Nghiên cứu thể tích môi trường thích hợp để kiểm tra vô trùng một số vắc xin tại Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế

ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, trên thế giới cũng như trên thị trường Việt Nam có rất nhiều loại vắc xin. Trước khi sử dụng trên người, các vắc xin phải được kiểm tra nghiêm ngặt trong phòng thí nghiệm về công hiệu, vô trùng và tính an toàn trên động vật thí nghiệm. Để kiểm tra tính vô trùng của vắc xin, người ta cho vắc xin vào các môi trường nuôi cấy phù hợp để xem có vi khuẩn hoặc nấm mọc hay không. Môi trường thường dùng là môi trường lỏng thioglycolat (Fluid thioglycollate medium: FTM) và canh thang TSB (Tryptic soy broth). Môi trường lỏng thioglycolat phát hiện vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí; canh thang TSB phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm trong vắc xin [6], [43], [58]. Vấn đề đặt ra là trong vắc xin có thể chứa các chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm (chất ức chế), ví dụ: thimerosal, 2 phenoxy ethanol, phenol,...Trong những trường hợp đó liệu vi khuẩn và nấm có mọc được trong môi trường kiểm tra tính vô trùng của vắc xin hay không? Để kiểm tra xem môi trường có đảm bảo cho vi khuẩn và nấm mọc được khi vắc xin chứa các chất ức chế hay không, phải thực hiện thử nghiệm kiểm tra khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm khi có mặt của vắc xin, gọi là thử nghiệm thẩm định hay thử nghiệm ức chế (validation test, bacteriostasis and fungistasis test) [66], [67], [69], [75]. Thử nghiệm này được thực hiện bằng cách cho chính vắc xin và chủng mẫu vào môi trường, sau đó theo dõi sự phát triển của chủng. Nếu chủng mẫu mọc trong tất cả các ống môi trường cấy vắc xin thì điều đó khẳng định rằng thử nghiệm vô trùng có khả năng phát hiện được các trường hợp vắc xin bị nhiễm trùng. Nếu chủng mẫu không mọc được trong các ống môi trường cấy vắc xin thì qui trình thực hiện thử nghiệm vô trùng cần phải thay đổi. Tổ chức Y tế thế giới khuyến cáo: khi kiểm tra vô trùng bằng phương pháp cấy trực tiếp, có thể loại bỏ ảnh hưởng của các chất ức chế bằng cách tăng thể tích môi trường [75]. Tuy nhiên việc này chưa được thực hiện tại Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (KĐQG). Thử nghiệm thẩm định được yêu cầu thực hiện cho từng vắc xin [63]. Vì mỗi vắc xin có chứa các chất ức chế khác nhau với nồng độ khác nhau. Do đó, cần có một qui trình chung để xác định thể tích môi trường thích hợp cho tất cả các vắc xin. Xuất phát từ nhu cầu trên chúng tôi tiến hành đề tài "Nghiên cứu thể tích môi trường thích hợp để kiểm tra vô trùng một số vắc xin tại Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế" với mục tiêu: 1. Tìm thể tích môi trường thích hợp cho 4 vắc xin được lựa chọn nghiên cứu, cụ thể: - Vắc xin bại liệt uống (OPV) do Trung tâm nghiên cứu, sản xuất vắc xin và sinh phẩm Y tế (POLYVAC) sản xuất. - Vắc xin BCG (BCG) do Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) sản xuất. - Vắc xin viêm gan B (VGB) do do Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) sản xuất. - Vắc xin viêm não Nhật Bản (VNNB) do VABIOTECH sản xuất. 2. Đề xuất qui trình xác định thể tích môi trường thích hợp để kiểm tra vô trùng vắc xin.

• Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñối với

PGS.TS Lê Văn Phủng, thầy hướng dẫn trực tiếp tôi từ những ngày ñầu của chuyên ngành vi sinh, người có ảnh hưởng lớn nhất ñối với tôi về sự cẩn thận, ý thức trách nhiệm trong công việc

• Tôi xin chân thành cảm ơn :

- Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo Sau ñại học trường Đại học Y Hà Nội,

- Các thầy cô, cán bộ công nhân viên Bộ môn Vi sinh ñã truyền ñạt kiến thức và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập

• Tôi xin gửi lòng biết ơn chân thành tới:

- PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Linh, phó Viện trưởng Viện Kiểm ñịnh Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế;

- Ban Lãnh ñạo, Phòng Kiểm ñịnh chất lượng Công ty Vắc xin và Sinh Phẩm

số 1;

- Ban Lãnh ñạo Trung tâm Nghiên cứu, Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế;

- Khoa Quản lý chất lượng Viện Kiểm Định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế;

- Th.S Nguyễn Thị Vân Anh, KTV Lê Thị Kim Thuỷ, KTV Phạm Thị Thu Phương, chị Nguyễn Thị Ký, anh Đỗ Văn Minh cùng các ñồng nghiệp khác ñã giúp tôi thực hiện thành công luận văn này

• Cuối cùng, tôi bày tỏ tình cảm thân thương và lòng biết ơn ñặc biệt ñối với gia ñình và người thân ñã luôn luôn ở bên cạnh tôi, giúp ñỡ, tạo ñiều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu

Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2010

Nguyễn Thị Kiều

(Bộ sưu tập chủng mẫu của Mỹ) BHB Brain heart broth

(Môi trường canh thang não tim)

CFU: Colony forming unit

(Đơn vị hình thành khuẩn lạc) FTM : Fluid thioglycollate medium

(Môi trường lỏng thioglycolat) GSK Glaxo Smith Kline

(Công ty Glaxo Smith Kline) HEPA High Efficiency Particulate Arresting

(Hệ thống lọc hiệu năng cao) ICH International conference on Hamonisation

(Hội nghị hoà hợp quốc tế)

IVAC: Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế

KĐQG: Viện Kiểm ñịnh Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế

MT: Môi trường

LAL Limulus Amebocytes Lysate

(Phản ứng xác ñịnh nội ñộc tố)

NMSL: Nước muối sinh lý

OPV: Vắc xin bại liệt uống

POLYVAC: Trung tâm nghiên cứu, sản xuất vắc xin và sinh phẩm Y tế

SOP Standard Operating procedure

(Qui trình chuẩn)

TSA: Tryptic soy agar

(Thạch TSA) TSB: Tryptic soy broth

(Canh thang TSB) VABIOTECH: Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1

VGB Vắc xin viêm gan B

Đặt vấn ñề 1

Chương 1 Tổng quan tài liệu

1.1 Vắc xin

1.1.1 Các thành phần trong vắc xin

1.1.2 Các chất ức chế trong vắc xin

1.1.3 Các vắc xin sử dụng trong nghiên cứu

1.1.3.1 BCG

1.1.3.2 OPV

1.1.3.3 Vắc xin viêm gan B

1.1.3.4 Vắc xin viêm não Nhật Bản

1.2 Kiểm ñịnh vắc xin

1.2.1 Kiểm tra vô trùng

1.2.2 Nhận dạng

1.2.3 Xác ñịnh công hiệu

1.2.4 Kiểm tra an toàn chung

1.2.5 Kiểm tra an toàn ñặc hiệu…

1.2.6 Kiểm tra chất gây sốt

1.2.7 Kiểm tra các chỉ tiêu hoá lý

1.3 Thử nghiệm vô trùng

1.3.1 Các phương pháp kiểm tra vô trùng

1.3.2 Điều kiện thực hiện thử nghiệm vô trùng

1.3.3 Vai trò của con người trong thử nghiệm vô trùng

1.3.4 Môi trường dùng trong kiểm tra vô trùng

1.3.5 Các chứng âm, chứng dương của thử nghiệm vô trùng

1.3.6 Việc loại bỏ ảnh hưởng của các chất ức chế

3

3

3

4

5

5

5

6

6

7

8

9

9

10

10

11

12

13

13

15

18

18

21

23

1.4 Quá trình hoàn thiện kỹ thuật kiểm tra vô trùng vắc xin tại Viện Kiểm

ñịnh Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế

1.4.1 Trước năm 2002

1.4.2 Năm 2002-2003

1.4.3 Năm 2004-2005

1.4.4 Từ 2006 ñến nay

1.4.5 Các tồn tại trong thử nghiệm vô trùng tại Viện Kiểm ñịnh Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế

28 28 28 29 29 31 Chương 2: Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.2 Vật liệu

2.2.1 Môi trường, hoá chất

2.2.2 Vắc xin

2.2.3 Chủng mẫu

2.2.4 Trang thiết bị dụng cụ

2.3 Phương pháp nghiên cứu………

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu

2.3.2 Nội dung nghiên cứu

2.3.3 Xác ñịnh thể tích môi trường

2.3.4 Xác ñịnh hàm lượng thimerosal của các loạt vắc xin viêm gan B, viêm não Nhật Bản

2.3.5 Xác ñịnh hàm lượng formaldehyd của các loạt vắc xin viêm gan B, viêm não Nhật Bản

32 32 33 33 33 35 35 36 36 37 37 41 42 Chương 3: Kết quả nghiên cứu

3.1 Kết quả xác ñịnh thể tích môi trường

44

45

3.1.3 Thể tích môi trường thích hợp ñể kiểm tra vô trùng vắc xin viêm gan B 3.1.4 Thể tích môi trường thích hợp ñể kiểm tra vô trùng vắc xin viêm não

Nhật Bản

3.1.5 So sánh tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong FTM và TSB

3.2 Kết quả xác ñịnh hàm lượng thimerosal và formaldehyd

3.2.1 Hàm lượng thimerosal và formaldehyd của vắc xin viêm gan B

3.2.2 Hàm lượng thimerosal và formaldehyd của vắc xin viêm não Nhật Bản 3.3 Qui trình xác ñịnh thể tích môi trường thích hợp ñể kiểm tra vô trùng vắc xin 50 56 60 63 63 65 66 Chương 4: Bàn luận

1 Về thể tích môi trường

2 Nồng ñộ các chất ức chế trong vắc xin viêm gan B, vắc xin viêm não Nhật Bản 3 Qui trình xác ñịnh thể tích môi trường thích hợp ñể kiểm tra vô trùng vắc xin 4 Hạn chế của ñề tài

68 68 75 77 79 Kết luận 80

Kiến nghị Tài liệu tham khảo

Phụ lục

82

Trang

Bảng 1.1: Số lượng vắc xin cần lấy ñể kiểm tra vô trùng

Bảng 1.2: Thể tích VX cần lấy từ mỗi lọ ñể cấy vào mỗi loại MT và thể tích VX cấy vào mỗi ống MT

Bảng 1.3: Giới hạn nhiễm VK và nấm của các cấp ñộ sạch

Bảng 1.4: Giới hạn hạt bụi của các cấp ñộ sạch (hạt/m 3 không khí)

Bảng 1.5: Các chủng mẫu do Dược ñiển Mỹ qui ñịnh

Bảng 1.6: Các chủng mẫu do Dược ñiển châu Âu qui ñịnh

Bảng 1.7: Các chủng mẫu sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.1: Số lượng ống MT cần cho mỗi loạt của từng VX

Bảng 2.2: Số lượng VX sử dụng cho xác ñịnh thể tích MT

Bảng 2.3: Số lượng ống MT của từng chủng mẫu ở mỗi thể tích MT

Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra vô trùng các loạt MT

Bảng 3.2: Kết quả kiểm tra dinh dưỡng các loạt FTM

Bảng 3.3: Kết quả kiểm tra dinh dưỡng các loạt TSB

Bảng 3.4: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy BCG, thể tích 20 mL/ống, loạt VX số 1

Bảng 3.5: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy BCG; thể tích 20 mL/ống; loạt VX số 2, số 3

Bảng 3.6: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy OPV, thể tích 20 mL/ống

Bảng 3.7: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy OPV, thể tích 30 mL/ống, loạt VX số 1

Bảng 3.8: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy OPV; thể tích 30 mL/ống; loạt số 2, số 3

Bảng 3.9: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy VGB, thể tích 20 mL/ống…

15

15

17

17

26

27

27

32

34

39

44

44

44

45

46

47

48

49

50

Bảng 3.12: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong FTM cấy VGB; thể tích 40

mL/ống; loạt VX số 2, số 3

Bảng 3.13: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong TSB cấy VGB

Bảng 3.14: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong TSB cấy VGB, thể tích 80 mL

Bảng 3.15: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy VNNB, thể tích 20 mL/ống Bảng 3.16: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy VNNB, thể tích 30 mL/ống Bảng 3.17: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy VNNB, thể tích 40 mL/ống Bảng 3.18: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy VNNB, thể tích 50 mL/ống Bảng 3.19: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy VNNB, thể tích 60 mL/ống Bảng 3.20: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong FTM cấy VNNB; thể tích 60 mL/ống; loạt VX số 2, số 3

Bảng 3.21: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong TSB cấy VNNB, thể tích 60 mL…

Bảng 3.22: Tỷ lệ mọc của B subtilis trong thử nghiệm ức chế VGB

Bảng 3.23: Tỷ lệ mọc của B subtilis trong thử nghiệm ức chế VNNB

Bảng 3.24: Tỷ lệ mọc của C albicans trong thử nghiệm ức chế VGB

Bảng 3.25: Tỷ lệ mọc của C albicans trong thử nghiệm ức chế VNNB

Bảng 3.26: Tỷ lệ mọc của K rhizophila trong thử nghiệm ức chế VGB……

Bảng 3.27: Tỷ lệ mọc của K rhizophila trong thử nghiệm ức chế VNNB……

Bảng 3.28: Hàm lượng thimerosal và formaldehyd của VGB

Bảng 3.29: Hàm lượng thimerosal và formaldehyd của VNNB……

53

54

55

56

57

57

58

58

59

60

60

61

61

62

62

63

63

65

Hình 1.1: Kiểm tra găng của kỹ thuật viên

Hình 1.2: Môi trường FTM

Hình 1.3: Môi trường TSB

Hình 1.4: Bảng hiện thị máy ñếm hạt bụi

Hình 1.5: Đầu thu mẫu máy ñếm vi khuẩn và nấm

Hình 1.6: Khuẩn lạc C albicans (môi trường TSA)

Hình 1.7: Khuẩn lạc K rhizophila (môi trường TSA)

Hình 1.8: B subtilis mọc làm mất chỉ thị màu FTM…………

Hình 1.9: C albicans mọc trong TSB

Hình 1.10: C albicans mọc trong FTM

17

19

19

31

31

45

45

47

51

51

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, trên thế giới cũng như trên thị trường Việt Nam có rất nhiều loại vắc xin Trước khi sử dụng trên người, các vắc xin phải ñược kiểm tra nghiêm ngặt trong phòng thí nghiệm về công hiệu, vô trùng và tính an toàn trên ñộng vật thí nghiệm

Để kiểm tra tính vô trùng của vắc xin, người ta cho vắc xin vào các môi

trường nuôi cấy phù hợp ñể xem có vi khuẩn hoặc nấm mọc hay không Môi trường thường dùng là môi trường lỏng thioglycolat (Fluid thioglycollate medium: FTM) và canh thang TSB (Tryptic soy broth) Môi trường lỏng thioglycolat phát hiện vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí; canh thang TSB phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm trong vắc xin [6], [43], [58]

Vấn ñề ñặt ra là trong vắc xin có thể chứa các chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm (chất ức chế), ví dụ: thimerosal, 2 phenoxy ethanol, phenol, Trong những trường hợp ñó liệu vi khuẩn và nấm có mọc ñược trong môi trường kiểm tra tính vô trùng của vắc xin hay không?

Để kiểm tra xem môi trường có ñảm bảo cho vi khuẩn và nấm mọc ñược khi vắc xin chứa các chất ức chế hay không, phải thực hiện thử nghiệm

kiểm tra khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm khi có mặt của vắc xin, gọi là thử nghiệm thẩm ñịnh hay thử nghiệm ức chế (validation test, bacteriostasis and fungistasis test) [66], [67], [69], [75] Thử nghiệm này ñược thực hiện bằng cách cho chính vắc xin và chủng mẫu vào môi trường, sau ñó theo dõi sự phát triển của chủng Nếu chủng mẫu mọc trong tất cả các ống môi trường cấy vắc xin thì ñiều ñó khẳng ñịnh rằng thử nghiệm vô trùng có khả năng phát hiện ñược các trường hợp vắc xin bị nhiễm trùng Nếu chủng mẫu không mọc ñược trong các ống môi trường cấy vắc xin thì qui trình thực hiện thử nghiệm vô trùng cần phải thay ñổi Tổ chức Y tế thế giới khuyến

cáo: khi kiểm tra vô trùng bằng phương pháp cấy trực tiếp, có thể loại bỏ ảnh hưởng của các chất ức chế bằng cách tăng thể tích môi trường [75] Tuy nhiên việc này chưa ñược thực hiện tại Viện Kiểm ñịnh Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (KĐQG)

Thử nghiệm thẩm ñịnh ñược yêu cầu thực hiện cho từng vắc xin [63]

Vì mỗi vắc xin có chứa các chất ức chế khác nhau với nồng ñộ khác nhau Do

ñó, cần có một qui trình chung ñể xác ñịnh thể tích môi trường thích hợp cho

tất cả các vắc xin

Xuất phát từ nhu cầu trên chúng tôi tiến hành ñề tài "Nghiên cứu thể tích môi trường thích hợp ñể kiểm tra vô trùng một số vắc xin tại Viện Kiểm

ñịnh Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế" với mục tiêu:

1 Tìm thể tích môi trường thích hợp cho 4 vắc xin ñược lựa chọn nghiên cứu,

cụ thể:

- Vắc xin bại liệt uống (OPV) do Trung tâm nghiên cứu, sản xuất vắc xin và sinh phẩm Y tế (POLYVAC) sản xuất

- Vắc xin BCG (BCG) do Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) sản xuất

- Vắc xin viêm gan B (VGB) do do Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) sản xuất

- Vắc xin viêm não Nhật Bản (VNNB) do VABIOTECH sản xuất

2 Đề xuất qui trình xác ñịnh thể tích môi trường thích hợp ñể kiểm tra vô trùng vắc xin

Tá chất miễn dịch là những yếu tố có trong thành phần của VX và làm tăng ñáp ứng miễn dịch Tá chất làm tăng tính sinh miễn dịch của VX qua ba

cơ chế: Ảnh hưởng lên sự giải phóng và trình diện kháng nguyên, tác ñộng lên các cytokin và tác ñộng lên tế bào trình diện kháng nguyên [45]

Chất ổn ñịnh giúp kháng nguyên ổn ñịnh

Chất bảo quản ngăn ngừa vi khuẩn và nấm phát triển Kháng sinh thường có trong các VX vi rút sống dưới dạng vết, bao gồm neomycin, kanamycin, streptomycin, polymycin B [79]

Ngoài ba thành phần chính trên, trong VX còn có dung môi, các chất

ñệm như NaCl, KH2PO4, Na2HPO4, Dung môi có thể là nước cất, các dịch treo phức tạp như môi trường nuôi cấy hoặc các chất tồn dư trong hệ thống sinh học dùng sản xuất kháng nguyên (ovalbumin của trứng, một số chất trong môi trường nuôi cấy, )

1.1.2 Các chất ức chế trong vắc xin

Các chất ức chế có trong VX bao gồm thimerosal; 2 phenoxy ethanol; phenol; formaldehyd; cloroform; benzethonium chlorid (phemerol); các loại kháng sinh như kanamycin, neomycin, polymyxin B Chúng có mặt trong VX với chủng loại, số lượng, hàm lượng khác nhau

Có VX không chứa một loại chất ức chế nào, VD: BCG, ImBCG của

IVAC; HIBERIX, Infanrix của Glaxo Smith Kline (GSK)

Có VX chỉ chứa một chất ức chế như VX thương hàn Vi (Công ty Vắc xin Đà Lạt), TYPHIM Vi (Sanofi pasteur) chứa phenol; D.T.VAX (Sanofi pasteur) chứa thimerosal;

Có VX chứa hai chất ức chế Thuộc loại này có VX uốn ván (IVAC),

mORCVAX (VABIOTECH) chứa thimerosal và formaldehyd; PENTAXIM

(Sanofi pasteur) chứa formaldehyd và 2 phenoxy ethanol,

Có những VX chứa tới ba hoặc bốn chất ức chế như VGB (VABIOTECH) chứa thimerosal, formaldehyd, neomycin, polymicin; Infanrix Hexa (GSK) chứa formaldehyd, 2 phenoxy ethanol, neomycin, polymicin;

Vai trò của các chất ức chế trong VX cũng khác nhau

Các chất này có thể là chất bảo quản ñược cho vào giai ñoạn cuối của quá trình sản xuất, ví dụ: thimerosal, 2 phenoxy ethanol, benzethonium chlorid, [46]

Các chất này cũng có thể là các chất bất hoạt trong quá trình sản xuất

và sót lại, ví dụ: formaldehyd, cloroform Chúng cũng có thể là các loại kháng sinh, rất phổ biến trong các VX vi rút Chất ức chế cũng có thể từ các hoá chất, môi trường nuôi cấy, dùng trong rất nhiều công ñoạn của quá trình sản xuất mà người ta không thể kiểm soát hay loại bỏ hết ñược, ví dụ: phenol trong OPV

1.1.3 Các vắc xin sử dụng trong nghiên cứu

1.1.3.1 BCG

BCG là chế phẩm dạng ñông khô của chủng Calmette-Guerin giảm ñộc

lực, có nguồn gốc từ Mycobacterium bovis Chủng Calmette-Guerin có ñặc tính miễn dịch học tương tự như chủng gây bệnh lao ở người là M

Tuberculosis, do vậy tiêm BCG sẽ tạo ñược miễn dịch chủ ñộng ñể chống lại

bệnh lao BCG ñược tiêm trong da 82,5 % trẻ sau tiêm 2 tháng xuất hiện loét, nốt loét kéo dài 2 tuần, sau ñó hình thành sẹo [9] BCG sản xuất tại IVAC ñạt yêu cầu về tính ổn ñịnh trong sản xuất và ngày càng tiến bộ [21] VX này có khả năng bảo vệ cao, tỷ lệ mắc lao sau 3 - 4 năm tiêm BCG là 0,43% [22] Nghiên cứu của Bùi Tấn Đợi và cs cũng chỉ ra BCG sản xuất tại IVAC ñạt tiêu chuẩn về ñộ ẩm tồn dư và tỷ lệ ổn ñịnh nhiệt của WHO [10]

BCG không chứa chất bảo quản, không chứa kháng sinh Trong thành phần của BCG, ngoài BCG sống ñông khô, chỉ chứa glutamate natri

1.1.3.2 OPV

OPV là VX tam liên gồm 3 týp poliovius 1, 2 và 3 Đây là VX sống

giảm ñộc lực (Chủng Sabin) sản xuất trên tế bào thận khỉ Macaca mulatta

[13], [14] và ñược ổn ñịnh bằng MgCl2 VX ñạt các tiêu chuẩn Việt Nam và tiêu chuẩn của WHO [74]

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Hiền Thanh [26] cho thấy OPV có thể

ñảm bảo ñược việc bảo vệ thành quả thanh toán bại liệt với tỷ lệ có kháng thể

bảo vệ 3 týp polio là 78%, týp 1 là 95,8%, týp 2 là 96,6%, týp 3 là 82,9%

Trong chương trình tiêm chủng mở rộng hiện nay, OPV ñược dùng 3 liều cho trẻ ñủ 2; 3; 4 tháng tuổi Với phác ñồ này sẽ có hiệu quả 100% phòng bệnh bại liệt [5] Việt Nam ñã công bố thanh toán bại liệt vào năm 2000, nhưng hiện nay trên thế giới vẫn còn một số nước chưa thanh toán ñược bệnh

này nên việc bảo vệ thành quả này cần ñược thực hiện một cách chặt chẽ Các chất ức chế trong OPV bao gồm phenol; kanamycin, neomycin

1.1.3.3 Vắc xin viêm gan B

VGB là VX tái tổ hợp ñầu tiên trên thế giới [49] VGB do Vabiotech sản xuất là VX phòng viêm gan B thế hệ II, ñược sản xuất bằng cách nuôi cấy

tế bào nấm men ñã ñược xử lý bằng công nghệ di truyền có mang gen mã hoá sinh tổng hợp HBsAg, sau ñó ñược tinh chế và bất hoạt bằng kỹ thuật hoá lý: siêu ly tâm, sắc ký cột và bất hoạt bằng formaldehyd HBsAg tinh chế ñược hấp phụ với hydroxyd nhôm, cuối cùng ñược cho thêm thimerosal làm chất bảo quản [31], [32] VX này có tính an toàn cao, ít phản ứng phụ và có tính sinh miễn dịch cao [1] VGB có hai chất ức chế là thimerosal và formaldehyde Thimerosal ñóng vai trò chất bảo quản, formaldehyde là chất bất hoạt trong quá trình sản xuất còn sót lại Tiêu chuẩn ñăng ký hàm lượng thimerosal của VGB là dưới 0,01 %, formaldehyd dưới 0,02 %

1.1.3.4 Vắc xin viêm não Nhật Bản

Bệnh viêm não Nhật Bản là một trong những bệnh thường gặp ở trẻ em Việt Nam, lứa tuổi 1-5 tuổi với tỷ lệ tử vong cao hoặc nếu sống sót ñể lại di chứng nặng nề về thần kinh Việc tiêm VX viêm não Nhật Bản (VNNB) cho trẻ em có ý nghĩa kinh tế và xã hội rất lớn [37] VNNB cũng tạo ñược hiệu giá kháng thể cao [35], có khả năng bảo vệ trẻ em khỏi bệnh viêm não Nhật Bản [36]

VNNB ñược sản xuất tại VABIOTECH theo qui trình công nghệ của Viện BIKEN, trường Đại học Osaka, Nhật Bản VX ñược sản xuất từ não chuột gây nhiễm với VR viêm não Nhật Bản chủng Nakayama NIH Chủng Nakayama này có cùng tính kháng nguyên với các chủng viêm não Nhật Bản phân lập ñược ở não tử thi, ở muỗi trong các vụ dịch viêm não Nhật Bản ở nước ta từ trước tới 1994 [23] Huyền dịch VR ñược xử lý với protamin

sulfat, bất hoạt bằng formaldehyd, cô ñặc bằng siêu lọc và sau cùng tinh chế bằng siêu ly tâm

VX gây ñáp ứng miễn dịch cao trong quần thể dân cư [15]

VNNB có chứa chất bảo quản là thimerosal, ngoài ra còn có chất ức chế khác là formaldehyd Đây là chất bất hoạt trong quá trình sản xuất còn sót lại Tiêu chuẩn ñăng ký hàm lượng thimerosal của VNNB là dưới 0,012 %, của formaldehyd là dưới 0,01 %

1.2 Kiểm ñịnh vắc xin

Kiểm ñịnh chất lượng VX một cách nghiêm ngặt là ñiều không thể thiếu vì rất nhiều lý do Thứ nhất, việc sử dụng VX phải an toàn vì nó ñược sử dụng với số lượng người rất lớn, trong cùng một thời ñiểm và ñều là những người khoẻ mạnh Thứ hai, các sản phẩm phải tạo ñược miễn dịch bảo vệ, ngăn ngừa bệnh tật Hơn nữa, các VX là các sản phẩm sinh học, rất khó chuẩn hóa so với các qui trình khác

Việc kiểm ñịnh chất lượng ñược thực hiện ở từng công ñoạn quan trọng của quá trình sản xuất, ở bán thành phẩm và sản phẩm cuối cùng

Hệ thống kiểm ñịnh VX gồm 3 cấp: Tại ñơn vị sản xuất của nhà sản xuất (Cấp 1), tại phòng kiểm ñịnh ñộc lập của nhà sản xuất (Cấp 2) và cơ quan Kiểm ñịnh Quốc gia (Cấp 3) Việc kiểm ñịnh chất lượng không chỉ cho những số liệu về từng loạt VX cụ thể mà còn cho biết mức ñộ ổn ñịnh của cả

hệ thống sản xuất và hệ thống kiểm ñịnh thông qua việc phân tích xu hướng (trend analysis) chất lượng sản phẩm từ các số liệu thu ñược [15]

Sau khi ñã ñược kiểm tra chất lượng tại nhà sản xuất, toàn bộ hồ sơ sản xuất, kiểm ñịnh và các mẫu VX của mỗi loạt VX sẽ ñược chuyển ñến KĐQG

ñể ñược cấp giấy phép xuất xưởng KĐQG sẽ căn cứ vào các kết quả thanh tra

nhà xưởng, qui trình sản xuất, hồ sơ loạt sản phẩm, số liệu về phân tích xu hướng các kết quả kiểm ñịnh chất lượng, ñể ñưa ra quyết ñịnh sẽ phải làm

những thử nghiệm gì, với tần xuất nào, tại KĐQG ñể kiểm tra chất lượng của loạt VX ñó

Có rất nhiều thử nghiệm ñể kiểm tra chất lượng VX Thông thường là các thử nghiệm nhận dạng; công hiệu; an toàn chung; an toàn ñặc hiệu; chất gây sốt; vô trùng và các thử nghiệm kiểm tra các tính chất vật lý, hoá học (thử nghiệm hoá lý) Ngoài ra, một số VX có thêm những thử nghiệm riêng, ñặc thù cho từng VX, ví dụ: BCG và ImBCG có thử nghiệm kiểm tra ñộ sống và

ñộ ổn ñịnh nhiệt

1.2.1 Kiểm tra vô trùng

Thử nghiệm vô trùng là thử nghiệm cơ bản nhất trong kiểm ñịnh vắc xin [42] Thử nghiệm vô trùng là một qui trình khó khăn và phải ñược chuẩn bị cũng như thực hiện sao cho loại trừ ñược các kết quả dương tính giả và âm tính giả [63]

Mỗi loạt VX ñược tiến hành kiểm tra vô trùng ở từng công ñoạn của quá trình sản xuất, bán thành phẩm và thành phẩm Chính vì lý do này mà khi các mẫu VX ñược gửi ñến KĐQG thì tỷ lệ phát hiện ra các loạt VX bị nhiễm trùng là rất thấp

1.2.2 Nhận dạng

Mục ñích của thử nghiệm nhận dạng là ñể xác ñịnh xem VX có chứa loại kháng nguyên ñã ñăng ký hay không Thử nghiệm nhận dạng có thể ñược thực hiện trực tiếp bằng cách tìm kháng nguyên hoặc gián tiếp thông qua tìm kháng thể ñặc hiệu

Thử nghiệm nhận dạng tìm kháng nguyên có thể ñược thực hiện bằng phản ứng khuếch ñại gen (polymerase chain reaction: PCR) ñối với các VX

có chứa acid nucleic Hiện nay, KĐQG có thể sử dụng phương pháp này ñể nhận dạng ñược hầu hết các VX Các VX ñã thực hiện nhận dạng theo phương pháp này như sởi, quai bị, rubella, cúm, viêm gan A, viêm não,

Một số VX, việc nhận dạng ñược thực hiện qua việc tìm phức hợp kháng nguyên-kháng thể bằng phản ứng miễn dịch gắn men (ví dụ: VX phế cầu, não mô cầu, HiB) hay các phản ứng ngưng kết như VX thương hàn, bạch hầu-ho gà-uốn ván [17], [27]

1.2.3 Xác ñịnh công hiệu

Xác ñịnh công hiệu của VX chính là xác ñịnh khả năng bảo vệ con người trước bệnh tật Việc xác ñịnh công hiệu của VX có thể ñược thực hiện trên súc vật thí nghiệm hay trong phòng thí nghiệm

Trên súc vật thí nghiệm, công hiệu ñược tính toán qua việc ño nồng ñộ kháng thể có trong huyết thanh sau khi sử dụng VX Khả năng bảo vệ của VX cũng có thể ñược ñánh giá bằng cách thử thách trực tiếp súc vật thí nghiệm sau khi sử dụng VX với nguồn bệnh

Để ñánh giá ñúng khả năng bảo vệ của VX, thử nghiệm xác ñịnh công

hiệu phải tuân thủ rất nhiều tiêu chuẩn khắt khe về súc vật thí nghiệm (loài, trọng lượng, tuổi, ñiều kiện nuôi dưỡng, ), chủng VK hoặc vi rút thử thách,

ñiều kiện thực hiện thử nghiệm, phương pháp, kỹ thuật thực hiện, Tuy nhiên,

ngay cả khi những ñiều kiện này ñược tuân thủ thì sự biến ñộng các giá trị cũng là ñiều không tránh khỏi do bản chất của các thử nghiệm sinh học Để hạn chế sai số trong việc ñánh giá công hiệu VX, người ta thường phải tiến hành song song mẫu thử với mẫu chuẩn quốc gia hoặc quốc tế [8]

1.2.4 Kiểm tra an toàn chung

Thử nghiệm an toàn chung còn ñược gọi là thử nghiệm an toàn không

ñặc hiệu Thử nghiệm này nhằm phát hiện bất kỳ chất ñộc nào có mặt trong

sản phẩm

Để thực hiện thử nghiệm này, người ta tiêm VX vào dưới da ở phần ổ

bụng chuột nhắt trắng và chuột lang Thông thường, mỗi loạt VX ñược tiêm cho 5 chuột nhắt trắng Swiss trọng lượng 18-22 g/con và 2 chuột lang trọng

lượng 250-350 g/con Chuột ñược theo dõi, cân trọng lượng hàng ngày trong

7 ngày sau khi tiêm Nếu sau 7 ngày chuột khoẻ mạnh, tăng cân, không có chuột nào chết hoặc có biểu hiện bất thường như giảm hoạt ñộng, rụng lông, thì loạt VX ñó ñạt yêu cầu về tiêu chuẩn an toàn chung trên ñộng vật thí nghiệm [29]

1.2.5 Kiểm tra an toàn ñặc hiệu

Chỉ có một số VX cần phải kiểm tra an toàn ñặc hiệu như BCG, VNNB, dại, Thử nghiệm an toàn ñặc hiệu nhằm kiểm tra các ñộc tính liên quan ñến ñặc ñiểm gây bệnh của chủng sản xuất Do ñây là thử nghiệm an toàn ñặc hiệu nên mỗi VX có qui trình thử nghiệm, cách ñánh giá kết quả riêng, ñặc trưng cho VX ñó

VD: BCG ñược tiêm dưới da bụng phải của chuột thí nghiệm Trong tiêu chuẩn ñánh giá kết quả, ngoài tiêu chuẩn chung như chuột tăng cân thì còn phải ñánh giá xem chuột có biểu hiện bệnh lao hay không Sau 42 ngày chuột ñược mổ ñể kiểm tra phủ tạng (gan, lách, phổi,…) xem có biểu hiện nhiễm lao hay không; các hạch có to không; có khác nhau giữa hạch vùng khoeo, nách, hạch bên trái so với bên phải (bên tiêm VX ) hay không [34]

1.2.6 Kiểm tra chất gây sốt

Thử nghiệm kiểm tra chất gây sốt (Pyrogens) nhằm phát hiện có hay không tác nhân gây sốt trong VX

Theo WHO, thử nghiệm này có thể ñược thực hiện trên thỏ hoặc bằng thuốc thử lysat [78]

Thử nghiệm chất gây sốt trên thỏ ñược thực hiện dựa trên nguyên tắc so sánh sự tăng thân nhiệt của hai nhóm thỏ trước và sau khi tiêm VX vào tĩnh mạch tai thỏ trong vòng 3 giờ [30]

Thuốc thử lysat là dịch phân giải tế bào dạng amip có trong máu một loài sam biển, là chất nhạy cảm với nội ñộc tố Dùng thuốc thử lysat chỉ phát

hiện ñược chất gây sốt là nội ñộc tố của vi khuẩn Hiện nay có 3 phương pháp

ñể thực hiện phép thử này: phương pháp tạo gel dựa vào sự hình thành gel khi

cho thuốc thử vào dung dịch có chứa nội ñộc tố, phương pháp ño ñộ ñục dựa vào sự thay ñổi ñộ ñục của thuốc thử lysat khi tạo gel, phương pháp ño màu dựa trên sự thay ñổi màu của phức hợp màu-peptid [6]

1.2.7 Kiểm tra các chỉ tiêu hoá lý

Các thử nghiệm hoá lý bao gồm: xác ñịnh các tính chất về hình thức

VX khi nhìn bằng mắt thường, pH, ñộ ẩm tồn dư, hàm lượng các chất ức chế (thimerosal, phenol, formaldehyd), hàm lượng nitơ toàn phần, hàm lượng nitơ protein, hàm lượng protein, hàm lượng nhôm, hàm lượng NaCl

Thử nghiệm xác ñịnh hàm lượng thimerosal ñược thực hiện dựa vào phản ứng của ion thủy ngân tự do từ thimerosal kết hợp với dithizon thành dithizon- thủy ngân và ñược xác ñịnh bằng phương pháp so màu [25]

Thử nghiệm xác ñịnh hàm lượng phenol ñược thực hiện dựa vào phản

ứng tạo màu của phenol với thuốc thử folin [7]

Việc ñịnh lượng formaldehyd trong VX ñược thực hiện bằng cách ño mật ñộ màu của 3,5 diacetyl-1,4 dihydrolutidin ở bước sóng 415 nm Phức hợp này màu vàng chanh, ñược tạo thành do phản ứng của formaldehyd tự do trong mẫu thử với acetylaceton và amoni trong môi trường acid nhẹ [12]

Việc xác ñịnh hàm lượng nitơ toàn phần, nitơ protein dựa trên phản

ứng màu của ion amoni ñược tạo thành khi tác dụng với thuốc thử Nessler sau

khi vô cơ hoá các sản phẩm chứa protein Sự khác biệt của hai thử nghiệm này ở chỗ: thử nghiệm xác ñịnh hàm lượng nitơ protein cần có bước tủa và tách protein, sau ñó mới vô cơ hóa lượng protein thu ñược bằng acid sulfuric

ñậm ñặc Thử nghiệm xác ñịnh hàm lượng protein toàn phần không cần bước

tủa và tách protein [16], [18]

Có 6 phương pháp ñịnh lượng protein toàn phần trong VX: phương pháp Lowry, phương pháp Bradford, phương pháp ñồng/bicinchoninic acid, phương pháp biuret, phương pháp quang phổ huỳnh quang, ño ñộ hấp phụ thực của protein ở bước sóng 280 nm Phương pháp hiện ñang ñược sử dụng

ở KĐQG là phương pháp Lowry Phương pháp này dựa trên nguyên lý:

protein trong mẫu thử bị tủa với acid tricloacetic Xác ñịnh lượng tủa ñể tính

ra lượng protein có trong mẫu thử [6]

Hàm lượng Al+++ ñược ñịnhlượng dựa trên sự tạo thành muối natri của acid ethylendiamintetraacetic (EDTA) với ion Al+++, sau ñó chuẩn ñộ dung dịch EDTA thừa bằng dung dịch ñồng sulfat 0,01 M [19]

Hàm lượng muối NaCl ñược xác ñịnh dựa trên phản ứng của ion Cl- với bạc nitrat 0,1 N, chỉ thị màu kalicromat 10% [11]

Thực hiện những thử nghiệm nào trong số các thử nghiệm nói trên là phụ thuộc vào bản chất của từng VX

1.3 Thử nghiệm vô trùng

1.3.1 Các phương pháp kiểm tra vô trùng

1.3.1.1 Hai phương pháp kiểm tra vô trùng

Hiện nay, trên thế giới có hai phương pháp kiểm tra vô trùng VX: Phương pháp màng lọc và phương pháp cấy trực tiếp [58], [75], [80]

Phương pháp màng lọc là phương pháp dùng một bơm chân không hút tất cả VX trong các lọ mẫu cần kiểm tra ñi qua một màng lọc có kích thước lỗ lọc nhỏ hơn 0,45 µm, rửa màng lọc ñể loại bỏ hết các chất ức chế bằng cách cho các dung dịch rửa ñi qua, sau ñó nuôi cấy màng lọc trong hai môi trường FTM và TSB

Phương pháp cấy trực tiếp ñược thực hiện bằng cách hút một lượng VX trong mỗi lọ chứa theo một tỷ lệ nhất ñịnh rồi cấy vào các ống môi trường FTM và TSB

Mỗi phương pháp có ưu ñiểm và nhược ñiểm riêng

Phương pháp cấy trực tiếp có ưu ñiểm:

- Rẻ tiền;

- Dễ áp dụng, không ñòi hỏi trang thiết bị ñắt tiền;

- Áp dụng ñược cho hầu hết các VX

Tuy nhiên nó có nhược ñiểm:

- Ít chính xác do chỉ kiểm tra ñược một phần VX trong mỗi lọ, ñặc biệt trong những trường hợp các lọ VX có thể tích lớn;

- Dễ bị nhiễm từ ngoài vào do trong quá trình thực hiện thử nghiệm phải mở nút các lọ VX và các ống MT;

- Tốn nhiều thời gian, công sức do phải dùng rất nhiều các ống MT, pipét Ngược lại, phương pháp màng lọc có ưu ñiểm:

- Chính xác hơn do:

+ Kiểm tra ñược toàn bộ lượng VX trong các lọ

+ Ít bị nhiễm từ ngoài vào do sử dụng những hệ thống kín hoặc nửa kín

Đối với hệ thống kín gần như chắc chắn 100% sẽ không bị nhiễm từ ngoài vào

- Tiết kiệm thời gian, công sức do chỉ cần 1 lọ FTM và 1 lọ TSB

- Đặc biệt thích hợp cho những VX ñược ñóng trong những lọ có thể tích lớn, những VX có chứa chất ức chế sự phát triển của VK, nấm

Và có nhược ñiểm

- Đắt tiền

- Không áp dụng ñược cho một số VX, ví dụ các VX chứa nhôm sẽ

không ñi qua ñược màng lọc

Phương pháp hiện nay ñang ñược sử dụng tại KĐQG là phương pháp cấy trực tiếp [28]

1.3.1.2 Số lượng vắc xin cần cho kiểm tra vô trùng của mỗi loạt sản xuất

Sau khi sản xuất, mỗi loạt VX cần lấy một số lọ nhất ñịnh ñể kiểm tra

vô trùng Số lượng VX cần cho kiểm tra vô trùng của một loạt sản xuất phụ

thuộc vào số lượng sản xuất của loạt ñó và thể tích VX có trong mỗi lọ Số lượng này ñược WHO qui ñịnh [75]:

Bảng 1.1: Số lượng vắc xin cần lấy ñể kiểm tra vô trùng

Công thức tính cỡ mẫu chung mà WHO ñưa ra là : n = 0 , 4 N ,

trong ñó: n là số lọ VX cần lấy, N là số lượng VX thành phẩm trong một loạt

Trong phương pháp cấy trực tiếp, lượng VX cần lấy từ mỗi lọ ñể cấy vào mỗi loại MT (FTM, TSB) và lượng VX cấy vào mỗi ống MT cũng ñược qui ñịnh tại tài liệu WHO TRS 530 annex 4 [75], cụ thể như sau:

Bảng 1.2: Thể tích VX cần lấy từ mỗi lọ ñể cấy vào mỗi loại MT và thể tích

VX cấy vào mỗi ống MT

Các ống FTM sau khi cấy VX ñược ủ ở nhiệt ñộ 30-350C, các ống TSB

ñược ủ ở 20-250C và theo dõi ít nhất 14 ngày [54], [57], [61]

1.3.2 Điều kiện thực hiện thử nghiệm vô trùng

Thử nghiệm vô trùng ñược thực hiện trong tủ cấy vô trùng cấp ñộ A,

ñặt trong phòng sạch cấp ñộ B hoặc trong một phòng cách ly [43], [58], [61]

WHO, Dược ñiển châu Âu chia phòng sạch làm 4 cấp ñộ: A, B, C, D dựa theo kết quả giám sát môi trường phòng sạch [43], [71]

Các nội dung giám sát môi trường phòng sạch bao gồm: ñếm số lượng

VK và nấm trong không khí, ñếm số lượng VK và nấm trên bề mặt phòng sạch và găng của cán bộ thực hiện thử nghiệm, ñếm số lượng hạt bụi trong không khí

- Đếm số lượng VK và nấm trong không khí bằng 2 phương pháp:

+ Phương pháp thụ ñộng bằng cách ñặt các ñĩa thạch ở các vị trí có khả năng lây nhiễm khác nhau trong 4 h

+ Phương pháp chủ ñộng: dùng máy lấy mẫu không khí ñể hút không khí qua máy VK và nấm trong không khí sẽ gắn vào ñĩa thạch hoặc màng gelatin lắp sẵn trong máy Màng gelatin sau ñó ñược ñặt lên ñĩa thạch Ủ các

ñĩa thạch trong tủ ấm Đếm số khuẩn lạc trên ñĩa thạch Dựa vào vận tốc lấy

mẫu, thời gian lấy mẫu ñể tính số VK và nấm có trong mỗi mét khối không khí Đây là phương pháp chính xác nhưng ñòi hỏi phải có trang thiết bị ñắt tiền

- Xác ñịnh VK và nấm trên bề mặt: lấy ñĩa thạch tiếp xúc có ñường kính 56

mm, mở nắp ñĩa thạch và cho mặt thạch tiếp xúc với bề mặt cần kiểm tra trong giây lát Đóng nắp ñĩa thạch Ủ ñĩa thạch trong tủ ấm Đếm số khuẩn lạc

trên ñĩa thạch

- Kiểm tra găng của kỹ thuật viên: mỗi kỹ thuật viên dùng một ñĩa thạch riêng biệt, in 10 ñầu ngón tay của mình vào ñĩa thạch theo trình tự tay phải in trước, tay trái in sau, tay phải ở giữa ñĩa thạch, tay trái bao phía ngoài

Hình 1.1: Kiểm tra găng của kỹ thuật viên

- Đếm số lượng hạt bụi trong không khí: dùng máy ñể ñếm số lượng các hạt bụi kích thước 0,5 - 5 µm và các hạt có kích thước ≥ 5 µm

Tiêu chuẩn từng cấp ñộ sạch như sau:

Bảng 1.3: giới hạn nhiễm VK và nấm của các cấp ñộ sạch

Thạch tiếp xúc (CFU/ñĩa)

Kiểm tra găng (CFU/ñĩa)

1.3.3 Vai trò của con người trong thử nghiệm vô trùng

Thử nghiệm vô trùng là một qui trình rất chính xác và vô trùng ñể ñảm bảo kết quả chính xác Do ñó, con người trong thử nghiệm phải ñược ñào tạo

Người làm việc trong phòng phải vệ sinh thân thể sạch sẽ, mang quần

áo, mũ, khẩu trang, bao chân vô trùng và hạn chế ñến mức tối thiểu các chuyển ñộng và nói chuyện [41] Ngoài ra, người thực hiện thử nghiệm không

ñược mắc các bệnh truyền nhiễm cấp tính hoặc mạn tính [72]

1.3.4 Môi trường dùng trong kiểm tra vô trùng

1.3.4.1 Các loại MT dùng trong kiểm tra vô trùng: TSB và các loại canh thang thioglycolat

Hầu hết các phòng thí nghiệm lớn trên thế giới cũng như KĐQG ñều dùng FTM và TSB làm MT nuôi cấy trong thử nghiệm vô trùng

Di-potassium hydrogen phosphat 2,5

pH sau khi tiệt trùng là 7,3 ± 0,2 ở 250C

TSB là một MT không có chất ức chế và chất chỉ thị, ñược dùng phổ biến TSB giàu chất dinh dưỡng cơ bản, thích hợp cho việc nuôi cấy cả những

VK khó tính TSB ñược sử dụng ñể phát hiện nấm và các VK hiếu khí phát

triển chậm có trong VX TSB còn ñược gọi dưới tên SCDM (Soya-bean casein digest medium) [51]

Để ñảm bảo cho sự phát triển của các VK hiếu khí và nấm, TSB cần ñược ñựng trong các ống sao cho thể tích của ống ít nhất phải gấp ñôi thể tích

pH sau khi tiệt trùng là 7,1 ± 0,2 ở 250C

FTM ñược dùng phổ biến vì có nhiều chất dinh dưỡng, pH ổn ñịnh giúp cho hầu hết các vi sinh vật ñều có thể phát triển ñược, ñáp ứng ñược yêu cầu

về dinh dưỡng

Đặc biệt trong MT này có sodium thioglycolat và L-cystine, là những

chất khử, giúp cho việc tạo ra ñiều kiện kỵ khí FTM còn chứa một lượng thạch nhỏ, tạo một ñộ nhớt cao chống lại sự hấp thu nhanh oxy từ không khí, tạo ra ñiều kiện kỵ khí ở phía dưới của ống nên nó thích hợp cho cả VK kỵ khí VK hiếu khí sẽ phát triển ở phía trên của ống MT và VK kỵ khí phát triển

ở phía ñáy ống

ở cuối giai ñoạn nuôi cấy [43] Để ñảm bảo ñiều này thì khoảng trống còn lại

trong các ống ñựng FTM không ñược quá lớn Trên thực tế làm việc tại KĐQG, ñể chứa 20 ml FTM thì nên dùng ống có ñường kính 18 mm hơn là dùng ống có ñường kính 20 mm

Nhóm sulhydryl của sodium thioglycolat và L-cystine bất hoạt Asen, bạc và hợp chất của các kim loại nặng khác, vì vậy mà FTM thích hợp cho việc kiểm tra những chất liệu có chứa kim loại nặng hoặc chất bảo quản có thành phần kim loại nặng, VD: thimerosal

Có nhiều loại canh thang thiglycolat dùng trong thử nghiệm vô trùng, loại thứ nhất là FTM như ñã nói ở trên, loại thứ hai là fluid thioglycolat medium G (FTMG), loại này có thành phần giống hệt FTM ngoại trừ thành phần thạch là thạch tổng hợp FTMG trong hơn FTM, vì vậy nó ñặc biệt thích hợp cho việc kiểm tra vô trùng các VX có thể tích lọ lớn và nuôi cấy dài ngày

Một loại canh thang thioglycolat nữa ñược sử dụng trong thử nghiệm

vô trùng, ñó là MT thioglycolat thay thế (Alternative fluid thioglycollate

medium: AFTM), thành phần của AFTM giống như FTM nhưng không có thạch và reazurin [69]

1.3.4.2 Chất lượng và hạn sử dụng của môi trường

Chất lượng của MT phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố trong quá trình pha chế, hấp tiệt trùng,…Nhiệt ñộ và thời gian hấp có ảnh hưởng ñến tính vô trùng và dinh dưỡng của MT: khi hấp ở nhiệt ñộ quá thấp, MT có thể bị nhiễm trước khi ñưa ra sử dụng Ngược lại, nếu hấp ở nhiệt ñộ quá cao và thời gian kéo dài sẽ làm hỏng ñường glucose có trong MT, không có lợi cho VK

và nấm phát triển Do ñó, MT ñược yêu cầu tiệt trùng bằng qui trình ñã ñược thẩm ñịnh Cũng vì những lý do trên mà MT ñược yêu cầu kiểm tra chất lượng từng loạt một

Sau khi tiệt trùng hai ngày, nếu không sử dụng ngay MT cần ñược bảo quản ở nhiệt ñộ từ 2-250C [43], [67], [69]

Hạn sử dụng của MT là một tháng sau khi pha chế nếu ñược ñựng trong các chai, tuýp không ñược hàn kín Nếu MT ñược ñựng trong các lọ ñược hàn kín, hạn sử dụng của MT là một năm miễn là chúng ñược kiểm tra dinh dưỡng

và chỉ thị màu ñạt yêu cầu FTM ñược khuyên là không nên dùng nếu quá một phần ba trên của ống MT ñổi thành màu hồng [54], [69]

Trong thử nghiệm kiểm tra vô trùng, nếu các VX gây ñục MT thì sau 7 ngày nuôi cấy phải tiến hành cấy chuyển sang một ống MT khác Viện Quốc gia về Sức khỏe và Môi trường Hà Lan khuyên trong hai lần kiểm tra ñó nên

sử dụng cùng một loạt MT [54]

1.3.5 Các chứng âm, chứng dương của thử nghiệm vô trùng

1.3.5.1 Các chứng âm

Thử nghiệm vô trùng có ba chứng âm, ñó là:

- Thử nghiệm kiểm tra vô trùng môi trường (FTM, TSB) sử dụng,

- Chứng âm của sản phẩm,

- Giám sát môi trường làm việc (Environment) [58]

Chứng âm ñược thực hiện ñể nhận ra những trường hợp dương tính giả:

VX hoàn toàn vô trùng nhưng lại có dấu hiệu phát triển của VK hoặc nấm hoặc cả VK và nấm trong các ống MT nuôi cấy Điều này xảy ra do bị nhiễm

VK và nấm từ bên ngoài trong quá trình thực hiện thử nghiệm

Giám sát môi trường làm việc (ñếm số lượng VK và nấm trong không

khí; ñếm số lượng VK và nấm trên bề mặt tủ cấy vô trùng, găng của cán bộ thực hiện thử nghiệm; ñếm số lượng hạt bụi trong không khí) nhằm ñánh giá xem có nguy cơ nhiễm vi khuẩn và nấm từ bên ngoài vào các lọ MT cấy VX trong quá trình kiểm tra vô trùng hay không

Chứng âm của sản phẩm là những lọ có ñặc ñiểm, hình dạng, kích thước giống các lọ VX cần kiểm tra vô trùng, thông thường là 10 lọ Người ta cho rằng các lọ này chắc chắn vô trùng vì ñã ñược tiệt trùng kép bằng cách hấp tiệt trùng hai lần, sấy tiệt trùng hai lần hoặc dùng tia gam ma cường ñộ 50 kGy Chứng âm của sản phẩm ñược thao tác ñồng thời với sản phẩm trong quá trình kiểm tra vô trùng Nếu trong các ống MT cấy chứng âm có dấu hiệu mọc của vi khuẩn hoặc nấm thì chứng tỏ thử nghiệm không có giá trị

1.3.5.2 Các chứng dương

Thử nghiệm vô trùng cũng có ba chứng dương, bao gồm các thử nghiệm theo thứ tự thực hiện như sau:

- Thử nghiệm kiểm tra dinh dưỡng môi trường (Growth promotion test),

- Thử nghiệm ức chế Thử nghiệm ức chế cũng ñược dùng với tên khác

là thử nghiệm thẩm ñịnh (Validation test) hoặc thử nghiệm thích hợp (Suitability test) ,

- Thử nghiệm duy trì (Stasis test) [58]

Các chứng dương này ñược thực hiện nhằm xác ñịnh những trường hợp

âm tính giả: VX bị nhiễm VK hoặc nấm hoặc thậm chí cả VK và nấm nhưng chúng không mọc ñược trong MT nuôi cấy

Thử nghiệm kiểm tra dinh dưỡng môi trường ñược thực hiện nhằm

ñánh giá chất lượng MT thông qua sự phát triển của chủng mẫu trong MT sử

dụng, bằng cách cho vào mỗi ống MT từ 10-100 CFU chủng mẫu Thử

nghiệm kiểm tra dinh dưỡng môi trường ñược yêu cầu thực hiện ñối với tất cả

các loạt MT Trong ñó, FTM cần ñược kiểm tra với ít nhất một chủng VK hiếu khí và một chủng VK kỵ khí, TSB cần ñược kiểm tra với ít nhất một chủng VK hiếu khí và một chủng nấm [43]

Thử nghiệm ức chế hay thử nghiệm thẩm ñịnh ñánh giá sự phát triển của chủng trong MT khi có mặt của VX Thử nghiệm ức chế ñược thực hiện

bằng cách cho VX vào MT, sau ñó cho 10-100 CFU chủng mẫu vào mỗi ống

MT rồi ñánh giá sự phát triển của chúng [53], [58], [67]

Thử nghiệm ức chế ñược thiết kế ñể thẩm ñịnh thử nghiệm vô trùng

bằng cách chứng minh rằng nếu có vi khuẩn và nấm trong sản phẩm thì sẽ phát hiện ñược trong thử nghiệm vô trùng [56]

Trong thử nghiệm ức chế, thử nghiệm kiểm tra vô trùng môi trường sẽ

ñóng vai trò là một chứng âm ñể chứng minh MT sử dụng không chứa VK và

nấm; thử nghiệm kiểm tra dinh dưỡng môi trường ñược sử dụng với vai trò

như một chứng dương, chứng tỏ MT có khả năng giúp cho chủng mẫu phát triển và chứng tỏ chủng mẫu có thể phát triển tốt trong MT [67]

Phương pháp thực hiện thử nghiệm ức chế, kiểm tra dinh dưỡng môi

trường và thử nghiệm duy trì ñã ñược ghi trong Dược ñiển Châu Âu, Dược

ñiển Mỹ, ICH,

Thử nghiệm duy trì ñược thực hiện bằng cách cho từ 10-100 CFU

chủng mẫu vào mỗi ống MT sau khi ñã cấy VX ít nhất 14 ngày mà không có dấu hiệu phát triển của VK và nấm

Thử nghiệm duy trì không phải là thử nghiệm bắt buộc nhưng nó là một

thử nghiệm theo yêu cầu của thực hành phòng thí nghiệm tốt (Good laboratory practice: GLP) và tổ chức tiêu chuẩn quốc tế 17025 (17025 International Standard Organization: ISO 17025) nhằm chứng minh ở cuối giai ñoạn nuôi cấy trong thử nghiệm vô trùng, MT vẫn có khả năng giúp cho các chủng mẫu phát triển, do:

- Vẫn duy trì ñược các chất dinh dưỡng,

- Vẫn có khả năng loại bỏ ảnh hưởng của các chất ức chế có trong

VX,

- Vẫn duy trì ñược ñiều kiện kỵ khí trong môi trường FTM

Thử nghiệm duy trì ñược thực hiện sau khi ñã thực hiện thử nghiệm ức chế

Thử nghiệm ức chế “nhại” lại thử nghiệm vô trùng một cách thích hợp

ở tất cả các chi tiết như: thể tích MT sử dụng, thể tích VX cho vào mỗi ống

MT, số lượng lọ VX, [67]

1.3.6 Việc loại bỏ ảnh hưởng của các chất ức chế

1.3.6.1 Phương pháp kiểm tra vô trùng VX bằng màng lọc

Đối với phương pháp kiểm tra vô trùng bằng màng lọc, việc loại bỏ ảnh

hưởng của các chất ức chế ñược thực hiện ngay trong quá trình thực hiện thử nghiệm vô trùng: sau khi lọc VX, rửa màng lọc bằng cách cho các dung dịch rửa ñi qua màng ít nhất ba lần, mỗi lần khoảng 100 mL

1.3.6.2 Phương pháp kiểm tra vô trùng VX bằng nuôi cấy trực tiếp

- Có ba cách ñể loại bỏ ảnh hưởng của các chất ức chế có trong VX:

+ Phương pháp trung hòa: cho thêm chất trung hoà các chất ức chế vào MT, + Phương pháp hòa loãng: tăng thể tích MT,

+ Kết hợp hai cách trên

- Các chất trung hoà chất ức chế gồm nhiều loại Dung dịch trung hoà ñiển

hình dùng cho tất cả các chất ức chế nói chung như sau:

Disodium hydrogen phosphate dihydrate 7,2 g

Nếu dung dịch trên vẫn chưa trung hoà hết chất ức chế thì tăng lượng

Nhóm thuỷ ngân hữu cơ: sodium thioglycolat

Nhóm halogen: sodium thiosulphat

Aldehyd: glycin

Hợp chất amoni bậc 4, iodine, parabens : polysorbate 80 [69]

1.3.7 Các thể tích môi trường thử nghiệm

Thể tích FTM, TSB hiện nay ñang sử dụng tại KĐQG là 20 mL/ống

Thể tích MT thích hợp cần ñược xác ñịnh cho từng VX [70] Để tìm ra

thể tích MT thích hợp cho từng VX, người ta phải thẩm ñịnh mỗi VX với

nhiều thể tích MT khác nhau [65]:

Công ty Biofarma (Indonesia) thẩm ñịnh các VX bằng các thể tích: 15 mL/ống, 30 mL/ống, 40 mL/ống, 50 mL/ống, 60 mL/ống [40], [39] Labo kiểm ñịnh Quốc gia Thái Lan sử dụng các thể tích 25 mL/ống, 40 mL/ống, 50 mL/ống, 60 mL/ống [65]

Mỗi thể tích MT như trên phải sử dụng số lượng VX bằng số lượng VX cho một lần thực hiện thử nghiệm vô trùng, thông thường là 20 lọ cho những

VX có thể tích mỗi lọ lớn hơn hoặc bằng 2 mL; 40 lọ cho những VX có thể tích mỗi lọ nhỏ hơn 2 mL

Để khẳng ñịnh thể tích MT tìm ñược, phải thực hiện thử nghiệm ức chế

trên ba loạt VX và ñều cho kết quả loại bỏ ñược ảnh hưởng của chất ức chế

1.3.8 Chủng mẫu

Để thực hiện thử nghiệm ức chế, một yếu tố rất quan trọng ñó là các

chủng VK và nấm mẫu Các chủng này chính là các chủng dùng ñể kiểm tra dinh dưỡng MT

Dược ñiển Anh, Mỹ và châu Âu khuyến cáo nên sử dụng ít nhất một chủng VK hiếu khí và ít nhất một chủng VK kị khí ñể thử thách ñối với môi trường FTM, ít nhất một chủng VK hiếu khí và một chủng nấm ñể thử thách

ñối với môi trường TSB

Chủng mẫu phải ñảm bảo yêu cầu là các chủng làm việc dùng trong thử nghiệm không cấy chuyển quá 5 lần kể từ chủng nguyên thủy [66], [69]

Hầu hết các quốc gia trên thế giới ñều tuân theo nguyên tắc này nhưng số lượng chủng thì không giống nhau Thông thường, các chủng này thường là chủng ATCC [59] Viện Quốc gia Sức khỏe và Môi trường Hà Lan sử dụng 6

chủng: Candida albicans ATCC 10231, Bacillus subtilis ATCC 6633,

Staphylococcus aureus ATCC 6538P, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Clostridium sporogenes ATCC 11437 và Aspergillus niger ATCC 16404 Viện

Pasteur Ấn ñộ chỉ sử dụng 3 chủng: S aureus ATCC 6538, C sporogenes

ATCC 11437 và C albicans ATCC 10231 [57] Hãng Sanofi Pasteur sử dụng 5 chủng: B subtilis ATCC 6633, P aeruginosa ATCC 9027, C albicans ATCC

10231, A niger ATCC 16404, C sporogenes ATCC 11437 [60]

Dược ñiển Mỹ qui ñịnh sử dụng các chủng sau:

Bảng 1.5: Các chủng mẫu do Dược ñiển Mỹ qui ñịnh

Dược ñiển Mỹ cũng qui ñịnh chủng B subtilis ATCC 6633 ñược dùng

ñể thay thế S aureus ATCC 6538, Kocuria rhizophila (M luteus) ATCC

9341 [23], [50] ñược dùng ñể thay thế P aeruginosa ATCC 9027 [69]

Chủng B subtilis ATCC 6633 và C albicans ATCC 10231 cũng ñược

quy ñịnh trong Dược ñiển châu Âu [43]

Bảng 1.6: Các chủng mẫu do Dược ñiển châu Âu qui ñịnh

Nhóm VK

Các chủng S aureus: ATCC 6538, CIP 4.83,

NCTC1 10788, NCIMB2 9518

Các chủng B subtilis: ATCC 6633, CIP3 52.62, NCIMB 8054

Hiếu khí Các chủng P aeruginosa: ATCC 9027, NCIMB 8626,

1: NCTC: National collection of type culture (bộ sưu tập chủng quốc gia Anh)

2: NCIMB: National collection of Industrial and Marine Bacteria (bộ sưu tập

vi khuẩn công nghiệp và biển, Scotland)

3: CIP: Institute Pasteur Collection (bộ sưu tập chủng của Viện Pasteur, Pháp) 4: IP: Institute Pasteur

Bảng 1.7: Các chủng mẫu sử dụng trong nghiên cứu

Các chủng này phù hợp với qui ñịnh của Dược ñiển Mỹ

Các ống, ñĩa MT cấy các chủng trên ñược ủ ở nhiệt ñộ 30-350C ñối với

VK và 20-250C ñối với nấm [73]

1.4 Quá trình hoàn thiện kỹ thuật kiểm tra vô trùng VX tại KĐQG

1.4.1 Trước năm 2002

- Điều kiện thực hiện thử nghiệm:

+ Labo thực hiện thử nghiệm kiểm tra vô trùng VX không có hệ thống lọc hiệu năng cao (High Efficiency Particulate Arresting: HEPA), không có

ñiều khiển áp suất, nhiệt ñộ

+ Môi trường (FTM và TSB) ñược ñựng trong các ống thuỷ tinh sản xuất trong nước, dùng nút bông Các ống thuỷ tinh này dễ vỡ trong khi thực hiện thử nghiệm cũng như khi sấy, rửa, pha chế môi trường Các nút bông dễ tạo ra bụi trong quá trình làm việc, dễ gây hiện tượng dương tính giả trong thử nghiệm vô trùng VX

- Việc kiểm tra vô trùng ñược thực hiện ở 3 khoa: Khoa Kiểm ñịnh vắc xin vi khuẩn, Khoa Kiểm ñịnh vắc xin vi rút, Khoa Kiểm ñịnh sinh phẩm Y tế

- Không hực hiện các chứng âm và chứng dương của thử nghiệm vô trùng:

+ Không thực hiện thử nghiệm kiểm tra vô trùng môi trường sử dụng;

+ Không có chứng âm của sản phẩm;

+ Không giám sát môi trường trong khi thực hiện thử nghiệm vô trùng, không giám sát môi trường phòng thí nghiệm ñịnh kỳ;

+ Không thực hiện thử nghiệm kiểm tra dinh dưỡng môi trường;

+ Không thực hiện thử nghiệm ức chế;

+ Không thực hiện thử nghiệm duy trì

1.4.2 Năm 2002-2003

Bắt ñầu thực hiện:

+ Một chứng âm của thử nghiệm vô trùng VX, ñó là thử nghiệm kiểm

tra vô trùng môi trường sử dụng;

+ Một chứng dương của thử nghiệm vô trùng VX, ñó là thử nghiệm

kiểm tra dinh dưỡng môi trường bằng một chủng: A feacalis 415

1.4.3 Năm 2004-2005

- Thực hiện việc kiểm tra kiểm tra dinh dưỡng MT bằng 3 chủng: B subtilis ATCC 6633, C albicans ATCC 10231, K rhizophila ATCC 9341

- Ưu ñiểm của việc kiểm tra dinh dưỡng môi trường bằng 3 chủng chuẩn:

So với khuyến cáo của Dược ñiển Anh, Mỹ, châu Âu, Nhật Bản; việc

kiểm tra dinh dưỡng MT bằng 3 chủng: B subtilis ATCC 6633, C albicans

ATCC 10231, K rhizophila ATCC 9341 vẫn thiếu một chủng VK kị khí ñể

thử thách ñối với môi trường FTM Tuy nhiên việc kiểm tra dinh dưỡng MT bằng 3 chủng trên ñã có một số ưu việt:

Thứ nhất, việc kiểm tra dinh dưỡng môi trường TSB ñã ñạt ñược yêu cầu của Dược ñiển Anh, Mỹ, châu Âu, Nhật Bản là kiểm tra với ít nhất một chủng VK hiếu khí và một chủng nấm

Thứ hai, qui trình kiểm tra rất thuận tiện, không mất nhiều thời gian và tạo ñược sự tin cậy cao [3]

1.4.4 Từ 2006 ñến nay

- Điều kiện thực hiện thử nghiệm:

+ Labo thực hiện thử nghiệm kiểm tra vô trùng VX:

* Được trang bị lọc HEPA Lọc này chỉ cho phép những hạt có kích thước rất nhỏ ñi qua Nó giữ lại tới 99,97 % các hạt có kích thước lớn hơn hoặc bằng 0,3 µm trong dòng không khí ñi qua lọc [64]

* Không khí trong phòng thay ñổi 60 lần/giờ

* Phòng thí nghiệm ñược thiết kế bởi các chuyên gia phòng sạch của Singapo, ñảm bảo ñược các tiêu chuẩn của phòng sạch như: tường, sàn, trần nhẵn; chịu ñược các hoá chất khử trùng, tiệt trùng như nước javen, formaldehyde, các góc ñược vê tròn tránh bám bụi

* Có hệ thống ñiều khiển áp suất, nhiệt ñộ, ñộ ẩm Áp suất trong phòng luôn cao hơn bên ngoài nhằm hạn chế không khí bẩn ñi vào phòng

Nhiệt ñộ trong phòng duy trì ở 22 ± 20C, ñộ ẩm duy trì 60 ± 5 % nhằm hạn chế sự phát triển của VK và nấm

* Quần áo mặc trong khi thực hiện thử nghiệm: may từ vải không sinh bụi

+ Môi trường FTM, TSB ñược ñựng trong ống thuỷ tinh nút vặn của hãng Pyrex, chất lượng tốt, thuận tiện cho công việc và giảm ñược hiện tượng dương tính giả

- Việc kiểm tra vô trùng VX ñã ñược chuyên môn hoá: thực hiện ở một labo,

do cán bộ chuyên trách ñảm nhiệm Điều này tiết kiệm ñược thời gian, công

sức và tài chính

- Thực hiện thêm một chứng âm của thử nghiệm vô trùng VX : giám sát môi

trường phòng sạch trong khi thực hiện thử nghiệm Việc thực hiện chứng âm

rất quan trọng, nó nhằm loại trừ các trường hợp dương tính giả: dấu hiệu phát

triển của VK hoặc nấm trong các ống môi trường nuôi cấy VX có thể do

nhiễm từ ngoài vào trong quá trình thao tác chứ không phải do bản thân sản

phẩm Việc huỷ nhầm một loạt VX rất lãng phí do chí phí sản xuất rất cao và

do chi phí phục vụ cho việc huỷ

Các kết quả giám sát môi trường phòng sạch trong khi thực hiện thử

nghiệm cũng như giám sát ñịnh kỳ cho thấy tủ cấy vô trùng ñạt tiêu chuẩn cấp

ñộ A, phòng thực hiện thử nghiệm ñạt tiêu chuẩn phòng sạch cấp ñộ B, ñáp

ứng tiêu chuẩn của WHO, Dược ñiển châu Âu, Mỹ, về ñiều kiện thực hiện

thử nghiệm vô trùng VX

Hình 1.4: Bảng hiện thị máy ñếm hạt bụi Hình 1.5: Đầu thu mẫu máy ñếm vi

khuẩn và nấm

1.4.5 Các tồn tại trong thử nghiệm vô trùng tại KĐQG

Mặc dù ñã có rất nhiều cải thiện trong những năm vừa qua nhưng thử

nghiệm vô trùng VX tại KĐQG vẫn còn một số hạn chế:

Thứ nhất: Chưa thực hiện ñược hết các chứng dương của thử nghiệm

vô trùng

Trong ba chứng dương KĐQG mới chỉ thực hiện ñược một chứng

dương là thử nghiệm kiểm tra dinh dưỡng của môi trường Còn hai chứng dương là thử nghiệm ức chế và thử nghiệm duy trì chưa ñược thực hiện Điều

này có thể dẫn ñến hiện tượng âm tính giả: VX nhiễm VK hoặc nấm nhưng không phát hiện ñược Thể tích MT mà KĐQG ñang sử dụng ñể kiểm tra vô trùng VX chưa ñược khẳng ñịnh là có thích hợp với các VX hay không

KĐQG phải kiểm tra vô trùng rất nhiều VX sản xuất trong nước cũng như VX nhập khẩu Viện cần xác ñịnh thể tích MT ñể kiểm tra vô trùng từng

VX, ñòi hỏi rất nhiều chi phí, thời gian, công sức Thực tế ñòi hỏi phải có một qui trình chung ñể giảm ba yếu tố trên Điều này KĐQG chưa thực hiện

Thứ hai: Đối với các VX mà trong quá trình sản xuất có thực hiện công

ñoạn nuôi cấy tế bào: chưa thực hiện thử nghiệm kiểm tra xem VX có bị

nhiễm Mycoplasma hay không [75] Công việc này ñang trong giai ñoạn triển

khai và sẽ trở thành thường qui trong những năm sắp tới