Nghiên cứu cải biến chitosan nhằm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm - Lê Phương Hà.

LÊ PHƯƠNG HÀTÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN CHITOSAN NHẰM TĂNG CƯỜNG HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC... Ứng dụng của chitosan và

LÊ PHƯƠNG HÀ

TÊN ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN CHITOSAN NHẰM

TĂNG CƯỜNG HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN

THỰC PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN ANH DŨNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, ñược các ñồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng ñược công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Họ tên tác giả

Lê Phương Hà

LỜI CẢM ƠN !

Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành ñến:

Ban giám hiệu trường Đại học Tây Nguyên

Các thầy cô Khoa sau Đại học, Khoa KHKT&CN Trường Đại học Tây Nguyên

Các thầy cô phòng thí nghiệm Sinh học thực vật – Khoa Nông Lâm Nghiệp Trường Đại học Tây nguyên ñã ñộng viên và giúp ñỡ cho tôi sớm hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Ban Giám Hiệu, toàn thể các anh chị, các bạn ñồng nghiệp và ñặc biệt là Khoa Trồng Trọt trường Cao ñẳng Công Nghệ và Kinh Tế Bảo Lộc

ñã luôn tạo ñiều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian công tác và học tập

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất ñến PGS.TS Nguyễn Anh Dũng, người ñã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ dạy và giúp ñỡ trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn

Xin ghi nhận sự giúp ñỡ của các anh chị trong lớp Cao học Sinh Học Thực Nghiệm K1 ñã luôn ñộng viên và giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Cuối cùng tôi vô cùng biết ơn sự quan tâm , khích lệ của người thân trong gia ñình ñã luôn luôn ñộng viên về mọi mặt ñể tôi hoàn thành tốt khóa học này

Xin chân thành cảm ơn!

LÊ PHƯƠNG HÀ

MỤC LỤC Trang

Các chữ viết tắt………i

Danh mục ảnh……… ii

Danh mục bảng……… iv

Danh mục hình………v

MỞ ĐẦU……….……… 1

Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… ……… 3

1.1 Tổng quan về chitosan và chitosan oligomer……… 3

1.1.1 Công thức cấu tạo ……….3

1.1.2 Tính chất của chitosan ……… 4

1.1.3 Các ñặc tính của chitosan 6

1.1.4 Ứng dụng của Chitosan và các dẫn suất ……… ………7

1.1.5 Tình hình nghiên cứu cải biến chitosan 15

1.1.6 Các dẫn suất cải biến của Chitosan 20

1.1.6.1 Chitooligosaccharide ……… …….20

1.1.6.2 Các dẫn suất của Chitosan ……… ……….21

1.1.7 Khả năng kháng khuẩn của Chitosan và dẫn suất 25

1.2 Tình hình bảo quản thực phẩm hiện nay 26

1.3 Một số ñặc ñiểm của ñối tượng nghiên cứu 27

1.3.1 Vi khuẩn Escherichia coli 27

1.3.1.1 Đặc ñiểm chung 27

1.3.1.2 Đặc ñiểm sinh vật 28

1.3.1.3 Phòng và trị 28

1.3.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 28

1.3.2.1 Đặc ñiểm chung 28

1.3.2.2 Phòng bệnh và chữa bệnh 29

Phần 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 30

2.1 Nội dung nghiên cứu 30

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Địa ñiểm nghiên cứu 30

2.2.2 Vật liệu hoá chất 30

2.2.3 Thiết kế thí nghiệm 30

2.2.3.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 30

2.2.4 Các bước tiến hành 31

2.2.5 Phương pháp nghiên cứu cải biến chitosan 32

2.2.5.1 Phương pháp cải biến chitosan-glucose 32

2.2.5.2 Phương pháp cải biến chitosan-glucosamine 33

2.2.6 Phương pháp nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các dẫn suất chitosan cải biến 33

2.2.6.1 Xác ñịnh khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp ño ñộ ñục 33

2.2.6.2 Xác ñịnh khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa 34

2.2.7 Phương pháp thử nghiệm các dẫn suất chitosan cải biến trong bảo quản thực phẩm 34

2.2.8 Phương pháp xử lý số liệu 37

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Nghiên cứu chế tạo dẫn suất Chitosan cải biến 38

3.1.1 Ảnh hưởng khối lượng phân tử của chitosan và tỷ lệ nồng ñộ chitosan/glucose ñến phản ứng Maillard 38

3.1.2 Ảnh hưởng khối lượng phân tử của chitosan và nồng ñộ ñường glucose ñến phản ứng Maillard gắn glucosamine vào mạch chitosan 40

3.2 Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các dẫn suất chitosan cải biến

trong invitro 41

3.2.1 Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của chitosan – glucose 41

3.2.2 Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn chitosan – glucosamine cải biến 52

3.3 Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan cải biến bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa 62

3.3.1 Đối với chitosan – glucose 62

3.3.2 Đối với chitosan – glucosamine 65

3.4 Nghiên cứu thử nghiệm các dẫn suất chitosan cải biến trong bảo quản thực phẩm 67

3.4.1 Đối với chitosan – glucose 67

3.4.1.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose ñến trạng thái cảm quan của thịt trong quá trình bảo quản 67

3.4.1.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine ñến trạng thái cảm quan của thịt trong quá trình bảo quản 71

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76

4.1 Kết luận ……….………76

4.2 Đề nghị ……… 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77

Tiếng Việt 77

Tiếng Anh ……… ……… 79 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng1.1: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử của chitosan ñến khả năng kháng khuẩn…… ………17 Bảng 1.2: Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của chitosan và DEMC 18 Bảng 2.1: Cơ sở cho ñiểm thịt bò theo TCVN 3215-79……… 37 Bảng 2.2: Hệ số quan trọng của các chỉ tiêu cảm quan của thịt………… 38 Bảng 2.3: Bảng phân cấp chất lượng thịt……… 38 Bảng 3.1: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử và nồng ñộ ñường glucose ñến mức ñộ phản ứng Maillard……… 40 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử và nồng ñộ ñường glucosamine ñến mức ñộ phản ứng Maillard………41 Bảng 3.3: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân

tử 30000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli……… 43

Bảng 3.4: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân

tử 30000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus……… 45

Bảng 3.5: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân

tử 300000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli……… 46

Bảng 3.6: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân

tử 300000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus……… 48

Bảng 3.7: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân

tử 700000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli……… 50

Bảng 3.8: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân

tử 700000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus……… 51

Bảng 3.9: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng

phân tử 30000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus……….53

Bảng 3.10: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng

phân tử 30000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli……… 55

Bảng 3.11: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng

phân tử 300000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus……… 56

Bảng 3.12: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng

phân tử 300000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli……… 57

Bảng 3.13: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng

phân tử 700000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus……… 59

Bảng 3.14: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng

phân tử 700000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli……… 60

Bảng 3.15: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose

bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn S aureus……… 62

Bảng 3.16: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose

bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn Escherichia coli……….63

Bảng 3.17: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn

Staphylococcus aureus……… 64

Bảng 3.18: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn

Escherichia coli……….65

DANH MỤC HÌNH VẼ, CÁC ĐỒ THỊ

Trang Hình 1.1: Cấu trúc của chitin, chitosan và cellulose……… 3 Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 30000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 250C) ñến trạng thái cảm quan của thịt……… 67 Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 300000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 250C) ñến trạng thái cảm quan của thịt……… 67 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 700000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 250C) ñến trạng thái cảm quan của thịt……… 68 Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 30000Da ở nhiệt ñộ lạnh (50C) ñến trạng thái cảm quan của thịt……… 69 Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 300000Da ở nhiệt ñộ lạnh (50C) ñến trạng thái cảm quan của thịt……… 69 Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 700000Da ở nhiệt ñộ lạnh (50C) ñến trạng thái cảm quan của thịt……… 70 Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine

có khối lượng phân tử 30000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 250C) ñến trạng thái cảm quan của thịt……… 71

Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine

có khối lượng phân tử 300000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 250C) ñến trạng thái cảm quan của thịt………71 Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine

có khối lượng phân tử 700000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 250C) ñến trạng thái cảm quan của thịt………72 Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine

có khối lượng phân tử 30000Da ở nhiệt ñộ lạnh (50C) ñến trạng thái cảm quan của thịt……… 72 Hình 3.11: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine

có khối lượng phân tử 300000Da ở nhiệt ñộ lạnh (50C) ñến trạng thái cảm quan của thịt……… 73 Hình 3.12: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine

có khối lượng phân tử 700000Da ở nhiệt ñộ lạnh (50C) ñến trạng thái cảm quan của thịt……… 73

Vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong những mối quan tâm chung của toàn xã hội và là vấn ñề thời sự ñược dư luận quan tâm, nhất là khi các cơ quan chức năng mới phát hiện hàng loạt những vi phạm nghiêm trọng về vệ sinh an toàn thực phẩm

Khi xu hướng sử dụng các loại thực phẩm chế biến sẵn của thị trường ñang gia tăng, ñặc biệt là ñối với các sản phẩm thịt chế biến cổ truyền của Việt Nam như giò lụa, nem chua, lạp xưởng, xúc xích ñược người tiêu dùng ngày càng ưa chuộng Tuy nhiên, theo báo cáo của Chi cục Thú y Thành phố

Hồ Chí Minh (1999) cho thấy 50-60% mẫu xét nghiệm không ñạt tiêu chuẩn

vi sinh và sinh hóa Ngộ ñộc thực phẩm do vi khuẩn và ñộc tố của nó thường xảy ra do thiếu sót trong quá trình chế biến, công tác kiểm tra, thanh tra thực phẩm và nguyên liệu dùng ñể chế biến thực phẩm Loại ngộ ñộc này thường do

Salmonella enteritidis, Clostridium perfrigens, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Hiện nay, ñể bảo quản các loại thực phẩm tươi như thịt, cá, giò

chả… phần lớn người ta ñã sử dụng các chất hóa học như phân urê, hàn the, benzoate natri, trong nước mắm có urê hay sử dụng formon trong làm bánh phở, hàn the ñể làm chả nem, hầu hết các chất này khi vào cơ thể tích tụ lâu ngày sẽ gây ảnh hưởng ñến sức khỏe của con người và nghiêm trọng hơn nữa là gây ra các bệnh ung thư và làm giảm giá trị của thực phẩm

Chitosan là một polimer sinh học, ñược tách từ vỏ tôm, cua, côn trùng, giáp xác và tế bào nấm Chitosan là một poly-glucosamin ñược cấu tạo từ các gốc glucosamin kiên kết với nhau bằng liên kết β- 1,4 glucoside Chitosan và các sản phẩm thủy phân của chitosan là chitosan oligomer là các sản phẩm của tự nhiên, không ñộc, không gây ô nhiểm môi trường nhưng có hoạt tính sinh học rất cao Chitosan ñược chứng minh là một chất có hoạt tính kháng khuẩn, chống nấm và chống oxi hóa nhờ tính chất polycation tự nhiên nên có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp và bảo quản thực phẩm Tuy nhiên, enzyme của

một số vi khuẩn tiết ra có khả năng phân hủy và làm mất hoạt tính của chitosan Vì vậy, ñể tăng cường hoạt tính kháng khuẩn, hạn chế khả năng phân huỷ của enzyme do vi sinh vật tiết ra, cần phải cải biến thay ñổi cấu trúc của chitosan Xuất phát từ thực tiễn ñó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:

“Nghiên cứu cải biến chitosan nhằm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn ñể ứng dụng trong bảo quản thực phẩm”

Mục tiêu của ñề tài là:

1 Cải biến chitosan nhằm nâng cao hoạt tính kháng khuẩn

2 Thử nghiệm ứng dụng chitosan cải biến trong bảo quản thực phẩm

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về chitosan và chitosan oligomer

1.1.1 Công thức cấu tạo

Chitosan là một polymer sinh học với các ñơn phân N-acetyl glucosamine ñược deacetyl hoá một phần, hiện diện tự nhiên trong vách một

số giống nấm như Mucorales (Muzarelli, 1993)[42] Tuy nhiên, phần lớn lượng chitosan hiện ñang ñược thu nhận và sử dụng lại chủ yếu từ quá trình deacetyl hoá chitin, thành phần chính của trong bộ xương ngoài của ñộng vật giáp xác như tôm, cua hay mực

Chitosan dễ tan trong các acid hữu cơ như axít lactic, axít acetic Khi phân hủy chitosan bằng các tác nhân khác nhau như axít clohidric, enzyme chitosanase, cellulase hoặc bức xạ gamma sẽ tạo nên các sản phẩm có chiều dài mạch ngắn hơn gọi là oligoglucosamine

Hình 1.1: Cấu trúc của chitin, chitosan và cellulose

Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, trong ñó nhóm (-NH2) thay thế nhóm (-COCH3) ở vị trí C(số 2) Chitosan ñược cấu tạo từ các mắt xích D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết b-(1-4-glicoside, do vậy chitosan có thể gọi là poly b-(1,4)-2-amino-2-deoxi-D-glucose hoặc là poly b-(1-4)-D-glucosamine (cấu trúc bậc III)

Các ñơn vị cấu tạo nên phân tử chitosan là -D-glucosamine hay 2-amino-2-deoxy-D-glucose

-(1,4)-1.1.2 Tính chất của chitosan

a Tính chất vật lý

Chitosan là chất rắn, xốp, nhẹ, màu trắng ngà, không mùi, không vị, hòa tan dễ dàng trong các acid hữu cơ như axít lactic, axít acetic Ngay từ năm 1968, K.Arai và cộng sự ñã xác ñịnh chitosan hầu như không có tính ñộc, không gây ñộc trên ñộng vật thực nghiệm và người Nhiều tác giả chỉ rõ chitosan, chitosan glucosamine có nhiều ưu ñiểm: tính chất cơ học tốt, không ñộc, dễ tạo màng, hòa hợp sinh học không những ñối với ñộng vật mà còn ñối với các mô thực vật

b Tính chất hóa học

Phân tử lượng từ 10 -1000 kDa tùy theo ñiều kiện sản xuất

Mức ñộ deacetyl hoá thường từ 70% ñến 100%

Nhiệt ñộ nóng chảy từ 309oC ñến 311oC tùy theo trọng lượng phân tử

và mức ñộ deacetyl hoá

Chitosan tan trong dung dịch loãng các axít hữu cơ như axít acetic, axít formic, axít adipic, axít propionic và một số axít vô cơ Ba thuộc tính cơ bản nhất của chitosan là: phân tử lượng, mức ñộ deacetyl hoá và ñộ tinh sạch Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức –OH, -NHCOCH3trong các mắt xích axetyl-D-glucosamine và nhóm –OH, nhóm –NH2 trong

mắt xích D-glucosamine có nghĩa chúng vừa là ancol vừa là amin, vừa là amit Phản ứng hóa học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N- hoặc dẫn xuất thế O-, N-

Mặt khác chitosan là những polimer và các monomer ñược nối với nhau bởi các liên kết b-(1,4)-glicoside, các liên kết này rất dễ bị cắt ñứt bởi các chất hóa học như: acid, bazơ, tác nhân oxy hóa và các enzime thủy phân

* Các phản ứng của nhóm –OH

Phản ứng của nhóm –OH có thể tạo ra các dẫn suất

- Dẫn xuất sunfat

- Dẫn xuất O-axyl của chitin/chitosan

- Dẫn xuất O-tosyl hóa chitin/ chitoan

* Phản ứng ở vị trí N

- Phản ứng N-acetyl hóa chitosan

- Dẫn xuất N-sunfat chitosan

c Các phương pháp thu nhận chitosan oligomer

Để thu nhận chitosan oligomer từ chitosan hiện nay có 3 phương pháp chủ yếu:

- Phương pháp hóa học

Đây là phương pháp khá ñơn giản, sử dụng các axít clohidric (6-12N)

ñể thủy phân, nhiệt ñộ thủy phân từ 80-1000C Domard,(1989) Tuy nhiên nhược ñiểm của phương pháp này là chi phí dành cho thiết bị cao, phải có thiết bị chống ăn mòn axít, gây ô nhiễm môi trường và nhất là hiệu suất thu

hồi các phân ñoạn oligoglucosamine có hoạt tính thấp, sản phẩm là các monomer là glucosamine cao (>30%)

- Phương pháp phân hủy bằng bức xạ gamma

Bức xạ gamma tăng cường ñộ deacetyl hóa và giảm bớt trọng lượng phân tử của chitosan Quá trình deacetyl hóa kiềm mạnh trọng lượng phân tử

của chitosan giảm từ 890 kDa ñến 380 kDa (bức xạ 50 kGy) và 200 kDa (bức

xạ 75 kGy) Điều chế chitosan oligomer ñược thực hiện bởi axít clohidric và

cellulase N.A.Dzung, (2001)[8]

- Phương pháp emzyme

Để thủy phân chitosan có thể sử dụng nhiều loại enzyme như chitosanase, celluloase, glucanase Phương pháp này ñược sử dụng khá rộng rãi hiện nay (Muraki, 1993; Aiba, 2002) Phương pháp này có nhiều ưu ñiểm như:

+ Hiệu suất thu hồi các phân ñoạn cao

+ Điều kiện diễn ra phản ứng thủy phân nhẹ nhàng, nhiệt ñộ thấp, pH

ôn hòa nên chi phí thiết bị thấp, không gây ô nhiễm môi trường

+ Nhược ñiểm của phương pháp này là chi phí dành cho enzyme khá cao

- Có thể tái sinh theo con ñường sinh học trên trái ñất

- Có khả năng thủy phân sinh học bằng enzyme trong cơ thể

- Có khả năng tương hợp sinh học với các cơ quan, mô và tế bào ñộng thực vật

- Có khả năng kích thích quá trình ñông máu và làm lành vết thương

- Có khả năng tương tác chuyên biệt với các thành phần của chất nền ngoại bào và các nhân tố tăng trưởng

- Giảm cholesterol do liên kết có chọn lọc với các lành axít béo

- Không gây ñộc do các sản phẩm sau thủy phân ñều là các chất chuyển hoá tự nhiên

- Không gây ñáp ứng miễn dịch trong mô và cơ quan ñộng vật

- Có tác dụng hỗ trợ trong ñiều hòa miễn dịch

- Có thể xử lý tạo nhiều dạng sản phẩm như dạng miếng, màng, tấm xốp, sợi, hạt, bột mịn, bông và gel

1.1.4 Ứng dụng của chitosan và các dẫn suất

Hiện nay, chitosan, chitin và chitosan oligomer là một trong những vật liệu mới ñã và ñang ñược ứng dụng rất phổ biến trong các lĩnh vực như: công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp, dược phẩm, y tế, môi trường, công nghệ sinh học và vật liệu mới Tất cả các ứng dụng của chitosan phụ thuộc chủ yếu vào các tính chất lý hóa và sinh học như: các thuộc tính lưu biến học, hoạt tính kháng khuẩn, ñiều chỉnh miễn dịch, làm lành vết thương và ñông máu, liên kết với enzyme, hấp thu kim loại, tạo màng và gel… Tùy vào lĩnh vực ứng dụng mà người ta sử dụng chitosan ở các mức ñộ tinh sạch khác nhau

Chitin, chitosan và oligoglucosamine ñều là các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên, không gây ñộc hại cho con người và gia súc, có khả năng phân huỷ sinh học và không gây ô nhiễm môi trường

• Ứng dụng của chitosan trong công nghiệp

+ Xử lý nước thải, hấp thu kim loại nặng

Hiện nay, phương pháp hóa lý là phương pháp tiện dụng và phổ biến trong hệ thống xử lý nước thải của các nhà máy công nghiệp Tuy nhiên, bất lợi chính của phương pháp này là nguy cơ gây ô nhiễm môi trường Vì thế, việc tìm ra một phương pháp "xanh" (phương pháp an toàn với môi trường) là

rất cần thiết Do có nguồn gốc từ tự nhiên và có khả năng thủy phân sinh học, chitosan là một chất thay thế hợp lý Chitosan ñã ñược sử dụng trong quá trình lọc nước từ khoảng 3 thập niên trước Các nghiên cứu ñã cho thấy chitosan có khả năng:

- Hấp thu kim loại nặng: chitosan mang ñiện tích dương kết hợp với những polymer ña ñiện âm tạo phức với các ion kim loại và kết tủa Chitosan cũng có thể ñược sử dụng như một chất hấp thụ ñể tách các ñồng vị phóng xạ nguy hiểm từ nước bị nhiễm phóng xạ và thu hồi uranium từ nước biển và nước ngọt

- Loại bỏ 100% các polyme hiện diện trong nước thải

- Giảm mùi hôi khó chịu (do làm giảm số lượng vi sinh vật gây thối)

- Một số ứng dụng mở rộng khác bao gồm: xử lý vệt dầu loang, xử lý nước thải sinh hoạt, tái sử dụng nước hồ bơi, thu hồi protein và khoáng

từ nước thải nông nghiệp, phân lập các chất có hoạt tính sinh học trong nước tiểu và tách các ñộc tố từ dung dịch

+ Trong công nghiệp sản xuất thực phẩm

Chitosan ñược dùng như một thành phần trong thực phẩm ở Nhật và Châu Âu từ khoảng 20 năm trước Chất này có tác dụng ổn ñịnh màu, mùi vị của thực phẩm Ngoài ra, chitosan còn thể hiện tác dụng tuyệt vời trong bảo quản thực phẩm

Ở Mỹ, chất này ñược sử dụng ñể "bẫy" lipid trong thực phẩm chức năng chống béo phì Chitosan ñược ưa chuộng không chỉ vì có tác dụng như chất xơ, thành phần quan trọng trong khẩu phần ăn, mà còn gắn với lipid trong dạ dày và ruột tạo thành một dạng chất mà cơ thể không thể hấp thu và

sẽ ñược loại thải ra ngoài Các nghiên cứu cho thấy chitosan gắn ñược với lượng chất béo gấp 4 lần khối lượng của chúng Andreu (2003)[14]

+ Trong công nghiệp mỹ phẩm

Chitosan là loại polymer tích ñiện dương tự nhiên duy nhất có khả năng chuyển thành dạng dung dịch nhớt khi hòa tan trong môi trường acid yếu Nhờ tính chất này mà chitosan ñã ñược ứng dụng rất nhiều trong sản phẩm chăm sóc tóc như dầu gội, dầu xả và sản phẩm tạo nếp Harida (1996)[74] Ngoài ra, chitosan cũng ñược dùng trong mỹ phẩm chăm sóc da, móng tay do

có các tính chất như bảo vệ, duy trì ñộ ẩm, tạo màng trên da ñồng thời gắn kết với các dưỡng chất cần thiết, tạo ñiều kiện cho các chất này hoạt ñộng tích cực trên da Tính kháng khuẩn của chitosan cũng góp phần vào công dụng của chitosan trong các sản phẩm mỹ phẩm và chăm sóc cá nhân Các ứng dụng cụ thể của chitosan trong lĩnh vực này bao gồm:

- Duy trì ñộ ẩm trên da, trị mụn, làm da khỏe hơn, tươi hơn, bảo vệ lớp biểu bì

- Giảm sự tích ñiện trên tóc (gây thương tổn tóc), trị gàu, giúp cho tóc mềm mại hơn, Andreu (2003)[14]

+ Trong một số công nghiệp khác

- Tăng ñộ bền cơ học và ñộ mịn của giấy, tăng chất lượng in trên giấy do thấm mực in tốt hơn

- Chitosan có thể ñược dùng làm chất cầm màu trong khi nhuộm và in sợi dệt Khả năng kháng khuẩn giúp vải bền hơn

Cải tiến quá trình in ảnh khi có mặt trong nhũ tương bạc cản quang Chitosan cũng còn ñược dùng làm chất bắt hình ñen trắng

• Ứng dụng của chitosan trong nông nghiệp

Chitosan ñược sử dụng như một chất thay thế an toàn cho các chất hoá học từ lâu vẫn ñược sử dụng có thể gây hại ñến môi trường và sức khỏe con người Chitosan tác ñộng hỗ trợ vào cơ chế phòng vệ ở thực vật (như trường hợp vaccine ñối với con người), kích thích sự tổng hợp và tiết một số loại

enzyme như phytoalexin, chitinase, pectinase, glucanase và lignin (Andreu, 2003)[14] Các ứng dụng chủ yếu của chitosan trong nông nghiệp gồm có:

+ Phóng thích chậm các hợp chất vào trong ñất

Trong nông nghiệp, việc kéo dài thời gian tác dụng của phân bón, chất ñiều hòa tăng trưởng hay chất dinh dưỡng là rất cần thiết Chitosan ñược sử dụng như chất mang tự nhiên ñể kếp hợp và phóng thích từ từ các hợp chất mong muốn vào trong ñất Chitosan bị phân hủy sinh học trong ñất trong khoảng 2 tháng, kèm theo sự phóng thích các chất Do ñó, người ta tiết kiệm ñược ñáng kể lượng chất sử dụng và thời gian bón lặp khi dùng chitosan làm chất mang

+ Vỏ bao của hạt

Hoạt ñộng chitinase ñược gia tăng trong giai ñoạn nảy mầm khi bề mặt của hạt giống ñược bao bằng một lớp chitosan Khi sử dụng chitosan làm vỏ bao của hạt, khả năng kháng nấm và vi khuẩn của chitosan hỗ trợ hữu hiệu cho sự nảy mầm và sự phát triển của cây trồng

+ Chất bổ sung vào thức ăn gia súc

Các khảo sát liên quan ñến việc bổ sung chitin và chitosan vào thức ăn gia súc cho một số kết quả sau:

- Ở gà mái và gà giò, chitin và chitosan cho ăn hầu như ñược tiêu hoá hoàn toàn

- Ở thỏ khoảng 30% lượng chitin cho ăn ñược tiêu hoá hoàn toàn Tỉ lệ này hầu như không thay ñổi sau 25 ngày cho ăn liên tục Trong khi ñó, chitosan ñược tiêu hoá 35% sau 5 ngày cho ăn và khả năng này tăng tới 80% sau 15 ngày Điều này có lẽ là do sự gia tăng số lượng vi khuẩn ñường ruột, Antoni (2005)[73]

+ Kích thích tăng trưởng thực vật

Hiện nay, oligoglucosamine ñược xếp vào nhóm ñiều hoà sinh trưởng thế hệ mới (Zubay, 1998)[75] Hiện nay ñang ñược nghiên cứu sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật cho phong lan (Nagasawa, 2002, Khin Lay Nge, 2002) Chvagrit (2002) thử nghiệm chitosan chiếu xạ ñể kích thích sinh trưởng cho phong lan sau 30 ngày sinh khối rễ và cây tăng từ 20-60% so với ñối chứng ở nồng ñộ thích hợp nhất là 50 ppm (Sasitorn, 2002) phun chitosan cho rau cải có thể tăng năng suất từ 13-31%

Cơ chế tác ñộng của chitosan, oligoglucosamine ñã ñược làm sáng tỏ bằng kỹ thuật sinh học phân tử (Hadwiger, 2002)[76] ñã chứng minh oligoglucosamine là tín hiệu phân tử hoạt hoá và tăng cường hoạt ñộng của hàng loạt gen trong hệ thống ñề kháng của thực vật và các gen liên quan ñến trao ñổi chất như chitinase, chitosanase, glucanase, tăng cường tổng hợp phytoalexin, proteinase inhibitor, tăng cường tổng hợp xenlulose, lignin,… Tình hình nghiên cứu ứng dụng chitin, chitosan và nhất là oligoglucosamine còn khá mới mẻ (Nguyễn Quốc Hiến, 1999) có nghiên cứu thu nhận các oligoalginate tách ra từ rong biển ñể sử dụng trong nông nghiệp Sau ñó, (Nguyễn Quốc Hiến, Phạm Thị Lệ Hà, 1999) cũng nghiên cứu chế tạo chitosan oligomer bằng kỹ thuật bức xạ gamma Tuy nhiên, phương pháp này còn có nhiều nhược ñiểm so với phương pháp enzyme là giá thành cao, các phân ñoạn oligomer có khối lượng phân tử không tập trung, vì vậy hoạt tính sinh học thường thấp

Ngoài ra, ở Việt nam chitosan còn ñược nghiên cứu trong bảo quản trái cây như chuối, vải thiều, cà chua, dưa chuột (Châu Văn Minh, 1996) Sản phẩm ñược bảo quản lâu hơn, màu sắc tươi tự nhiên hơn so với ñối chứng

+ Thuốc bảo vệ thực vật sinh học

Chitosan và chitosan oligomer có hoạt tính kích thích tăng trưởng thực vật, tăng số lượng vi sinh vật có lợi và hạn chế các nấm gây hại trong ñất, hoạt hóa tăng cường hệ thống ñề kháng của thực vật

(Suwalee, 2002) thử nghiệm phun chitosan cho cây ngô ñể trị bệnh bạc

lá, kết quả cho thấy nếu sử dụng nồng ñộ 80 ppm thì chitosan hiệu quả hơn và

an toàn hơn so với các loại thuốc bảo vệ thực vật trên thị trường (Nguyễn

Anh Dũng, 2006)[62] nghiên cứu sử dụng chitosan oligomer và chitosan

oligomer cải biến ñể kháng nấm Fusarium, vi khuẩn gây bệnh héo xanh cho lạc Pseudomnas solanacerum và tuyến trùng ký sinh Meloidogine incognita,

số lượng tuyến trùng ký sinh giảm từ 6-8 lần sau khi tưới chitosan oligomer 3 tháng (Rabea, 2004) cũng nghiên cứu tổng hợp alkyl và aryl-chitosan sử dụng làm thuốc trừ nấm và trừ sâu

+ Bảo quản nông sản

Trong bảo quản thực phẩm, chitosan không những phát huy khả năng kháng khuẩn và nấm, mà còn giúp ñiều chỉnh môi trường bên trong rau quả thông qua kiểm soát quá trình trao ñổi khí giữa rau quả và môi trường (Nguyễn Anh Dũng và các cộng sự, 1999) Dung dịch chitosan ñã ñược dùng

ñể tạo lớp màng bảo quản hoa quả và rau củ chống vi khuẩn và nấm Ở Nhật, dung dịch chitosan cũng ñược phun lên táo và cam cho mục ñích này Nghiên cứu của (André Bégin, 2003)[77] cũng ñề xuất quy trình bảo quản dâu bằng chitosan Chitosan còn ñược sử dụng ñể làm bao bảo vệ chống sương giá (Andreu, 2003)[14]

(Ghaouth, 1996) nghiên cứu cho thấy chitosan có khả năng ức chế các

loại nấm gây hại sau thu hoạch rau quả như Rhizopus, Colletotrichum,

chitosan bảo quản dâu tươi và các loại trái cây khác lâu hơn do hạn chế nấm gây hư thối và ức chế hô hấp (Fajado, 1994) cho thấy chitosan ức chế nấm

mốc sinh ñộc tố A flavus trên lạc, ñậu tương

Sử dụng chitosan ñể bảo quản trái cây cũng rất ñược chú ý Chitosan ñã ñược sử dụng ñể bảo quản xoài, cam, dâu tây (Piyabutr, 2002; Varaporn, 2002; Chucheep, 2002) Sử dụng chitosan bao trái cây (coating) có thể kéo dài thời gian bảo quản 15 ngày ở nhiệt ñộ phòng so với ñối chứng

(Hong Kyoon No, Na Young Park, Samuel P Meyers, 2002) cho thấy chitosan có hoạt tính kháng khẩn cao hơn chitosan oligomer Chitosan ñã ức chế sự sinh trưởng của hầu hết các loại vi khuẩn và có hiệu quả kháng khuẩn ñối với vi khuẩn gram dương cao hơn vi khuẩn gram âm Chitosan ñược xem như là một chất phụ gia thực phẩm ở Hàn Quốc và Nhật Bản trước năm 1995

và 1983 Chitosan với hoạt tính kháng khuẩn cao sẽ ngăn chặn những thực phẩm bị hỏng do vi khuẩn hoặc kéo dài thời gian sử dụng của thực phẩm

(Devlieghere, 2004) nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và ứng dụng trong bảo quản rau quả và thực phẩm Chitosan nghiên cứu có mức

ñộ deacetyl hóa 95%, khối lượng phân tử 43 kDa Kết quả cho thấy chitosan

có khả năng kháng mạnh ñối với vi khuẩn gram âm, chỉ số MIC là < 60 ppm, trong khi ñó nấm men và vi khuẩn gram dương là 100 ppm

• Ứng dụng của chitosan trong lĩnh vực sinh học và y học

Đã có rất nhiều thử nghiệm ñã ñược tiến hành ñể xác nhận tính an toàn của chitosan như: thử nghiệm khả năng gây ñột biến; khả năng gây ñộc cấp tính; bán cấp tính và mãn tính; khả năng gây sốt; làm tan máu và gây dị ứng (Antoni, 2005)

Số liệu ghi nhận trên thỏ, gà mái và gà giò khi ñược cho ăn chitosan với liều lượng 0,7- 0,8g/kg khối lượng cơ thể/ngày trong 239 ngày là không có triệu chứng bất thường nào Khả năng tiêu hoá chitosan biểu kiến ở thỏ là 28- 38% còn ở gà mái, gà giò là hoàn toàn Khi tiêm chitosan và các phân ñoạn chitosan vào thỏ với liều lượng 4,5mg/kg khối lượng cơ thể/ ngày trong 7-11 ngày, không phát hiện ñược biểu hiện bất thường nào (Antoni, 2005) Trong nghiên cứu kéo dài 12 tuần trên người, không có triệu chứng lâm sàng nào ñược ghi nhận ở những người uống chitosan trong so với những người uống thuốc giả Chỉ có 2,6 – 5,4% ñối tượng có triệu chứng buồn nôn và táo bón tuy nhiên rất nhẹ và tạm thời (Lin, 2004) Với tất cả các bằng chứng trên, việc

ứng dụng các thuộc tính qúy giá của chitosan trong lĩnh vực y sinh là hoàn toàn hợp lý

+ Tác nhân hạ cholesterol LDL

Đã có rất nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng giảm cholesterol và

mỡ trong máu của chitosan Thí nghiệm trên mô hình chuột quá dư thừa cholesterol trong máu do thiếu apolipoprotein E ñược tiến hành trong 20 ngày Mỗi ngày chuột thí nghiệm ñược ăn 5% chitosan trong khẩu phần thức ăn còn

lô ñối chứng thì không ñược cho ăn chitosan Hàm lượng cholesterol trong máu giảm ñáng kể sau 20 tuần, chỉ còn 64% so với lô ñối chứng Ngoài ra, khả năng ức chế xơ vữa ñộng mạch của chuột ñược ăn chitosan ở ñộng mạch chủ là 42% và cung ñộng mạch chủ là 50% Chuột ñược ăn chitosan cũng lớn nhanh hơn rõ rệt Thí nghiệm này cũng mở ra khả năng ức chế sự phát triển chứng xơ vữa ñộng mạch trong ñiều trị bệnh cho người quá dư thừa hàm lượng cholesterol trong máu, (Heller, 1990)[62] Ở một nghiên cứu khác trên người, chitosan hạ 5,8 - 42,6% tổng lượng cholesterol trong huyết tương và 15,1 - 35,1% lipoprotein tỉ trọng thấp (low density lipoprotein – LDL) trong

cơ thể (Lin, 2004)

+ Chitosan dùng làm vật liệu sinh học, y học và dược phẩm

Chitosan có khả năng tương hợp sinh học với mô và tế bào do ñó có thể

sử dụng trong việc cấy ghép vào mô ñộng vật Vì vậy, người ta ñã tiến hành ứng dụng chitosan làm vật liệu y sinh học mới như chỉ khâu tự tan trong phẫu thuật, da nhân tạo trong ñiều trị bỏng và vết thương, kính áp tròng trong ñiều trị các tật về mắt Gần ñây, người ta cũng ñã tiến hành nghiên cứu sử dụng chitosan dạng ống nhằm mục ñích tái sinh dây thần kinh (Krysteva, 1987)

Trong ñiều trị vết thương, chitosan có tác dụng cầm máu, ñẩy nhanh quá trình phát triển các tế bào ở vùng mô bị thương, tăng cường hoạt ñộng của chitinase và lysozyme, dẫn ñến mau lành vết thương và giảm nhiễm

trùng[54] Chitosan ñược báo cáo là bền với dịch mật, dịch tuỵ và nước tiểu nên ñược dùng trong chỉ khâu phẫu thuật thay thế cho các loại vật liệu khác

có thể bị chất dịch trong cơ thể tấn công và ñứt trước khi vết thương lành hẳn Harida (1996)

Trong các trường hợp bị bỏng, chitosan có thể tạo thành ở dạng màng xốp hút nước mạnh và giúp cho oxy phân tán qua màng vào mô tổn thương rất

dễ dàng, tạo ñiều kiện cho các mô này bình phục nhanh chóng

Trong lĩnh vực dược phẩm, chitosan ñược sử dụng như chất mang an toàn, có khả năng phóng thích thuốc dần dần trong cơ thể, kéo dài tác dụng của thuốc hay vật liệu cố ñịnh enzyme trong sản xuất và ñiều trị Chitosan còn ñược dùng ñể ñiều chế các chất làm giảm bớt ñộ chua trong dạ dày và các sản phẩm ngưng tụ của axít benzyl, penicilic với chitosan ñã ñược dùng ñể xác ñịnh ñộ nhạy penicilin trong cơ thể người

+ Đặc tính chống ung thư của chitosan

Chitosan có khả năng trung hòa acid và có hoạt tính chống ung thư Điều này ñã ñược kiểm chứng ở chó và chuột Người ta cho rằng chitosan có ñặc tính tương tự với các chất bao vùng dạ dày

Ngoài ra, chitosan còn ñược ứng dụng trong ñiều trị bệnh nhân ung thư ñược xạ trị và hoá trị liệu Kết quả cho thấy chitosan giúp giảm thiểu sự thay ñổi về thể trạng, các chỉ tiêu huyết học và sinh hoá ở bệnh nhân ñược ñiều trị bằng xạ và hoá trị liệu (Nguyễn Anh Dũng và cộng sự, 1996)[1]

+ Đặc tính kháng khuẩn của chitosan

Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất của nó ñã nhận ñược sự quan tâm ñáng kể trong những năm gần ñây Cơ chế kháng khuẩn của chitosan là nhờ một số cơ chế sau:

- Chitosan là một polycationic, chúng tương tác với thành phần polyanion vách tế bào (polysaccharides và protein) của vi sinh vật, kết quả là

sự rò rỉ thành phần nội bào do các thay ñổi trong tính thấm của hàng rào (barrier), ngăn cản chất dinh dưỡng ñi vào tế bào, ngăn cản sự nhập vào tế bào (ñặc biệt là chitosan có khối lượng phân tử thấp LMWC )

- Chitosan có khả năng kết hợp với DNA và nhờ vậy chitosan có khả năng ức chế tổng hợp RNA và protein

- Chitosan có khả năng gắn kết gây ñông tụ, kết tủa tế bào vi khuẩn và dẫn ñến giết chết tế bào

Chitosan cho thấy một phổ kháng khuẩn rộng kháng lại cả nấm và vi khuẩn gram-dương và Gram âm (Vishu Kumar, Varadaraj, Gowda, & Tharanathan, 2005)

Hong Kyoon No (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của sáu loại khối lượng phân tử khác nhau của chitosan, chitosan oligomer ñến khả năng kháng khuẩn trên 7 loại vi khuẩn gram dương và 4 vi khuẩn gram âm Kết quả thấy rằng chitosan có khối lượng phân tử cao có khả năng kháng khuẩn tốt hơn chitosan oligomer có khối lượng phân tử thấp hơn Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan mạnh hơn ở vi khuẩn gram âm hơn là vi khuẩn gram dương Chỉ số MIC của chitosan biến ñộng trong khoảng 0,05-0,1% tùy thuộc vào khối lượng phân tử

và loại vi khuẩn Hong Kyoon No (2004) cũng khẳng ñịnh rằng hoạt tính kháng khuẩn của chitosan thể hiện tốt hơn ở môi trường pH thấp

Bảng1.1: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử của chitosan ñến khả năng

kháng khuẩn

ñầu

Kiểm soát1

Phân tử lượng (kDa) 1

1671 1106 746 470 224 28 Gram (-) Escherichia coli 6,92 8,59 4,94 b 5,59 c 4,28 a 4,66 a 5,48 c 5,61 c

Nguyễn Anh Dũng (2004) cũng nghiên cứu khả năng kháng E.coli của

chitosan, chitosan oligomer và chitosan oligomer cải biến bằng cách gắn với salicylic aldehyde ñã làm gia tăng hoạt tính kháng khuẩn lên nhiều lần MIC

của chitosan ñối với E coli khoảng 250 ppm, oligoglucosamine khoảng

80-100 ppm và salicyden oligoglucosamine (SO) chỉ còn 30-40 ppm

Muối ammonium bậc bốn của chitosan thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rất cao Ví dụ: diethylmethylchitosan cloride thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao hơn chitosan Hydroxypropyl chitosan ghép với axit maleic natri ức chế

hơn 99% vi khuẩn S aureus và E coli trong 30 phút tiếp xúc với nồng ñộ 100

mg/ml

Avadi (2004) nghiên cứu chế tạo dẫn suất diethylmethylchitosan (DEMC) ñể tăng khả năng hòa tan trong dung môi, nước và tăng tính kháng khuẩn gấp hai lần so với chitosan không cải biến

Bảng 1.2: Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của chitosan và DEMC

Môi trường Kiểm chứng (mẫu trắng) Chitosan DEMC

1.1.5 Tình hình nghiên cứu cải biến chitosan

Theo nhiều nghiên cứu khẳng ñịnh hoạt tính kháng khuẩn của chitosan

- Chitosan có hoạt tính gây ñông tụ (coagulation) các tế bào vi khuẩn,

ức chế vi khuẩn sinh trưởng

Tuy nhiên, có một số vi khuẩn có hoạt tính chitinase, chitosanase và cellulase ngoại bào nên có khả năng phân hủy ñược chitosan, làm giảm hoạt tính kháng khuẩn Vì vậy hiện nay trên thế giới có 3 xu hướng cải biến

chitosan ñể làm thay ñổi cấu trúc ñể làm giảm hoạt tính của enzyme ngoại bào của vi khuẩn và tăng hoạt tính kháng khuẩn:

- Cải biến bằng cách tăng ñiện tích dương của chitosan

- Cải biến bằng cách tạo nhánh với các phân tử ñường

- Cải biến bằng cách tạo dẫn suất với các gốc hóa học khác như phosphate, sulfate, salicylic, …

Nguyễn Anh Dũng (2003) nghiên cứu cải biến tạo dẫn suất salicyden- chitosan ñể nâng cao hoạt tính kháng khuẩn Kết quả cho thấy chỉ số MIC của chitosan oligomer là 100 ppm, trong khi ñó salicyden chitosan oligomer chỉ có 30ppm Ying-Chien Chung và các công sự (2005) nghiên cứu cải biến chitosan khi gắn các gốc ñường glucose, glucosamine, maltose và fructose bằng phản ứng Maillard ñể tăng khả năng hòa tan và kháng khuẩn của chitosan Kết quả cho thấy: xét về tính tan, α-chitosan phù hợp với chuẩn bị chitosan hoà tan trong nước hơn là β-chitosan pH tối là 3,3 với nhiệt ñộ phản ứng là 65oC Hiệu suất tối ưu trong các kết quả của dẫn suất chitosan ñạt ñược vào các ngày (từ 2 ñến 6 ngày) và phụ thuộc vào việc sử dụng saccharide Căn

cứ vào các kết quả ñối với hiệu suất, tính tan, mức ñộ deacetyl và pH ổn ñịnh, nhiều khả năng chitosan hoà tan trong nước là dẫn suất chitosan glucosamin Dẫn suất này cho thấy khả năng tạo chelat với các ion kim loại cao hơn và có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn so với chitosan hoà tan trong acid Các kết quả này cho thấy rằng dẫn suất chitosan glucosamin sản xuất bằng phản ứng Maillard là một triển vọng thương mại thay thế cho chitosan hoà tan trong acid

Sweetie R Kanatt, Ramesh Chander, Arun Sharma (2007) cho thấy phức hợp chitosan glucose là chất ñể bảo quản tốt hơn là chỉ có chitosan, cho thấy ñó là chất chống ôxi hóa mạnh hơn so với chỉ có chitosan/glucose Hoạt tính kháng khuẩn của phức hợp chitosan/glucose thì giống với chitosan ñối

với các thực phẩm bị hỏng phổ biến và các mầm bệnh như: E.coli,

Pseudomonas spp, S aureus và B cereus

Avadi (2004) nghiên cứu cải biến chitosan bằng cách tạo dẫn suất dimethyl ethyl chitosan Dẫn suất này có tổng ñiện tích dương tăng ñáng kể

và tăng khả năng kháng khuẩn cũng như hạn chế khả năng phân huỷ do enzyme ngoại bào của vi khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn của dimethyl ethyl

chitosan ñược thử nghiệm với E coli Kết quả cho thấy, trị số MIC của

dimethyl ethyl chitosan nhỏ hơn gấp 2 lần so với chitosan

Huang (2004) nghiên cứu cải biến tạo dẫn suất chitosan sulfate ñể nâng cao hoạt tính kháng khuẩn của chitosan Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng

khuẩn của chitosan sulfate cho thấy chitosan sulfate ức chế mạnh vi khuẩn S

aureus, nhưng lại không ức chế E coli Khả năng ức chế ở nồng ñộ < 100

microgam/lít ñối với S aureus cao hơn axít phenic và một số chất kháng sinh

thông dụng

1.1.6 Các dẫn suất cải biến của chitosan

Như ñã ñề cập ở phần trên, chitosan có phạm vi ứng dụng rất ña dạng Tuy nhiên, khả năng tan hạn chế của chitosan (không tan trong nước, chỉ tan trong dung dịch có pH axít nhẹ…) ñã làm giới hạn các ứng dụng trong nhiều trường hợp Người ta ñã cố gắng tìm ra các phương pháp khắc phục nhược ñiểm này, tạo ra các loại chitosan tan tốt nhằm phục vụ cho mục ñích phát huy hiệu quả của chitosan trong các ñiều kiện pH môi trường ñòi hỏi khác nhau Các ứng dụng này chia làm hai hướng cơ bản:

- Phân cắt chitosan tạo các chitooligosaccharide có khả năng hòa tan ở

vừa ñắng, tan hoàn toàn trong nước, pH khoảng 5-7, tuỳ theo từng mục ñích ứng dụng cụ thể mà chitooligosaccharide ñược sản xuất có khối lượng phân tử dưới 3 kDa, dưới 6 kDa hay từ 6 kDa ñến 10 kDa

Các chitoologosaccharide ñã lôi cuốn rất nhiều chú ý của các nhà khoa học do khả năng phản ứng, thuộc tính vật lý và các hoạt tính sinh học của chúng Chúng có nhiều chức năng sinh lý quan trọng như cảm ứng phytoalexin, kháng khuẩn, kháng ung thư và khả năng kích thích hệ miễn dịch Galed (2004)[41] Ngoài ra, chitooligosaccharide còn ñược chứng minh có khả năng ngăn ngừa tiến triển của bệnh tiểu ñường và có ái lực với lipopolysaccharide cao hơn chitosan, Fujii (1978)[40]

Các nghiên cứu cũng ñã ghi nhận tính kháng khuẩn rất tốt và khả năng ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm của chitooligosaccharide có số mức

ñộ trùng hợp hoá (degree of polimerization) khoảng 8-16, Dumitriu [33] và cộng sự (1994), Lê Văn Hiệp (2008) Trong một số tài liệu, các nhà nghiên cứu gọi chúng là chitosan có khối lượng phân tử thấp (LMWC) hoặc phân ñoạn B Tuy nhiên, ñể cho thống nhất, chúng tôi sử dụng thuật ngữ chitooligosaccharide ñể chỉ chitosan có mức ñộ trùng hợp hoá là 8-16

+ Độ an toàn

Một thử nghiệm về ñộ gây ñộc bán cấp của chitooligosaccharide ñược Sprague-Dawley tiến hành trên chuột ñực và cái Các nhóm 36 con chuột cả ñực và cái thí nghiệm ñược cho ăn các liều 500, 1000 và 2000 mg/kg/ngày trong 4 tuần Các xét nghiệm về dấu hiệu bệnh lý, cân nặng, chỉ tiêu huyết học, sinh hoá và mô bệnh học ñã ñược tiến hành Kết quả cho thấy chuột trong nhóm ñối chứng và các nhóm thí nghiệm không khác biệt về các chỉ tiêu hình thái lẫn hành vi Thêm vào ñó, cũng không có khác biệt ñáng kể trong phân tích nước tiểu, huyết học, sinh hoá máu, khối lượng các cơ quan và mô bệnh học giữa các nhóm nói trên Vì vậy, có thể kết luận rằng tính ñộc bán cấp của chitooligosaccharide thấp dưới mức phát hiện với mức ñộ an toàn

ñược ghi nhận là 2.000 mg/kg khi xem xét các chỉ số tác ñộng bất lợi ñến sức khoẻ chuột, Fisk (1996)

1.1.6.2 Các dẫn suất của chitosan

Như ñã ñề cập, chitosan có nhiều tính năng ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực Tuy nhiên, khả năng tan hạn chế ñã gây khá nhiều trở ngại cho chất này trong các ứng dụng thực tế Chitosan chỉ tan trong dung dịch axít yếu do

có hiệu ứng proton hoá nhóm amino ở vị trí carbon C-2 của gốc glucosamine Các nhà khoa học ñã và ñang nghiên cứu các phương thức làm tăng khả năng tan của chitosan, ñồng thời vẫn duy trì và khai thác thêm ñược các tính năng quý giá của chất này Ngoài phân cắt tạo các chitooligosaccharide, người ta cũng ñã tiến hành các biến ñổi tạo dẫn xuất từ chitosan

• Tạo dẫn xuất tại vị trí nhóm –NH 2 của C-2

Sự hiện diện của nhóm amino trên phân tử chitosan rất hữu ích do nó mang ñến các thuộc tính sinh hoá quan trọng Các nghiên cứu ñược công bố

về khả năng kháng khuẩn của chitosan nhấn mạnh ñến ñộ deacetyl hoá, hay nói các khác là số lượng nhóm NH2 có mặt trong phân tử Số lượng này càng cao thì khả năng kháng khuẩn càng tốt, nhóm NH2 ñã ñược chứng minh ñóng vai trò quan trọng trong chức năng diệt khuẩn của chitosan (Harish 1996; Harida và cộng sự 1984)[53] [54]

Ngoài ra, nhóm amino cũng là một vị trí tạo thuận lợi cho việc gắn thêm các gốc hoá học trong phản ứng tạo dẫn xuất

+ Gắn ñường khử

Trong phản ứng khử alkyl hoá chitosan có sự hiện diện của tác nhân khử, các ñường ñôi khử như glucose, lactose, galactose, glucosamine… sẽ ñược gắn vào vị trí carbon C-2 của chitosan Phản ứng này mở mạch vòng của phân tử ñường (Chihara 1993; Lee HW và cộng sự 2003)[28]

Bên cạnh ñó, khi thực hiện phản ứng giữa chitosan và các dẫn xuất formylmethyl của các ñường khử nói trên thì sẽ xảy ra phản ứng gắn không có

sự mở vòng, Cui (2001)[30] như sơ ñồ sau:

+ Gắn polyethylene glycol (PEG)

PEG là một polyme ái nước, nên việc gắn PEG lên chitosan có khả năng cải thiện tính tan của chitosan, ñồng thời vẫn giữ nguyên cấu trúc cơ bản của nó, Nguyễn Anh Dũng (2004)[9] Harris (1984) cũng nghiên cứu thực hiện phản ứng khử alkyl hoá với gốc aldehyde của dẫn xuất PEG ñược trình bày như sau, Chihara (1993)[29]:

+ Gắn nhóm carboxy

Các nhóm carboxy ñược gắn vào phân tử chitosan tạo nên thuộc tính anion và lưỡng tính cho dẫn xuất tạo thành Carboxymethyl chitosan ñược tạo thành do phản ứng khử của chitosan và nhóm aldehyde của glyoxylic axít với xúc tác NaCNBH3, gắn nhóm carboxymethyl vào carbon C-2 Harris và các cộng sự (1984)[56]

• Tạo dẫn xuất tại vị trí nhóm –OH của C-6

Việc tạo dẫn xuất bằng cách gắn thêm gốc tại vị trí carbon C-3 và C-6 tương ñối khó hơn gắn vào nhóm amino ở C-2 Chính vì vậy, các phản ứng với các ñiều kiện riêng biệt phục vụ cho mục ñích này ñược nghiên cứu rất kỹ lưỡng

+ Gắn ñường α-mannose

Khi sử dụng 3-O-acetyl-2-N-phthaloyl chitosan là nguyên liệu ñể tiến hành gắn ñường, α-mannose ñược gắn vào vị trí C-6

Tương tự, β-galactose, glucosamine và N-acetyl-glucosamine cũng có thể ñược gắn vào vị trí C-6 như α-mannose, Garnett (1985)[42]

Gỡ bỏ chất bảo vệ, trả lại gốc NH2 và OH tự do

1.1.7 Khả năng kháng khuẩn của chitosan và dẫn suất

Chitosan và rất nhiều dẫn xuất của nó thể hiện khả năng kháng khuẩn rất tốt Tác ñộng kháng khuẩn thường diễn ra rất nhanh (trong vài giờ), Borges và cộng sự (2007) Thêm vào ñó, chúng ñều là các chất có khả năng phân giải sinh học và không gây ñộc ñối với tế bào ñộng vật hữu nhũ Phổ kháng khuẩn của chúng rộng, bao gồm cả vi khuẩn gram âm và gram dương Tuy nhiên, cần nhắc lại là khả năng tuyệt vời này bị hạn chế do tính tan hạn chế của chitosan (không tan trong môi trường pH >7) Bên cạnh ñó, ñộ nhớt cao của dung dịch chitosan cũng là một trở ngại, gây kết tụ protein ở ñiều kiện pH sinh lý Vì thế, chitooligomer và các dẫn xuất ñã ñược nghiên cứu nhằm khắc phục những vấn ñề trên

Cơ chế tác ñộng chính xác của chitosan và các dẫn xuất lên tế bào vi sinh vật thực tế vẫn chưa ñược tìm ra Nhiều cơ chế khác nhau ñã ñược ñề nghị ñể giải thích khả năng này Ví dụ như tính chất ña ñiện tích dương của chitosan và các dẫn xuất ñã khởi ñầu cho quá trình gắn kết lên màng tế bào vi sinh vật có ñiện tích âm Khi Hwang và các cộng sự (1998) quan sát tế bào vi

khuẩn E coli sau khi xử lý bằng dung dịch chitosan và các dẫn xuất qua kính

hiển vi ñiện tử truyền qua (TEM), kết quả cho thấy màng sinh chất của tế bào

bị tách ra khỏi màng trong Sau khi gắn vào tế bào, chitosan và dẫn xuất gây ảnh hưởng ñến tính thấm của tế bào, làm rò rỉ các thành phần sinh chất và tế bào chết ñi do thiếu hụt các thành phần này David (1994)[31]

Hay theo một giả thiết khác là chitosan và các dẫn xuất hoạt ñộng như tác nhân kẹp (chelating agent) lấy các kim loại dạng vết trong tế bào chất của

tế bào trong khi các kim loại này ñóng vai trò tối quan trọng trong chức năng sinh hoá của vi khuẩn Sự thiếu hụt các kim loại này ức chế sự tạo thành ñộc

tố, enzyme và sự tăng trưởng của tế bào, Kondo và cộng sự (2000) Bên cạnh

ñó, chitosan và các dẫn xuất cũng ñược cho là ức chế quá trình phiên mã tạo thành mRNA và quá trình dịch mã tạo protein khi ñi ñược vào trong nhân tế bào (chitooligosaccharide), Klein (1981)[81]

Tóm lại, trên thế giới trong những năm gần ñây ñã có nhiều nghiên cứu ứng dụng của chitosan và các dẫn xuất chitosan trong công nghiệp thực phẩm như là một chất bảo quản thực phẩm tự nhiên Tuy nhiên phần lớn các nghiên cứu còn ở qui mô phòng thí nghiệm, ít có các nghiên cứu thực tế trên các thực phẩm dùng hàng ngày như các loại thịt, cá

1.2 Tình hình bảo quản thực phẩm hiện nay

Tác dụng kháng khuẩn là ñặc tính quan trọng của chitosan ñã ñược rất nhiều nhà khoa học trên thế giới chứng minh Do ñó việc ứng dụng chitosan

ñể bảo quản thực phẩm là rất cần thiết và cũng là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học Đã có rất nhiều nghiên cứu về màng chitosan ñể bảo quản thực phẩm:

- Nghiên cứu về ức chế vi khuẩn gây hư hỏng trên các sản phẩm thịt chế biến bằng màng chitosan của tác giả Blaise ouattara, Andrebegin, Gabriel piette, Trung tâm nghiên cứu và phát triển thực phẩm Canada- Đại học Quebec, Canada

- Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của màng chitosan bằng việc kết hợp với dầu tỏi của tác giả Y.Pranoto, S.K Rakskit và V.M.Salokhe thuộc viện công nghệ Châu Á, Thái Lan

- Sự hợp tác nghiên cứu giữa các nhà khoa học K.Soontarapa và N.Suwan thuộc Trường Đại học Chulalongkorn – Thái Lan và K.Tota, S.Mistushita, Kamiya thuộc Trường Đại học Quốc gia Yokohama – Nhật ñã nghiên cứu làm tăng hiệu quả trao ñổi ion, tăng ñộ kín màng chitosan bằng một số hóa chất hay chất kích thích

- Nghiên cứu chế tạo màng chitosan kết hợp với tinh bột của Y.X.Xu, K.M.Hana, D.Nag thuộc nghành công nghệ thực phẩm, Đại học Nebraska, USA Màng ñược phối trộn bằng cách trộn chitosan và tinh bột theo tỉ lệ 1:1

và nồng ñộ tinh bột ñược thay ñổi, nghiên cứu tính chất cơ lý của màng

+ Nghiên cứu trong nước:

- Hai nhà khoa học Nguyễn Anh Trinh và Bùi Văn Miên, khoa học công nghệ thực phẩm, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh ñã nghiên cứu chế tạo màng chitosan ứng dụng ñể bảo quản thực phẩm giàu ñạm, dễ hư hỏng như thịt, cá Đây ñược xem là bao bì có tính năng bảo vệ và có thể sử dụng như thực phẩm mà không hại tới môi trường Màng ñược sử dụng ñể bao bọc xúc xích giúp sản phẩm có hình dáng ñẹp và nó còn có tác dụng không làm mất màu, mùi vị ñặc trưng của sản phẩm

- Đống Thị Anh Đào và Châu Trần Diễm Ái thuộc khoa công nghệ hóa học và dầu khí, Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh ñã ứng dụng màng chitosan ñể bảo quản nhãn ở môi trường có nồng ñộ CO2 cao hơn trong môi trường khí quyển Kết quả là nhãn ñược bao gói bằng màng chitosan vẫn giữ ñược giá trị thương phẩm sau 45 ngày bảo quản

PGS.TS Trần Thị Luyến, Trường Đại học Thủy sản Nha Trang ñã nghiên cứu khả năng chịu lực và ñộ giãn của màng chitosan với phụ liệu ñồng tạo màng

Nghiên cứu màng chitosan có bổ sung tinh bột ethylen glycol ñể bao gói thịt bò bảo quản lạnh của Phạm Thị Hoa, chuyên ngành Công nghệ sinh học trường Đại học Thủy sản Nha Trang

Đề tài nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan ñến thời gian bảo quản và chất lượng trái bơ của Nguyễn Thị Trâm (2004)

1.3 Một số ñặc ñiểm của ñối tượng nghiên cứu

1.3.1 Vi khuẩn Escherichia coli

1.3.1.1 Đặc ñiểm chung

Trực khuẩn ruột già Escherichia coli còn có tên là Bacterium

colicommun, Bacillus colicommunis ñược Escherichia phân lập năm 1885 từ

phân trẻ em E coli thường có ở phần sau của ruột, ít khi có ở dạ dày và ruột non Bình thường E coli có trong ruột với số lượng lớn so với các loại vi khuẩn khác, khi sức ñề kháng của cơ thể yếu hay gia súc mắc bệnh nào ñó thì

E coli phát triển mạnh tăng ñộc lực và gây bệnh

1.3.1.2 Đặc ñiểm sinh vật

Hình thái E coli là trực khuẩn hình que, kích thước dài ngắn khác

nhau, trung bình từ 2-3 µm, rộng 0,5µm, ñôi khi trong môi trường nuôi cấy

trực khuẩn dài 6-8µm Trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn, ñứng riêng lẻ loi

ñôi khi xếp thành chuỗi ngắn Phần lớn E coli di ñộng do có lông ở xung

quanh thân, nhưng một số không thấy di ñộng

1.3.1.3 Phòng và trị

Do E coli có rất nhiều typ khác nhau, nên việc chế vaccin và huyết

thanh phòng bệnh là hết sức phức tạp, người ta thường chế vaccin và kháng huyết thanh ña giá, cũng có thể chế vaccin tại chỗ