đặc điểm sinh học phân tử của haemophilus influenzae typ b (hib) phân lập từ bệnh nhi viêm màng não

Khả năng miễn dịch thu được một cách tự nhiên này, đó là kết quả của đáp ứng với sự xâm nhiễm họng - mũi của Hib cũng như sự xâm nhiễm không triệu chứng ở ruột của hệ vi khuẩn đường ru

ĐẶT VẤN ĐỀ

Giống vi khuẩn Haemophilus là một trong những loại vi khuẩn ký sinh

ở đường hô hấp người và một số loài động vật Loài H influenzae (Hi) là căn

nguyên của một số bệnh nhiễm trùng ở người (có thể từ viêm đường hô hấp

cho đến viêm màng não) Hi typ b (Hib) đã được thế giới xác định là một

trong những căn nguyên chớnh gõy viờm màng não (VMN) do vi khuẩn, đặc biệt ở trẻ em dưới 5 tuổi [13], [78]

Tại các nước phát triển như khu vực Bắc Mỹ, Tây Âu, Châu Úc hầu hết

những nghiên cứu đã cho thấy tỷ lệ mang Hib ở họng rất cao ở trẻ nhỏ, đặc

biệt là những trẻ được chăm sóc tại các trung tâm giữ trẻ ban ngày có thể

mang Hib đến 15% [41], [58] Bên cạnh đó, Hib cũng được đánh giá là

nguyên nhân hàng đầu gõy cỏc bệnh nhiễm trùng nguy hiểm cho trẻ nhỏ như viêm màng não (VMN), viêm phổi để lại di chứng và tỷ lệ tử vong cao

(khoảng 10%) Gánh nặng bệnh tật do Hib đã giảm đáng kể nhờ có vacxin

phòng bệnh tại các nước này [78] Tuy nhiên, một số nước trên thế giới sau

khi đánh giá quá trình thực hiện phòng bệnh do Hib bằng vacxin đã cho thấy

tỷ lệ thất bại của vacxin cũng không nhỏ Xuất phát từ vấn đề này, đã có nhiều nghiên cứu về đặc điểm học phân tử (phổ biến nhất là sử dụng kỹ thuật

PFGE) của Hib được tiến hành để đỏnh giá dịch tễ học phân tử của vi khuẩn

này [71], [90], [95], [101], [102]

Tại Việt Nam, một số nghiên cứu đã đánh giá tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang

vi khuẩn Hi nói chung [1], tỷ lệ mắc VMN do Hi (chưa có điều kiện xác định typ huyết thanh) ở trẻ dưới 5 tuổi [6] Cho thấy tỷ lệ trẻ dưới 5 tuổi mang Hi chiếm 21,4-35,5% [4] và Hi là căn nguyên hàng đầu gây VMN (50-60% các

trường hợp VMN xác định được vi khuẩn) ở trẻ nhỏ [6] Từ năm 1999 đến

2004, một số nghiên cứu của Phan Lê Thanh Hương cùng cộng sự đã đưa ra

tỷ lệ VMN do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi tại Hà Nội và một số tỉnh phớa Bắc [6],

[87], cũng như tìm hiểu về sự phân bố theo biotype, genotype (phân loại bằng PFGE) và gen mã hóa tổng hợp enzym β−lactamase của Hib phân lập từ trẻ

viêm màng não ở trẻ dưới 5 tuổi đã được thực hiện [6] Tuy nhiên, số lượng

chủng Hib sử dụng trong nghiên cứu vẫn còn hạn chế và chưa có những so sánh với những chủng Hib phõn lập được ở trẻ khỏe mạnh Vì vậy, để góp phần tìm hiểu nguồn gốc, đặc điểm sinh học phân tử của những chủng Hib

gõy viêm màng não cho trẻ dưới 5 tuổi và trẻ khỏe mạnh ở lứa tuổi mẫu giáo

có mang Hib Chúng tôi thực hiện đề tài: “Đặc điểm sinh học phân tử của

Haemophilus influenzae typ b (Hib) phân lập từ bệnh nhi viêm màng não

mủ dưới 5 tuổi và trẻ khỏe mạnh tại Nhà trẻ - Mẫu giáo”, nhằm thực hiện

3 mục tiêu:

1 Xác định biotype, genotype, khả năng sinh enzym β-lactamase của các chủng Hib phân lập được từ bệnh nhi viêm màng não mủ

và trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi.

2 Đỏnh giá mối liên quan về đặc điểm sinh học và ADN giữa Hib gõy viờm màng não mủ ở trẻ nhỏ với Hib được phân lập từ trẻ khỏe mạnh mang vi khuẩn.

3 Xác định tỷ lệ mang Hib ở trẻ khỏe mạnh tại Nhà trẻ - Mẫu giáo được điều tra.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi khuẩn Haemophilus influenzae typ b (Hib)

1.1.1 Haemophilus influenzae: lịch sử và tên gọi

Haemophilus influenzae (Hi) được phân lập lần đầu bởi Richard

Pfeiffer từ đờm của một bệnh nhân bị viêm phổi - cúm trong đại dịch cúm năm 1890 Lúc đó, vi khuẩn này được hiểu lầm là nguyên nhân gây ra bệnh cúm nên được gọi là trực khuẩn cúm (Influenzae bacteria) Mãi cho đến khi

đại dịch cúm xảy ra trong những năm 1918-1919, người ta mới biết Hi chỉ là

thành viên của hệ vi khuẩn ký sinh ở đường hô hấp trên và không phải lúc nào cũng gây bệnh Đến năm 1933, khi phát hiện ra virus cúm là căn nguyên của

bệnh cúm, vai trò của Hi mới được làm sáng tỏ: virus cúm gây ra bệnh cúm, còn Hi chỉ là vi khuẩn “ăn theo” (second invader) sau khi các tế bào đường hô

hấp đã bị tổn thương nặng nề bởi virus cúm [11], [32], [78] Vì vậy, vi khuẩn

này có tên Haemophilus influenzae được xuất phát từ nhu cầu đòi hỏi môi

trường giàu chất dinh dưỡng, bao gồm các yếu tố phát triển có mặt ở máu

(Haemophilus: ưa mỏu), đặc biệt là yếu tố X (hemin) và yếu tố V (NAD hoặc

NADP) Thêm vào đó, vi khuẩn này lại có mối liên quan lịch sử với bệnh cúm

(influenzae: bệnh cúm) Cho nên, vi khuẩn được gọi tên là như vậy [11], [78].

1.1.2 Đặc điểm sinh học đặc trưng của Hib

1.1.2.1 Hình thể và cấu trúc [11], [78]

Hi là một trong những loài vi khuẩn nhỏ nhất, còn được gọi là cầu trực

khuẩn vì vi khuẩn này có dạng trực khuẩn ngắn (1,0–1,5µm) nhưng uốn cong

ở hai đầu trông như hình cầu Tuy nhiên khi chúng ở dịch não tuỷ, hình thể

của Hi có thể kéo dài ra gấp vài lần so với chiều dài thông thường (Hình 1.1)

Hi bắt màu Gram õm, khụng di động và không hình thành nha bào Thành tế

bào của vi khuẩn này có cấu trúc bề mặt lipopolysaccharide–protein tương tự

như thành của những vi khuẩn Gram õm khỏc Tuy nhiên, Hi được phân loại

thành 2 nhóm: loại không vỏ polysaccharide (non-typeable khụng xác định được typ huyết thanh) và loại có vỏ (typeable xác định được typ huyết thanh)

Loài Hi (Hi) có vỏ bọc được phân loại tiếp tục theo các typ huyết thanh (serotype) từ a đến f tuỳ thuộc vào đặc tính kháng nguyên của vỏ

polysaccharide do gen qui định [11], [32], [78] Vỏ bọc typ b là một dạng trùng hợp của ribose, ribitol và phosphate, được gọi là polyribosyl - ribitol - phosphate (PRP) Những polysaccharide bề mặt này có liên quan mạnh mẽ

đến tớnh gõy độc của vi khuẩn, đặc biệt là Hi typ b (Hib), nguyên nhân của

nhiều trường hợp nhiễm trùng hệ thống nghiêm trọng bao gồm cả VMN

(chiếm trên 90% các ca nhiễm khuẩn lan tràn do Hib).

Hình 1.1 Hình thể của Hi trên tiêu bản nhuộm gram dịch não tuỷ dưới

kính hiển vi quang học [89]

Trên thực tế lõm sàng, nếu nhuộm gram bệnh phẩm dịch nóo tủy từ bệnh nhõn mà trên vi trường cho thấy nhiều vi khuẩn gram (-) nhỏ, đa hình thái và nhiều bạch cầu đa nhõn thì đõy là dấu hiệu rất quan trọng gợi ý cho

chẩn đoán sớm VMN do Hi [78].

Hi

Bạch cầu đa nhân

1.1.2.2 Sức đề kháng [117]

Hi là loại vi khuẩn chịu đựng rất kém với các yếu tố ngoại cảnh Trong

bệnh phẩm, chúng chết nhanh chóng nếu để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp,

để khô hoặc lạnh giá Các chất sát khuẩn thông thường tiêu diệt vi khuẩn này một cách dễ dàng

Vì vậy, bệnh phẩm để chẩn đoán vi khuẩn này nên được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 1 giờ, hoặc không quá 6 giờ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (24 - 28oC) Nếu là tăm bông bệnh phẩm phải giữ trong môi trường vận chuyển (môi trường bảo quản), có thể giữ ở nhiệt độ 4 - 8oC tối đa

24 giờ trong môi trường này

1.1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy [11]

Điều kiện nuôi cấy:

Hi là loại vi khuẩn khó nuôi cấy Chỳng khụng mọc trờn cỏc mụi

trường nuôi cấy thông thường, chỉ mọc khi trong môi trường đã có sẵn cả hai yếu tố X và V Yếu tố X có lẽ không phải là một chất thuần tuý mà là hỗn hợp của các chất màu có chứa sắt (như hemin và hematin); nếu không có cả hai

yếu tố này trong môi trường nuôi cấy, vi khuẩn Hi không phát triển được

Hi dùng yếu tố X để tổng hợp một số enzym như catalase, peroxidase

và cytochrom của hệ thống vận chuyển điện tử Máu và các sản phẩm của máu, kể cả hemin là nguồn nguyên liệu truyền thống được sử dụng để sản xuất yếu tố X Thạch máu (5%) có khả năng cung cấp đủ lượng yếu tố X mà

Hi cần thiết phát triển Khi dùng hematin tinh chế thì nồng độ cần thiết là 0,1

– 1,0 µg/ml Yếu tố V là NAD hoặc NADP mặc dù có mặt trong máu, nhưng một phần chúng nằm bên trong tế bào Mặt khác, trong máu của nhiều loài động vật có enzym NADase, nên trong máu tươi không có NAD ở dạng tự do Thạch chocolate, NAD được giải phóng ra khỏi tế bào và enzym NADase bị nhiệt phá huỷ Khi dùng NAD tinh chế, nồng độ cần thiết là 0,2 - 1,0 µg/ml

Hi hiếu khí, đòi hỏi môi trường nuôi cấy có CO2 (2-5%) khi mới phân lập Mọc tốt trờn mụi trường chocolate và Levinthal ở nhiệt độ khoảng 23-

390C, tối ưu là 370C Không mọc được trên thạch máu cừu; nếu mọc trờn cỏc loại thạch mỏu khỏc (ví dụ máu thỏ) thỡ khụng gõy tan máu và khuẩn lạc nhỏ hơn nhiều so với trên chocolate trong cựng cỏc điều kiện nuôi cấy Cũng trên

thạch máu, người ta thấy khuẩn lạc Hi mọc xung quanh các khuẩn lạc Staphylococcus aureus bội nhiễm rất to, trong khi đó ở những vùng xa thì

khuẩn lạc hoặc là không mọc, hoặc là rất bé Hiện tượng này gọi là hiện tượng

“vệ tinh” (satellitism), do khả năng tiết ra yếu tố V của vi khuẩn bội nhiễm đó

giúp Hi phát triển được thạch mỏu thụng thường.

Hình 1.2: Hiện tượng "vệ tinh", khuẩn lạc của vi khuẩn Hi mọc xung

quanh khuẩn lạc của S aureus trên môi trường thạch mỏu thỏ

Môi trường nuôi cấy và đặc điểm khuẩn lạc:

Để nuôi cấy Hi, có 3 loại môi trường có thể được được sử dụng [11],

[32], [78], [117]:

- Thạch chocolate có hoặc không có 300µg bacitracin/ml môi trường

(có tác dụng ức chế các vi khuẩn khác, đặc biệt là liên cầu) để phõn lập Hi

S aureus

H influenzae

Đõy là loại môi trường thường được sử dụng nhất trong nuôi cấy và phõn lập

vi khuẩn này

- Thạch máu thỏ tươi 7%

Sau khi nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường phân lập, ủ ấm trong khí trường 5% CO2 (nếu không có tủ ấm CO2, môi trường nuôi cấy được đặt trong một chuông thủy tinh và đốt 1 cây nến trong quả chuông này Sau khi ngọn nến tắt, khí trường bên trong quả chuông có thể là 3 - 5% CO2) ở 37oC trong thời gian 18 – 24 giờ

Hình 1.3: Khuẩn lạc Hi mọc trờn mụi trường chocolate

Sau 16 – 18 giờ nuôi cấy, Hi phát triển thành những khuẩn lạc bóng

mờ, vồng nhẹ, đường kính từ 1- 2mm và khụng gõy tan huyết Vi khuẩn Hib

luôn vỏ, khuẩn lạc thường sáng bóng, nhày ướt, óng ánh khi ánh sáng chiếu vào và có đường kính lớn hơn Ngoài ra, môi trường nuôi cấy vi khuẩn thuần nhất thường có mùi hăng đặc biệt (hăng indol) Sau 24 – 48 giờ, trạng thái mất vỏ xuất hiện, tính óng ánh biến mất, vi khuẩn tự ly giải và có thể tính chất bắt màu Gram thay đổi

Trờn môi trường lỏng, Hi thường phát triển làm đục môi trường Tình

trạng mất vỏ xảy ra sớm hơn trờn mụi trường thạch, vì vậy nếu muốn xác định vỏ cần chọn thời điểm nuôi cấy thích hợp (18 giờ)

Haemophilus influenzae được phân biệt với những loại Heamophilus

khác ở các đặc điểm sau đây:

Tính chất sinh hóa đặc trưng của Hi :

Tớnh chất sinh hóa đặc trưng của Hi là nhu cầu đòi hỏi bắt buộc 2 yếu

tố phát triển là X và V trong môi trường nuôi cấy Tớnh chất này có thể được xác định bằng một trong các thử nghiệm sau [11], [32], [78], [117]:

Hình 1.4: Thử nghiệm với bằng 3 khoanh giấy X, V và XV, cho thấy vi

khuẩn đòi hỏi bắt buộc phải có cả 2 yếu tố X và V cho sự phát triển

1.1.3 Đặc điểm phân loại theo typ huyết thanh (serotype) và biotype của Haemophilus influenzae

1.1.3.1 Đặc điểm phân loại Hi theo serotype (typ huyết thanh) [11], [32], [78]

Năm 1930, Hi được xác định thành 2 nhúm chớnh, đó là loài không vỏ

(khụng xỏc được typ huyết thanh - non typeable) và loài có vỏ (xác định được typ huyết thanh - typeable) Dựa trên tính đặc hiệu kháng nguyên của vỏ

polysaccharide, vi khuẩn Hi có vỏ được chia ra thành 6 typ huyết thanh từ a đến f Theo hầu hết các nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Hi gõy bệnh thuộc loại

có vỏ, nhiều nhất là Hi typ b.

1.1.3.2 Đặc điểm phân loại Hi theo biotype (typ sinh học)

Biotype Test Urease Test IndolCác tính chất hoá họcOrnithin decarboxylase (ODC)

-Bảng 1.2: Phân loại Haemophilus influenzae theo typ sinh học

Kilian đã đưa ra phương pháp sử dụng một số thử nghiệm sinh hoá để

xác định biotype và đặc điểm sinh học của các loài Haemophilus dựa trên kết quả của 3 thử nghiệm sinh hoá: tìm khả năng sinh Indol, hoạt động của hai enzym Urease và Decarboxylase của vi khuẩn Trước đõy, Kilian nghiên cứu

và chia Hi thành 4 biotype từ I đến IV Những biotype này độc lập với typ huyết thanh của vi khuẩn đó, bởi vỡ các chủng Hi không có vỏ cũng cho kết

quả tương tự với ba phản ứng sinh hoá ở trên Sau này, cũng với những thử

nghiệm tương tự, Kilian đã bổ sung thêm 4 biotype từ V đến VIII Vì vậy, Hi

được chia ra làm 8 typ như sau theo tiêu chuẩn của Killian (bảng 1.2) [32]

Hình 1.5 : Đại thực bào nuốt vi khuẩn Hib bị opsonin hóa bởi kháng

thể đặc hiệu của kháng nguyên vỏ và kháng nguyên thân [78]

Miễn dịch tự nhiên đối với Hib rất đa dạng, bao gồm một sự hợp nhất

phức tạp của nhiều thành phần trong hệ thống miễn dịch: 1) Các yếu tố miễn dịch niêm mạc, 2) Kháng thể dịch thể, 3) Sự opsonin hóa và quá trình hoạt hóa các phản ứng viêm qua trung gian bổ thể, 4) Khả năng thực bào, diệt vi khuẩn bởi những đại thực bào và tế bào đa nhân, 5) Chức năng miễn dịch qua trung gian tế bào lympho T Trong đó khó có thể đánh giá rạch ròi cơ chế miễn dịch nào là quan trong nhất trong những cơ chế bảo vệ cơ thể vật chủ Tuy nhiên, hầu hết các cá thể có được khả năng miễn dịch bảo vệ trong những

năm đầu của cuộc đời mà không mắc bệnh nhiễm khuẩn Hib lan tràn Khả

năng miễn dịch thu được một cách tự nhiên này, đó là kết quả của đáp ứng

với sự xâm nhiễm họng - mũi của Hib cũng như sự xâm nhiễm không triệu

chứng ở ruột của hệ vi khuẩn đường ruột bình thường, dẫn đến có phản ứng

chéo với kháng nguyên Hib Mối liên quan tỷ lệ nghịch giữa nguy cơ mắc

bệnh nhiễm khuẩn do Hib đặc thù đối với tuổi và nồng độ kháng thể tự nhiên kháng Hib có được trong những năm tháng đầu của cuộc đời Đặc điểm này

cũng đã nêu lên được tầm quan trọng của kháng thể trong việc bảo vệ cơ thể

khỏi bệnh nhiễm khuẩn lan tràn do Hib Hiện tượng trên được mô tả đầu tiên

bởi Fothergill và Wright năm 1933 [36], người ta biết trẻ sơ sinh đã có được

kháng thể diệt khuẩn Immunoglobulin G (IgG) từ mẹ, kháng thể này yếu dần

đi trong những tháng tuổi đầu tiên, đồng thời với nguy cơ nhạy cảm theo tuổi giữa tháng tuổi thứ 6 cho đến 2-4 tuổi nên để bảo vệ cơ thể cần phải thông qua việc gây miễn dịch chủ động

Mặc dù đặc điểm miễn dịch tự nhiên đối với vi khuẩn Hib là miễn dịch

đáp ứng với vài loại kháng nguyên bề mặt của vi khuẩn này, song kháng thể kháng polysaccharide vỏ thuộc typ b (PRP) dường như có tầm quan trọng

nhất Đối với loài Hi typ b, 90% tổng số những kháng thể kháng PRP có khả

năng hoạt hóa bổ thể giúp tăng hoạt động thực bào và diệt vi khuẩn nhờ opsonin hóa để bảo vệ cơ thể Ở người, trước khi có kháng sinh, việc sử dụng

thụ động globulin miễn dịch chống lại Hib đã là phương pháp để điều trị hiệu quả bệnh nhiễm khuẩn lan tràn này Tuy nhiên, kháng nguyên vỏ của Hib lại

không được nhận biết bởi đại thực bào và tế bào lympho T nhưng lại kích thích cỏc dũng tế bào lympho B đặc hiệu, do đó được gọi là kháng nguyên

độc lập với tế bào T Vì vậy, kháng nguyên vỏ của Hib sẽ bị hạn chế về khả

năng đáp ứng miễn dịch, không hoạt hóa được các tế bào lympho T hỗ trợ đặc hiệu Tế bào T hỗ trợ tác động đến sự chín muồi, biệt hóa và tăng sinh các tế bào B để những tế bào này trở thành tương bào sản xuất kháng thể Tế bào T

hỗ trợ cũng có thời gian sống dài và tạo nên trí nhớ miễn dịch cần thiết cho đáp ứng tăng cường tiếp theo khi cơ thể tiếp xúc trở lại với kháng nguyên này Kết quả của những đáp ứng kháng thể thiếu sự tham gia của tế bào T thì hiệu lực miễn dịch sẽ thấp Để khắc phục nhược điểm này, thành phần PRP đã

được cộng hợp (liên kết cộng hóa trị) với nhiều loại protein có tính sinh miễn

dịch làm tăng cường khả năng nhận biết của đại thực bào và tế bào T trong

sản xuất vacxin, để có những ưu điểm như sau:

1) Tạo được nồng độ kháng thể cao hơn, đặc biệt ở trẻ nhỏ

2) Khi nhắc tiêm nhắc lại, vacxin sẽ kích thích miễn dịch tăng lên, vì thế đõy là một phương pháp làm tăng tối đa tính miễn dịch

3) Đáp ứng miễn dịch chín muồi hơn, đặc thù hơn bởi sự chiếm ưu thế của các kháng thể IgG-1

4) Việc dùng trước hay dùng đồng thời các protein mang (dạng như độc tố uốn ván hoặc bạch hầu) đã tăng cường đáp ứng của tế bào T, nhờ

hapten-đó làm tăng tối đa đáp ứng miễn dịch với PRP khi cộng hợp với chất mang

1.1.5 Khả năng gõy bệnh VMN của vi khuẩn Hib

1.1.5.1 Đặc điểm sinh bệnh học [13]

Hib lây truyền qua tiếp xúc hoặc hít phải các chất bài tiết bị nhiễm

khuẩn của đường hô hấp Sau khi định cư ở vùng mũi họng, vi khuẩn có thể gõy nhiễm khuẩn đường hô hấp, lan ra tổ chức lân cận hoặc xâm nhập vào dòng máu Người ta cho rằng vi khuẩn từ mũi họng vào dòng máu do kết quả của sự vận chuyển trong những tế bào thực bào từ niêm mạc vào các mạch

bạch huyết Trong máu, những vi khuẩn Hib có vỏ PRP kháng lại được hiện tượng đại thực bào và hoạt tính bổ thể Ở trạng thái nhiễm khuẩn huyết, Hib

có thể lan tràn và vượt qua hàng rào mỏu – não Vị trí Hib từ máu vào dịch

não tủy là đám rối màng mạch, nơi có sự phân bố mạch cao VMN xảy ra thường có tương quan trực tiếp tới thời gian và tính chất nghiêm trọng của nhiễm trùng huyết (> 103 đơn vị tạo khuẩn lạc: CFU – Colony Formed Unit)

1.1.5.2 Đặc điểm lâm sàng của bệnh VMN [13]

Trên lâm sàng, VMN do Hi typ b có thể tiến triển âm ỉ trên vài ngày,

thường phối hợp với nhiễm trùng đường hô hấp trên hoặc đột ngột tiến triển

trong vài giờ Những dấu hiệu và triệu chứng của VMN do vi khuẩn này cũng giống hệt như triệu chứng và dấu hiệu gặp trong VMN do các vi khuẩn gây bệnh khác

Những dấu hiệu không đặc hiệu, bao gồm: sốt, ngủ gà, kích thích, chán

ăn, nôn, suy hô hấp và rối loạn tõm thần Đối với trẻ lớn thường có nhức đầu, cứng gáy, sợ ánh sáng Các dấu hiệu Brudzinski, Kernig và cứng gáy đặc trưng ít thấy ở trẻ dưới 15 tháng tuổi Thêm vào đó, những dấu hiệu khu trú

có thể xuất hiện sớm, có đến 1/3 số bệnh nhõn bị co giật trước khi nhập viện

Tỷ lệ tử vong bởi VMN do Hi typ b khoảng 5% và tỷ lệ mắc bệnh kéo

dài là 15 – 30%

1.1.6 Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm VMN do vi khuẩn Hib

Hi là loại vi khuẩn khó nuôi cấy, chỉ mọc trên môi trường giàu chất

dinh dưỡng có chứa đầy đủ hai yếu tố phát triển X (hemin), V (NAD hoặc NADP) và không có khả năng mọc trờn cỏc môi trường thông thường Vì

vậy, việc chẩn đoán VMN do Hib chủ yếu được thực hiện ở bệnh viện tuyến

tỉnh hoặc tuyến Trung ương dựa vào phương pháp nuôi cấy phân lập nên gặp rất nhiều khó khăn Thêm vào đó, đõy cũng là phương pháp thường được áp

dụng nhất ở Việt Nam nhưng khả năng phát hiện căn nguyên vi khuẩn Hib lại

1.1.6.1 Phương pháp nuôi cấy phân lập và xác định vi khuẩn Hib

Chẩn đoán vi khuẩn Hib từ bệnh phẩm dịch não tủy [117]

- Bệnh phẩm: lấy bệnh phẩm dịch não tủy (DNT) phải được thực hiện

bởi bác sĩ chuyên khoa có kinh nghiệm trong điều kiện và thủ thuật vô trùng Những trường hợp nghi ngờ bệnh nhân mắc VMN, DNT là bệnh phẩm tốt nhất được sử dụng cho phân lập hoặc phát hiện căn nguyên gây bệnh Lấy dịch não tủy nên chỉ sử dụng cho việc chẩn đoán và được cấy trực tiếp vào cả hai đĩa thạch nuôi cấy (01 đĩa thạch máu và 01 đĩa thạch chocolate) Ngay sau khi được lấy, bệnh phẩm nên được đưa ngay đến phòng xét nghiệm vi sinh để tiến hành các kỹ thuật chẩn đoán càng sớm càng tốt (trong vòng 1 giờ sau khi lấy bệnh phẩm) Không được để DNT bị ánh sáng trực tiếp chiếu vào hoặc để nhiệt độ quỏ núng hay quá lạnh Nếu bệnh phẩm không thể vận chuyển sớm

về phòng xét nghiệm thì có thể bơm bệnh phẩm DNT vào môi trường T-I (Trans-Isolate medium) và để qua đêm ở nhiệt độ 35oC T-I là môi trường hai

pha, rất thuận tiện cho nuôi cấy nguyên thủy N meningitidis và các loại vi

khuẩn gây bệnh khỏc cú trong bệnh phẩm DNT hay bệnh phẩm máu

- Nhuộm gram bệnh phẩm DNT:

Đõy là một phương pháp chẩn đoán sơ bộ Hib cũng như các vi khuẩn

khỏc gõy VMN Có thể thực hiện bởi kỹ thuật nhuộm gram từ cặn dịch não

tủy hoặc bằng cách phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của Hib trong DNT bởi

kỹ thuật ngưng kết hạt latex (sẽ đề cập ở phần 1.1.6.2) Kết quả dương tính của một trong hai kỹ thuật này đều cho thấy bằng chứng nhiễm trùng, thậm chí nuôi cấy có thể thất bại

+ Tiến hành ly tâm dịch não tủy 20 phút với tốc độ 2000 vũng/ phỳt.+ Dùng pippett nhỏ giọt sạch vô trùng hút nước nổi chuyển sang một ống nghiệm sạch vô trùng có nắp đậy

+ Tiến hành nhuộm gram một tiêu bản từ cặn bệnh phẩm DNT vừa ly tâm Để khô tiêu bản

+ Soi tiêu bản ở vật kớnh ì 100 để tìm vi khuẩn gây bệnh Nếu trên tiêu bản xuất hiện các trực khuẩn gram (-) nhỏ, đa hình thái (có thể ở dạng cầu trực khuẩn, trực khuẩn hoặc mảnh dài như sợi chỉ) thì đõy là dấu hiệu gợi ý

quan trọng định hướng chẩn đoán VMN do Hib.

của Hib thường có đặc điểm: khuẩn lạc có kích thước 1,0-1,5mm, vồng nhẹ,

sáng bóng, nhày ướt, óng ánh khi ánh sáng chiếu vào và khụng gõy tan máu Ngoài ra, môi trường nuôi cấy vi khuẩn thuần nhất thường có mùi hăng đặc biệt (hăng indol)

- Xác định

+ Nhuộm gram: nhuộm vi khuẩn từ khuẩn lạc mọc được trên đĩa thạch chocolate sau khi nuôi cấy từ dịch não tủy, nhận thấy trên tiêu bản có các trực khuẩn gram (-) nhỏ, đa hình thái

+ Tiến hành thử nghiệm xác định nhu cầu đòi hỏi 2 yếu tố phát triển (growth factors) X và V: thử nghiệm X, V dương tính hoặc thử nghiệm “Vệ

tinh” với chủng S aureus ATCC dương tính.

+ Tiến hành định typ huyết thanh để xác định Hib bằng kháng huyết

thanh mẫu [32], [78]

+ Tiến hành xác định biotype (typ sinh học) các chủng Hib phân lập được bằng thanh xác định tớnh chất sinh vật hóa học Api 10s (bioMộrieux) [8].

Chẩn đoán vi khuẩn Hib từ bệnh phẩm máu

Trong chẩn đoán VMN, ngoài bệnh phẩm dịch não tủy thường được sử dụng trong chẩn đoán thì bệnh phẩm máu cũng được sử dụng với tỷ lệ dương tính khá cao [8], [117].

- Quy trình cấy máu gồm các bước như sau: [117]

+ Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ, bao gồm: găng tay, bơm kim tiêm vô khuẩn, dây garo, gạc vuụng, bụng vờ trũn vô khuẩn, băng vết thương nhỏ, môi trường cấy máu và dung dịch sát khuẩn (cồn iod hoặc povidone-iodine,

có thể dùng cồn 70o) Kích thước của kim phụ thuộc vào vị trí lấy bệnh phẩm

và kích thước của tĩnh mạch Kim cỡ 23, tức là dài 20 – 25mm hoặc kim bướm thường được dùng cho trẻ em

+ Chọn một cánh tay và buộc dây garo phía trên vị trí cần lấy máu để ngăn dòng chảy của máu tĩnh mạch Tĩnh mạch lớn ở cẳng tay là loại tĩnh mạch nổi thường được lựa chọn

+ Rửa sạch vùng da định lấy máu bằng cồn 70o và sau đó sát khuẩn bằng cồn iod hoặc povidone-iodine Để khô Nếu cần phải bắt tĩnh mạch lại thì phải sát trùng nơi lấy bệnh phẩm một lần nữa

+ Sau khi sát trùng da và để khô, chọc kim vào trong tĩnh mạch với mặt nghiêng của mũi kim ngửa lên trên Khi kim đã vào tĩnh mạch, hút máu bằng cỏch rút từ từ pittong, đều đặn Sau khi hút đủ lượng máu cần thiết (1-2 ml để cấy vào 20ml môi trường canh thang dinh dưỡng), tháo bỏ dây garo và đặt một viờn bụng trũn vô khuẩn đã tẩm cồn lên phía trên mũi kim

(Chú ý: không để cho không khí lọt vào trong tĩnh mạch)

+ Rút bơm kim tiêm ra và đặt cố định viờn bụng trũn chắc ở vị trí lấy máu cho đến khi không còn chảy máu

+ Bơm máu vào môi trường dùng để cấy máu theo nguyên tắc vô trùng (thông thường nên sử dụng chai cấy máu có môi trường pha chế sẵn của Hãng Becton – Dickinson) [8]

+ Đặt một băng nhỏ lên vết thương Ngay lập tức vận chuyển bình cấy máu về phòng xét nghiệm vi sinh Bình cấy máu có thể được giữ ở nhiệt độ phòng (20o – 25oC) khoảng 4-6 giờ trước khi ủ ấm ở 35o – 37oC, thông khí với khí trường 5 – 10% CO2

(Chú ý: Bình cấy máu không được giữ trong tủ lạnh Ủ ấm trong quá trình vận chuyển có thể sử dụng nhiệt độ 25o – 35oC)

+ Trong một số trường hợp cần lấy máu để thực hiện phương pháp chẩn đoán khỏc, nờn lấy vào các ống nghiệm chân không vô trùng

- Theo dõi và chẩn đoán bình cấy máu [117]

Bình cấy máu được kiểm tra sau 14 – 17 giờ ủ trong tủ ấm và sau đó là theo dõi hàng ngày cho hết 7 ngày Bất cứ có xuất hiện đục hay tan máu trong môi trường đều có thể cho thấy là cấy máu (+), do đó lập tức lắc đều bình cấy máu và cấy chuyển sang đĩa thạch chocolate theo các bước như sau:

+ Sát khuẩn nút cao su chai cấy máu bằng cồn 70o và povidone-iodine.+ Hút 0,5 ml từ môi trường cấy máu bằng bơm kim tiêm vô trùng và nhỏ lờn gúc (gần rìa đĩa Petri) đĩa môi trường chocolate

+ Sử dụng que cấy vô trùng ria cấy theo phương pháp phân vùng Ủ đĩa thạch ở 37oC với khí trường 5% CO2 khoảng 18-24 giờ Nếu trên đĩa thạch có

khuẩn lạc Hib mọc, tiến hành xác định Hib và typ sinh học (như phần chẩn

đoán dịch não tủy)

1.1.6.2 Phương pháp phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của Hib trong DNT bằng phương pháp ngưng kết hạt latex [8], [32]

Nguyên lý: Phát hiện kháng nguyên vỏ polysaccharide của Hib trong

dịch não tủy bằng kháng thể (đơn giá) kháng vỏ đặc hiệu với Hib được gắn

lên bề mặt gắn hạt latex Kết quả phản ứng dương tính khi hỗn dịch làm phản ứng trên lam kính hoặc phiến giấy xuất hiện các hạt ngưng kết; phản ứng âm tính khi không có hiện tượng ngưng kết xảy ra

Thực hiện kỹ thuật:

- Dụng cụ, hóa chất: Pasteurex Meningitis Hib (KHT đa giá); Bio

Merieux Slidex meningite KIT (HT đa giá)

- Tiến hành kỹ thuật:

+ Tiến hành ly tâm dịch não tủy 20 phút với tốc độ 2000 vũng/ phỳt.+ Dùng pippett nhỏ giọt sạch vô trùng hút nước nổi chuyển sang một ống nghiệm sạch vô trùng có nắp đậy

+ Đun nước nổi DNT trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 100oC/5 phút.+ Lắc lọ kháng thể mẫu có gắn hạt latex cho đến khi có dung dịch thuần nhất

+ Nhỏ một giọt của mỗi loại kháng thể mẫu gắn hạt latex lên lam kính

ở giữa vòng tròn đã được khoanh bằng bút viết kính hoặc phiến giấy dùng một lần để thực hiện các phản ứng ngưng kết

+ Nhỏ 30 – 50 àl dịch não tủy vào từng loại kháng thể mẫu đã được nhỏ lên lam kính hoặc phiến giấy

+ Xoay tròn lam kính hoặc phiến giấy làm phản ứng 2 – 10 phút (hoặc dựng mỏy lắc tròn với tần số 100 vũng/ phỳt)

- Đọc kết quả: phản ứng âm tính khi huyền dịch làm phản ứng vẫn đục

và có màu sữa nhạt; phản ứng dương tính khi xuất hiện các hạt ngưng kết xảy

ra trong vòng 2 phút sau khi thực hiện phản ứng và huyền dịch trở nên trong

1.1.6.3 Phương pháp phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của Hib trong DNT bằng kỹ thuật điện di đối lưu [8]

Nguyên lý: Đõy là loại phản ứng kết tủa dựa trên nguyên lý khỏng

nguyên tích điện âm từ giếng ở phía cực âm và kháng thể tích điện dương từ giếng ở phía cực dương (các Ig ở pH 8,4 di chuyển về cực âm của hệ mao dẫn theo lực điện thẩm thấu nội) sẽ di chuyển ngược chiều nhau, khi gặp nhau sẽ hình thành đường tủa đặc hiệu trong gel (thạch điện di)

/ Kháng huyết thanh thỏ kháng Hib

/ Kháng nguyên chuẩn polysaccharide của Hib (NIH – Mỹ).

/ Thạch điện di (Sigma); hóa chất pha thạch và đệm điện di (đệm Bacbital – Sigma) Trong đó, thạch nền: agarose thường được pha 3% trong nước cất Thạch điện I (type I - Sigma): 1% trong đệm bacbital pH 8,4

- Tiến hành kỹ thuật:

+ Phủ một lớp mỏng thạch nền lên phiến kính, phơi khô

+ Đặt phiến kớnh lờn bàn mức ngang và đổ thạch 1% lên (6ml cho phiến kớnh 7ì7cm)

+ Để khô, đục giếng trên thạch với kích thước như sau: đường kính giếng khoảng 2-3mm; khoảng cách từ giếng kháng thể đến giếng bệnh phẩm

là 5mm

+ Nhỏ hàng trên là kháng thể (kháng huyết thanh) 5àl/ giếng; hàng dưới nhỏ 5àl bệnh phẩm (dịch não tủy); chứng dương là 5àl polysaccharide typ b

của Hib + 1àl thuốc nhuộm Bromophenol.

+ Đặt vào bể điện di, chạy với tốc độ 8mA/30 phút

+ Đọc kết quả sau 1-3 giờ dừng chạy điện di, nếu dương tính sẽ thấy vạch tủa trắng gần phía giếng kháng thể (cực dương)

1.1.6.4 Phương pháp phát hiện đoạn ADN đặc hiệu của Hib trong DNT bằng

kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR được biết là kỹ thuật chẩn đoán cho kết quả nhanh, nhạy và đặc

hiệu với Hib ở DNT Hơn thế nữa, kỹ thuật này cũng góp phần nâng cao tối

đa khả năng quản lý các trường hợp viêm màng não nhằm giảm tỷ lệ trầm trọng, tỷ lệ chết và những phức tạp trong điều trị các bệnh nhiễm trùng xâm

hại do Hib Tại những cơ sở xét nghiệm lâm sàng, kỹ thuật PCR truyền thống thường được dùng nhất trong chẩn đoán Hib Tuy nhiên, hiện nay kỹ thuật Realtime-PCR cũng đã được sử dụng trong phân loại và xác định Hi nói chung và Hib nói riêng với độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao [8], [60], [63], [79].

Cặp mồi này tương tự và bổ sung với trình tự acid nucleic của vùng bảo

tồn gen “hpD” đặc hiệu cho typ huyết thanh b của Hi Cả hai mồi bao gồm

khoảng 24 cặp base (base pair)

+ Thang ADN mẫu dùng trong diện di gen

+ Đệm, nước khử ion và MgCl2 25mM

- Các bước chẩn đoán PCR:

+ Tách chiết ADN của Hib trong dịch não tủy:

/ Bằng kỹ thuật vô trùng lấy 100àl DNT cho vào một ống ly tõm sạch,

vô trùng

/ Cho ống nghiệm chứa DNT cho vào nồi cách thủy đun 100o/15 phút./ Ly tõm ống nghiệm bệnh phẩm DNT (sau khi đã đun cách thủy) với tần số 10.000 vòng/ phút ì 5 phút

/ Lấy 10àl nước nổi sau khi ly tõm sử dụng để làm mẫu ADN

khử ion và cặp mồi (mồi 1,2: 2 àL hoặc 40pm) cho mỗi ống

/ Hỗn hợp phản ứng được chạy theo chương trình cài đặt của máy điều nhiệt (Ependorff, Germany) khoảng 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ cú cỏc thông số dưới đây: giai đoạn biến tính khoảng 2 phút ở 94oC; giai đoạn gắn mồi khoảng 2 phút ở 56oC; giai đoạn kéo dài khoảng 2 phút ở 72oC Trong đó, giai đoạn biến tính đầu tiên cần 10 phút ở 94oC và giai đoạn kéo dài cuối cùng là 8 phút ở 72oC Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu ADN sau khi khuếch đại có thể được giữ ở 4oC cho đến khi phân tích Sản phẩm của phản ứng PCR để chẩn

đoán Hib được phát hiện bởi kết quả điện di trên thạch agarose.

+ Tách chiết ADN của Hib từ dịch não tủy dựa vào QIAamp blood kit

(Qiagen, Hilden, Germany) theo quy trình của nhà sản xuất

+ Tiến hành kỹ thuật:

Phản ứng khuếch đại được thực hiện với hỗn hợp phàn ứng có thể tích tổng là 25àL, chứa 2ìTaqMan universal master mix (Perkin-Elmer-Biosystems), mỗi primer với nồng độ 400nM, 200nM probe, và 1àl ADN tách chiết

Quá trình khuếch đại PCR có thể được thực hiện trên nhiều mẫu giống nhau dựa trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM 7700 Các thông số chuẩn cho quá trình khuếch đại: 2 phút ở 50oC, và 10 phút ở 95oC cho 40 chu kỳ; trong đó với một chu kỳ gồm 15 giây ở 95oC và 1 phút ở 60oC

Kết quả của phản ứng RT-PCR được phân tích phần mềm cho hệ thống phát hiện trình tự, phiên bản 1.7

1.1.6.5 Đánh giá các kỹ thuật phát hiện Hib trong chẩn đoán VMN

Giá trị chẩn đoán của các kỹ thuật phát hiện Hib gây VMN được giới

thiệu ở trên đó cú một số nghiên cứu, đánh giá và cho thấy độ nhạy, độ đặc hiệu của từng phương pháp

- Phương pháp nuôi cấy chẩn đoán Hib thường có độ nhạy không cao

(khoảng 50 – 55%), nhưng độ đặc hiệu là 100% Ngoài ra, phương pháp này cũn giỳp cho những nhà vi sinh lõm sàng xác định được mức độ nhạy cảm với

kháng sinh của những chủng Hib gây bệnh phân lập được mà các phương

pháp khác thường không thực hiện được[8]

- Phương pháp phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của Hib trong dịch não

tủy bằng phương pháp ngưng kết hạt latex là phương pháp thực hiện rất đơn giản nhưng có độ nhạy và độ đặc hiệu khá cao (độ nhạy 95%, độ đặc hiệu 99,6%) [8]

- Phương pháp phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của Hib trong dịch não

tủy bằng kỹ thuật điện di đối lưu có độ nhạy 97%, độ đặc hiệu 100% [8]

- Phương pháp phát hiện đoạn ADN đặc hiệu của Hib trong dịch não

tủy bằng kỹ thuật PCR có độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 99% [8], [63]

1.2 Tỷ lệ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi mang Hib, tình hình viêm màng não (VMN) do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi trong nước và trên thế giới

1.2.1 Tỷ lệ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi mang Hib

1.2.1.1 Khái niệm về người khỏe mạnh mang vi khuẩn (Hib)

Người khỏe mạnh mang vi khuẩn (carriers) là những người mang vi khuẩn gây bệnh trong cơ thể mà không có biểu hiện triệu chứng hoặc không phát hiện thấy dấu hiệu đáp ứng miễn dịch của cơ thể [17]

Trạng thái mang vi khuẩn của cơ thể có thể tồn tại với thời gian ngắn hoặc dài, có thể gián đoạn hoặc liên tục Những người mang vi khuẩn thường

có khả năng lây truyền cho người khác Vì vậy, người lành mang Hib đồng

nghĩa với vi khuẩn này định cư trên cơ thể và xác định được sự xuất hiện của

vi khuẩn Hib sống ở màng nhày họng (pharyngeal mucosa) Tuy nhiên, kết

quả xác định này cũn phụ thuộc vào độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp

xét nghiệm tìm vi khuẩn Hib còn sống ký sinh ở màng nhày họng người khỏe

mạnh [17]

1.2.1.2 Phương pháp xác định

Trong hầu hết các nghiên cứu điều tra về người khỏe mạnh mang Hib,

khó khăn xảy ra trong việc phân lập vi khuẩn này có thể dẫn đến kết quả tỷ lệ

mang Hib thu được thường thấp hơn so với thực tế Qua một số nghiên cứu,

cho thấy phương pháp sử dụng tăm bông lấy bệnh phẩm từ họng miệng

(oropharyngeal swabs) dùng để nuôi cấy xác định người lành mang Hib

thường có kết quả tương tự hoặc cao hơn so với nuôi cấy từ tăm bông lấy bệnh phẩm ở họng mũi (nasopharyngeal swabs) [66]

Trạng thái người khỏe mạnh mang Hib thường được xác định bằng các

kỹ thuật nuôi cấy Vì vậy, tất cả các bước thực hiện trong kỹ thuật xét nghiệm dùng cho nghiên cứu điều tra vi sinh này cần phải đạt được độ chuẩn xác tối

đa Những sai số có khả năng xảy ra trong quá trình xác định tỷ lệ Hib ký sinh

ở họng người khỏe mạnh, bao gồm: kỹ thuật ngoáy họng lấy bệnh phẩm (đây

là kỹ thuật khó duy trì ổn định), sự sống sót của vi khuẩn trong quá trình vận chuyển bệnh phẩm cho đến khi nuôi cấy vào môi trường; và sự xuất hiện nhiều vi khuẩn khác nhau có trong bệnh phẩm nhưng lại có sự tương đồng về hình thái khuẩn lạc, nên có thể dẫn đến chọn khuẩn lạc nhầm Sự khác biệt

của các phương pháp nuôi cấy được sử dụng trong phân lập Hib từ tăm bông

bệnh phẩm ngoáy họng là yếu tố chính dẫn đến những khó khăn và phức tạp trong việc giải thích các số liệu từ các nghiên cứu khác nhau [17]

Hình 1.6: Hình ảnh giải phẫu đường hô hấp trên

1.2.1.3 Dịch tễ học của trẻ khỏe mạnh mang Hib và một số yếu tố ảnh hưởng

Những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến dịch tễ học của Hib, đó là

yếu tố xã hội học (soccial) và nhân khẩu học (demographic) Khả năng mang

Hib ở trẻ nhỏ dường như có liên quan rất gần đến khả năng, mức độ phơi

nhiễm (likelihood of exposure to the organisms) đối với vi khuẩn này [17]

Hốc mũi

Lưỡi

Thanh quản

Họng mũi Họng miệng Thanh quản-hầu (vùng dưới hầu) Thực quản

Hi là thành viên của hệ vi khuẩn ký sinh ở đường hô hấp trên Trong

đó, Hib có ở 1-5% trẻ em khoẻ mạnh và không có biểu hiện bệnh [78] Tỷ lệ

mang vi khuẩn thấp nhất ở người lớn và trẻ nhỏ, cao nhất ở lứa tuổi mẫu giáo [58], [110], [114] Hầu hết các điều tra đều cho thấy, nuôi cấy từ tăm bông

bệnh phẩm ngoáy họng miệng hay họng mũi phát hiện thấy Hib có khoảng 3 - 5% trẻ nhỏ dưới năm tuổi [58], [110], đây là lứa tuổi với tỷ lệ mang Hib được

xem là nổi trội nhất [47] Một số nghiên cứu trong nước và trên thế giới đã cho thấy:

+ Tại Việt Nam, nghiên cứu của Lê Huy Chính và cộng sự về tỷ lệ trẻ

em dưới 60 tháng tuổi mang Hi (chưa có điều kiện định typ huyết thanh) ở

cộng đồng một số tỉnh miền Bắc cho kết quả: 21,4% (trẻ dưới 12 tháng); 35,5% (trẻ 13 - 24 tháng); 32,5% (trẻ 25 - 36 tháng); 27,7% (trẻ 37 - 48 tháng)

và 31,6% (trẻ 49 - dưới 60 tháng) [4] Tuy nhiên, hiện nay có rất ít nghiên cứu

đánh giá, xác định tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang vi khuẩn Hib.

+ Trên thế giới, hầu hết các nghiên cứu về trẻ khỏe mạnh mang Hi đều

được định typ huyết thanh Nghiên cứu của Staphanie H Factor và cộng sự về

tỷ lệ trẻ dưới 5 tuổi có mang Hib tại Châu Á, cho thấy tỷ lệ chung là 6%

Trong đó: 3% (trẻ 2 – 5 tháng); 10% (trẻ 6 - 11 tháng); 5% (trẻ 12 - 23 tháng); 8% (trẻ 24 - 35 tháng); 4% (trẻ 36 - 47 tháng) và 5% (trẻ 48 - 59 tháng) [94] Nghiờn cứu khác của Gúmez Elizabeth và cộng sự về dịch tễ học

trẻ khỏe mạnh mang Hib tại Santo Domingo, nước cộng hòa Dominic cho thấy tỷ lệ trẻ mang Hib: 1,5% (trẻ dưới 5 tháng); cao nhất 12,5% (trẻ 6 - 11

tháng); 6% (trẻ 12 - 23 tháng); 7,9% (trẻ 24 - 35 tháng); 9,8% (trẻ 36 - 47 tháng) [41] Tại Thổ Nhĩ Kỳ, nghiên cứu của Muge Oguzkaya–Artan và cộng

sự cho thấy tỷ lệ trẻ nhỏ ở lứa tuổi 5 - 7 mang Hib với tỷ lệ là 4,2% [76] Bên

cạnh đó, nghiên cứu của Lucia Ferro Bricks tại Sao Paulo Brasil với 1200 trẻ nhỏ dưới 6 tuổi được chăm sóc tại 29 Nhà trẻ Taubatộ (trong đó, 213 trẻ

không tham dự, còn lại 987) cho thấy 172 trẻ phân lập được Hi (17,4%), trong

đú có 73 chủng là Hib Nghĩa là tỷ lệ trẻ mang Hib ở các nhà trẻ được nghiên

cứu là 7,4% [25]

Qua hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy tỷ lệ mang Hib ở những trẻ được chăm sóc tại các nhà trẻ thường rất cao Trong đó, tỷ lệ mang Hib thấp ở

lứa tuổi dưới 6 tháng, tỷ lệ cao nhất trong lứa tuổi từ 6 tháng - 5 tuổi (đặc biệt

là 6 - 11 tháng) và giảm dần cho đến tuổi trưởng thành [17], [25], [34], [41]

Tuy nhiên, còn một số yếu tố khác có thể làm tăng hoặc giảm tỷ lệ trẻ

khỏe mạnh mang vi khuẩn Hib

- Ảnh hưởng của điều kiện sống lên tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang Hib

Điều kiện sống đông đúc như ở các căn hộ, trung tâm chăm sóc trẻ ban

ngày cũng góp phần làm cho tỷ lệ mang vi khuẩn Hib ở trẻ nhỏ có thể cao lên

một cách đáng kể Một số nghiên cứu cho thấy khi xảy ra một nhiễm khuẩn

xâm lấn do Hib, tỷ lệ mang vi khuẩn này ở những đứa trẻ khác trong nhóm là

58% ở các trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày và 91% ở các nhà giữ trẻ nhỏ hơn Tương tự, trong một gia đình, khi có một trường hợp bị nhiễm bệnh do

Hib xảy ra, tỷ lệ nhiễm khuẩn đã được khảo sát là 60-70% giữa các anh em

ruột và 20% ở các bậc cha mẹ [17], [58] Tuy nhiên, một số nghiên cứu khác

cũng cho thấy tỷ lệ nhiễm khuẩn Hib cao ở một số trung tâm chăm sóc trẻ ban

ngày cho dù tại đó không có trường hợp nào mắc bệnh xảy ra Điều này đã

cho thấy vi khuẩn Hib được lây truyền giữa những trẻ mang vi khuẩn không

có triệu chứng Mặc dù trên thực tế cho thấy tỷ lệ trẻ mang Hib thường ít hơn 5%, nhưng tỷ lệ mang vi khuẩn Hib tại các trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày

được báo cáo chiếm khoảng 15-25% [41], [58], [110] Điển hình, trong một nghiên cứu lâu dài 18 tháng tại một trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày ở Dallas, người ta thấy mặc dù không có một trường hợp nào mắc bệnh nhưng tỷ lệ

mang vi khuẩn Hib trung bình là 10%, trong đó: ở trẻ từ 18-35 tháng tuổi tỷ lệ

mang vi khuẩn là 71%, và 48% ở trẻ từ 36-71 tháng tuổi Điều này gợi ý rằng nguồn vi khuẩn ở lứa tuổi mẫu giáo có thể bị lây từ lứa tuổi bé hơn Sự xâm chiếm của vi khuẩn ở tỵ hầu có thể tồn tại hàng tháng [58]

- Ảnh hưởng của tiêm chủng vacxin đặc hiệu lên tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang Hib

+ Vacxin cộng hợp (conjugate vaccine) và người lành mang Hib:

Sau 4 năm thực hiện tiêm chủng trên toàn quốc cho trẻ em ở Phần Lan,

Takala và cộng sự đã báo cáo tỷ lệ trẻ mang Hib giảm nhiều trong số 327 trẻ

đã được tiêm chủng vacxin PRP-D (vacxin Hib có chất cộng hợp có nguồn

gốc từ vi khuẩn bạch hầu – diphtheria-related substance) so với 398 trẻ chưa được tiêm chủng vacxin trong nghiên cứu trước (cụ thể là: 0% và 3,5%) Trong đó, những trẻ được lựa chọn nghiên cứu là những trẻ 3 tuổi khỏe mạnh đến trung tâm y tế địa phương và được lấy bệnh phẩm tăm bông ngoáy họng

để nuôi cấy xác định [102]

Tại một trung tõm chăm sóc trẻ ở Dallas, một nghiên cứu tiến cứu xác

định tỷ lệ trẻ mang Hib trong khoảng thời gian 1987 – 1989 [77] Trong giai

đoạn này vacxin liên hợp đã được giới thiệu ở Mỹ, vì vậy những đứa trẻ được nghiên cứu tại trung tõm này bao gồm cả trẻ đã được tiêm và không được tiêm vacxin Trong tổng số 283 trẻ được nghiên cứu, có 59 trẻ chưa được tiêm

vacxin phòng Hib và 89 trẻ đã được tiêm vacxin liên hợp (trong số đó 94% trẻ tiêm vacxin là loại PRP-D) Kết quả cho thấy tỷ lệ trẻ mang vi khuẩn Hib thu

được lần lượt là 21% và 9% Ngoài ra, nghiên cứu những trẻ phơi nhiễm đối

với Hib (tức là những đứa trẻ này sống cùng với ít nhất một trẻ có kết quả dương tớnh với Hib) cho thấy hiệu lực của vacxin liên hợp trong việc chống

lại sự định cư của vi khuẩn khi phõn tích riêng lẻ là 64% Trong đó, không có

sự tác động lên sự định cư của vi khuẩn Hib được tỡm thấy với việc tiêm

chủng loại vacxin PRP

Một nghiên cứu lõm sàng cơ bản ở trung tõm Atlanta cho thấy tỷ lệ

mang Hib giảm ở lứa tuổi từ 2 – 5, trong đó 70% trẻ được tiêm chủng vacxin liên hợp phòng Hib [70] và ở Apache, Navaro trẻ em da đỏ (Indian children)

đã được tiêm chủng vacxin Hib-OMPC (vacxin Hib có chất cộng hợp có

nguồn gốc từ cầu khuẩn màng não – meningococcal-related substance) phù hợp theo lứa tuổi [53]

Nghiên cứu tại Oxford Region nước Anh đã thực hiện tiêm chủng

vacxin cộng hợp PRP-T (vacxin Hib có chất cộng hợp có nguồn gốc từ vi

khuẩn uốn ván – tetanus-related substance) từ vùng này tới vùng khác để xác định tác dụng của vacxin qua một thời gian theo dừi ở những nhúm trẻ nhỏ được tiêm và không được tiêm vacxin trong cùng một thời điểm nghiên cứu Trẻ vừa mới sinh được lựa chọn để nghiên cứu với mục đích giảm tối thiểu

những sai số có liên quan đến những trẻ đã sẵn mang vi khuẩn Hib đem lại

Trong đó, những sai số từ mẫu nghiên cứu cũng đã được hạn chế bằng cách chỉ có một người thực hiện ngoáy họng và phõn tích xét nghiệm chuẩn xác thực hiện tại một phòng xét nghiệm [16] Tuy nhiên, một số yếu tố khác cũng

có thể ảnh hưởng đến sự phơi nhiễm đối với Hib hoặc nhạy cảm với khả năng

mang vi khuẩn này được xác định là lệ thuộc vào nhúm chứng thống kê (statistic control) Kết quả cho thấy, những trẻ em được tiêm vacxin liên hợp

ở lứa tuổi 2, 3 và 4 tháng tỷ lệ mang Hib thấp hơn nhúm chứng có ý nghĩa thống kê Phù hợp với điều này, tỷ lệ mang Hib thực tế thấp hơn ở nhúm tiêm vacxin so với nhúm chứng ở 6, 9 và 12 tháng tuổi Tỷ lệ mang Hib thu được

và mức độ phổ biến của Hi nhúm e, f không có sự khác nhau giữa nhúm tiêm

Tuy nhiờn, không có ảnh hưởng đến tỷ lệ mang Hib ở vùng họng miệng

(oropharyngeal carriage) [81] Tương tự cũng không có hiệu quả với tỷ lệ mang vi khuẩn ở vùng hầu họng của các loại vacxin polysaccharide khác được sử dụng: nóo mô cầu nhóm A, E và một số typ huyết thanh đối với

vacxin polysaccharide của Streptococcus pneumoniae [17], [47].

Vacxin cộng hợp có thể đem đến nồng độ kháng thể kháng PRP cao hơn trong huyết thanh trẻ em so với vacxin polysaccharide thông thường Nồng độ kháng thể trong huyết thanh cao có thể dẫn đến hiện tượng ngấm thụ động kháng thể IgG ra bề mặt của các màng nhày [56] Nghiên cứu một mẫu chuột nhắt, cho thấy nồng độ kháng thể IgG cần thiết để hạn chế sự định cư

của Hib là 7àg/mL Ngoài ra, nhiều nghiên cứu gần đõy cũng cho thấy kháng

thể IgG kháng lại PRP có ở màng nhày liên quan đến nồng độ kháng thể có trong huyết thanh sau khi tiêm vacxin [53] Kháng thể tiết IgA kháng lại PRP được tỡm thấy trong nước bọt của trẻ không đồng nhất với phát hiện IgA trong huyết thanh Điều này cho thấy kháng thể IgG trong nước bọt bắt nguồn

từ huyết thanh, trong khi IgA được sản xuất tại chỗ Dường như vacxin cộng hợp có thể làm tăng đáp ứng của kháng thể bề mặt IgA cũng như đáp ứng IgG

hệ thống miễn dịch, trong khi đã có bằng chứng cho rằng nồng độ IgG cao trong huyết thanh có liên quan đến sự ngăn chặn hiện tượng mang vi khuẩn, vai trò của IgA vẫn cũn chưa rừ ràng [17]

Sự giảm dần của nồng độ kháng thể kháng PRP trong huyết thanh và màng nhày theo thời gian đã đưa ra giải thích đơn giản về tác dụng của miễn

dịch nguyên thủy do vacxin cộng hợp lên sự định cư của Hib Trung bình

nhõn nồng độ chuẩn (Geometric mean titer: GMT) của kháng thể kháng PRP

có trong huyết thanh trẻ nhỏ ở Oxfordshire nước Anh cho thấy: ở 5 tháng tuổi ngay sau quá trình gõy miễn dịch là 5àg/mL [21]; GMT của trẻ 12 tháng tuổi

là 0,83àg/mL [22] Nồng độ kháng thể bằng 1àg/mL sau khi đáp ứng miễn

dịch đối với vacxin polyccharide là nồng độ được xác định có khả năng bảo

vệ cơ thể chống lại các bệnh nhiễm trùng xõm nhập do Hib trong một thời gian dài [56] Hiện tượng mang Hib và mang Hib kéo dài là do nồng độ kháng

thể trong huyết thanh hoặc màng nhày ở dưới ngưỡng

Kháng thể đặc hiệu góp phần như thế nào đến khả năng hạn chế sự tấn

công của Hib ở màng nhày họng vẫn chưa được giải đáp Các cơ chế có thể

bao gồm: hiện tượng thực bào opsonin hóa qua trung gian kháng thể, tác dụng tiêu diệt trực tiếp vi khuẩn, hoặc ức chế hướng thể rắn (stereotactic inhibition) của kháng thể Tuy nhiên, cơ chế kháng khuẩn qua trung gian kháng thể đơn giản không thể giải thích hoàn toàn cho sự thay đổi về sự định cư của vi

khuẩn ở những người tiêm vacxin Tình trạng những người đang mang Hib

thường không mất đi nhanh chóng sau khi tiêm vacxin [4] Kết quả này dễ

dàng được giải thích do sự ẩn nấp của Hib trong tế bào (intracellular

sequestration) [36] nên có thể hoàn lại vi khuẩn mà kháng thể trong dịch tiết không đến được Ngoài ra, cũng có thể vacxin cộng hợp không đủ khả năng

kích thích hệ miễn dịch những trẻ mang Hib, đặc biệt với kháng nguyên Hib

xuất hiện ở màng nhày Bên cạnh đó, hiện nay một số nghiên cứu cũng cho

thấy vacxin kháng Hib can thiệp vào mối quan hệ bình thường giữa Hib và cơ

thể Cơ chế chủ yếu bằng sự tăng nồng độ kháng thể kháng PRP huyết thanh và/ hoặc màng nhày của cơ thể trước khi cơ thể có bất cứ yếu tố phơi nhiễm nào với vi khuẩn này Thứ nhất, có thể chứng minh vai trò đầu tiên của vacxin

trong việc hạn chế sự định cư của Hib là ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn

Thứ hai, hiện tượng tăng hiệu giá nồng độ kháng thể (nguyên nhõn bởi sự tiếp

xúc của màng nhày với Hib ở cơ thể đã có miễn dịch) có thể dẫn đến sự loại trừ nhanh chóng hơn Hib ra khỏi cơ thể Ngoài ra, các bằng chứng ít có ý nghĩa khác như số lượng khuẩn lạc Hib đếm được trên môi trường cấy từ

những trẻ đã tiêm vacxin cũng được nhắc đến [22]

Trong giới hạn sinh thái học (ecologic term), Hib có thể tạm thời ký sinh ở họng Tiêm chủng vacxin có thể làm đảo ngược sinh thái học của Hib ở

những người tiêm vacxin, dẫn đến ảnh hưởng sõu sắc đến biến động của quần

thể Hib Sự tăng lên của kháng thể trong huyết thanh hoặc dịch nhày có thể đủ ảnh hưởng đột ngột đến kiểu lan truyền của Hib Dường như vậy, ảnh hưởng

này được xác định là trước tiên và lớn nhất thay vì yếu tố tiếp xúc gần giữa các trẻ nhỏ ở tại gia đình hay các cơ sở chăm sóc trẻ Sau đó, ảnh hưởng của vacxin sẽ trở thành rừ ràng và điển hình trong một quần thể rộng rói hơn

Hiện nay, có rất ít số liệu về sự thay đổi sinh thái học của Hib tại họng, ảnh

hưởng của vacxin liên hợp lên sự thay đổi này Tầm quan trọng của ảnh hưởng đó đã thúc đẩy những nỗ lực trong xõy dựng mẫu toán học để dự báo

trước động học của quần thể dõn số mang Hib và mắc bệnh do Hib sau khi sử

dụng vacxin cộng hợp [17]

Do bản chất khác nhau về thành phần hóa học và khả năng sinh miễn dịch, cho nên những loại vacxin cộng hợp khác nhau về thời gian có hiệu lực

bảo vệ và ảnh hưởng đến tình trạng mang Hib cũng như vai trò của sự lõy

nhiễm Bên cạnh đó, chế độ (regimen) tiêm chủng trong quần thể dõn số cũng

có thể ảnh hưởng đến bất cứ quá trình tạo ra nhóm miễn dịch nào (herd immunity) Ví dụ, sử dụng một liều vacxin cộng hợp củng cố sau khi đứa trẻ

12 tháng có thể kéo dài thời gian có nồng độ kháng thể kháng PRP cao ở trẻ

nhỏ, do đó làm nõng cao khả năng hạn chế sự lan truyền của Hib trong cộng

đồng [17]

- Ảnh hưởng của liệu pháp điều trị kháng sinh lên tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang Hib

Hầu hết các liệu pháp kháng sinh được sử dụng trong điều trị đều có thể

ảnh hưởng đến tỷ lệ mang Hib ở trẻ nhỏ Cụ thể, sử dụng rifampicin có thể loại bỏ tình trạng mang Hib ở họng và giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh thứ phát

do Hib khi tiếp xúc với nguồn lây [40] Ngoài ra, các kháng sinh như chloramphenicol, nhúm macrolides cũng có ảnh hưởng đến tỷ lệ mang Hib ở

họng [17], [33]

Nói túm lại, đã có nhiều các nghiên cứu dọc về đặc điểm của trẻ mang

Hib Cho thấy, một số trẻ em mang Hib nhất thời - thoáng qua, nhưng hầu hết trẻ mang Hib có khuynh hướng tồn tại nhiều tuần hoặc nhiều tháng [40], [42],

[62] Trong đó, quá trình tiếp xúc gần và phát tán rộng rói các chất bài tiết từ đường hô hấp trên được xem là nguồn lây nhiễm chủ yếu giữa những cá thể

Thậm chí, khi có sự tiếp xúc giữa một người mang Hib đã được xác định trước và một đứa trẻ nhạy cảm một cách gần gũi thì sự lan truyền Hib có thể

qua nhiều tuần, nhiều tháng [66], [110] Bijlmer đã đưa ra kết luận về động học dõn số và điều kiện sống của dân cư trong các làng mạc ở Gambia dẫn

đến những biến động về sự định cư và sự lan truyền của vi khuẩn Hib, do đó

sự tồn tại trạng thái mang Hib của trẻ em Gambia thường ngắn [18] Tuy

nhiên, hầu hết các nghiên cứu cũng đã cho thấy không có sự liên quan giữa

các yếu tố như: mùa, giới và chủng tộc với tỷ lệ mang Hib ở trẻ [40], [66] 1.2.1.4 Trẻ khỏe mạnh mang Hib và sự lan truyền bệnh tật

Hầu hết bệnh nhân mắc bệnh do Hib đều không tiếp xúc với những người đang mắc các bệnh nhiễm trùng xâm hại do Hib, bởi vì vi khuẩn này không có ổ chứa ở ngoài cơ thể Do đó, những người mang Hib không có

triệu chứng được xác định nguồn lây nhiễm chính Mối liên quan giữa tỷ lệ

người khỏe mạnh mang Hib với nguy cơ mắc bệnh là không đơn giản Đó là,

xuất hiện những trường hợp mắc bệnh nhiễm trùng trong khi tỷ lệ mang vi khuẩn thấp đã được mô tả [113] và không thấy mắc bệnh rõ ràng xuất hiện cho dù tỷ lệ mang vi khuẩn cao [44], [110] Hơn thế nữa, những vi khuẩn phân lập được từ họng thường có đặc điểm thiếu yếu tố độc lực gây bệnh cho

dù được tìm thấy khi phân lập ở bệnh nhân mắc nhiễm trùng xâm hại [17]

Giống như những điều tra về người khỏe mạnh mang Hib khác, điều tra

về dịch tễ học của các bệnh nhiễm trùng do Hib đã cho thấy sự phát tán nhanh của những chủng Hib là không theo quy luật Hiện tượng tấn công thứ phát của Hib đối với những người tiếp xúc trực tiếp trong một gia đình cao hơn

500 lần so với nguy cơ mắc bệnh của quần thể dõn chúng [83] Bên cạnh đó, một số nghiên cứu cho thấy tần số xuất hiện với tỷ lệ cao trẻ khỏe mạnh mang

Hib khi ở chung nhà hoặc chung trung tõm chăm sóc với người bệnh Điều này đã minh chứng những người mắc bệnh nhiễm trùng do Hib được xem là

nguồn lõy rất mạnh đối với tất cả những người tiếp xúc gần [17]

Vỏ của Hib có vai trò nõng cao khả năng sống sót của vi khuẩn này qua

áp lực bị thủy phõn trong suốt quá trình lõy nhiễm giữa các đối tượng trong cộng đồng [72] Tuy nhiên vẫn cũn nhiều điều chưa biết về sự lõy truyền của

Hib Các phương thức lây truyền giữa các cơ thể là gì? Thời gian có thể sống

sót của vi khuẩn này giữa các cơ thể là bao lõu? Giới hạn vị trí quần thể vi khuẩn định cư là ở chỗ nào và liều lượng vi khuẩn là bao nhiêu để đảm bảo cho quá trình lây truyền thành công? Có hay không bất cứ mối liên quan nào giữa mức độ liều nhiễm trùng hoặc số lượng vi khuẩn cơ thể mang với khả năng xảy ra bệnh nhiễm trùng xõm nhập? [17]

1.2.1.5 Người lành mang Hib và sinh bệnh học

Sinh bệnh học cho thấy những bệnh xõm hại do Hib đều bắt nguồn từ

họng, đõy là cánh cổng (portal) đường vào của vi khuẩn Những mẫu chuột

mới đẻ mắc VMN do Hi đã được sử dụng để nghiên cứu về dấu hiệu bệnh học sớm do Hib Cho thấy, chuột mới đẻ có thể mắc VMN sau khi cho Hib vào trong khoang mũi (intranasal) [74] Vi khuẩn Hib có thể xõm nhập vào màng

nóo gõy VMN [72] và/ hoặc gõy nhiễm trùng huyết sau khi cấy vi khuẩn vào

họng mũi, trong đó mức độ nhạy cảm với Hib của chuột có liên quan đến tuổi Bằng chứng VMN do Hib không chỉ liên quan đến tuổi của chuột mà cũn có

liên quan trực tiếp đến mức độ trầm trọng của nhiễm trùng huyết do vi khuẩn

này [74] Để xõm nhập dòng mỏu, vi khuẩn Hib không có khả năng di động

phải đi qua hoặc đi giữa các tế bào biểu mô, xõm nhập qua màng ngoài của tế bào biểu mô mạch mỏu, qua mô dưới của mạch máu và chui qua màng trong mạch mỏu để vào mỏu Nếu không được điều trị, VMN và viêm nắp thanh quản không thể tránh được trong phần lớn các trường hợp Vật chủ chết sẽ làm cho vi khuẩn sẽ không lõy lan và nhõn lên được Thông thường, sự xõm

nhập vào mạch mỏu của Hib có thể là gián tiếp hoặc tình cờ hơn là kết quả

của sự tiến triển của bệnh

1.2.1.6 Người lành mang Hib và đáp ứng miễn dịch của cơ thể

Vỏ polysaccharide là sản phẩm trùng hợp của ribose, ribitol, phosphate [78] và được gọi là polyribosylribitolphosphate (PRP) PRP là yếu tố quyết

định chớnh cho độc lực của Hib [74], [78] và là đích tác dụng của đáp ứng

sinh kháng thể đặc hiệu Dường như các nghiên cứu đều cho thấy kháng thể chống lại PRP có tác dụng bảo vệ cơ thể [94]

Lúc mới sinh, trẻ nhận được kháng thể bảo vệ từ mẹ Tuy nhiên, kháng

thể nhận từ mẹ sẽ giảm dần dẫn đến nguy cơ mắc các bệnh do Hib sẽ tăng

cao Khi trẻ đến gần 2 tuổi, kháng thể của cơ thể chống lại kháng nguyên vỏ polysaccharide bắt đầu xuất hiện Kháng thể có vai trò tiêu diệt vi khuẩn này

bởi kết quả của đáp ứng miễn dịch cơ thể trực tiếp với Hib ở màng nhày hoặc

với các kháng nguyên chéo của những vi khuẩn khác mang cấu trúc vỏ polysaccharide [24]

Nồng độ kháng thể kháng vỏ cao trong huyết thanh có liên quan đến

tình trạng mang Hib ở trẻ lớn hơn 18 tháng [16], [44], nhưng sự định cư của

vi khuẩn có ảnh hưởng như thế nào đến nồng độ kháng thể kháng PRP vẫn

cũn chưa biết rừ Kháng nguyên Hib có thể hấp thụ qua màng nhày hoặc toàn

bộ vi khuẩn có thể vượt qua hàng rào này trong thời gian định cư trên cơ thể,

dẫn đến trạng thái vi khuẩn huyết không có triệu chứng ở mức độ thấp và đáp

ứng của hệ thống miễn dịch đã sinh ra kháng thể Vi khuẩn Hib cũng có thể bị

thực bào bởi các tế bào lympho (lymphoid cells) ở màng nhày họng dẫn đến sản xuất huyết thanh đặc hiệu hoặc kháng thể màng nhày, có hoặc không có

vi khuẩn xõm nhập vào trong mạch mỏu [18]

Đã có nhiều tranh cói về vấn đề có một tỷ lệ cao trẻ em mang kháng thể

kháng PRP nhưng tỷ lệ những đứa trẻ này mang Hib lại thấp nhằm xác định nguồn gốc khác ngoài Hib có thể dẫn đến sự gia tăng kháng huyết thanh

kháng PRP Tuy nhiên, sự khó khăn trong kỹ thuật xác định người lành mang

Hib có thể đã dẫn đến đánh giá tỷ lệ mang vi khuẩn Hib ở trẻ nhỏ dưới mức

thực tế Với nhiều kỹ thuật nuôi cấy có độ nhạy cao, hiện nay nhờ các phương

pháp xác định tỷ lệ trẻ mang Hib hoặc trẻ bị mắc nhiễm trùng đã giải thích

được sự xuất hiện của miễn dịch tự nhiên (natural immunity) [17]

1.2.2 Sinh bệnh học, đặc điểm lõm sàng, tỷ lệ bệnh VMN do Hib ở trẻ dưới

5 tuổi từ các nghiên cứu trong và ngoài nước

1.2.2.1 Đặc điểm sinh bệnh học của Hib trong bệnh VMN

Hib lây truyền qua tiếp xúc hoặc hít phải các chất bài tiết bị nhiễm khuẩn của đường hô hấp Sau khi định cư ở vùng mũi họng, vi khuẩn Hib có

thể gõy nhiễm khuẩn đường hô hấp, lan ra tổ chức lân cận hoặc xâm nhập vào dòng máu Người ta cho rằng vi khuẩn từ mũi họng vào dòng máu do kết quả của sự vận chuyển trong những thực bào từ niêm mạc vào các mạch bạch

huyết Trong máu, những vi khuẩn Hib có vỏ PRP kháng lại hiện tượng đại

thực bào và hoạt tính bổ thể Ở trạng thái nhiễm khuẩn huyết, vi khuẩn có thể lan tràn và vượt qua hàng rào mỏu – não Vị trí mà vi khuẩn từ máu vào dịch não tủy là đám rối màng mạch, nơi có sự phân bố mạch cao Viờm màng não xảy ra thường có tương quan trực tiếp tới thời gian và tính chất nghiêm trọng của nhiễm trùng [13]

1.2.2.2 Đặc điểm lâm sàng của bệnh VMN

Trên lâm sàng, VMN do Hib có thể tiến triển âm ỉ trên vài ngày,

thường phối hợp với nhiễm trùng đường hô hấp trên hoặc đột ngột tiến triển trong vài giờ Những dấu hiệu và triệu chứng của VMN do vi khuẩn này cũng giống hệt như triệu chứng và dấu hiệu gặp trong VMN do các vi khuẩn gây bệnh khác

Những dấu hiệu không đặc hiệu, bao gồm: sốt, ngủ gà, kích thích, chán

ăn, nôn, suy hô hấp và rối loạn tõm thần Đối với trẻ lớn thường có nhức đầu, cứng gáy, sợ ánh sáng Các dấu hiệu Brudzinski, Kernig và cứng gáy đặc trưng ít thấy ở trẻ dưới 15 tháng tuổi Thêm vào đó, những dấu hiệu khu trú

có thể xuất hiện sớm, có đến 1/3 số bệnh nhõn bị co giật trước khi nhập viện

Tỷ lệ tử vong bởi VMN do Hib khoảng 5% và tỷ lệ mắc bệnh kéo dài

mắc bệnh xâm hại do Hib [13].

Hầu hết tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao do Hib trên toàn thế giới xảy ra

ở trẻ dưới 5 tuổi Vai trò của Hib trong gây VMN đã được chứng minh có tầm

quan trọng hơn so với những nhiễm trùng ở cơ quan khỏc trờn cơ thể Vì vậy,

tỷ lệ Hib gây VMN cho trẻ dưới 5 tuổi được dùng như một tiêu chuẩn đánh

giá so sánh gánh nặng bệnh tật mà vi khuẩn này gây ra giữa các nước [118] Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), sau khi phân tích kết quả của 229 nghiên

cứu điều tra thông tin về VMN do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi tại nhiều nước trên thế

giới với 30.000 trẻ mắc VMN và hơn 2.100 trường hợp tử vong Kết quả nghiên cứu được xác định từ những địa điểm Tổ chức y tế thế giới quan tâm (WHO regions), cụ thể là 43 (19%) từ châu Phi, 44 (19%) từ châu Mỹ, 23 (10%) từ phía Đông Địa Trung Hải, 72 (31%) từ châu Âu, 12 (15%) từ Đông Nam châu Á và 35 (15%) từ Đông Thái Bình Dương Trong đó, 62% trong số

229 nghiên cứu được thực hiện ở các nước phát triển [118]

- Hib là căn nguyên hàng đầu gây VMN cho trẻ dưới 5 tuổi:

+ Những nghiên cứu ở trong nước: VMN là một trong những bệnh nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương hay gặp ở trẻ em tại Việt Nam Theo thống kê tại Viện Nhi Trung Ương trong 10 năm (1983-1992) có 1.958 bệnh nhân VMN vào viện, đứng hàng thứ sáu trong các bệnh nhiễm trùng phải nhập viện Trên thế giới, bệnh đang có xu hướng giảm dần ở các nước phát

Hình 1.7: Phân bố các vị trí nhiễm trùng bởi Hib và Hi không có vỏ ở

một số cơ quan [78]

Viêm màng não (Hib)

Viêm tai giữa (Hi không có vỏ)

Viêm xoang (Hi không có vỏ)

Viêm nắp thanh quản (Hib)

Viêm khí quản (Hi không có vỏ)

Nhiễm trùng huyết (Hib)

Viêm phổi (Hib và Hi

không có vỏ)

H influenzae

triển song hầu như không thay đổi ở các nước đang phát triển, đặc biệt là các nước Châu Phi [1], [2], [7].

Tại Việt Nam, VMN do căn nguyên vi khuẩn Hib ít được quan tâm vào những năm trước 1994 Vì vậy, những nghiên cứu về VMN do Hib tại Việt

Nam cho đến nay vẫn chưa nhiều Tuy nhiên, nghiên cứu của Phạm Nhật An

và cộng sự năm 2001 [1] với tất cả những bệnh nhân từ 0 đến 15 tuổi được chẩn đoán là VMN vào điều trị tại Viện Nhi Trung Ương từ tháng 12 năm

1998 đến tháng 12 năm 1999, cho thấy kết quả về căn nguyên gây VMN được

xác định ở trẻ em nói chung theo thứ tự hay gặp là: Hi (50%), S pneumoniae (22,06%), N meningitidis (11,76%), Streptococcus (5,88%), Klebsiella (4,22%), E coli, Staphylococcus, P aeruginosa và Serratia spp (47%) cho dù

chưa có điều kiện xác định chi tiết về typ huyết thanh của mỗi loại vi khuẩn

Như vậy, vi khuẩn Hi, S pneumoniae, N meningitidis là căn nguyên gây VMN hay gặp nhất ở trẻ em (83,82%); đứng đầu là Hi (50%)

Gần đõy, một số nghiên cứu khác của Phan Lê Thanh Hương, Đặng

Đức Anh cùng cộng sự về vai trò gây VMN của Hib ở trẻ dưới 5 tuổi tại Hà Nội và một số tỉnh phía Bắc từ 2000 - 2002 cũng đã cho thấy Hib vẫn đứng

đầu trong những căn nguyờn gõy VMN cho trẻ dưới 5 tuổi do vi khuẩn, chiếm 48,8% [2], [7]

+ Những nghiên cứu ở nước ngoài: Tại các nước châu Á, theo nghiên

cứu ở nhiều nước của Peltola H năm 1999 cũng cho thấy được Hib là căn nguyên hàng đầu gây ra VMN, cụ thể: Hib chiếm 34%, S pneumoniae chiếm 23%, N meningitidis chiếm 14%, Salmonella chiếm 4% và 25% do các loại

vi khuẩn khác Bên cạnh đó, nghiên cứu của Yang Y tại Hefei - Trung Quốc

cũng cho thấy được VMN do Hib chiếm 51,7%; N meningitidis (Nm) là 38,3%, và S pneumoniae (Sp) là 8,3% [42], [60]; tại Đài Loan Hib cũng

chiếm 42% tỷ lệ căn nguyên gây VMN [66], [82]

Những nước khỏc trờn thế giới, hầu hếu các nghiên cứu đều cho thấy

Hib là căn nguyên chủ yếu gây VMN Điển hình như nghiên cứu ở Mỹ năm

1990 cho thấy 3 vi khuẩn hàng đầu gây VMN cho trẻ dưới 5 tuổi là: Hib, S pneumoniae, N meningitidis lần lượt chiếm tỷ lệ là 45%, 18% và 14% [83]; tại Oman năm 2008 vi khuẩn Hib, S pneumoniae, N meningitidis gây VMN

lần lượt chiếm tỷ lệ là 22%, 15% và 11% [78] Tuy nhiên, hiện nay ở những

nước phát triển đã đưa vacxin phòng Hib vào chương trình tiêm chủng quốc gia thì tỷ lệ VMN do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi giảm xuống rất thấp, có thể xuống

gần 0% [47]

1.2.2.4 Tỷ lệ mắc bệnh VMN do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi

- Những nghiên cứu ở trong nước:

Theo một nghiên cứu dịch tễ học VMN do vi khuẩn dựa trên cộng đồng

tại Hà Nội (Phan Lê Thanh Hương, Đặng Đức Anh), cho thấy VMN do Hib ở

trẻ dưới 5 tuổi là 10/100.000, trong đó lứa tuổi 1-23 tháng chiếm tỷ lệ cao nhất 26/100.000 [1], [2], [6], [87]

- Những nghiên cứu ở nước ngoài:

Qua phân tích số liệu từ 229 nghiên cứu trên toàn thế giới về VMN do

Hib, kết quả tỷ lệ VMN do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi trung bình là 22,8/100.000

(với trung vị là 18 và dao động trong khoảng 0,9 – 94,6) [56] Trong đó, tại một số nước phát triển trên thế giới ở thời kỳ trước khi sử dụng vacxin, tỷ lệ

mắc VMN do Hib cũng đã báo cáo chiếm khoảng 11 – 50/100.000 ở lứa tuổi

0 – 4 tuổi [67], [118]

Ở các nước châu Á, theo nghiên cứu tại nhiều nước của Peltola H năm

1999 cho thấy tỷ lệ mắc VMN do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi vào khoảng

25/100.000 Cụ thể, các nước châu Á như Trung Quốc, Thái Lan cũng đã có nhiều nghiên cứu cho kết quả tương tự lần lượt là: 19,2/100.000 (năm 1996) [119], 26,6/100.000 (2004) Tuy nhiên, nghiên cứu năm 2000 tại Philippin và

Ấn Độ cho thấy tỷ lệ này khá cao, lần lượt là 95/100.000 (1994 - 1996) [59], 86/100.000 (2008) [67]

Tỷ lệ mắc bệnh VMN do Hib hiện nay đã giảm một cách đáng kể ở những nước đã đưa vacxin phòng Hib vào chương trình tiêm chủng quốc gia

Minh chứng cho vấn đề này, một số nghiên cứu tại Isarel, Đài Loan cho thấy

tỷ lệ mắc VMN do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi giảm xuống còn khoảng 5/100.000 sau khi sử dụng vacxin phòng Hib tại các nước này [82].

1.2.2.5 Phân bố tỷ lệ viêm màng não do Hib theo các nhóm tuổi

- Những nghiên cứu ở trong nước:

Theo Phan Lê Thanh Hương, tất cả các trường hợp VMN do Hib tập

trung ở lứa tuổi từ 1 – 23 tháng (88%) [6], [7], [87] Trong khi đó, tỷ lệ trẻ

mắc VMN do Hib giảm dần ở các lứa tuổi tiếp theo.

- Những nghiên cứu ở nước ngoài:

Qua nghiên cứu tổng thể về tỷ lệ VMN do Hib tại nhiều nước trên thế giới, nhìn chung VMN do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi có sự phân bố khác nhau

trong từng nhóm tuổi, như sau: 1-5 tháng chiếm 22,6%; 6-11 tháng chiếm 35,6%; 12-23 tháng chiếm 23,8% Tuy nhiên, qua thống kê từ các nghiên cứu

đều cho thấy ở lứa tuổi từ 0-11 tháng là có tỷ lệ VMN do Hib cao nhất [118]

Cụ thể, một điều tra tiến cứu được thực hiện từ năm 1997-1999 tại Ấn Độ để

đánh giá tỷ lệ mắc VMN do Hib, cho thấy: ở lứa tuổi từ 0 – 4 là 15,9/100.000

(trong đó, ở lứa tuổi từ 24 – 59 tháng là 7,1/100.000; ở lứa tuổi từ 0 – 11 tháng là 32/100.000 và ở lứa tuổi từ 12 – 23 tháng là 19/100.000) [68]

Như vậy, hầu hết các nghiên cứu trong và ngoài nước đều cho thấy vi

khuẩn Hib gây VMN chủ yếu gặp ở lứa tuổi 1 – 23 tháng.

1.2.2.6 Tỷ lệ tử vong do VMN bởi căn nguyên Hib ở trẻ dưới 5 tuổi

Tại Việt Nam, tác giả Phan Lê Thanh Hương cho thấy tỷ lệ tử vong của

VMN do Hib là 3% và các di chứng nặng do Hib (như: điếc - nghễnh ngãng,