LAN

NGHIÊN CỨU TÍNH AN TOÀN VÀ CÔNG HIỆU VĂCXIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TỪ NÃO CHUỘT CHỦNG BEIJING-1 DO VIỆT NAM SẢN XUẤT

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

Hà Nội – 2010

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc của mình, em xin dành trang đầu tiên của luận văn

để bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:

Ban giám hiệu trường Đại học Y Hà Nội, Phòng đào tạo sau Đại học, cùng toàn thể quý thầy cô trong Bộ môn Vi sinh đã giảng dạy tận tình và giúp đỡ em trong quá trình học tập ở trường

PGS.TS Lê Văn Phủng- Viện trưởng Viện kiểm định Quốc gia Văcxin và Sinh phẩm Y tế, đồng thời là Trưởng Bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Hà Nội người thầy luôn quan tâm, động viên em trong quá trình học tập tại trường và làm việc tại Viện

GS TS Huỳnh Phương Liên- Công ty văcxin và sinh phẩm số 1, người thầy

đã luôn quan tâm hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình làm luận văn

Phòng kiểm định chất lượng, Công ty văcxin và sinh phẩm số 1

Khoa Kiểm định Văcxin virut, Viện Kiểm định Quốc gia Văcxin và Sinh Phẩm Y Tế, đã tạo điều kiện cho tôi học tập và làm việc

Xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình , tất cả bạn bè, anh chị em đã quan tâm, giúp đỡ, chia sẻ, động viên em trong suốt thời gian qua

Hà Nội, tháng 8 năm 2010

Đỗ Thị Diệp Lan

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU……….….…3

1.1 Virut VNNB………3

1.1.1 Thành phần hoá học của virut……… 3

1.1.2 Tính chất hoá lý……… …… 4

1.1.3 Cấu trúc hạt virut……… ….…4

1.1.4 Hình thái học ……… …… 4

1.1.5 Sự nhân lên của virut……… 5

1.2 Dịch tễ học……… 6

1.3 Đặc điểm lâm sàng……… … 10

1.4 Chẩn đoán……… … 11

1.4.1 Chẩn đoán lâm sàng……… 11

1.4.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm……… … 11

1.5 Bệnh lý học và sinh bệnh học……… …15

1.6 Văcxin VNNB……… 16

1.6.1 Những khía cạnh chung của phương pháp tiêm phòng bằng văcxin 16

1.6.2 Kháng nguyên bảo vệ và văcxin……… ………18

1.6.3 Ý nghĩa và lịch sử phát triển của văcxin VNNB……… 19

1.6.4 Hiệu lực của văcxin……… …21

1.6.5 Thời gian miễn dịch……….22

1.7 Các loại văcxin sử dụng trên thế giới……… 23

1.8 Văcxin VNNB bất hoạt sản xuất từ não chuột ……….23

1.8.1 Định nghĩa……….… 23

1.8.2 Chủng virut……… 23

1.8.3 Chuột dùng cho sản xuất văcxin……… … 23

1.8.4 Sản xuất văcxin……… ……… 23

1.8.5 Kiểm định văcxin……… …… 23

Chương II ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu………26

2.2 Vật liệu nghiên cứu……… … 26

2.3 Phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu……… 29

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu……….…29

2.3.2 Kiểm tra tính an toàn của văcxin VNNB……… … 29

2.3.2.1 Kiểm tra an toàn chung ……… … 29

2.3.2.2 Kiểm tra chất gây sốt……… … 32

2.3.2.3 Kiểm tra an toàn đặc hiệu……… 34

2.3.2.4 Kiểm tra vô trùng……… 36

2.3.2.5 Kiểm tra các thành phần hoá học……… 37

2.3.3 Kiểm tra tính công hiệu của văcxin VNNB……… 42

2.3.4 Phương pháp xử lý sô liệu……….… 47

2.3.5 Đạo đức trong nghiên cứu……….…… 47

Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……… ………48

3.1 Kết quả kiểm tra thành phần hoá học của 6 loạt văcxin VNNB từ chủng Beijing-1……… 48

3.2 Kết quả kiểm tra tính công hiệu của 6 loạt văcxin VNNB từ chủng Beijing1 57

Chương IV BÀN LUẬN……….……… 58

4.1.Tính an toàn của văcxin VNNB từ chủng Beijing-1 do Việt Nam sản xuất 58

4.1.1 Hàm lượng TCA-Protein 58

4.1.2 Hàm lượng Thimerosal 59

4.1.3 Hàm lượng Formaldehyd 61

4.1.4 Độ pH 62

4.1.6 Thử nghiệm an toàn chung 62

4.1.7 Thử nghiệm an toàn đặc hiệu 63

4.1.8 Thử nghiệm yếu tố gây sốt 64

4.2 Tính công hiệu của văcxin VNNB từ chủng Beijing-1 do Việt Nam

sản xuất 65 Chương V: KẾT LUẬN 66

1 Tính an toàn của văcxin VNNB từ chủng Beijing-1 do Việt Nam sản xuất

2 Tính công hiệu của văcxin VNNB từ chủng Beijing-1 do Việt Nam sản xuất

KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

BHK-21 Tế bào thận chuột đất vàng (Baby hamster kidney)

CTTCMR Chương trình tiêm chủng mở rộng

CV Virut thử thách (Challenge virus)

DTaP Bạch hầu, Uốn ván, Ho gà vô bào

( Diphteria, Tetanus, acellular Pertussis)

ELISA Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết gắn enzym (Enzyme

Link Immuno-sorbent Assay) FBS Huyết thanh bào thai bê (Fetal Bovin Serum)

GMP Thực hành sản xuất tốt (Good Manufacturing Practice) GSK Glaxo Smith Kline

HI Ngăn ngưng kết hồng cầu (Hemaglutination Inhibition)

IP Tiêm phúc mạc (intra peritorial))

JE Viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis)

NICVB Viện Kiểm định Quốc gia Văcxin và Sinh phẩm Y tế

(National Institute for control of Vaccines and Biologicals)

PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)

PFU Tạo đám hoại tử (Plaque Forming Unit)

PRNT Trung hoà giảm đám hoại tử (Plaque Reduction Neutralization

Test)

VABIOTECH Công ty văcxin và sinh phẩm số 1

WHO Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization)

Ở Việt Nam dịch xảy ra hàng năm, rải rác khắp các tỉnh thành từ đồng bằng đến miền núi, miền Bắc có tỷ lệ mắc cao nhất Hiện nay khi việc tiêu diệt

vectơ truyền bệnh là muỗi Culex hoặc tiêm phòng cho lợn là ổ chứa virut còn rất

khó khăn thì gây miễn dịch cho người là biện pháp duy nhất để ngăn ngừa bệnh VNNB.Tuy nhiên với sự thay đổi của các chủng virut như VNNB genotyp 1 được phát hiện ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Việt Nam báo động cho chúng ta cần dự phòng bệnh tích cực hơn bằng các chủng loại vắc xin VNNB có diện đáp ứng kháng thể rộng với nhiều chủng, lưu hành ở nhiều vùng khác nhau. Theo nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy chủng Beijing-1 được coi là chủng đại diện nhất, có thể bảo vệ chéo với nhiều chủng VNNB lưu hành ở nhiều địa phương và khả năng miễn dịch cao hơn chủng Nakayama

Sau khi chuyển giao công nghệ của Nhật Bản, Việt Nam đã sản xuất thành công văcxin VNNB từ chủng Nakayama Hiện nay, Công ty văcxin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) đã sản xuất văcxin VNNB ở cả 2 chủng Nakayama và Beijing-1 để đáp ứng nhu cầu thị trường trong và ngoài nước Kiểm tra chất lượng văcxin là một vấn đề hết sức quan trọng, có tính chất khẳng định chất lượng của văcxin về tính an toàn và công hiệu của nó Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

"Nghiên cứu tính an toàn và công hiệu văcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt từ não chuột chủng Beijing-1 do Việt Nam sản xuất”

Trong phạm vi của đề tài này nhằm 2 mục tiêu:

1 Đánh giá tính an toàn của vắc xin viêm não Nhật Bản từ não chuột chủng Beijing-1 trong ph òng th í nghiệm do Việt Nam sản xuất

2 Đánh giá tính công hiệu của vắc xin viêm não Nhật Bản từ não chuột chủng Beijing-1 trong ph òng th í nghiệm do Việt Nam sản xuất

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Virut viêm não Nhật Bản

Virut VNNB là một thành viên của nhóm B các arbovirut, thuộc họ

Togaviridae, dòng Flavivirut; là một virut chứa ARN có vỏ bọc Các hạt virut

hình cầu có đường kính trung bình 40 – 50nm [41]

Hình 1.1: Sơ đồ cấu trúc hạt virut VNNB (Flaviviruse)

1.1.1 Thành phần hoá học của virut

- ARN sợi đơn, có hằng số lắng là 44S, có trọng lượng phân tử 4 ×106dalton ARN chiếm 6% trọng lượng của virion và có thành phần bazơ là G:26; A:30; C:22; U:22 ARN là vật liệu gây nhiễm và đóng vai trò của ARN thông tin với một mũ "cap" ở đầu 5’ và không có dải poly A ở đầu 3’ [56]

- Protein: có 3 protein cấu trúc [49]:

+ Protein vỏ (protein E) là một glycoprotein có chức năng là mộtkháng nguyên ngưng kết hồng cầu và có trọng lượng phân tử 53 ×103dalton

+ Protein lõi (protein C) có trọng lượng phân tử 13,5 ×103dalton

+ Protein giống màng (hay protein M) có trọng lượng phân tử

8,7 ×103dalton

Các protein chiếm 66% trọng lượng của virion

- Lipit: chiếm 17% trọng lượng của virion

- Đường (carbohydrate): 9% trọng lượng của virion, protein E gắn với đường mannoza và các glycan

1.1.3 Cấu trúc hạt virut

- Nucleocapsit: có đường kính 25 - 30 nm và hệ số lắng 120 - 140S Gồm ARN và protein C

- Vỏ bọc gồm 1 màng lipit kép gắn với protein E và protein M [41]

1.1.4 Hình thái học

Hạt virut hình cầu đường kính trung bình 45-50 nm với các chỗ lồi rất nhỏ trên bề mặt tạo thành quầng sáng quanh hạt virut Chỗ lồi trên bề mặt hạt virut là các gai dài 5 - 10nm với đường kính 2nm Những gai này chính là các glycoprotein mang hoạt tính ngưng kết hồng cầu và hoạt tính trung hoà [48]

1.1.5 Sự nhân lên của virut

Virut VNNB có thể nhân lên được ở một số loại tế bào có nguồn gốc khác nhau như: Tế bào có nguồn gốc từ người, khỉ, một số loài gậm nhấm, lợn, chim và

tế bào muỗi Hiệu giá của virut khi nhân lên tuỳ thuộc vào từng loại tế bào chủ

Quá trình nhân lên của virut VNNB có thể chia thành 4 giai đoạn:

* Giai đoạn 1: Virut bám dính và xâm nhập vào tế bào chủ

* Giai đoạn 2: Giai đoạn tổng hợp các thành phần của virut bên trong tế bào Khi xâm nhập vào tế bào virut truyền thông tin di truyền của nó từ ARN, kích ứng sinh tổng hợp ARN-Polymeraza ARN sợi (+) sẽ được phiên mã nhờ ARN-polymeraza thành ARN (-) bổ sung thành sợi kép để làm khuôn sinh tổng hợp ARN mới theo cách bán bảo tồn, ARN được tổng hợp ở quanh nhân tế bào Các ARN của virut và ARN thông tin được tạo thành để tổng hợp các protein của virut

* Giai đoạn 3: Giai đoạn lắp ráp các thành phần của virut khi axit nucleic

và protein của virut được tổng hợp, chúng tiến dần đến màng tế bào để lắp ráp

vỏ capsit và ARN để tạo thành virut mới

* Giai đoạn 4: Virut thoát khỏi tế bào Sau khi lắp ráp thành virut hoàn chỉnh chúng tiến dần đến màng tế bào, phá vỡ tế bào, giải phóng khỏi tế bào để xâm nhập vào tế bào khác

Hình 1 2: Hình ảnh hạt virut VNNB quan sát dưới kính hiển vi điện tử JEM -

T8 độ phóng đại 120 000 lần

1.2 Dịch tễ học

Virut VNNB được lưu hành rộng rãi ở châu Á bao gồm Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Triều Tiên, Philippin, vùng Viễn Đông Liên Xô, hầu hết các nước Đông Nam Á và Ấn Độ [25] Từ thập kỷ 90 của thế kỷ 20 virut VNNB đã lan đến vùng khác ngoài châu Á như vùng Torres của Australia [34, 44] Năm

1924 một vụ dịch viêm não lớn xẩy ra ở Nhật Bản với hơn 6000 trường hợp mắc

và tỷ lệ tử vong là hơn 60% Sau đó các vụ dịch xẩy ra hàng năm vào mùa hè với tổng số khoảng 27000 trường hợp mắc trong thời gian từ năm 1924 - 1940

Vụ dịch VNNB năm 1949 ở Triều Tiên có 5500 trường hợp mắc với tỷ lệ tử vong là 50% Ở Trung Quốc hàng năm có trên 1000 trường hợp mắc Từ cuối những năm 60 của thế kỷ trước, tỷ lệ mắc bệnh giảm đi ở Nhật Bản và Trung Quốc: hàng năm ở Nhật Bản có dưới 20 trường hợp mắc; ở Bắc Kinh - Trung Quốc tỷ lệ mắc bệnh giảm từ 15 - 30 trường hợp/100000 dân xuống còn 2,5

trường hợp/ 100000 dân (theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới năm 1980)

Ngược lại, các vụ dịch lớn xuất hiện ở Ấn Độ, Nepal và Đông Nam Á Các nghiên cứu cho thấy ở miền Bắc Thái Lan dịch xảy ra hàng năm với số lượng mắc trung bình là 1600 trường hợp (3 - 5 trường hợp/100000 dân) Năm

1969 một vụ dịch lớn bùng nổ ở đây, đặc biệt là ở tỉnh Chiang Mai với tỷ lệ mắc

là 20,3 trường hợp/100000dân [32, 33] Ở Ấn Độ dịch xảy ra hàng năm ở nhiều vùng khác nhau, các vụ dịch từ năm 1973 đến 1983 đã có trên 10.000 trường hợp mắc (theo báo cáo của Viện Virut học Quốc Gia Ấn Độ) Ở Triều Tiên và các tỉnh ven biển Trung Quốc đến nay dịch vẫn xảy ra hàng năm Tỷ lệ tử vong trong các vụ dịch là 20 đến 70% phụ thuộc vào sự chăm sóc y tế và điều kiện sống từng nơi

Virut VNNB được phân lập đầu tiên vào năm 1935 ở Nhật Bản và đã được tìm thấy ở hầu hết các nước Đông Nam Á Genotyp I phân lập bao gồm các nước miền bắc Thái Lan, Campuchia và Hàn Quốc Việt Nam chỉ phân lập được 1 chủng Genotyp I từ người vào năm 1990 còn hầu hết Genotyp I được phát hiện ở muỗi và lợn Genotyp II được phân lập ở các nước miền nam Thái

Lan, Malaysia, Indonesia và phía Bắc Australia Genotype III bao gồm các nước Nhật Bản, Trung Quốc, Hồng Kông, Philippines, Việt Nam [40] Ở Việt Nam, bệnh VNNB đã được ghi nhận từ năm 1960 và đã được chẩn đoán xác định bằng huyết thanh học và phân lập virut từ người bệnh, súc vật, muỗi vectơ Bệnh VNNB lưu hành ở hầu hết các tỉnh phía Bắc trên địa bàn 107 quận, huyện, thị

xã Các ổ dịch lưu hành phần lớn tập trung tại các vùng bán sơn địa và vùng đồng bằng trồng lúa nước thuộc các tỉnh Hà Giang, Thái Nguyên, Bắc Kạn, Hoà Bình, Hải Dương, Hưng Yên, Hà Nam, Ninh Bình, ngoại thành Hà Nội và Hải Phòng Ở miền Nam, miền Trung và Tây Nguyên có tỷ lệ mắc thấp hơn so với các tỉnh miền Bắc [10]

Trong 5 năm từ 1989-1992 có 4.130 trường hợp viêm não cấp tính được thông báo từ 23 tỉnh, thành phố trong đó 237 trường hợp tử vong chiếm 5,7%

1296 trường hợp được lấy máu xét nghiệm xác định được 733 trường hợp là bệnh VNNB chiếm 56,55%, 860 mẫu huyết thanh lợn được xét nghiệm xác định được 370 mẫu có kháng thể VNNB chiếm 43,5%[11] Chỉ số mật độ muỗi ở nơi lưu hành bệnh VNNB thường tăng cao từ tháng 4 đến tháng 9 Hai năm có dịch xảy ra lớn là 1988 và 1992, 119 số quận huyện thị đã được xác định có lưu hành bệnh, tập trung cao ở vùng đồng bằng và vùng bán sơn địa có trồng lúa nước ở miền Bắc Việt Nam Bệnh xảy ra quanh năm đỉnh cao là tháng 6 thường chậm hơn đỉnh cao của sự nhiễm virut trong quần thể lợn và chỉ số mật độ muỗi từ 1-2 tháng Trẻ em dưới 15 tuổi là đối tượng mắc bệnh chủ yếu trong đó trẻ từ 3 tháng tuổi đến 9 tuổi chiếm 86,1% [11]

Cho đến nay virut VNNB vẫn là nguyên nhân hàng đầu gây hội chứng não cấp (HCNC) ở Việt Nam, với trên 80% số mắc ở trẻ em dưới 15 tuổi Để khống chế bệnh VNNB cần tăng cường sử dụng vắc xin VNNB cho trẻ dưới 15 tuổi [6] 976 mẫu kháng huyết thanh và dịch não tủy của bệnh nhân có HCNC

đã chẩn đoán xác định IgM kháng virut VNNB là 46,1 % trường hợp bị HCNC

là do virut VNNB [8]

Hình 1.3: Sự phân bố theo nhóm tuổi các trường hợp VNNB

năm 2002 ở miền Bắc

Scherer và cộng tác đã chứng minh rằng lợn và chim - chủ yếu là cò, diệc,

có thể cả vịt - là những ổ chứa virut và muỗi Culex là vectơ truyền virut giữa

các ổ chứa này và từ chúng truyền sang người Trong trường hợp thể bệnh cảnh lâm sàng rõ rệt cũng như trong trường hợp nhiễm không có triệu chứng ở lợn và

chim [46] Muỗi Culex tritaeniorhynchus là vectơ truyền bệnh quan trọng nhất,

chúng đẻ trứng trên các đồng lúa nước, rãnh nước và ao hồ Mật độ muỗi cao nhất trong các tháng hè nóng, các loài muỗi khác cũng truyền virut VNNB như

Culex vishnui (Ấn Độ), Culex gelidus, Culex fuscocephalus (Malaysia, Thái

Lan), Culex annuilus (Đài Loan) và Culex annulirostris (Guam)[47, 59]

Ở vùng ôn đới, virut xuất hiện ở muỗi vào tháng 7 thì 1 đến 3 tuần sau ở lợn và chim, người nhiễm virut vào vài tuần sau đó [27] Ở vùng nhiệt đới chu trình tuần hoàn virut VNNB giữa muỗi, chim và lợn có thể xảy ra quanh năm

Ở Việt Nam, theo thống kê của viện VSDTTƯ từ năm 1980 đến nay cho thấy virut VNNB được truyền ở quần thể lợn trong suốt năm như một chu kỳ

khép kín tạo thành ổ chứa virut gần người Nhưng chỉ số mật độ muỗi Culex

tritaeniorhynchus tăng cao từ tháng 4 đến tháng 9 và tần số mắc bệnh VNNB

tăng cao từ tháng 5 đến tháng 7 [7]

Hình 1 4: Chu trình tuần hoàn virut VNNB trong tự nhiên

Muỗi và lợn được xác định là vật truyền và ổ chứa virut VNNB quan trọng đã gây ra các vụ dịch viêm não Lợn còn được xác định là động vật khuếch đại virut Ở những vùng cận nhiệt đới như miền Bắc Việt Nam, dịch VNNB thường xảy ra vào mùa hè, ngược lại ở những vùng nhiệt đới như miền Nam Việt nam, các trường hợp VNNB xảy ra rải rác quanh năm Trong mùa dịch, tỷ

lệ nhiễm virut VNNB trong quần thể lợn rất cao chiếm 82% trong tháng 6 Ngược lại trong các tháng khác ngoài mùa dịch tần suất nhiễm virut VNNB trong quần thể lợn rất thấp với tỉ lệ xác định dương tính trong quần thể lợn dao động trong khoảng 1,96-14% [9]

Khả năng tồn tại qua mùa đông của virut VNNB ở các vùng ôn đới còn

chưa được sáng tỏ Việc truyền virut VNNB do muỗi Culex và Aedes đã được

chứng minh trong phòng thí nghiệm và bằng các nghiên cứu thực địa [47] Các

giả thiết khác cho rằng virut sống sót trong muỗi cái Culex tritaeniorhynchus

ngủ đông, tồn tại ở ve hoặc các vectơ khác, nhiễm virut dai dẳng ở động vật có xương sống, hoặc chu trình được bắt đầu lại bởi các loài chim di cư Ở Nhật Bản người ta đã tìm thấy virut VNNB và kháng thể ở dơi [43,55] Những con dơi được gây nhiễm thực nghiệm rồi ngủ đông sẽ nhiễm virut dai dẳng và khi trời

ấm lên sẽ có đủ virut trong máu để muỗi có thể hút máu dơi và truyền virut sang

cho người [41] Virut VNNB và kháng thể cũng được tìm thấy ở loài bò sát nhưng vai trò của chúng trong sinh thái học bệnh VNNB còn chưa rõ [39]

1.3 Đặc điểm lâm sàng

VNNB là bệnh nhiễm trùng cấp tính hệ thần kinh trung ương bởi vậy các triệu trứng chủ yếu là phản ánh tổn thương hệ thần kinh trung ương Bệnh có thể chia thành 4 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Thời kỳ ủ bệnh thường 6- 16 ngày, giai đoạn này không có biểu hiện triệu trứng lâm sàng

Giai đoạn 2: Thời kỳ khởi phát từ 2-4 ngày, với sốt cao đột ngột, đau đầu buồn nôn và nôn sau đó có các biểu hiện tổn thương thần kinh

Giai đoạn 3: Thời kỳ toàn phát: Bệnh nhân tiếp tục sốt cao co giật, giai đoạn này có tổn thương thực thể ở não biểu hiện cứng gáy, Babinski (+), co giật

và đi vào hôn mê thường ngày thứ 5 đến ngày thứ 9

Giai đoạn 4: Thời kỳ bình phục:

Nhẹ: Bệnh nhân qua khỏi, hồi phục chức năng vận động

Nặng: Bệnh nhân tiếp tục co giật, hôn mê sâu dẫn đến tử vong

Bệnh VNNB có tỷ lệ tử vong cao, di chứng nặng nề Có thể là liệt chi, liệt nửa người, kém trí nhớ, động kinh thường xảy ra muộn hơn

1.4 Chẩn đoán

1.4.1 Chẩn đoán lâm sàng: Chủ yếu dựa vào các triệu chứng lâm sàng như sốt

cao đột ngột, đau đầu, buồn nôn, nôn dấu hiệu Babinski (+) hay còn gọi là các triệu chứng của viêm não do virut

Chỉ dựa vào các triệu chứng lâm sàng thì rất dễ nhầm với các bệnh khác như lao màng não, sốt rét ác tính thể não Để chẩn đoán xác định cần phải dựa vào chẩn đoán phòng thí nghiệm

1.4.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

Vai trò chẩn đoán phòng thí nghiệm rất quan trọng, quyết định về kết quả xác định căn nguyên, vì vậy cần có phòng xét nghiệm chuyên ngành về virut học, hiện nay có rất nhiều kỹ thuật chẩn đoán, tuy nhiên tuỳ từng trường hợp cụ thể mà ta tiến hành các kỹ thuật xét nghiệm khác nhau

1.4.2.1 Lấy mẫu bệnh phẩm

* Lấy mẫu bệnh phẩm để chẩn đoán phòng thí nghiệm hết sức quan trọng

Nó quyết định tác nhân gây bệnh, nếu lấy mẫu bệnh phẩm đúng quy định thì tỷ

lệ chẩn đoán sẽ cao và ngược lại

- Lấy mẫu bệnh phẩm để phân lập virut:

* Ổ chứa virut (máu lợn, não chim )

* Máu lợn lấy 2-4 ml

* Véc tơ (muỗi Culex triaeniorlynchus) 20-50 con/mẫu

* Người: + Lấy máu bệnh nhân từ khi có triệu chứng đầu tiên đến ngày thứ 13 thì virut vào hết hệ thần kinh

+ Nước não tuỷ sau khi mắc 1-3 ngày 2-4 ml

+ Não tử thi: Lấy não tử thi sau khi chết không quá 6 giờ, bệnh nhân chết sau khi mắc bệnh dưới 2 tuần, lấy các vị trí khác nhau: đại não, tiểu não, các nhân xám (trong trường hợp không lấy được não có thể dùng kim chọc hút qua khe sàng)

- Lấy mẫu bệnh phẩm để chẩn đoán huyết thanh:

+ Máu lợn để xác định sự lưu hành VNNB trong quần thể lợn

+ Máu và nước não tuỷ của bệnh nhân nghi mắc VNNB

Thông thường thì lấy máu kép để tìm động lực kháng thể (ELISA-IgG,HI)

Máu 1: Ngày khởi bệnh

Máu 2: 2 tuần sau khi lấy máu 1

Ngày nay có những kỹ thuật chỉ cần một mẫu máu cũng có thể cho kết quả chính xác như kỹ thuật phát hiện sớm IgM bằng ELISA có thể chẩn đoán sau khi mắc bênh từ 3-5 ngày Kỹ thuật RT-PCR phát hiện ARN của virut VNNB với cặp mồi đặc hiệu cho ta kết quả chính xác

Các mẫu muỗi phải được giữ trong điều kiện chúng vẫn còn sống

Bệnh phẩm

Máu lợn C.tritaeniorhynchus Não tử thi

Não chim, cò và những loài Nước não tuỷ

muỗi nghi ngờ Máu bệnh nhân

Chuột Chuột liệt Tế bào bị huỷ hoại Phát hiện genom

không liệt sau 4 ngày CPE(+) hoặc CPE(-) của virut bằng phản

Sau 3 lần tiêm truyền ứng chuỗi Polymeraza

Tiêm truyền Chuyển tiếp trên tế bào phiên mã ngược

Kháng thể đơn dòng với ELISA SANDWICH

Hình 1.5: Sơ đồ phân lập và định loại virut

1.4.2.3 Chẩn đoán huyết thanh

Trong chẩn đoán huyết thanh học có nhiều phương pháp- các phương pháp cổ điển như ngăn ngưng kết hồng cầu (HI), kết hợp bổ thể (CF), phản ứng trung hoà trên chuột Thập kỷ 80 và 90 của thế kỷ trước các kỹ thuật được sử dụng nhiều là IF, ELISA, PRNT

MAC-ELISA: WHO đã công nhận kỹ thuật MAC-ELISA là kỹ thuật

chuẩn thức trong chẩn đoán VNNB Kỹ thuật MAC-ELISA (IgM antibody capture ELISA) là kỹ thuật ELISA tóm bắt kháng thể IgM Chỉ trong trường hợp nhiễm virut vào hệ thần kinh trung ương làm thay đổi tính thấm của hàng rào máu não, IgM mới vượt qua để làm nhiệm vụ bảo vệ hệ thống thần kinh trung ương Vì vậy, việc phát hiện kháng thể IgM kháng virut VNNB trong mẫu dịch não tủy là bằng chứng cho thấy sự mới nhiễm virut Đó là lý do khi phát hiện IgM kháng virut VNNB trong dịch não tủy được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán nhiễm virut VNNB [30, 31] Kỹ thuật ELISA phát hiện IgM trong chẩn đoán huyết thanh học được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán bệnh VNNB Kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể chẩn đoán phân biệt được với sự nhiễm các virut trong cùng một họ Chính vì vậy kĩ thuật này đã được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán xác định các virut Arbo [9, 10]

Ngăn ngưng kết hồng cầu: Là kỹ thuật cổ điển để thực hiện đối với những

phòng thí nghiệm không có đủ điều kiện, cần phải lấy máu 2 lần để tìm động lực kháng thể Nhược điểm của phương pháp này là miễn dịch chéo với các Flavivirus khác

Kết hợp bổ thể: Kỹ thuật này có độ đặc hiệu trung bình, kháng thể kết hợp

bổ thể thường xuất hiện muộn, phản ứng này bổ xung cho HI

Miễn dịch huỳnh quang: Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

thường dùng kỹ thuật này để phát hiện virut trong mẫu thử có nhiễm virut Phát hiện được nhanh, độ đặc hiệu cao nhưng đòi hỏi trang thiết bị và sinh phẩm

Phản ứng trung hoà:

Là phản ứng đặc hiệu nhất dùng để chẩn đoán huyết thanh học Arbo virut Thông thường người ta thường dùng kỹ thuật trung hoà giảm đám hoại tử trên tế bào nuôi một lớp Tuy nhiên có thể sử dụng kỹ thuật trung hoà trên động vật thí nghiệm đặc biệt là kỹ thuật trung hoà trên chuột

Kháng thể trung hoà nói chung được tăng dần lên ngay từ những ngày đầu của bệnh đỉnh cao sau hai tuần sau đó giảm dần và kéo dài nhiều năm

Độ nhạy cảm của phản ứng tương đương thử nghiệm HI và IF nhưng tính đặc hiệu cao

Tóm lại: Các thử nghiệm để chẩn đoán virut VNNB rất phong phú, trong thực tế tuỳ từng mục đích, điều kiện mà ta có thể lựa chọn thử nghiệm nào cho thích hợp

và hoại tử, viêm thực bào thần kinh, các hạch thần kinh đệm và viêm quanh mạch Những biến đổi này xảy ra ở chất xám và ảnh hưởng trước tiên lên não trung gian, não giữa và các cấu trúc não Có thể có sự phá huỷ các tế bào Purkije của tiểu não Hàng loạt những biến đổi bệnh lý ở các mô ngoài thần kinh cũng được nhận thấy gồm sự tăng sản các trung tâm điểm hệ thống hạch bạch huyết, viêm cơ tim mô kẽ, sưng và thay đổi albumin ở các tế bào Kupffer ở gan, viêm phổi và xuất huyết ở thận Khi nghiên cứu các trường hợp tử vong người ta thấy lượng virut cao nhất ở trong các tế bào thần kinh vùng đồi thị và thân não

Nhiễm virut qua nhau thai ở lợn dẫn đến kết quả sẩy thai và đẻ non, thai

bị sẩy có những tổn thương ở não Virut VNNB cũng làm giảm và vô tinh hoàn

ở lợn đực Những thay đổi bệnh lý của tổ chức gồm viêm mào tinh hoàn, ngừng sinh tinh dịch và viêm bao tinh hoàn Nhiễm virut qua nhau thai ở người cũng dẫn đến kết quả sẩy thai và phân lập được virut từ thai nhi Tiêm phúc mạc cho chuột chửa cũng truyền virut cho chuột bào thai và thường dẫn đến sẩy thai

Trong bệnh VNNB có nhiều trường hợp nhiễm trùng ẩn, nhiều người bị nhiễm virut mà không mắc bệnh Người ta cho rằng các yếu tố sau ảnh hưởng đến khả năng nhiễm virut và khả năng gây bệnh:

- Đường truyền virut bởi vectơ muỗi, nghĩa là virut được truyền vào máu rồi tới hệ thần kinh trung ương hay vào các tổ chức dưới da mà ở đó chúng được nhân lên trước khi vào mạch máu

- Số lượng virut được truyền do muỗi

- Sự khác nhau về khả năng đề kháng của mỗi người liên quan đến lứa tuổi mà ảnh hưởng đến việc sinh interferon hoặc kháng thể

1.6 Văcxin viêm não Nhật Bản

1.6.1 Những khía cạnh chung của phương pháp tiêm phòng bằng văcxin

Cơ thể sống có nhiều cơ chế bảo vệ chống nhiễm trùng trong đó quan trọng nhất là miễn dịch dịch thể có được do các kháng thể và miễn dịch qua trung gian tế bào do các tế bào lympho phụ thuộc tuyến ức được hoạt hoá Hai

cơ chế bảo vệ chống lại vi sinh vật này tác động bằng hai cách khác nhau

Cơ thể sống có những quần thể tế bào lympho, một số ở trong máu ngoại

vi, số khác cư trú trong các hạch bạch huyết, lách, tuyến ức, hoặc trong các tổ chức khác nhau Chúng được phân loại thành 2 nhóm: lympho bào B và lympho bào T

Trước tiên các tế bào nguồn từ tuỷ xương di cư đến tuyến ức, chúng được "gia công" và trở nên có thẩm quyền miễn dịch, sau đó các tế bào lympho

T chín đi vào máu rồi cũng cư ngụ tại các vùng phụ thuộc tuyến ức của lách và

hạch Các tế bào này được gọi là lympho bào phụ thuộc tuyến ức hay tế bào lympho T, chúng có vai trò chủ yếu trong đáp ứng qua miễn dịch trung gian tế bào Nhóm lympho bào B cũng được biệt hoá từ tế bào nguồn Trước tiên các tế bào nguồn được biệt hoá thành tiền lympho bào B Tiền lympho bào B được biệt hoá thành lympho B chưa chín, sau đó lympho B chưa chín được biệt hoá thành lympho B chín, các lympho bào B chín sẽ biến thành các tế bào plasma là nơi sản xuất và tiết ra các kháng thể Diễn biến của quá trình này phụ thuộc vào sự kích thích của kháng nguyên và sự hợp tác của các lympho bào T hỗ trợ Các kháng nguyên sau khi vào cơ thể sẽ chọn lọc và gắn với các lympho bào B chín

để có những thụ thể thích hợp Việc kháng nguyên gắn với lympho bào B là một trong những điều kiện cơ bản cho sự phát triển một đáp ứng miễn dịch

Các kháng thể được chia thành nhiều lớp, đó là IgM, IgG, IgA, IgD và IgE dựa theo cấu trúc phân tử của chúng IgG và IgM là các kháng thể phổ biến nhất tuần hoàn trong máu, trong khi đó các phân tử IgA thường được tạo thành ở ruột, đường hô hấp và chỉ có một lượng rất nhỏ trong máu

Sau lần tiếp xúc đầu tiên với một kháng nguyên (do nhiễm khuẩn hoặc tiêm chủng), cơ thể có phản ứng lần thứ nhất để hình thành kháng thể Đó là một đáp ứng hạn chế, cường độ yếu và ngắn hạn (hình 1.6) Kháng thể xuất hiện trong máu hầu hết gồm IgM và IgG Phân tử IgM được tổng hợp sớm và sau đó mất đi, trong khi phân tử IgG tồn tại trong máu một thời gian khá dài Trong đáp ứng lần thứ nhất này, các tâm điểm mầm phát triển thành các nhóm lympho bào khu trú trong tổ chức lympho (gọi là các nang lympho), trong khi đó các tế bào plasma gia tăng ở tiếp điểm vỏ - tuỷ và trong các giây tuỷ Trong lần tiếp xúc sau với kháng nguyên, thì cơ thể có đáp ứng lần thứ 2 ; kháng nguyên sẽ khu trú trong các tâm điểm mầm và trong vùng tuỷ của các hạch lympho, và các tế bào plasma được gia tăng phát triển mạnh mẽ Đáp ứng lần thứ 2 này mạnh hơn đáp ứng lần thứ nhất rất nhiều, và kháng thể có thể được hình thành liên tục trong nhiều tháng hoặc trong nhiều năm liền Đáp ứng lần thứ 2 chủ yếu là IgG Các IgM cũng được hình thành, nhưng rất ít và trong thời gian rất ngắn Người ta

cho rằng, trong đáp ứng lần thứ 2 rất quan trọng này, có sự kiện "ký ức miễn dịch" do vai trò của các lympho bào nhỏ [21]

Đáp ứng miễn dịch lần đầu Đáp ứng miễn dịch lần 2

Nhiễm lần đầu Nhiễm lần 2

Hình 1.6: Đáp ứng miễn dịch sau nhiễm virut

Trong nhiều bệnh nhiễm trùng do virut đáp ứng miễn dịch qua trung gian

tế bào cùng với đáp ứng miễn dịch dịch thể đóng vai trò chủ yếu trung hoà hết virut và dẫn đến khỏi bệnh Vì vậy văcxin dự phòng phải có đủ công hiệu nghĩa

là có khả năng gây đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào

1.6.2 Kháng nguyên bảo vệ và văcxin

Vi sinh vật, cả vi khuẩn và virut chứa nhiều loại kháng nguyên mà gây tạo các kháng thể tương ứng Tuy nhiên không phải tất cả các kháng nguyên đều liên quan với sự sinh miễn dịch và phòng ngừa bệnh Thường chỉ có 1 đến 2 kháng nguyên được coi là thích hợp với khả năng gây bệnh của vi sinh vật mà bị trung hoà bởi kháng thể Các kháng nguyên này gọi là kháng nguyên bảo vệ

Kháng nguyên bảo vệ là các kháng nguyên được tạo thành ở cấu trúc bề mặt của vi sinh vật gây bệnh Các kháng nguyên này là vị trí ảnh hưởng qua lại giữa

vi sinh vật với các tế bào chủ, là nơi tiếp xúc đầu tiên với tế bào chủ Khái niệm kháng nguyên bảo vệ có liên quan mật thiết với sự phát triển và sản xuất văcxin Văcxin được sản xuất từ độc tố, vi khuẩn hay virut phải chứa các kháng nguyên bảo

vệ Khi tiêm chủng các kháng nguyên này gây tạo các kháng thể bảo vệ, mà đóng vai trò chính trong bảo vệ cơ thể chống lại các vi sinh vật gây bệnh [20]

Văcxin phải thật sự có hiệu lực bảo vệ cơ thể chống lại các nhiễm khuẩn đồng thời không gây các phản ứng có hại cho cơ thể Văcxin bị nhiễm trùng có thể gây những rối loạn sau khi tiêm ít lâu hoặc trở thành những dị ứng nguyên Văcxin cũng phải được loại các phần độc khỏi phức hợp kháng nguyên Cuối cùng nếu chính kháng nguyên bảo vệ lại là độc tố thì phải khử độc

1.6.3 Ý nghĩa và lịch sử phát triển của văcxin VNNB

Người ta cho rằng có 3 cách phòng bệnh VNNB: tiêu diệt vectơ muỗi, tiêm phòng cho lợn là ổ chứa virut VNNB và tiêm phòng cho người

Vấn đề phòng bệnh bằng diệt vectơ thực hiện rất khó khăn Muỗi Culex sống trong các ruộng lúa, ao hồ, trên một diện tích rộng khó diệt

Ý tưởng tiêm phòng cho lợn có ý nghĩa về mặt lý thuyết để cắt nguồn truyền bệnh nhưng không thể thực hiện được trên thực tế Một trong những khó khăn đó là tìm được thời gian thích hợp để tiêm phòng: sau 4 tháng tuổi lợn mới hết kháng thể mẹ truyền mà 7 -8 tháng đã bị mổ thịt, do đó khoảng cách còn lại

để tiêm văcxin rất ngắn Vì vậy văcxin phòng bệnh cho người là cần thiết và là biện pháp tích cực nhất để ngăn ngừa bệnh VNNB trong giai đoạn hiện nay

Việc nghiên cứu văcxin VNNB đã được bắt đầu từ chiến tranh thế giới thứ II Trước tiên văcxin được thử nghiệm thực địa trên ngựa vì ngựa cũng bị mắc bệnh nghiêm trọng như người Bệnh VNNB cũng lưu hành ở ngựa trong một thời gian dài Người ta đã thấy văcxin có hiệu quả bảo vệ đáng kể cho ngựa trong một vụ dịch ở Nhật Bản năm 1948 - 1949 Trên cơ sở những thành công thực địa, văcxin VNNB sản xuất trên não chuột đã được chính phủ Nhật Bản

cho phép sản xuất từ năm 1954 Văcxin này chứa tất cả các thành phần của não, hàm lượng protein trong văcxin cao nên dễ gây phản ứng phụ nghiêm trọng và nhiều nhà nghiên cứu ở Nhật Bản đã dành những cố gắng lớn để nâng cao hiệu lực của văcxin và loại các dị ứng nguyên khỏi văcxin [35]

Năm 1968, Takaku và cộng tác thông báo một phương pháp hoá lý để tinh chế văcxin VNNB bằng ứng dụng siêu ly tâm [55] Phương pháp này được coi là tiên tiến nhất để tinh chế văcxin VNNB ở quy mô lớn Văcxin này dùng cho người rất an toàn Ở Nhật Bản, văcxin do Viện BiKen sản xuất

và được tinh chế theo phương pháp này đã được dùng trong nhiều năm ở nhiều nước và mang lại hiệu quả rất lớn Đến nay qua nhiều năm nghiên cứu

và theo dõi người ta thấy rằng văcxin VNNB sản xuất trên não chuột có độ tinh khiết cao rất an toàn, ngay cả khi tiêm nhắc lại [20]

Năm 1990, sau khi chuyển giao công nghệ sản xuất văcxin VNNB trên não chuột của Viện BiKen, Việt Nam cũng đã thành công trong việc sản xuất văcxin VNNB Năm 1992, Bộ Y tế cho phép thử nghiệm lâm sàng văcxin của Việt Nam trên người tình nguyện song song với nhóm tiêm văcxin Biken, kết quả cho thấy số trẻ em được tiêm cả hai loại văcxin này đều có đáp ứng kháng thể 100%, trong đó có cả số trẻ trước khi tiêm văcxin

đã có kháng thể kháng virut VNNB (+) và số kháng thể (-) Số trẻ em có kháng thể kháng VNNB (-) thì phản ứng sinh miễn dịch mạnh hơn và động lực kháng thể tăng rất cao [3] Trên cơ sở đã tự sản xuất được văcxin VNNB với chất lượng ngang bằng tiêu chuẩn Nhật Bản, Bộ Y tế đã quyết định đưa văcxin VNNB vào CTTCMR từ năm 1997 Cho đến nay, ở miền Bắc số trẻ

em 1-5 tuổi đã được tiêm chủng miễn phí 200/300 huyện của 29 tỉnh phía Bắc Nhờ đó mà khi xác định căn nguyên VNNB bằng phát hiện IgM đặc hiệu kháng virut VNNB trong số mắc hội chứng não cấp do virut đã giảm hơn 50%, góp phần bảo vệ sức khoẻ cho nhân dân, đặc biệt là trẻ em và giúp cho ngành Y học dự phòng của nước nhà ngày càng vững mạnh

1.6.4 Hiệu lực của văcxin

Năm 1965, văcxin VNNB đã dược thử nghiệm trên thực địa ở Đài Loan với quy mô lớn gồm 400.000 người, trong đó có 134.000 trẻ em từ 3 đến 7 tuổi [36] Theo dõi chặt chẽ các trường hợp được tiêm văcxin và nhóm đối chứng người ta thấy tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm được gây miễn dịch bằng 2 liều cơ bản gần bằng 20% so với nhóm đối chứng Hiệu lực của văcxin được tính là gần 81% Vậy đây là một bằng chứng có giá trị để thừa nhận hiệu lực của văcxin VNNB dùng cho người Từ đó hiệu lực của văcxin thử nghiệm trên thực địa là 81% này được quy định là tiêu chuẩn tối thiểu trong Kiểm định Quốc gia đối với văcxin VNNB Phương pháp đánh giá công hiệu của văcxin thử nghiệm trên thực địa rồi so sánh tỷ lệ mắc bệnh giữa các nhóm được tiêm văcxin và nhóm đối chứng cũng được thử nghiệm ở các vùng lưu hành dịch ở Nhật Bản và một số nước khác Ở Việt Nam, văcxin VNNB của Viện BiKen - Nhật Bản đã được thử nghiệm công hiệu trên thực địa ở huyện Đông Anh, ngoại thành Hà Nội là nơi lưu hành bệnh VNNB Kết quả thử nghiệm trên 27.700 trẻ em từ 3 tháng đến 5 tuổi cho thấy văcxin có hiệu quả bảo vệ rõ rệt (85,7%) Số trường hợp bị mắc bệnh VNNB xẩy ra hầu hết ở nhóm không được tiêm văcxin [18]

Ngày nay, hiệu lực văcxin còn được đánh giá bằng phương pháp tìm đáp ứng kháng thể ở những người được tiêm văcxin Phương pháp này giản tiện hơn việc giám sát tỷ lệ mắc bệnh nhưng nếu tiến hành ở vùng có lưu hành dịch việc đánh giá kết quả sẽ khó khăn vì nhiễm virut VNNB tự nhiên có thể làm thay đổi đáp ứng kháng thể Kỹ thuật trung hoà giảm đám hoại tử trên tế bào phôi gà, tế bào BHK 21 một lớp là phương pháp thích hợp nhất để tìm đáp ứng kháng thể Bằng thực nghiệm người ta đã chứng minh được rằng chuột nhắt trắng giống Swiss được gây miễn dịch có hiệu giá kháng thể trung hoà lớn hơn 1: 10 đã không bị mắc bệnh sau khi được thử thách với liều virut VNNB bằng 104 MLD

Từ khi Takahashi thông báo rằng hiệu giá tối đa của virut VNNB được truyền cho người hoặc động vật do một lần muỗi đốt là khoảng 104 MLD thì người ta

cho rằng người được tiêm văcxin có khả năng bảo vệ nếu có kháng thể trung hoà trong máu lớn hơn 1: 10 [20]

Trẻ em được tiêm 1 liều văcxin thì có khoảng 50% có hiệu giá kháng thể trung hoà lớn hơn 1: 10, còn nếu được tiêm 2 liều cách nhau 1 tháng thì có khoảng 80% có hiệu giá kháng thể trung hoà lớn hơn 1: 10 Công hiệu này cũng được quy định là tiêu chuẩn tối thiểu đối với văcxin VNNB hiện nay

1.6.5 Thời gian miễn dịch

Nói chung hiệu quả miễn dịch khi tiêm văcxin VNNB bằng 2 liều cơ bản không được quá 1 năm Vì vậy sau 1 năm phải tiêm nhắc lại Kanamitsu và cộng tác đã chứng minh rằng hiệu giá trung bình của kháng thể trung hoà duy trì ở mức lớn hơn 1: 10 được tới 3 năm sau khi tiêm nhắc lại lần đầu [38] Trên cơ sở

đó người ta cho rằng để việc tiêm phòng có hiệu quả cần tuân theo chỉ dẫn như sau: tiêm 2 liều cơ bản cách nhau 1 đến 2 tuần, sau 1 năm tiêm nhắc lại, rồi sau

đó cứ 3 đến 4 năm lại tiêm nhắc lại 1 lần

Hình 1.7: Nồng độ kháng thể trung hoà sau miễn dịch cơ bản và nhắc lại ở

người khi tiêm văcxin VNNB [46]

1.7 Các loại văcxin VNNB sử dụng trên thế giới [45] [60]

1.7.1 Văcxin bất hoạt: có 3 dạng hiện nay được sử dụng trên thế giới:

- Văcxin tinh chế từ não chuột chủng Nakayama-NIH hoặc Beijing 1 (P-1)

- Văcxin tinh chế từ tế bào thận chuột đất vàng tiên phát (PHK), chủng

Beijing 3 (P-3)

-Văcxin tinh chế từ tế bào Vero sử dụng chủng Beijing 1 hoặc SA-14-14-2

tất cả các chủng nói trên đều thuộc genotyp 3

1.7.2.Văcxin sống giảm độc lực: sản xuất trên tế bào PHK chủng SA-14-14-2 1.7.3 Văcxin thế hệ 3: sử dụng công nghệ tái tổ hợp AND từ protein kháng nguyên E hiện đang được nghiên cứu, chưa có công bố về thử nghiệm lâm sàng

1.8 Văcxin VNNB bất hoạt sản xuất từ não chuột [64]

1.8.1 Định nghĩa: là sản phẩm dạng lỏng hoặc đông khô được tinh chế từ não

chuột đã được gây nhiễm virut và được bất hoạt bằng phương pháp thích hợp

1.8.2.Chủng virut: Việc sản xuất văcxin VNNB phải sử dụng hệ thống chủng

virut Cơ quan kiểm định Quốc gia nên xác định số lần cấy chuyển từ chủng virut gốc giống Chủng virut giống nên giữ ở dạng đông khô hoặc đông băng ( từ -20oC đến -60oC)

1.8.3.Chuột cho sản xuất văcxin: Chuột được sử dụng cho virut VNNB nhân

lên trên não phải dưới 5 tuần tuổi và không có dấu hiệu bệnh lý

1.8.4 Sản xuất văcxin: Não chuột được tiêm chủng virut sản xuất Sau đó tiến hành

gặt não khi chuột có dấu hiệu liệt Não chuột được nghiền đồng nhất trong môi trường thích hợp và được tinh chế, bất hoạt bằng phương pháp hóa lý thích hợp

1.8.5 Kiểm định văcxin: Phải được thực hiện trong từng loạt sản xuất và ở

từng công đoạn (từ nguyên liệu đầu đến bán thành phẩm và thành phẩm cuối cùng).Việc đảm bảo chất lượng văcxin là một công việc phức tạp bắt đầu từ

công việc kiểm định nguồn nguyên liệu đầu, giám sát quy trình sản xuất và tuân theo thực hành sản xuất đúng đắn (GMP) một cách nghiêm khắc để xuất xưởng văcxin có chất lượng tốt Việc kiểm tra đánh giá chất lượng văcxin đòi hỏi tính khách quan và chính xác với đội ngũ cán bộ trung thực, có tay nghề và trình độ chuyên môn Phải tuân thủ chặt chẽ các quy trình, các phương pháp, kỹ thuật của tổ chức Y tế thế giới và kiểm định Quốc gia quy định, nhằm đảm bảo độ chính xác cao [58]

Chất lượng của văcxin thành phẩm được đánh giá ở các khâu sau: đánh giá ở phòng thí nghiệm, đánh giá lâm sàng và đánh giá thực địa Đánh giá phòng thí nghiệm là rất quan trọng, bao gồm các thử nghiệm về các mặt hoá học (nhận dạng, tính chất hoá - lý), và sinh vật học (vô khuẩn, an toàn, công hiệu và chất gây sốt) Các thử nghiệm này được thực hiện theo thường quy thống nhất toàn cầu hoặc trong một nước [63]

• Kiểm tra sinh vật học

- Vô khuẩn: Kiểm tra vô khuẩn là để xác định sự vô khuẩn của văcxin Văcxin phải không có tạp khuẩn hoặc nấm phát triển trên môi trường kiểm tra trong suốt thời gian theo dõi [64]

- An toàn trên chuột: văcxin phải được tiêm trên chuột nhắt và chuột lang sau đó theo dõi chúng sau 7 ngày hoặc 14 ngày Yêu cầu chuột phải tăng cân, không có dấu hiệu bệnh lý [1, 64]

- Công hiệu: Mục đích của kiểm tra công hiệu là xác định khả năng gây miễn dịch của văcxin Hiệu lực của văcxin được đảm bảo bởi các thử nghiệm được thực hiện trong từng giai đoạn của quá trình sản xuất và trên sản phẩm cuối cùng Đối với văcxin VNNB bất hoạt công hiệu được xác định bằng phương pháp trung hoà giảm đám hoại tử trên tế bào BHK-21[1, 64]

- Chất gây sốt: Thử nghiệm chất gây sốt được thực hiện để phát hiện các thành phần gây sốt có trong sản phẩm Chất gây sốt của văcxin được xác định gián tiếp qua thí nghiệm đo thân nhiệt của thỏ thí nghiệm trước và sau khi tiêm văcxin [1]

• Kiểm tra lý - hoá học

Đối với văcxin VNNB bất hoạt cần kiểm tra những mặt sau đây:

- Trạng thái bên ngoài: màu sắc, độ đục, thể tích văcxin, nhãn

- Độ pH của văcxin

- Hàm lượng protein toàn phần, formaldehyt, thimerosal [1, 64]

Chương II ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Văcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt từ não chuột chủng Beijing-1 sản xuất tại công ty văcxin và sinh phẩm số 1

- Văcxin mẫu chuẩn Nhật Bản EJP034A

2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

* Địa điểm nghiên cứu:

Phòng kiểm định văcxin, Công ty văcxin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH)

* Thời gian nghiên cứu

- Văcxin mẫu chuẩn Nhật Bản EJP034A

- Chủng virut VNNB Beijing-1 NIH, Nhật Bản

- Tế bào thận chuột đất vàng (BHK- 21)

2.2.2.2 Môi trường và hoá chất

- Môi trường TSB ( Mỹ)

- Môi trường FTM (Mỹ)

- Môi trường TCA (Mỹ)

- Dung dịch PBS pH = 7,4 chứa 0,02% gelatin (Gibco)

- Môi trường MEM× 2 (Sigma)

- Dung dịch NaHCO3 7% (Sigma)

- Dung dịch Agarose 2% (Gibco)

- Dung dịch Agar Noble 2% (Gibco)

- Dung dịch đỏ trung tính 0,25% (Sigma)

- Fetal Bovine Serum (FBS) (Sigma)

- Dung dịch đồng kiềm (Sigma)

- Thuốc thử Folin Ciocaltor (Sigma)

- Albumin bò tinh khiết (Sigma)

- Axit tricloracetic (Gibco)

- Kháng sinh: Ampicillin, Kanamycin, Erythromycin,

2.2.2.3 Vật tư, trang thiết bị

- Tube thuỷ tinh φ 14 (Việt Nam)

- Chai thuỷ tinh 100ml, 250ml, 500ml (Schotte- Đức)

- Ống đong 100ml, 250ml, 500ml (Schotte- Đức)

- Pipet nhựa loại 2ml, 10ml & 25ml Kimble- Mỹ)

- Đầu côn 300 µl, 1000 µl (Labosystem - Mỹ)

- Pipetman200µl,1000µl (Gilson)

- Pipette Aid (Drummond Scient Co - Mỹ)

- Giấy Parafilm (Laboratory film- Anh )

- Giấy thấm (Việt Nam)

- Máy trộn – KIKA (Malaysia)

- Tủ lạnh (Mitsubishi - Nhật Bản)

- Tủ ấm CO2 (Jouan- Pháp)

- Tủ ẩm 37°C (Sanofi-Pháp)

- Máy đo pH (Metter Toledo/MP220- Thuỵ sĩ)

- Cân phân tích (Metter Toledo/MP220- Thuỵ sĩ)

- Máy khuấy từ (KIKA/MIDI MR1- Đức )

- Máy ly tâm lạnh (Kubota - Nhật Bản)

- Hotte Laminaire (lọc thổi không khí vô trùng) (Pháp)

- Găng tay, mũ, khẩu trang vô trùng (Việt Nam)

- Thùng nitơ lỏng (giữ giống virut và tế bào) (Pháp)

- Lò sấy khô (Mỹ)

- Lò hấp ướt (Pháp)

- Và các thiết bị khác

2.3 Phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu

* Thiết kế nghiên cứu: tiến hành theo phương pháp nghiên cứu phòng thí nghiệm

* Cỡ mẫu nghiên cứu:

Tiến hành thử nghiệm trên 6 loạt văcxin thành phẩm

* Biến số và chỉ số nghiên cứu:

Hàm lượng TCA-protein, Hàm lượng Thimerosal, Hàm lượng Formaldehyd

Hiệu giá kháng thể trung hoà

2.3.2 Kiểm tra tính an toàn của vắc xin VNNB

2.3.2.1 Kiểm tra an toàn chung (Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009,

SOP: KĐQG-21, 2007, NICVB)

* Thử nghiệm trên chuột lang:

Chọn chuột lang 150 – 300 g khoẻ mạnh, tăng trọng bình thường Thời gian thích nghi điều kiện thử nghiệm (lồng chuồng, nhiệt độ và độ ẩm phòng, thức ăn ) ít nhất 5 ngày Mỗi mẫu thử nghiệm dùng 2 chuột lang Tiêm 5 ml vào đường phúc mạc cho mỗi chuột Theo dõi trọng lượng hàng ngày trong 7 ngày Yêu cầu chất lượng sau tiêm chuột khoẻ mạnh, bình thường, tăng trọng

Hình 2.1: Tiêm chuột lang trong thử nghiệm an toàn chung ở NICVB

Hình 2.2: Theo dõi trọng lượng chuột lang trong thử nghiệm

an toàn chung ở NICVB

* Thử nghiệm trên chuột nhắt:

Chọn chuột nhắt trắng 5 tuần tuổi, khoẻ mạnh, bình thường Thời gian thích nghi điều kiện thử nghiệm ( như trên chuột lang) ít nhất 5 ngày Mỗi mẫu thử nghiệm dùng 2 chuột nhắt Liều tiêm 0,5 ml vào đường phúc mạc cho mỗi chuột Theo dõi ít nhất 7 ngày Hàng ngày theo dõi trọng lượng và tình trạng sức khoẻ của chuột Yêu cầu chất lượng sau tiêm 7 ngày chuột khoẻ mạnh, bình thường và tăng trọng

Hình 2.3: Tiêm phúc mạc chuột nhắt trắng trong thử nghiệm an toàn chung

Hình 2.4: Theo dõi trọng lượng chuột nhắt trong thử nghiệm

an toàn chung ở NICVB

2.3.2.2 Kiểm tra chất gây sốt (Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP:

KĐQG-22, 2007, NICVB)

Thử nghiệm chất gây sốt là phương pháp sinh học dùng để đánh giá tính chất gây sốt của văcxin dựa trên sự tăng thân nhiệt của thỏ trước và sau khi tiêm vào tĩnh mạch tai thỏ dung dịch mẫu thử

Văcxin thành phẩm được kiểm tra chất gây sốt trên thỏ Đây là phương pháp nhậy nhất để phát hiện yếu tố gây sốt trong văcxin

• Thử nghiệm thăm dò

1 ngày đến 3 ngày trước khi tiến hành tiêm văcxin, cần kiểm tra sơ bộ về tính nhậy cảm cho các thỏ thí nghiệm bằng cách tiêm vào tĩnh mạch 10ml/kg trọng lượng nước muối sinh lý 0,9% không chứa chất gây sốt Ghi nhiệt độ trước tiêm

và tiếp tục trong vòng 3 giờ sau khi tiêm dung dịch nước muối sinh lý Nếu thỏ nào có nhiệt độ giao động so với nhiệt độ ban đầu > 0,6 oC sẽ bị loại, không dùng đưa vào thử nghiệm chính