Khảo sát sự tăng trưởng của cây húng chanh (plectranthus amboinicus (lour.) spreng.) trong điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp

Phương pháp này loại bỏ các thành phần hữu cơ trong môi trường nuôi cấy như đường và vitamin, đồng thời tăng cường khả năng trao đổi khí của bình nuôi cấy với bên ngoài, tạo cho cây điều

TP HỒ CHÍ MINH, 1/2011

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA CÂY HÚNG CHANH

(PLECTRANTHUS AMBOINICUS (LOUR.) SPRENG.)

TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY QUANG TỰ DƯỠNG BƠM KHÍ TRỰC TIẾP

CBHD: PGS.TS NGUYỄN THỊ QUỲNH SVTH: NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH MSSV: 60604017

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn PGS TS Nguyễn Thị Quỳnh người đã tận tình chỉ dạy và hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô và các anh chị phòng Công nghệ Tế bào Thực vật của viện Sinh Học Nhiệt Đới đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Như Hiến, chị Hoàng Ngọc Nhung, chị Trịnh Thanh Vân, những người đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn Phạm Thành Thái, Phạm Minh Duy đã cho tôi những lời khuyên quý báu và động viên tôi giúp tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô bộ môn công nghệ sinh học trường đại học Bách khoa TP HCM, những người đã dạy dỗ và tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô đại học Bách khoa TP HCM đã tận tình dạy dỗ và truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu

Tôi xin cảm ơn các bạn lớp HC06BSH, những người đồng hành và động viên tôi những lúc khó khăn nhất

Cuối cùng, con xin cảm ơn cha mẹ đã sinh thành và nuôi dưỡng con, luôn dõi theo con và cho con những lời khuyên bảo ân cần, cha mẹ luôn là nguồn động viên

to lớn giúp con vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống, cha mẹ luôn là niềm tự hào của con

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 01 năm 2011

Nguyễn Thị Hoàng Anh

TÓM TẮT

Cây húng chanh (Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng.) là một loài thực

vật được sử dụng như dược liệu ở nhiều nơi trên thế giới kể cả Việt Nam Húng chanh thường được nuôi cấy bằng phương pháp giâm cành, tuy nhiên phương pháp này không thể cung cấp một lượng lớn cây húng chanh sạch bệnh và chất lượng ổn định Nuôi cấy mô quang tự dưỡng là một phương pháp hiệu quả đê nhân giống cây húng chanh Với nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp nuôi cấy mô truyền thống

và phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng trao đổi khí tự nhiên, phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp đã được lựa chọn đê nghiên cứu quy trình nhân giống húng chanh bán tự động và khảo sát sự tích lũy hợp chất thứ cấp Mục đích của nghiên cứu này là xác định thời gian nuôi cấy húng chanh thích hợp trong hộp nuôi cấy quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp thể tích 60 l

Mẫu cấy là đốt cây húng chanh mang 2 lá mở khối lượng 700 ± 100g Mẫu cấy được cấy vào hộp nuôi cấy thể tích 60 l đã được khử trùng trước đó Hộp nuôi cây chứa 9 l perlite và 6 l môi trường lỏng ( môi trường MS1/2 không chứa đường, vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật) Thiết lập hệ thống nuôi cấy mô quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp theo thời gian nuôi cấy 25, 35, 45 ngày Sau các thời gian nuôi cấy đó, các chỉ tiêu tăng trưởng của cây húng chanh được khảo sát Kết quả thí nghiệm cho thấy có sự tăng trưởng nhanh chóng của cây húng chanh theo thời gian nuôi cấy Thời gian nuôi cấy thích hợp với hệ thống nuôi cấy quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp sử dụng hộp nuôi cấy thể tích 60 l là 35 ngày

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

Chương 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 3

Chương 2: TỔNG QUAN 4

2.2 Nuôi cấy mô tế bào thưc vật 10

2.2.1 Lịch sử nuôi cấy mô thực vật trên thế giới 10

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 12

2.2.3 Các giai đoạn nhân giống in vitro 12

2.2.4 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và chất điều hòa sinh trưởng đến nhân giống in vitro 13

2.2.4 Nhược điểm của phương phương pháp vi nhân giống truyền thống 20

2.3 Phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng 21

2.3.1 Khái niệm 21

2.3.2 Các phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng 22

2.3.4 Các giai đoạn vi nhân giống quang tự dưỡng 26

2.3.5 Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý đến nuôi cấy mô quang tự dưỡng 29

2.3.3 Ưu điểm và hạn chế của nuôi cấy mô quang tự dưỡng 32

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 34

3.2 Vật liệu 34

3.2.1 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 34

3.2.2 Giá thể sử dụng trong thí nghiệm 35

3.2.3 Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 35

3.2.4 Môi trường nuôi cấy 37

3.2.5 Mẫu cấy thí nghiệm 37

3.3 Phương pháp nghiên cứu 37

3.3.1 Thí nghiệm: 37

3.3.2 Mục tiêu thí nghiệm: 38

3.3.3 Bố trí thí nghiê ̣m 38

3.3.4 Vật liê ̣u 38

3.3.5 Phương pháp thí nghiệm 38

3.3.6 Điều kiện thí nghiê ̣m 41

3.3.7 Chỉ tiêu theo dõi ở ngày thứ 25, 35, 45 41

3.4 Phương pháp thu thập và tính toán số liệu 42

3.4.1 Gia tăng trọng lượng tươi (GTTLT) (mg/cây) 42

3.4.2 Gia tăng trọng lượng khô (GTTLK) (mg/cây) 42

3.4.3 Tỷ lệ trọng lượng tươi thân lá/rễ 42

3.4.4 Tỷ lệ trọng lượng tươi thân lá/rễ 42

3.4.5 Phần trăm chất khô (%) 42

3.4.6 Số lá mở/cây 42

3.4.7 Chiều cao cây (mm/cây) 42

3.4.8 Chiều dài rễ (mm/cây) 43

3.4.10 Đường kính thân (mm/cây) 43

3.4.11 Diện tích lá (cm2/cây) 43

3.4.12 Xác định hàm lượng chlorophyll theo phương pháp Arnon, 1949 43

3.4.13 Hiệu suất quang hợp thuần Pn (µmol mol-1 h-1/cây) 43

3.5 Phân tích thống kê 44

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

4.1 Kết quả 45

4.1.1 Gia tăng trọng lượng tươi (GTTLT) và gia tăng trọng lượng khô (GTTLK) 45

4.1.2 Tỷ lệ trọng lượng tươi thân lá/rễ (TL TLT TL/R) và tỷ lệ trọng lượng khô thân lá/rễ (TL TLK TL/R) 48

4.1.5 Phần trăm chất khô (%CK) 48

4.1.4 Chiều cao cây (mm/cây) 48

4.1.5 Chiều dài rễ (mm/cây) 49

4.1.6 Đường kính thân (mm/cây) 49

4.1.7 Số lá mở/cây và diện tích lá 49

4.1.9 Hàm lượng chlorophyl l a, b, a + b và a/b 50

4.1.10 Hiệu suất quang hợp thuần (Pn) (µmol mol-1 h-1/cây) 52

4.2 Thảo luận 54

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58

5.1 Kết luận 58

5.2 Đề nghị 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC 64

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

%CK Phần trăm chất khô CDR Chiều dài rễ

ĐKT Đường kính thân DTL Diện tích lá GTTLK Gia tăng trọng lượng khô GTTLT Gia tăng trọng lượng tươi

MS Murashige và Skoog (1962)

TLK Trọng lượng khô TLT Trọng lượng tươi TLTLK TL/R Tỷ lệ trọng lượng khô thân lá/rễ TLTLT TL/R Tỷ lệ trọng lượng tươi thân lá/rễ

DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Tóm tắt những nghiên cứu về nuôi cấy mô quang tự dưỡng bơm khí trực

tiếp từ năm 1988 27

Bảng 3.1: Tiến trình thí nghiệm 40 Bảng 4.1: Gia tăng trọng lượng tươi và khô, tỉ lệ trọng lượng tươi và khô thân lá/rễ

và % chất khô của cây húng chanh ở các thời gian nuôi cấy khác nhau 45

Bảng 4.2: Chiều cao cây (CCC), chiều dài rễ (CDR), đường kính thân (DKT), số lá

và diện tích lá (DTL) của cây húng chanh ở các thời gian nuôi cấy khác nhau 48

Bảng 4.3: Hàm lượng chlorophyll của cây húng chanh theo thời gian nuôi cấy 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Cây và hoa húng chanh 5

Hình 2.2: Công thức cấu tạo của Carvarol và Thymol 7

Hình 2.3: Vai trò sự phối hợp giữa auxin và cytokinin trong nuôi cấy mô, tế bào in vitro 19

Hình 2.4: Các bình nuôi cấy sử dụng trong phương pháp trao đổi khí tự nhiên 23

Hình 2.5: Hệ thống nuôi cấy hoa kèn (Zantedeschia elliottiana) và linh sam (Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook) 25

Hình 2.6 : Các giai đoạn nuôi cấy trong vi nhân giống quang dị dưỡng (photomixotrophic) và quang tự dưỡng (photoautotrophic) 26

Hình 3.1: Thiết kế hộp nuôi cấy mô quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp thể tích 60 L 36

Hình 3.2: Đốt thân hai lá mở của cây húng chanh 37

Hình 3.3: Hệ thống nuôi cấy mô quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp sử dụng hộp 60L 39

Hình 4.1: Gia tăng trọng lượng tươi của cây húng chanh theo thời gian nuôi cấy 46 Hình 4.2: Gia tăng trọng lượng khô của cây húng chanh theo thời gian nuôi cấy 46 Hình 4.3: Biến thiên trọng lượng tươi của cây trong hộp nuôi cấy 25 ngày 47

Hình 4.4: Biến thiên trọng lượng tươi của cây trong hộp nuôi cấy 35 ngày 47

Hình 4.5: Biến thiên trọng lượng tươi của cây trong hộp nuôi cấy 45 ngày 47

Hình 4.6: Chiều cao cây húng chanh ở các ngày nuôi cấy khác nhau 49

Hình 4.7: Hàm lượng chlorophyll a và b của cây húng chanh ở các ngày nuôi cấy khác nhau 50

Hình 4.8: Hộp nuôi cấy húng chanh ở các thời gian nuôi cấy khác nhau…………51

Hình 4.9: Cây húng chanh ở các ngày nuôi cấy 25, 35 và 45 52

Hình 4.10: Số lần trao đổi khí của hệ thống nuôi cấy quang tự dưỡngbơm khí trực tiếp 52

Hình 4.11: Hiệu suất quang hợp thuần của cây húng chanh theo thời gian nuôi cấy 53

Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, khi đa số thuốc tây (tân dược) có nguồn gốc là hóa chất hoàn toàn được tổng hợp Khi đưa vào cơ thể thuốc tây dễ gây tác dụng phụ, thậm chí gây tác hại cho một số cơ quan trong cơ thể Trước những nguy cơ đó, con người có xu hướng trở về với nguồn dược liệu có nguồn gốc từ thiên nhiên Vì vậy, việc khai thác nguồn dược liệu thiên nhiên, từ nuôi trồng cây thuốc đến việc tách chiết các hợp chất thứ cấp từ cây dược liệu đang được sự quan tâm của hầu hết các nước trên thế giới và Việt Nam Tuy nhiên, việc sản xuất cây dược liệu với quy mô lớn để thu hợp chất thứ cấp gặp nhiều khó khănkhi việc sản xuất trên đồng ruộng chịu ảnh hưởng lớn từ thời tiết, việc sử dụng các loại phân bón hóa học, thuốc diệt trừ sâu bệnh, làm cây dược liệu không sạch và chất lượng không được đảm bảo Vì thế những phương pháp sản xuất cây dược liệu khác sạch hơn và ổn định hơn để thay thế cho việc nuôi cấy trên đồng ruộng đã được nghiên cứu và thử nghiệm Một trong những phương pháp sản xuất thay thế phổ biến và được nghiên cứu rộng rãi là nuôi cấy mô tế bào thực vật Đã có nhiều nghiên cứu cả trong và ngoài nước sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô nhằm mục đích nhân giống một số cây dược liệu (nhân

sâm, thông đỏ, v.v.) và tiến xa hơn là sản xuất hợp chất thứ cấp in vitro bằng cách

nuôi cấy mô tế bào thực vật trong các bioreactor Tuy nhiên phương pháp nuôi cấy

mô truyền thống sử dụng điều kiện dị dưỡng, tỉ lệ nhiễm nấm khuẩn cao, nuôi cấy kín làm thay đổi nhiều đặc điểm sinh lý, sinh trưởng của cây, từ đó ảnh hưởng đến

sự hình thành các hợp chất thứ cấp ở các cây dược liệu và đến sự sinh trưởng của cây khi ra vườn ươm Nhằm khắc phu ̣c những nhược điểm đó nên vào thâ ̣p niên 80, Giáo sư Toyoki Kozai và các cộng sự thuộc trường Đại học Chiba , Nhật Bản đã phát triển kỹ thuâ ̣t nuôi cấy mô quang tự dưỡng Phương pháp này loại bỏ các thành phần hữu cơ trong môi trường nuôi cấy như đường và vitamin, đồng thời tăng cường khả năng trao đổi khí của bình nuôi cấy với bên ngoài, tạo cho cây điều kiện tăng trưởng tự dưỡng, tương tự như điều kiện ngoài tự nhiên, giảm thiểu sự thay đổi sinh lý cũng như giúp cây thích nghi điều kiện tự nhiên tốt hơn khi đem ra vườn

ươm, thích hợp cả cho vi nhân giống cũng như sản xuất hợp chất thứ cấp in vitro từ

cây dược liệu

Cây húng chanh được sử dụng như một nguồn dược liệu ở nhiều nơi trên thế giới cũng như tại Việt Nam Nhiều công trình nghiên cứu đã cho thấy tinh dầu húng chanh có tác dụng chữa bênh, đặc biệt là khả năng kháng khuẩn, kháng virus của tinh dầu húng chanh cũng đã được nghiên cứu Cây húng chanh được nhân giống dễ dàng ngoài đồng ruộng bẳng phương pháp giâm cành, tuy nhiên, việc nuôi cấy trên đồng ruộng không thể cung cấp nguồn húng chanh sạch bệnh và ổn định về chất lượng Vì vậy, việc nuôi cấy mô húng chanh cần được nghiên cứu và ứng dụng Những nghiên cứ u về nuôi cấy mô tế bào thực vâ ̣t trên cây húng chanh chưa có nhiều công bố trên thế giới cũng như ở Viê ̣t Nam Nguyễn Thị Quỳnh và ctv (2010)

sử dụng phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng để nuôi cấy húng chanh Với hệ thống nuôi cấy trao đổi khí tự nhiên trong bao nylon gắn giấy lọc và trong bình nuôi cấy thể tích 330 ml hay hệ thống bơm khí trực tiếp trong hôp nuôi cấy thể tích 17 l,

đã cho nhiều kết quả khả quan Phương pháp nuôi cấy quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp với hộp thể tích 17 l cho kết quả tăng trưởng tốt hơn so với phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng trao đổi khí tự nhiên và phương pháp nuôi cấy mô truyền thống

Đề tài “Khảo sát sự tăng trưởng của cây húng chanh trong điều kiện nuôi cấy

mô quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp” kế thừa và phát triển những nghiên cứu về phương pháp nuôi cấy húng chanh quang tự dưỡng Lần đầu tiên khảo sát sự tăng trưởng của cây húng chanh trong hộp nuôi cấy quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp thể tích 60 l, đề tài góp phần làm nền cho các nghiên cứu khảo sát sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong cây húng chanh theo thời gian nuôi cấy, đồng thời khảo sát hệ thống nuôi cấy quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp để hoàn chỉnh quy trình nuôi cấy,

từ đó xây dựng quy trình nhân giống bán tự động, giảm chi phí nhân công và hạ giá thành sản xuất

1.2 Yêu cầu của đề tài

Tiến hành thí nghiê ̣m mô ̣t cách khoa ho ̣c có sự lă ̣p la ̣i và phân tích thống kê để đánh giá kết quả

1.3 Nội dung thực hiện

Thực hiện nuôi cấy cây húng chanh theo phương pháp nuôi cấy quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp trong hộp nuôi cấy thể tích 60 l

Khảo sát sự tăng trưởng của cây húng chanh theo thời gian nuôi cấy

Chương 2: TỔNG QUAN 2.1 Sơ lược về cây húng chanh:

2.1.1 Vị trí, phân loại:

Giới (Kingdom): Plantae

Ngành (Division): Magnoliophyta

Lớp (Class): Magnoliopsida

Phân lớp (Subclass): Lamiidae (Hoa môi)

Bộ (order): Lamiales (Hoa môi)

Họ (Family): Lamiaceae (Bạc hà)

Chi (Genus): Plectranthus

Loài (Species): Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng Tên la tinh: Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng., Plectranthus aromaticus Roxb., Coleus amboinicus Lour., Coleus aromaticus Benth

Tên tiếng Anh : Country borage , Indian borage , Indian mint , Puerto Rico oregano, thyme [ Country borage là tên go ̣i những cây thuô ̣c ho ̣ ba ̣c hà ở nhiều nước nhiê ̣t đới và câ ̣n nhiê ̣t đới (Morton, 1992) Morton (1992) đã đưa ra danh sách gồm những tên bản xứ và tên tiếng Anh (được sử du ̣ng ở những nước không dùng tiếng Anh là ngôn ngữ chính ), như: bread-and-butter plant, Cuban oregano, East Indian thyme, French thyme, Indian borage, Mexican thyme, sage, Spanish thyme, wild thyme, v.v Việc sử du ̣ng nhiều tên tiếng Anh đã làm nhầm lẫn với những cây thảo dược khác có cùng tên thông thường] [38]

Tên tiếng Pháp : Coliole aromatique,Aromate des Javanais (m) (là tên P háp đươ ̣c sử du ̣ng ở New Caledonia ), oreille (ở Haiti ), plectranthre (tên của nhóm Plectranthus)

2.1.2 Nguồn gốc, phân bố:

Hiện nay, nguồn gốc xuất xứ của Plectranthus amboinicus vẫn chưa rõ ràng

Theo Codd (1975), Staples và Kristiansen (1999) húng chanh có nguồn gốc từ châu Phi Tuy nhiên Morton (1992) cho rằng húng chanh có nguồn gốc từ Malaysia [31, 39]

Cây húng chanh có vùng phân bố rộng từ các vùng cận nhiệt đến các vùng

nhiệt đới Hiện nay, cây húng chanh được trồng rộng rãi khắp các vùng nhiệt đới, từ châu Phi, Ấn Độ, Malesia, và Philippines đến quần đảo Virgin, Cuba, và Mexico [28]. Ở Việt Nam, cây được trồng làm thuốc và thực phẩm ở nhiều nơi nhất là ở Nam Bộ

2.1.3 Đặc điểm hình thái:

Thân: Húng chanh là cây thân cỏ sống nhiều năm, mọc đứng, cao 30 – 70 cm,

phân nhánh nhiều; cành non vuông, có nhiều lông Thân già gần tròn, mập

Lá: lá đơn, mọc đối chéo chữ thập ; phiến lá dày, mọng nước, hình trứng rộng

hay gần tròn, kích thước 4 – 8 x 3 – 6 cm, đỉnh lá nhọn hoặc tù, gốc tròn hay cụt, mép có răng cưa to , không nhọn, cả 2 mặt lá có lông ngắn Gân chính to , gân bên nhỏ, 4-5 đôi, gân hình mạng nổi rõ ở mă ̣t dưới lá Lá có mùi thơm dễ chi ̣u như mùi chanh, vị chua Cuống lá dài 2 – 4 cm, hình lòng máng, có lông

Hoa: Hoa húng chanh nhỏ màu tím hồng, mọc thành bông ở ngọn, thân và

đầu cành Cây rất hiếm khi thấy ra hoa

Quả: Quả nhỏ tròn, màu nâu [44]

Hình 2.1: Cây và hoa húng chanh [43]

Húng chanh là cây thân thảo, phát triển tốt ở nơi thoát nước tốt, nhiều ánh nắng hay một phần bóng râm Cây húng chanh chết khi trồng ở nơi có khí hậu lạnh

và phát triển tốt nhất ở vùng ôn đới và nhiệt đới

Cây có thể phát triển ở nhiệt độ từ 10 – 32 °C, pH trong khoảng 5,0 – 8,7 Vị trí trồng tốt nhất ở nơi có nhiều ánh sáng Nếu thấy lá có màu tối và khoảng cách từ

lá này đến lá kia lớn thì có nghĩa là cây đã không nhận đủ ánh sáng, cần phải di chuyển cây đến nơi có cường độ ánh sáng cao hơn [39]

Cây húng chanh cần rất ít nước, cây có thể chịu được điều kiện khô hạn trong thời gian ngắn do tính chất mọng nước, tuy nhiên tưới nước điều độ giúp tăng tốc

độ phát triển của cây, cây sẽ thối rữa và chết khi bị ngập nước trong thời gian dài [38]

2.1.5 Thành phần hóa học:

Lá cây húng chanh chứa tinh dầu, thành phần chính là carvacrol: 40-60%, tiếp đến là -terpinen (7.5%), cariophilen (7%), ρ-cimen (4%), α-zingiberen (4%), oxid cariophilen (2.3%), α-terpinen (0.78%) ngoài ra còn có chất màu đỏ là colein Lá Húng chanh mọc ở Hà Nội chứa 0,002 – 0,003% tinh dầu trong đó có carvacrol 39,5%, γ-terpinen 19%, α-terpinen 16,8% [45]

Thành phần hóa học trong cây húng chanh thay đổi khá nhiều Sự thay đổi này có thể là do gen, tác động của môi trường, quá trình phát triển hay một số nguyên nhân khác (Singh và cộng sự, 2002) Lượng tinh dầu trong cây khoảng 0,055% và từ 0,1 đến 0,2% trên trọng lượng tươi của lá, hoặc 0,01 – 0,02% ở thân theo Morton (1992) Nguyễn Xuân Dũng và Đỗ Tất Lợi (1991) tìm thấy thành phần tinh dầu trong cây húng chanh gồm carvacrol (40%), caryophyllene (6%) và α-terpinene (17%) [37] Senthilkumar và Venkatesalu (2010), đã xác định được 26 hợp chất trong lá húng chanh Ấn Độ bằng phương pháp GC và GC – MS trong đó carvacrol (28.65%), thymol (21.66%), α-humulene (9.67%), undecanal (8.29%), γ-terpinene (7.76%), ρ-cymene (6.46%), caryophyllene oxide (5.85%), α-terpineol (3.28%) and β-selinene (2.01%) [36] Bos và cộng sự (1983); Tucker và Maciarello (1987) nhận thấy trong tinh dầu của lá húng chanh chứa 60,1-63,8 carvacrol% và 3,3-20,6% β – caryophyllene [28].

Ngoài tinh dầu ra thì trong cây húng chanh còn có khoảng 140 loại diterpenoids được phân lập từ lá và các phenolic Tuy nhiên các nghiên cứu về các chất được tổng hợp trên cây húng chanh còn rất ít ỏi (Abdel-Mogib, 2002)

Nói chung, thành phần cơ bản trong tinh dầu của cây húng chanh gồm 2 hợp chất chính là carvarol và thymol Carvarol và thymol là 2 chất đồng phân có cùng công thức hóa học C10H14O Trong đó, carvarol (2-methy; 5-isopropylphenol) là một monoterpenoid phenol Ít tan trong nước nhưng tan nhiều trong các dung môi

hữu cơ như ethanol, diethyl ether, carbon tetrachloride và acetone Cavacrol có tính

cay, mùi nồng, có khả năng ức chế nhiều loại vi khuẩn nguy hiểm như : E coli

O157 : H7 [20], Staphylococcus aureus [18] Tác dụng kháng khuẩn của carvacrol

được cho là do khả năng phá vỡ màng vi khuẩn của nó Carvacrol có tính độc thấp cùng với hương vị dễ chịu nên được sử dụng làm phụ gia thực phẩm để ngăn ngừa

sự nhiễm khuẩn

Hình 2.2: Công thức cấu tạo của Carvarol và Thymol [44]

Thymol hay 2-isopropyl-5-methylphenol, là một monoterpene phenol dẫn xuất của cymene Thymol ít tan trong nước nhưng tan mạnh trong ethanol và các dung môi hữu cơ khác Thymol là chất có nhiều hoạt tính sinh học như kháng nấm khuẩn, kháng viêm Hoạt tính kháng khuẩn của thymol là do nó có khả năng phân hủy màng nguyên sinh chất, phá hủy các chuỗi acid béo nên làm giảm tính thấm của màng vi khuẩn (Souza và cộng sự, 2007)

Theo Vera (1993), ngoài hai chất chính là carvacrol và thymol trong tinh dầu húng chanh còn chứa các chất sau: α-pinene, camphene, 1-octen-3-ol, β-pinene,

myrcene, α-phellandrene, Δ-3-carene, α-terpinene, p-cymene, limonene,

(Z)-β-ocimene, (E)-β-(Z)-β-ocimene, α-phelandrène, γ-terpinene, α-terpinolene, linalool, camphor, 1-terpinen-4-ol, α-terpineol, α-cubebene, β-cubebene, β-elemene, β-caryophyllene, α-bergamotene, (Z)- β-farnesene, α-humulene, β-guaiene, (-)-α-selinene, β-bisabolene, δ-cadinene, caryophyllene oxide, δ-cadinol, α-cadinol, farnesol, calamenol và (-)-4β-7β-aromadendrandiol

2.1.6 Ứng dụng của cây húng chanh:

Cây húng chanh được sử dụng nhiều trong y học, ngoài ra nó còn làm gia vị, làm cảnh và làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp

Người Cổ Đại đã biết dùng húng chanh để làm trà, thuốc sắc, thậm chí làm cả thuốc đắp ngoài da để giảm đau trong đời sống thường ngày Tác dụng giảm đau

này kết hợp với những tính năng sát khuẩn và chống co thắt [46]

Cây húng chanh có vị the cay, hơi chua, mùi thơm, tính ấm, không độc, có tác dụng lợi phế, trừ đờm, giải cảm, làm ra mồ hôi, làm thông hơi, giải độc Colein trong lá có tác dụng kháng sinh mạnh đối với một số vi trùng, nhất là ở vùng họng, mũi, miệng và cả ở đường ruột

Húng chanh được dân gian và y học cổ truyền sử dụng cho các bệnh lý đường tiêu hóa như kích thích dạ dày yếu, hổ trợ mật và năng ngừa chướng ho Sau những bữa ăn thịnh soạn có thể nhai vài lá tần dầy lá để giúp tiêu hóa là rất công hiệu Tại châu Phi, lá cây húng chanh được dùng để giảm đau Ở Đông Phi lá cây còn được sử dụng như thuốc trừ sâu (Kokwaro, 1976) Tại Đông và Nam Phi cây húng chanh được dùng để trừ giun, sán [29] Cây húng chanh ở tại châu Á được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau từ chữa ho, chữa bệnh đau dạ dày, đau tim đến điều trị cảm sốt, đau đầu và cả vết thương gây ra bởi rết hay bọ cạp (Burkill, 1935).Tại khu vực Trung Mỹ như Cuba và Jamaica thì cây húng chanh được dùng

để trị ho, tại Venezuela thì được dùng như thuốc tiêu và để trị bệnh về thận [37]

Ở Malaysia, người ta dùng lá cây húng chanh nấu cho phụ nữ sau khi sinh đẻ,

lá tươi giã ra lấy nước cốt cho trẻ em bị sổ mũi uống Để chữa bệnh ngoài da, có thể lấy lá giã ra đắp trị nẻ môi, đau bụng, đau đầu và dùng xoa lên người khi bị sốt

Ở Ấn Độ, lá cây húng chanh dùng chữa bệnh về đường tiết niệu và rỉ nước âm đạo Nước ép lá trộn với đường là một loại thuốc gây trung tiện mạnh, cũng dùng trị

Chang J và Cheng C (2007), nhận thấy rằng tinh dầu húng chanh làm giảm các triệu chứng sưng và viêm gây ra ở chuột, tác giả cho rằng tinh dầu húng chanh

có tiềm năng chữa trị bệnh thấp khớp [18]

Candrappa (2009) đã chứng minh tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết từ

lá cây húng chanh trên những con con chuột bị tiểu đường

Khả năng chống oxi hóa của tinh dầu đã được ghi nhận bởi Albuquerque (2006)

Henderson (2005) đã ghi nhận có sự giảm cân ở những phụ nữ thừa cân nhẹ khi trong khẩu phần ăn hằng ngày của họ có bổ sung thêm cây húng chanh

Theo một vài nghiên cứu khác, tinh dầu húng chanh có tác dụng ức chế nhiều

loại vi khuẩn như Staphylococcus, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Streptococcus, Diplococcus pneumoniae Tinh dầu có khả năng kháng virus, chống lại Herpes simplex virus-1 (Hattori, 1995) và có hoạt tính

ức chế virus HIV (Kusumoto, 1995) [29]

2.1.7 Các phương pháp nhân giống:

2.1.7.1 Phương pháp truyền thống:

Có 2 phương pháp: gieo hạt, cắt đốt, chủ yếu là phương pháp cắt đốt

Gieo hạt: Hạt được thu trên cây, sau đó đem phơi nắng, có thể gieo ngay hoặc

giữ trong chai, nơi khô ráo Hạt nảy mầm trong khoảng 4 – 14 ngày.Phương pháp này ít được sử dụng do cây ít ra hoa và tạo hạt [39]

Cắt đốt: Cây húng chanh được nhân giống dễ dàng bằng phương pháp cắt

đốt Đoạn thân húng chanh dài 15-20 cm được cắt và loại bỏ lá ở những mắt ngủ phía dưới sau đó giâm sâu ít nhất 10 cm vào trong đất sạch, perlite mịn, hoặc hỗn hợp 50 % than bùn + 50% perlite, nén chặt đất ở quanh gốc và tưới nước Rễ sẽ được hình thành sau 7 tới 10 ngày ở gốc vết cắt Cắm đốt cắt trong vùng có bóng râm để việc hình thành rễ Khi chồi bắt đầu hình thành và rễ đã phát triển, tăng lượng ánh sáng để chồi phát triển tốt hơn [39]

2.1.7.2 Nhân giống bằng nuôi cấy mô

Phương pháp nhân giống cây húng chanh chủ yếu hiện nay là phương pháp cắt đốt, tuy nhiên phương pháp này về lâu dài gây thoái hóa giống và không tạo được

nguồn dược liệu sạch bệnh để cung cấp cho nhu cầu dược liệu thiên nhiên ngày càng lớn

Phương pháp nuôi cấy mô khắc phục nhược điểm trên, tuy nhiên hiện nay, việc nghiên cứu về nuôi cấy mô cây húng chanh không nhiều Bauer và ctv (2002)

đã nuôi cấy chồi cây húng chanh trong bình Erlenmeyer 300 mL chứa 50 mL môi trường MS nguyên bổ sung 3% sucrose và 0,8% agar nhằm mục đích nghiên cứu chuyển gen ở cây húng chanh [12] Roja và cộng sự (2005) đã tiến hành nuôi cấy

mô cây húng chanh Ấn Độ Các mẫu lá, thân và chồi nách được nuôi cấy trên môi trường MS hoặc môi trường MS có thành phần khoáng đa lượng 1/2 Giá thể được

sử dụng là agar và môi trường có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật BA (0,2-2 mg/l) và NAA (0,05 mg/l) IAA (1 mg/l) kết hợp với IBA (1 mg/l) cũng được

sử dụng để khảo sát sự tạo rễ cây húng chanh [36]

Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Quỳnh và ctv (2009 và 2010) đã bước đầu xây

dựng quy trình nhân giống cây húng chanh in vitro và tiếp tục nghiên cứu nuôi cấy

mô quang tự dưỡng cây húng chanh bằng việc sử dụng các bình nuôi cấy có gắn màng trao đổi khí bằng giấy lọc, đồng thời nuôi cấy trong hộp thể tích lớn và sử dụng hệ thống bơm khí trực tiếp [5]

2.2 Nuôi cấy mô tế bào thƣc vật

2.2.1 Lịch sử nuôi cấy mô thực vật trên thế giới

Năm 1902, nhà bác học Haberlandt là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh giả thuyết về tính toàn năng của tế bào

do Schleiden và Schwann khởi xướng năm 1838

Năm 1922, Kotte học trò của Haberlandt và Robbins, lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây thân thảo trong môi trường lỏng có muối khoáng và glucose Đỉnh sinh trưởng tồn tại một thời gian sau đó chậm dần và ngừng lại mặc dù đã chuyển sang môi trường mới

Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật,

khi White, nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) với một

môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men bằng hỗn hợp

ba loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) và Nicotinic axit (B9)

Cùng thời gian này Gautheret, đã xác nhận tác dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo của IAA và ba nhóm vitamin trên

Năm 1939-1957, trong giai đoạn này các nhà khoa học đã nghiên cứu các chất kích thích trên nhiều đối tượng khác nhau:

 Nuôi cấy mô sẹo cà rốt (Daucus carota) trên môi trường thạch

(Gautheret và Nobecourt, 1939)

 Chứng minh trong nước dừa có chất kích thích sinh trưởng trên cây họ

cà (Daturra) (Overbeck, 1941)

 Nghiên cứu tổng hợp hóa học thành công a- Napthilacetic acid (NAA)

và 2,4 - Dichlorphenoxy acetic acid (2,4-D), NAA, 2,4 - D cùng với nước dừa cảm ứng tạo mô sẹo trên cây cà rốt (Stewart, 1948) và tìm ra Kinetin, có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào (Skoog, 1954) Năm 1956, Nickell nuôi liên tục được một huyền phù tế bào đơn cây đậu

(Phaseolus vuigaris)

Cũng trong giai đoạn này, các nhà khoa học đã tìm ra ảnh hưởng của tỉ lệ cytokinin: auxin lên sự hình thành mô sẹo cây thuốc lá (Skoog và Miller, 1957) Năm 1958, tính toàn năng của tế bào đã được khẳng định bằng công trình nghiên cứu của Stewart và cộng sự (1958) trên mô rễ cây cà rốt Các tác giả này đã nuôi cấy mô rễ cà rốt trên môi trường đặc có nước dừa và đã thu nhận khối mô sẹo gồm các tế bào nhu mô

Năm 1960, Cooking công bố có thể dùng men phân hủy cellulose phân hủy vỏ cellulose của tế bào thực vật thu được tế bào trần (protoplast)

Năm 1965, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy Môi trường của họ đã được sử dụng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được

sử dụng cho tới nay

Năm 1967, Bourgin và Nitsch thành công trong việc tạo cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc lá

Năm 1970, Nagata và Takebe thành công trong việc cho các protoplast tách từ

mô cây thuốc lá tái tại vỏ cellulose và tạo một quần thể tế bào trong môi trường lỏng

Cuối thập niên 80, phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng được giáo sư Kozai và ctv phát triển với những ưu điểm vượt trội so với phương pháp nuôi cấy

mô truyền thống

Ngoài ra, hàng loạt các công trình nghiên cứu và ứng dung kỹ thuật nuôi cấy

mô trong việc chuyển gen vào thực vật, sản xuất sinh khối thực vật và các hợp chất thứ cấp Nuôi cấy mô trở thành công nghệ được áp dụng ở hầu hết các nước trên thế giối và được đưa vào các chương trình chọn giống nhân tạo hiện đại

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Edwin F George (1984) đã phân loại các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật như sau:

Nuôi cấy từ cấu trúc có tổ chức:

 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

 Nuôi cấy chồi

 Nuôi cấy nốt đơn thân

 Nuôi cấy rễ cô lập

 Nuôi cấy phôi

Nuôi cấy từ cấu trúc không tổ chức:

 Nuôi cấy mô sẹo

 Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào

 Nuôi cấy tế bào trần (protoplast)

 Nuôi cấy túi phấn

2.2.3 Các giai đoạn nhân giống in vitro

Quá trình nhân giống in vitro được chia thành các giai đoạn sau: Giai đoạn (1): Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng Chọn cây mẹ sạch bệnh và đang trong thời gian tăng trưởng tốt nhất, lựa chọn mẫu cấy thích hợp Sau đó, mẫu cấy được khử trùng và chuyển sang môi trường nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Mẫu cấy còn sống, không bị nhiễm sau khi khử trùng sẽ được chuyển sang giai đoạn (2): tăng sinh Giai đoạn này nhằm tăng nhanh số lượng cá thể nhờ sự sinh phôi soma, tạo cụm chồi, các chồi đạt đến sự phát triển nhất định sẽ được chuyển sang giai đoạn 4 Giai đoạn (3): ra rễ Có thể bổ sung chất kích thích ra rễ Giai đoạn(4):

chuyển cây ra môi trường tự nhiên Cây được chuyển ra vườn ươm, thuần hóa ex vitro [17]

2.2.4 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và chất điều hòa sinh trưởng đến

nhân giống in vitro

2.2.4.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được sử dụng phổ biến nhất

trong nuôi cấy in vitro Nhưng các loài khác nhau có thể đòi hỏi môi trường nuôi

cấy khác nhau Samartin (1989) đã sử dụng 6 công thức muối đa lượng khác nhau

đối với cây trà Camelia japonica và thấy rằng môi trường MS cho tốc độ sinh

trưởng nhanh nhất khi thu mẫu từ cây non Môi trường MS đã chứng tỏ không thích hợp cho mẫu lấy từ cây già, trong khi môi trường muối loãng hơn (Heller, 1953) lại cho kết quả khá [1]

Trong số các muối đa lượng, muối nitơ có ý nghĩa quyết định đến sự tái sinh chồi Welander (1985) cho biết khi nồng độ NH4NO3 và KNO3 trong môi trường

MS giảm đi 1/2, đỉnh sinh trưởng của dâu tây phát triển khá hơn, rễ tái sinh mạnh hơn Giảm muối khoáng trong một số trường hợp có tác dụng tốt đối với sự ra rễ ở một số loài (Murashige, 1977; Hasegawa, 1980; Drew, 1987) như trường hợp chồi hoa hồng ra rễ tốt hơn khi nồng độ nitơ tổng số giảm (Hyndman cs., 1982)

Nguồn carbon cũng rất quan trọng đối với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nồng độ đường 1- 3 % được sử dụng phổ biến Nồng độ đường sucrose cao hơn 3 % đã gây

ức chế sinh trưởng ở một số trường hợp (Rublue và Kartha, 1985)

Trạng thái vật lý của môi trường nuôi cấy cũng có ý nghĩa quan trọng trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Đa số các trường hợp người ta sử dụng môi trường agar nhưng khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng một số loài, môi trường lỏng mang lại kết quả tốt hơn (Mellor và Stace Smith, 1969)

Nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thấp trong môi trường có thể làm giảm các biến dị tế bào soma (Grosser và Gmitter, 1990)

Nhiệt độ

Trong môi trường tự nhiên, thực vật có thể tồn tại trong một khoảng nhiệt độ dao động rộng, đặc biệt là giữa ngày và đêm Nhiệt độ ngày và đêm không phải lúc nào cũng có tác dụng tương tự trên sự tăng trưởng của thực vật (Langton và

Cockshull, 1997) Sự tăng trưởng của thực vật có thể được cải thiện bằng cách hạ thấp nhiệt độ vào ban đêm vì khi đó hô hấp sẽ giảm đi Các tác động trực tiếp của nhiệt độ ban đêm đến sự tăng trưởng rất khác nhau, gia tăng nhiệt độ ban đêm giảm chiều dài lóng ở một số loài nhưng có thể làm tăng chiều dài lóng ở các loài khác Một thuận lợi nữa của việc thay đổi nhiệt độ giữa ngày và đêm là giúp tăng sự trao đổi khí trong bình nuôi cấy (Chalupa, 1987) Tuy nhiên, sự thay đổi là không cần thiết, và, trong nhiều phòng thí nghiệm, việc nuôi cấy mô được duy trì trong phòng nuôi cấy ở cùng một nhiệt độ ngày và đêm

Khoảng nhiệt độ thích hợp nuôi cấy mô 20 - 270C Nhiệt độ ảnh hưởng sâu

sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro qua những tiến trình sinh lý như hô

hấp hay hình thành tế bào và cơ quan

Để tăng trưởng nhanh và phát sinh hình thái in vitro, việc nuôi cấy được duy trì ở nhiệt độ trung bình cao hơn so với nuôi cấy in vivo Nhiệt độ trung bình của phòng nuôi cấy được tìm thấy trong phần lớn báo cáo thử nghiệm là 25°C (với một phạm vi từ 17 đến 32°C) Thực vật nhiệt đới và cận nhiệt đới như cây bông, lúa, cây

có múi và được nuôi cấy ở nhiệt độ hơi cao hơn so với các loài ôn đới (trung bình 27,7°C, khoảng 24 - 32°C)

Tốc độ tăng trưởng thực vật in vitro, thường giảm từ từ khi nhiệt độ thấp hơn mức tối ưu, khi nhiệt độ cao hơn mức tối ưu tối ưu, tỷ lệ tăng trưởng giảm đi nhanh

chóng hơn Quá trình nuôi cấy chồi cây mít Artocarpus heterophyllus cho nhiều

chồi hơn ở 25°C hoặc 30°C so với ở 20°C, khó tạo chồi ở 35°C Rahman và Blake (1988) cho rằng ở nhiệt độ cao hơn, quá trình hô hấp lấn át quá trình quang hợp Nhiệt độ còn ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái, sự tạo chồi tạo rễ từ mẫu

cấy Khi nuôi cấy Begonia cheimantha , Heide (1965) nhận thấy rằng với mẫu cấy

từ lá việc tạo chồi tối ưu diễn ra ở 15°C Fonnesbech (1974a) thực hiện tạo chồi

từ các phân đoạn cuống lá Begonia cheimantha thấy rằng việc tạo chồi tối ưu là ở

15 - 20°C, tuy nhiên, sự phát triển tăng lên khi nuôi cấy ở 24°C (Fonnesbech,

1974b) Sự cảm ứng chồi từ mẫu cấy cuống hoa của Anemone coronaria chỉ diễn

ra ở 15-19°C, trên 26°C mẫu cấy chết (Sutter và Langhans, 1978)

Sự hình thành của rễ từ chồi phụ thuộc nhiệt độ Ví dụ không có mô sẹo hoặc

rễ hình thành từ chồi non cây Asparagus ở 0, 10 hoặc 15°C, nhưng 20 phần trăm

mẫu cấy hình thành rễ ở 20°C, và 45 phần trăm mẫu cấy hình thành rễ ở 25°C (Gorter, 1965) Ở nhiều thực vật, sự cảm ứng rễ từ chồi in vitro đòi hỏi nhiệt độ thấp hơn so với việc tạo chồi và tăng trưởng chồi Hầu hết cây lá kim ra rễ tốt nhất

ở nhiệt độ 25°C (Chalupa, 1987) Rễ phát sinh từ chồi cây linh sam Douglas tăng trưởng ở 24°C, nhưng chỉ có một vài cây con có thể tạo rễ ở nhiệt độ này.Tuy nhiên, ở 19°C nhiều cây con có thể tạo rễ bình thường (Cheng, 1978)

Ánh sáng

Ba yếu tố của ánh sáng ảnh hưởng rõ ràng nhất đến sự tăng trưởng và phát

sinh hình thái in vitro đó là: bước sóng; cường độ và thời gian chiếu sáng Mỗi yếu

tố đều có tác dụng trên cả sự phát sinh hình thái và quang hợp của cây in vitro Sự

tăng trưởng của mô thực vật in vitro thường không bị ức chế bởi ánh sang mà ánh sáng cần thiết cho sự phát triển tối ưu của cây in vitro Tuy nhiên, sự phân chia ban

đầu của tế bào và sự phát triển của mô sẹo đôi khi không cần sự chiếu sáng

Hầu hết các quá trình vi nhân giống được thực hiện dưới ánh sáng nhân tạo trong phòng nuôi cấy có thể điều chình nhiệt độ Ánh sáng với bước sóng màu xanh dương và tím ảnh hưởng sâu sắc lên sự phát triển của mô sẹo và sự phát sinh hình

thái từ mô sẹo Seibert và cộng sự (1975) thấy rằng mặc dù tăng trưởng và phát sinh

hình thái của mô sẹo thuốc lá chỉ chịu ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc màu xanh lam hay ánh sáng gần với UV, nhưng dưới ánh sáng trắng (bao gồm nhiều bước sóng), tăng trưởng tốt nhất và sự phát sinh chồi có được khi chiếu lượng ánh sáng cân đối trong vùng màu đỏ (600-700 nm) Tương tự như vậy, Fridborg và Eriksson (1975) phát hiện hàm lượng hormone cần thiết cho sự nhân lên thấp hơn nhiều khi chiếu ánh sáng trắng (8 Wm-2) Những kết quả này cho thấy rằng ánh sáng đỏ có thể tăng cường hiệu quả kích thích của ánh sáng màu xanh và ánh sáng gần với UV khi chúng được sử dụng cùng một lúc Ánh sáng ở các bước sóng màu vàng và đỏ đã được tìm thấy để thúc đẩy sự nhân nhanh chồi của cây ăn quả (Rugini và cộng sự, 1987; Loreti và cộng sự, 1991) Trần Thanh Vân và các cộng sự (1987) thấy rằng

75% các mảnh trụ dưới lá mầm (hypocotyls) của Pseudotsuga menziesii hình thành

chồi khi nuôi cấy dưới ánh sáng đơn sắc có bước sóng 550 nm (màu xanh / vàng), trong khi chỉ 35% mẫu cấy tạo chồi dưới ánh sáng trắng (170 μmol m-2 s-1)

Trong một nghiên cứu chi tiết, Seibert và cộng sự (1975) đã chứng minh tác

động kết hợp của bước sóng và cường độ ánh sáng đến sự phát triển mô sẹo và phát sinh hình thái từ mô sẹo Sử dụng mô sẹo thuốc lá, họ đã cho thấy rằng mặc dù các

mô sẽ phát triển trong bóng tối, sự tăng trưởng của nó đã được kích thích, và sự tạo chồi lớn nhất khi chiếu ánh sáng tím (371 nm) ở cường độ rất thấp 0,24 Wm-2 (90 lux), nhưng sự tạo chồi bị ức chế khi cường độ lớn hơn 1,5 Wm-2

(khoảng 540 lux); ánh sáng xanh lam có bước sóng 420 nm hoặc 467 nm gây kích thích tăng trưởng tối đa ở 3 và 6 Wm-2 (khoảng 1080 và 2160 lux)

Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng rõ ràng nhất đến sự ra hoa của nhiều loài Những cây ngắn ngày như cúc, sẽ ra hoa khi thời gian chiếu sáng là 8-10 h, trong khi ở các cây dài ngày (như lúa mì và lúa mạch) sự ra hoa chỉ bắt đầu khi được chiếu sáng 14-16 h mỗi ngày Thời gian chiếu sáng ảnh hưởng đến những đáp ứng sinh lý ở cây trồng Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng lên sự phát sinh hình thái,

có thể được thay thế bằng cách bổ sung chất điều hòa sinh trưởng vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, Murashige (1978) chỉ ra rằng thực vật cần thời gian chiếu sáng riêng biệt cho sự tăng trưởng và phát triển đặc biệt là trong nuôi cấy in vitro

Haramaki (1971), khi nuôi cấy chồi cây hoa kèn thấy rằng cây con hình thành

bị vàng úa và có lá nhỏ khi được chiếu sáng 8 h mỗi ngày ở 1075 lux Khi chiếu

sáng 16h/ngày cho lá dày, lớn và sẫm màu hơn Chồi ngọn từ hạt của cây Pharbitis nil (một loại cây ngắn ngày) phát triển và hình thành cây con tốt khi chiếu sáng 16

hoặc 24 giờ (Bapat và Rao, 1977) nhưng khi thời gian chiếu sáng là 8 hoặc 12h,

tăng trưởng của chồi và rễ cây Pharbitis nil bị ức chế

Các chất khí

Thành phần chất khí trong bình nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng của

cây in vitro O2, CO2 và ethylen là những chất khí được khảo sát nhiều

O2 cần thiết cho sự phát triển của thực vật, trong nuôi cấy mô, nồng độ O2 cao

có thể gây độc cho tế bào

O2 luôn cần thiết cho sự tồn tại, tăng trưởng và phát triển của thực vật Các phản ứng khác nhau của thực vật khi nuôi cấy trong môi trường lỏng và rắn là do sự hiện diện của O2 Thực vật hoạt động và tăng trưởng đòi hỏi năng lượng, năng lượng này chủ yếu cung cấp từ quá trình chuyển hóa carbonhydrate thông qua chu

kỳ của Krebs khi thực vật hô hấp Tốc độ của chu trình Krebs thường giảm ngay lập

tức khi nồng độ oxy trong tế bào thấp hơn trong không khí Sự tăng trưởng của mô sẹo khoai tây có thể được tăng gấp đôi nếu lượng không khí trong bình nuôi cấy có chứa 70% oxy Van der Plas và Wagner (1986) cho rằng bổ sung ôxy có thể được

sử dụng để tăng tỷ lệ tăng trưởng của mô sẹo mà không gây ảnh hưởng bất lợi nào

Tỷ lệ tăng trưởng thực vật giảm khi hạn chế cung cấp oxy Sự hình thành và phát triển của rễ cũng phụ thuộc vào oxy Tỷ lệ hấp thụ của đường sucrose, nitrat và các ion dinh dưỡng khác của rễ hoặc các mô không có tổ chức giảm trong điều kiện thiếu oxy, mặc dù nguồn cung cấp nitơ có thể không hạn chế , tăng trưởng ngừng khi nồng độ O2 trong môi trường thấp hơn 0,003 mmol -1 (Kessel và Carr, 1972; Buwalda và Greenway, 1989) Tế bào chết khi hàm lượng oxy giảm xuống dưới mức độ cần thiết (anoxia) và mặc dù các mô có thể tồn tại trong thời gian dài tại nồng độ oxy thấp, nhưng không thể phát triển trong điều kiện này

Sử dụng bình có bổ sung CO2 và làm giàu CO2 trong phòng nuôi cây làm cây

in vitro tăng trưởng tốt hơn Nồng độ CO2 cao và cường độ ánh sáng cao giúp cho

quá trình quang hợp xảy ra nhanh hơn và nâng cao tốc độ vi nhân giống Trong môi trường nuôi cấy không sử dụng đường saccharose làm giảm sự hoại mẫu trong nuôi

cấy do vi sinh vật gây ra Nồng độ của khí CO2 thấp kích thích sự sinh tổng hợp ethylene: ở nồng độ cao hơn (1-10% CO2) hoạt động của ethylene bị ức chế

Ethylene được xem như là chất làm giảm sinh trưởng trong nuôi cấy mô khi tích lũy trong bình nuôi cấy ngày càng nhiều theo thời gian nuôi cấy Thể tích khí trong môi trường nuôi ở hệ thống truyền thống thường nhỏ và khả năng trao đổi khí thấp Do đó, khí ethylene do cây sản sinh ra, tích tụ trong bình ngày càng nhiều Khi nồng độ ethylene trên 0,1 μmol mol-1 trong bình nuôi cấy thì sự tăng trưởng của cây sẽ bị ức chế và dẫn đến những hư hỏng về hình thái như hiện tượng thủy tinh thể (Zoybayed, 2000)

2.2.4.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Có 5 nhóm chất điều hòa sinh trưởng quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật: auxin, gibberellin, cytokinin, acid abscisic, ethylene Cả auxin và cytokinin đều được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để kích thích sự phát sinh hình thái của thực vật nuôi cấy Tỷ lệ hormon sử dụng để kích thích tạo chồi hay tạo rễ không giống

nhau Tùy theo loài thực vật mà nhu cầu về dạng và nồng độ của auxin và cytokinin khác nhau trong sự phát sinh hình thái

Auxin

Auxin có ảnh hưởng lên sự cảm ứng và tăng trưởng mô sẹo 2,4-D thường được sử dụng để cảm ứng mô sẹo sau đó mẫu cấy sẽ được chuyển sang môi trường

có NAA hoặc IAA để tránh đột biến Auxin kết hợp với cytokinin có ảnh hưởng lên

sự tạo chồi và tạo rễ từ mẫu cấy Auxin ngăn cản sự tổng hợp diệp lục tố, khi môi trường có nồng độ auxin cao sự phát sinh phôi soma được khởi phát và duy trì khi giảm nồng độ auxin [2]

Cytokinin

Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào Cytokinin cần thiết trong sự điều hòa sinh tổng hợp protein tế bào trong sự tăng trưởng và phát triển của tế bào Cytokinin rất có hiệu quả trong vai trò kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như trên mô thực vật nuôi cấy in vitro Tác dụng này trở nên hiệu quả hơn khi phối hợp với auxin Khi bổ sung cytokinin với nồng độ thấp (thường là 0,5- 2,5 μM) vào môi trường nuôi sẽ cảm ứng tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi đặc biệt là cây có tán rộng Một vài trường hợp cytokinin cản sinh phôi ở cây một lá mầm [2]

Cytokinin kích thích sự tăng sinh chồi bên và làm giảm hiện tượng ưu tính ngọn trong nuôi cấy chồi của những loài cây có lá rộng Khi phối hợp cytokinin với auxin giúp tạo chồi bất định Nồng độ cytokinin cao (0,5-10mg/l) thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ (Schraudolf và Reinert, 1959; Harris và Hart, 1964;) đồng thời cũng cản sự tăng trưởng của rễ và cản hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin

Gibberellin

Khi gibberellin được bổ sung trong môi trường nuôi cấy thì chúng có vai trò như các auxin tự nhiên Gibberellin nồng độ cao (1-8 mg/l) có thể cảm ứng sự tăng trưởng cuả những tế bào mô sẹo không phân hóa và có thể kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo khi phối hợp với auxin và cytokinin Gibberellin làm giảm bớt hoặc ngăn cản sự tạo chồi, rễ bất định và sự phát sinh phôi soma Ở mô sẹo thuốc lá, gibberellin có tác dụng cản sự tạo chồi khi nó có mặt vào giai đoạn hình thành đỉnh sinh trưởng và nó có tác dụng mạnh hơn khi mẫu cấy được nuôi trong điều kiện tối

so với ngoài sáng GA3 có thể làm tăng sự tăng trưởng hoặc tăng tốc độ tăng sinh chồi

Hình 2.3: Vai trò sự phối hợp giữa auxin và cytokinin trong nuôi cấy mô, tế bào

in vitro [17]

Gibberellin có tác dụng cản sự ra rễ và khi xử lý cành giâm với gibberellinnồng độ cao (1-10mg/l) ở ngay vị trí đáy của cành giâm thì cành này sẽ không tạo được rễ (Brian, 1959), đặc biệt khi xử lý cùng lúc với auxin Tuy nhiên, ở một số loài thực vật xử lý với GA3 trước khi chuyển vào môi trường ra rễ thì sẽ làm tăng sự tạo rễ của cành giâm

Acid absisic (ABA)

Trong nuôi cấy mô, ABA đôi khi điều khiển sự phát sinh hình thái cây

ABA có ảnh hưởng đến sự tạo chồi bất định: sự thành lập chồi từ lá Begonia cheimantha tách rời sẽ tăng lên khi lá này được xử lý với acid ABA ABA giúp cho

sự trưởng thành và phát triển của phôi giống như phôi hợp tử ABA kích thích sự tăng trưởng mô sẹo nếu bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ thấp, còn khi tăng nồng độ lên thì Acid ABA lại làm giảm lượng mô sẹo đã được tạo thành

Ethylene

Ethylene gây ra sự chín trái, sự lão suy và sự rụng của lá Trong cơ thể thực vật thường có sự điều chỉnh trạng thái cân bằng giữa auxin và ethylene nội sinh Ethylene cản sự hình thành chồi trong suốt 5 ngày đầu tiên của quá trình khởi

sự tạo chồi, nhưng sau đó nó lại thúc đẩy tạo sơ khởi lá Ethylene có ảnh hưởng đến

sự hình thành củ, củ của hoa tulip sẽ tăng lên khi có sự gia tăng hàm lượng ethylene nội sinh bằng cách bổ sung 0,1-10 mg/l acid acetylsalicylic vào môi trường hoặc nuôi mẫu với ánh sáng tỷ lệ tia đỏ/tia đỏ xa thấp Ethylene vừa có tác dụng kích

thích, vừa có tác dụng kìm hãm sự ra rễ dưới mẫu cấy in vitro [2]

2.2.4 Nhược điểm của phương phương pháp vi nhân giống truyền thống

 Trong phương pháp vi nhân giống truyền thống, đường là nguồn cacbon

chủ yếu cho cây phát triển, cây in vitro sống dựa vào nguồn carbon từ môi trường, nên hiệu suất quang hợp của cây in vitro thấp, khả năng tự dưỡng kém, nên khi chuyển sang giai đoạn ex vitro cây cần một khoảng thời gian

để phục hồi khả năng quang hợp do đó cây sinh trưởng chậm khi đưa ra vườn ươm trong 3 – 4 tuần đầu tiên

 Do bình nuôi cấy kín nên ẩm độ tương đối (relative humidity) trong bình nuôi cấy luôn ở mức xấp xỉ 100% Việc này dẫn đến những bất thường về sinh lý, sự biến dị ở cây cấy mô Hiện tượng thủy tinh thể là kết quả của các tác nhân vật lý và hóa học bao gồm ẩm độ tương đối và nồng độ ethylene ở mức cao trong bình nuôi cấy

 Trong điều kiện độ ẩm cao, khí khổng cây in vitro hoạt động không bình

thường, mở liên tục, hay mất khả năng đóng hoàn toàn, điều này làm tăng

tỷ lệ thoát hơi nước của cây khi đưa cây ra môi trường ex vitro

 Tỉ lệ nhiễm khuẩn cao trong giai đoạn in vitro do sự hiện diện của đường và

vitamin trong môi trường nuôi cấy

 Bình nuôi cấy thường nhỏ và kín đã gây nhiều khó khăn trong việc tự động hóa quá trình nuôi cấy đồng thời tốn công lao động cho việc cấy chuyền và

cọ rửa

 Chất điều hòa sinh trưởng thường xuyên được sử dụng cũng làm tăng chi phí sản xuất.Việc sử dụng thường xuyên các chất điều hòa sinh trưởng thực vật còn gây ra các biến dị soma cho cây nuôi cấy mô

 Cây ra rễ không hoàn chỉnh, thường chỉ có hệ rễ sơ cấp, một số còn hình thành mô sẹo ở gốc

 Tỉ lệ sống của các cây con khi chuyển ra vườn ươm thấp do sự khác biệt lớn giữa môi trường sống bên trong và bên ngoài bình nuôi cấy Vì vậy nhà nhân giống cần quan tâm, chăm sóc nhiều hơn cây cấy mô trong những ngày đầu tiên cây ở giai đoạn ex vitro

2.3 Phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng

2.3.1 Khái niệm

Vi nhân giống quang tự dưỡng là phương pháp vi nhân giống các mẫu cấy thực vật có chứa diệp lục tố trên môi trường không có nguồn carbon hữu cơ (không đường, không vitamin và không chất điều hòa sinh trưởng thực vật) Đây là phương pháp vi nhân giống mới trong đó thực vật sử dụng nguồn carbon vô cơ (CO2) từ không khí và ánh sáng làm nguồn năng lượng chính [22]

Phương pháp mới này chú trọng đến các tác nhân vật lý của môi trường nuôi cấy (ion, sự khuếch tán khí hòa tan) và các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển cây con trong bình nuôi cấy (cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng, thành phần không khí, ẩm độ, nhiệt độ và tốc độ luân chuyển của không khí trong bình nuôi cấy, v.v.) thay vì chỉ nghiên cứu thành phần hóa học của môi trường nuôi cấy như nồng độ đường, muối khoáng, vitamin hay việc sử dụng các chất kích thích sinh trưởng thực vật mà các nhà nuôi cấy mô vẫn thường quan tâm Đặc điểm chính của phương pháp mới này là không sử dụng đường, vitamin, hạn chế hoặc không sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nhân giống Điều này dựa trên cơ sở là trong tự nhiên tất cả các cây xanh chứa diệp lục tố đều có khả năng tự quang hợp để tồn tại và phát triển [18, 22]

Khi sử dụng phương pháp này cần lưu ý: Cần tạo điều kiện cho cây hấp thu

CO2, tạo điều kiện cho cây tận dụng năng lượng ánh sáng và sử dụng giá thể xốp

2.3.2 Các phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng

2.3.2.1 Trao đổi khí tự nhiên

Trao đổi khí tự nhiên là phương pháp sử dụng bình/hộp nuôi cấy thông thường

có gắn màng trao đổi khí Nguồn gốc của sự trao đổi khí tự nhiên là do sự khác biệt

về áp suất giữa trong và ngoài bình gây ra bởi sự khác biệt về nhiệt độ giữa trong và ngoài bình/hộp cùng với sự chuyển động của dòng không khí xung quanh các bình/hộp nuôi cấy Do đó, hình dạng của bình, hướng của nắp đậy và lỗ thông khí hay dòng không khí xung quanh bình sẽ ảnh hưởng đến tốc độ trao đổi khí tự nhiên của bình Môi trường khí bên trong bình được cải thiện khi sự thông khí của bình nuôi được tăng cường Trong phương pháp đổi khí tự nhiên sự thông khí của bình nuôi cấy được cải thiện khi dùng nắp đậy có gắn màng lọc millipore cho phép khí khuếch tán qua màng nhưng không cho bụi, bào tử nấm hay vi khuẩn vào bên trong bình Hiện nay, nhiều màng lọc khí và hệ thống bình nuôi thương mại có đặc tính thông khí cao đã xuất hiện trên thị trường

Tại Viện Sinh học Nhiệt đới, hơn 10 năm nay nhóm nghiên cứu nuôi cấy mô quang tự dưỡng đã sử dụng giấy mỏng để thay thế cho nút cao su đậy bình tam giác

trong nuôi cấy quang tự dưỡng cây paulownia, cây lõi thọ, cây hoa đồng tiền, cây

cà tím lai v.v…Đồng thời việc sử dụng màng millipore gắn trên nắp hay thành hộp Magenta cũng được sử dụng để nghiên cứu quang tự dưỡng trên nhiều đối tượng

thực vật như nho không hạt, tre tầm vông, khoai lang, khoai tây, cà phê Arabusta, lan Dendrobium, khoai mỡ Ở Việt Nam việc áp dụng phương pháp vi nhân giống

quang tự dưỡng còn chưa được phổ biến do những hạn chế về bình nuôi cấy

Để phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng có thể tiếp cận được với các phòng nuôi cấy mô tại Việt Nam việc sử dụng bào nilon có gắn màng trao đổi khí bằng giấy lọc đã được sử dụng và chứng minh hiệu quả rõ rệt đối với một số thực vật nuôi cấy mô như lan Dendrobium, cây hông Pawlonia, húng chanh (Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự, 2010)

Hình 2.4: Các bình nuôi cấy sử dụng trong phương pháp trao đổi khí tự nhiên

(Kozai và ctv, 2005)

2.3.2.2 Bơm khí trực tiếp

Phương pháp bơm khí trực tiếp là hệ thống nuôi cấy có thể điều chỉnh được dòng không khí đi vào bình nuôi nên có thể kiểm soát được hệ vi khí hậu bên trong

hộp nuôi cấy để tối ưu hóa sự tăng trưởng của cây in vitro Hệ thống bơm khí trực

tiếp trong vi nhân giống quang tự dưỡng được thiết kế ngày càng tiến bộ hơn, các hộp nuôi cấy có kích thước lớn (chứa từ 50 – 500 cây) với các thiết bị kiểm soát môi trường vật lý bên trong hộp đã được phát triển từ cuối thập niên 1980

Bảng 2.1 tóm tắt các hệ thống bơm khí trực tiếp được thiết kế và ứng dụng từ năm 1988, từ đó ta thấy được sự phát triển hệ thống nuôi cấy mô quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp và những thành tựu đạt được của các hệ thống này

Năm 2004, Kozai và Xiao đã thiết kế một hệ thống nuôi cấy diện tích lớn (hình 2.6) để đánh giá khả năng thương mại hóa của phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng, tác giả cho rằng khả năng thương mại hóa sẽ thuận lợi hơn với các

loài thực vật dùng để trang trí như cây hoa kèn (Zantedeschia elliottiana) và linh sam (Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook) [42]

Kết quả nghiên cứu cho thấy nuôi cấy mô quang tự dưỡng giúp gia tăng trọng lượng gấp 2 lần so với nuôi cấy mô thông thường ở cây hoa kèn, và gấp gần 3 lần ở

linh sam; tỷ lệ sống của cây thủy vu ex vitro là 95% so với 60% khi nuôi cấy thông

thường, với linh sam, tỷ lệ sống của cây ex vitro khi nuôi cấy mô quang tự dưỡng là 97% so với nuôi cấy mô thong thường là 16%; giá thành sản xuất được tính toán chi tiết từ chi phí đầu tư ban đầu cho thấy nuôi cấy mô quang tự dưỡng giúp hạ giá thành sản phẩm

Nguyễn Thị Quỳnh và ctv (từ năm 2000 đến 2010) đã thiết kế các hộp nuôi bơm khí trực tiếp có thể tích thay đổi từ 7 L, 17 L, 60 L, 100 L để ứng dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô quang tự dưỡng và xây dựng quy trình nhân giống cây con

quang tự dưỡng một số cây như lan Dendrobium, Paulownia, nho không hạt, tre

tầm vông, khoai mỡ, húng chanh

Hộp nuôi cấy với thể tích 60 L, với thiết kế đơn giản hơn gồm 2 đầu khí ra, 2 đầu khí vào và 6 màng trao đổi khí gắn trên nắp hộp giúp sự lưu thông khí trong hộp nuôi cấy tốt hơn, cùng với quy trình khử trùng hộp nuôi cấy đã được khảo sát ở các nghiên cứu trước, chúng tôi thấy rằng việc sử dụng hộp nuôi cấy 60 L là thích hợp cho việc nuôi cấy húng chanh để khảo sát quá trình sinh trưởng đồng thời với việc thu nhận hợp chất thứ cấp

Ưu điểm của phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp so với vi nhân giống quang tự dưỡng trao đổi khí tự nhiên:

 Tốc độ tăng trưởng của cây con nhanh hơn nhờ diện tích nuôi cấy lớn hơn

 Tăng cường CO2 thông qua quá trình bơm khí giúp nâng cao khả năng quang hợp từ đó tăng tốc độ phát triển của cây con

 Không sử dụng đường, vitamin và các chất kích thích sinh trưởng nhờ đó giảm khả năng nhiễm khuẩn, đồng thời giảm chi phí sản xuất

 Duy trì độ ẩm ở mức thấp hơn so với nuôi cấy hộp nhỏ, môi trường thông thoáng, sử dụng giá thể tơi xốp, thoáng khí, tăng khả năng phát triển của rễ, đồng thời dễ dàng chuyển cây con sang môi trường nuôi cấy mới, nâng cao

khả năng sống của cây ex vitro

 Có thể nuôi cấy cùng lúc một số lượng lớn cây con giảm giá thành sản xuất

Hình 2.5: Hệ thống nuôi cấy hoa kèn (Zantedeschia elliottiana) và linh sam (Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook) theo Xiao và Kozai (2004)

2.3.4 Các giai đoạn vi nhân giống quang tự dƣỡng

Hình 2.6 : Các giai đoạn nuôi cấy trong vi nhân giống quang dị dưỡng

(photomixotrophic) và quang tự dưỡng (photoautotrophic)

Theo Kozai và Kubota (2005), vi nhân giống thông thường trải qua 4 giai

đoạn: thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng, nhân nhanh chồi, tạo rễ, thuần hóa ex

vitro, với nuôi cấy mô quang tự dưỡng quá trình tạo chồi và tạo rễ kết hợp thành

một giai đoạn và cây tăng trưởng tốt trong điều kiện quang tự dưỡng nên giai đoạn

thuần hóa ex vitro là không cần thiết, do đó có thể chuyển cây ra đất khi cây đã tạo

rễ đầy đủ Như vậy, các giai đoạn vi nhân giống quang tự dưỡng bao gồm 3 giai

đoạn: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng, nhân nhanh chồi và tạo rễ , chuyển ra

điều kiện ex vitro

Loại hộp Thể

tích (l)

Thiết bị

sử dụng cho việc bơm khí

Lượng khí trao đổi/h

cây trong hộp

Số cây/

Sợi polyester

200 1348 Tăng khả năng sinh trưởng

và tăng khả năng quang hợp

1992 Poly

carbonate

11 Bơm 0.9, 1.9,

2.8, 3.3

Ipomoea batatas L

Cellulose

và vermiculite

6 94 Tăng khả năng sinh trưởng

Florialite 40 1150 Tăng sinh trưởng, quang

hợp thuần, cây con đồng nhất

Florialite 500 2538 Tăng sinh trưởng, cây con

đồng nhất, tăng tỷ lệ sống

của cây ex vitro

Zobayed, 2000a

lệ sống của cây ex vitro

Zobayed, 2000b

Plexiglas 125 Bình CO2

và buồng trộ không khí

Florialite 40 611 Tăng sinh trưởng, sản xuất

Florialite 40 611 Tăng lượng đường hòa tan

và lượng tinh bột

Wilson,

2001 Hộp với

ống dẫn

khí

3.4 Bơm 0.5 - 6 Eralyptus

camaldulesis

Florialite 40 1150 Phân phối CO2 đồng đều,

tăng sinh trưởng, quang hợp, khả năng sống, lá phát triển bình thường

Zobayed,

2001

Plastic 2.6 Bơm 1.6 – 5.8 Coffea

arabusia

Florialite 54 2400 Tăng sinh trưởng, quang

hợp, tăng khả năng nảy mầm phôi soma, tăng tỷ lệ sống của cây ex vitro

Afreen,

2002

Plexiglas 120 Bình CO2

và buồng trôn không khí

2.3 - 22 Zantedeschia

elliottiana và Cunninggha mia

lanceolala

Vermiculite 1500 2240 Tăng khả năng sinh trưởng

và tỷ lệ sống, hạ giá thành cây con

Xiao, Kozai 2004

2.3.5 Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý đến nuôi cấy mô quang tự dưỡng

2.3.4.1 Ánh sáng

Trong tự nhiên, tất cả các sinh vật chứa diệp lục tố đều có khả năng sử dụng

năng lượng mặt trời để tổng hợp chất hữu cơ carbohydrate Trong nhân giống in vitro, cây sử dụng nguồn ánh sáng nhân tạo để tổng hợp carbonhydrate Cây nuôi

cấy theo phương pháp truyền thống (quang dị dưỡng) thường được chiếu sáng với cường độ ánh sáng thấp (khoảng 30 – 40 µmol m-2

s-1) và đường hiện diện trong môi trường nuôi cấy đã kiềm hãm khả năng quang hợp (Kozai, 1991) Trái lại, cây

nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng có khả năng quang hợp cao khi môi trường nuôi

cấy được cung cấp cường độ ánh sáng (PPF) cao và thời gian chiếu sáng gia tăng (Kozai và Iwanami, 1988; Kozai và ctv 1986, 1987, 1988), nhờ đó không cần thiết phải sử dụng đường trong môi trường nuôi cấy Nghiên cứu gần đây về khả năng quang hợp của phôi soma cà phê cho thấy rằng nuôi cấy các phôi dưới cường độ ánh sáng cao (100-150 μmol m -2 s -1) trong 14 ngày sẽ tạo ra các chất diệp lục, phát triển các khí khổng và từ đó khả năng quang hợp của phôi soma có lá gia tăng (Afreen và cộng sự, 2001; 2002)

Để gia tăng lượng ánh sáng cung cấp cho cây ta có thể đặt các tấm phản chiếu (giấy trắng hoặc tấm nhôm với hệ số phản xạ là 80-90%) ở phía trên các bóng đèn huỳnh quang chỉ có khoảng 25% ánh sáng phát ra từ bóng đèn đến trực tiếp giàn nuôi cấy, phần còn lại phát tán ra ngoài Nếu không sử dụng các tấm phản chiếu, 50% ánh sáng phát ngược lên trên sẽ bị hấp thụ phần lớn bởi bề mặt dưới của giàn nuôi cấy phía trên các bóng đèn huỳnh quang Lượng ánh sáng này sẽ được chuyển thành nhiệt làm gia tăng nhiệt độ của giàn nuôi cấy và do đó làm tăng nhiệt độ không khí xung quanh các bóng đèn Trong trường hợp một tấm kính trong được sử dụng để làm các tấm đáy của các giàn nuôi cấy trong kệ, ánh sáng hướng lên truyền qua tấm kính bên trên bóng đèn sẽ được hấp thu bởi môi trường bên trong bình nuôi cấy ở giàn phía trên, kết quả làm nhiệt độ của môi trường tăng lên và ảnh hưởng đến tăng trưởng của thực vật nuôi cấy Một cách khác để tăng cường ánh sáng cho cây là sử dụng các hộp nuôi cấy lớn với nắp có tính truyền sáng cao (Kozai và cộng

sự, 2005)

2.3.4.2 Nồng độ CO 2

Thực vật quang dị dưỡng sử dụng CO2 trong pha sáng của quang hợp nên nồng độ CO2 trong bình nuôi cấy nhanh chóng giảm làm hiệu suất quang hợp giảm trong suôt pha sáng Khi cây tiếp tục tăng trưởng thì nhu cầu CO2 tăng nhưng do bình kín thì nồng độ CO2 không thể tăng theo nhu cầu của cây, kết quả là sự tăng trưởng và phát triển của cây bị kìm hãm Phương pháp quang tự dưỡng làm gia tăng

CO2 trong bình bằng cách sử dụng các màng lọc millipore gắn lên nắp hoặc thành bình nuôi cấy hoặc sử dụng bơm khí trực tiếp vào bình nuôi Như vậy, tăng nồng độ

CO2 làm tăng khả năng quang hợp từ đó tăng khả năng phát triển của cây in vitro

[22]

2.3.4.3 Độ ẩm tương đối (RH)

Theo Kozai và cộng sự (1993) độ ẩm tương đối trong bình nuôi cây thường cao hơn 95% do sự bốc hơi nước của môi trường và sự thoát nước của lá Độ ẩm cao có thể gây ra hiện tượng thủy tinh thể, làm cho cây thoát hơi nước chậm dẫn đến tốc độ hấp thu nước và khoáng chất từ môi trường giảm sút, dẫn đến sự phát

triển bất thường của lớp cutin bề mặt lá và hoạt động khí khổng của cây in vitro bị

hạn chế (Chen, 2003) Một số nghiên cứu đã cho thấy rằng độ ẩm tương đối cao

trong bình nuôi cấy dẫn đến rối loạn sinh lý của cây in vitro (Ghashghaie, 1992; Preece và Sutter, 1990; Ziv, 1990) Do độ ẩm tương đối cao, cây in vitro không có khả năng chống lại stress nước sau khi chuyển sang môi trường ex vitro Debergh

và cộng sự (1992) kết luận rằng độ ẩm tương đối cao là yếu tố chi phối các rối loạn

sinh lý của cây in vitro

Vanderschaeghe và Debergh (1987) làm mát đáy bình nuôi cấy để giảm độ ẩm tương đối trong bình Bình nuôi cấy được đặt trên bề mặt của hai lớp kim loại Làm lạnh chất lỏng giữa 2 lớp kim loại, từ đó làm giảm nhiệt độ trong bình nuôi cấy Ghashghaie (1992) sử dụng phương pháp làm mát và sử dụng nắp thấm hơi nước để giảm độ ẩm tương đối Kết quả cho thấy những kỹ thuật này có thể giảm sự mất nước ở lá và cải thiện hoạt động của khí khổng Trong điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng, độ ẩm trong bình có thể được giảm bằng cách tăng lượng khí trao đổi qua bình, tăng sự khuyếch tán khí hay bơm khí cho bình nuôi Bằng cách sử dụng hệ

thống bơm khí, độ ẩm trong bình còn có thể được kiểm soát (Kozai và cộng sự, 1995)

2.3.4.4 Dòng khí

Trong các mô sống của cây nuôi cấy, không chỉ những cơ quan quang hợp mà tất cả các cơ quan đều cần có sự trao đổi khí cho hoạt động hô hấp của chúng Việc ngăn cản trao đổi khí trong vài giờ thường gây hại cho các tế bào đang tăng trưởng Thể tích khí trong môi trường nuôi cấy truyền thống thường nhỏ và có khả năng trao đổi khí thấp Do đó, tốc độ của dòng khí không thay đổi làm tích tụ ethylene trong bình nuôi cấy Khi nồng độ ethylene cao trên 0,1 mol mol-1 trong không khí của bình nuôi cấy sẽ ức chế sự tăng trưởng của cây, gây ra những hư hỏng về hình

thái như sự dư thừa nước trong cây in vitro (Zobayed, 2000)

Trong điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng, nhờ gia tăng sự trao đổi không khí với môi trường bên ngoài nên việc trao đổi không khí giữa các mô và không khí xung quanh được tăng cường đáng kể từ đó khắc phục những vấn đề trên

2.3.4.5 Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng lên sự quang hợp của cây Sự nhạy cảm của cây với oxygen trong quang hợp gia tăng theo nhiệt độ Lá và chồi chịu ảnh hưởng trục tiếp của nhiệt độ, Trong hệ thống nuôi cấy truyền thống, khi bình nuôi được đậy kín thì nhiệt độ bên trong bình thường không đổi theo thời gian và luôn cao hơn nhiệt độ phòng nuôi từ 1-2 oC Tuy nhiên, trong hệ thống quang tự dưỡng, không khí trong bình/hộp được trao đổi qua màng hay bằng bơm khí trực tiếp thì nhiệt độ không phụ thuộc vào hệ thống kín của bình mà phụ thuộc vào nhiệt độ của phòng nuôi cấy (Kozai và cộng sự, 1995)

2.3.4.6 Giá thể

Việc sử dụng agar hay gelrite trong nuôi cấy truyền thống có thể dẫn đến sự

chậm phát triển của cây in vitro do môi trường hệ rễ thiếu thông thoáng khiến hệ thống bó mạch ở rễ phát triển yếu, và thường cây in vitro chỉ phát triển hệ rễ sơ cấp

(Kozai và cộng sự, 2005)

Việc thay thế agar bằng các lọai giá thể xốp, có lỗ thoáng khí có tác động quan trọng lên môi trường vùng rễ và đặc điểm sinh học của rễ Cấu trúc rễ của cây