đánh giá một số phương pháp phát hiện ß–lactamase phổ rộng (ESBL) của escherichia coli và klebsiella pneumoniae

ÐẶT VẤN ÐỀ Vi khuẩn đề kháng kháng sinh luôn là vấn đề cần phải quan tâm của các nuớc trên thế giới, đặc biệt là các nuớc đang phát triển. Kháng kháng sinh đã trở thành nguy co đối với sức khỏe mọi nguời. Vi khuẩn và gen kháng thuốc của vi khuẩn nhanh chóng lan truyền khắp mọi noi, kể cả bệnh viện, cộng đồng và trong chan nuôi. Trong khi tốc độ đề kháng kháng sinh ngày càng gia tang thì việc nghiên cứu tìm ra các loại kháng sinh mới để điều trị ngày càng giảm. Nhu vậy trong cuộc chạy đua dành uu thế, vi khuẩn luôn vuợt lên truớc, khoảng cách giữa khả nang vi khuẩn biến đổi để trở thành kháng kháng sinh và khả nang con nguời kiểm soát đuợc vi khuẩn đã cách xa. Vì vậy nếu chúng ta không có các biện pháp làm giảm tốc độ kháng thuốc kịp thời sẽ dẫn đến hậu quả không còn kháng sinh để điều trị. Việt Nam là một nuớc nhiệt đới, vì vậy bệnh nhiễm khuẩn luôn chiếm vị trí hàng đầu trong mô hình bệnh tật. Khác với những nam 1990, hiện nay nhiễm khuẩn do các vi khuẩn Gram âm đang chiếm uu thế so với các vi khuẩn Gram duong. Nhiều nghiên cứu cho thấy đa số can nguyên nhiễm khuẩn huyết, sốc nhiễm khuẩn, thậm chí bệnh nhân bị tử vong đuợc xác định khoảng 70% là nhiễm trùng do vi khuẩn Gram âm [3]. Các vi khuẩn Gram âm gây bệnh thuờng gặp tại các bệnh viện là Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii. Kháng sinh nhóm ß -lactam đuợc biết đến sớm nhất trong lịch sử kháng sinh và có vai trò đặc biệt quan trọng trong điều trị các nhiễm khuẩn. Hiện nay nhóm ß-lactam có số luợng kháng sinh lớn nhất, chiếm gần ba phần tu tổng số loại kháng sinh hiện đang luu hành. Trong những nam gần đây, các kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 đang đuợc các bác si lâm sàng sử dụng một cách rộng rãi nhu kháng sinh đầu tay, đồng thời cung là thứ “vu khí” cuối cùng để điều trị cho bệnh nhân. Do đuợc sử dụng rộng rãi nên tỷ lệ vi khuẩn đề kháng các kháng sinh này rất cao, nhất là ở các vi khuẩn Gram âm. Hiện nay đã xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn Gram âm sinh men ß-lactamases phổ rộng (ESBL: Extended Spectrum ß-lactamase) đề kháng các kháng sinh nhóm ß-lactam, bao gồm cả các kháng sinh phổ rộng nhu cephalosporin thế hệ 3 và 4. Sinh ESBL vẫn là nguyên nhân chủ yếu gây gia tang đề kháng KS nhóm ßlactam ở những vi khuẩn Gram âm, đặc biệt E. coli và K. pneumoniae và một số vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đuờng ruột Enterobacteriacae. Gen mã hoá sinh ESBL nằm trên plasmide, một kiểu di truyền nằm ngoài NST. Khác với việc truyền gen đề kháng do đột biến, lan truyền gen đề kháng qua trung gian R–plasmide có khả nang lan truyền ngang, các loài vi khuẩn có thể truyền cho nhau gen sinh ESBL một cách nhanh chóng dù chỉ qua một thế hệ, làm cho chủng loại và số luợng vi khuẩn Gram âm sinh ESBL có thể lan rộng nhanh tới mức khó kiểm soát [15]. Vi khuẩn sinh ESBL sẽ đề kháng toàn bộ các penicillin, cephalosporin và aztreonam. Hon nữa chúng còn có khả nang đề kháng chéo với nhiều nhóm kháng sinh khác nhu aminoglycoside, fluoroquinolone, tetracyclin, co-trimoxazol [19], [51]. Ðiều này đã gây không ít khó khan cho điều trị do việc lựa chọn kháng sinh bị thu hẹp. Những bệnh nhân nhiễm khuẩn do vi khuẩn sinh ESBL có bệnh cảnh lâm sàng thuờng nặng, tỷ lệ tử vong cao do vi khuẩn đề kháng. Việc phát hiện các vi khuẩn sinh ESBL nhanh, chính xác của phòng xét nghiệm Vi sinh tại các bệnh viện là việc làm hết sức cần thiết, giúp cho các bác si lâm sàng sớm lựa chọn đuợc kháng sinh thích hợp, giảm chi phí điều trị, cứu sống bệnh nhân. Tuy nhiên hiện nay nếu chỉ thực hiện kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuyếch tán thông thuờng (phuong pháp KirbyBauer) các khoa Vi Sinh lâm sàng của các bệnh viện sẽ không phát hiện đuợc những vi khuẩn Gram âm nhu E. coli và K. pneumoniae sinh ESBL. Nhiều tài liệu trên thế giới đã đề xuất một số phuong pháp sàng lọc nhu sử dụng môi truờng ChromID ESBL, hoặc khẳng định bằng phuong pháp “đia đôi”, khoanh giấy phối hợp, E-test ESBL… Tại Việt Nam, tùy theo điều kiện của từng bệnh viện, một số khoa Vi sinh lâm sàng đã tiến hành thử nghiệm phát hiện vi khuẩn sinh ESBL bằng các phuong pháp khác nhau. Tuy nhiên một câu hỏi đuợc đặt ra là nên lựa chọn phuong pháp nào để phát hiện vi khuẩn sinh ESBL nhanh và có độ tin cậy cao vẫn đang cần đuợc trả lời. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Ðánh giá một số phuong pháp phát hiện ß–lactamase phổ rộng (ESBL) của Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae” Với các mục tiêu sau: 1. Ðánh giá các phuong pháp ChromID ESBL, đia đôi, E-test ESBL phát hiện E. coli và K. pneumoniae sinh ß–lactamase phổ rộng (ESBL). 2. Xác định phân bố giá trị MIC ceftazidime và cefotaxime của các chủng E. coli và K. pneumoniae nghiên cứu. 3. Mô tả một số đặc điểm lâm sàng của các chủng E. coli và K. pneumoniae sinh ESBL phân lập đuợc.

NGUYỄN SÂM

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN

ß – LACTAMASE PHỔ RỘNG (ESBL) CỦA

ESCHERICHIA COLI VÀ KLEBSIELLA PNEUMONIAE

Chuyên ngành: Vi Sinh Vật

Mã số: 60.72.68

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS ĐOÀN MAI PHƯƠNG

Hà nội - 2009

TS Đoàn Mai Phương, Phó trưởng khoa Vi sinh Bệnh viện Bạch Mai, đã

tận tình hướng dẫn khoa học và giúp em hoàn thành luận văn này

Các thầy cô Bộ môn Vi sinh Trường Đại học Y Hà Nội:

- GS TS Lê Huy Chính, nguyên chủ nhiệm bộ môn

- PGS TS Đinh Hữu Dung

- PGS TS Lê Văn Phủng, chủ nhiệm bộ môn

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới

- Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học - Trường Đại học Y Hà Nội đã cho phép và tạo điều kiện giúp em trong quá trình học tập cũng như hoàn thành luận văn này

- Ban giám đốc, Phòng tổ chức cán bộ, Khoa Vi sinh Bệnh viện Bạch Mai đã cho phép và tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình học tập và thực hiện đề tài luận văn

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn người thân, bạn bè và đồng nghiệp

đã động viên em rất nhiều trong quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 25 tháng 9 năm 2009

Nguyễn Sâm

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Khái quát lịch sử và phân loại ESBL 4

1.1.1 Vài nét về lịch sử phát hiện ESBL 4

1.1.2 Đặc ñiểm phân loại ESBL 6

1.2 Các vi khuẩn nghiên cứu 13

1.2.1 Escherichia coli 13

1.2.2 Klebsiella pneumoniae 14

1.2.3 Kháng sinh nhóm ß– lactam và cơ chế ñề kháng KS của vi khuẩn Gram âm sinh ESBL 15

1.3 Các phương pháp phát hiện ESBL 19

1.3.1 Tiêu chuẩn sàng lọc vi khuẩn sinh ESBL 19

1.3.2 Các phương pháp phát hiện vi khuẩn sinh ESBL 20

1.4 Các nghiên cứu về E coli và K pneumoniae sinh ESBL trên thế giới và Việt Nam 25

1.4.1 Trên thế giới 25

1.4.2 Việt Nam 27

1.5 Đặc ñiểm lâm sàng và ñiều trị vi khuẩn sinh ESBL 28

1.5.1 Điều trị nhiễm khuẩn sinh ESBL 28

1.5.2 Phòng ngừa vi khuẩn sinh ESBL 29

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Đối tượng nghiên cứu 30

2.2 Địa ñiểm và thời gian nghiên cứu 30

2.2.1 Địa ñiểm nghiên cứu 30

2.2.2 Thời gian nghiên cứu 30

2.3 Vật liệu nghiên cứu 30

2.3.1 Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn gây bệnh 30

2.3.2 Vật liệu, dụng cụ sinh phẩm làm kháng sinh ñồ 31

2.3.3 Vật liệu và sinh phẩm xác ñịnh vi khuẩn sinh ESBL 31

2.4 Phương pháp nghiên cứu 32

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu 32

2.4.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 32

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu 33

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 46

2.6 Vấn ñề y ñức trong nghiên cứu 46

2.7 Hạn chế sai số 46

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 47

3.1 Kết quả thử nghiệm phát hiện E coli và K pneumoniae sinh ESBL 47

3.1.1 Kết quả của thử nghiệm ChromID ESBL, ñĩa ñôi, E-test ESBL phát hiện E coli và K pneumoniae sinh ESBL 47

3.1.2 Kết quả so sánh thử nghiệm phát hiện E coli và K pneumoniae sinh ESBL 49

3.1.3 Kết quả phối hợp các thử nghiệm phát hiện E coli và K pneumoniae sinh ESBL 50

3.1.4 Kết quả ñối chiếu thử nghiệm E-test ESBL phát hiện 151 chủng E coli và K pneumoniae sinh ESBL với ñường kính khoanh giấy kháng sinh AMC 51

3.2 Kết quả phân bố giá trị MIC cefotaxime và ceftazidime của E coli và K pneumoniae 52

3.2.1 Kết quả phân bố giá trị MIC cefotaxime của E coli 52

3.2.2 Kết quả phân bố giá trị MIC ceftazidime của E coli 54

3.2.3 Kết quả phân bố giá trị MIC cefotaxime của K pneumoniae 56

3.2.4 Kết quả phân bố giá trị MIC ceftazidime của K pneumoniae 57

3.3 Một số ñặc ñiểm lâm sàng của E coli và K pneumoniae 59

3.3.1 Kết quả phân bố E coli và K pneumoniae theo khoa ñiều trị 59

3.3.2 Kết quả phân bố E coli và K pneumoniae theo loại bệnh phẩm 60

Chương 4: BÀN LUẬN 61

4.1 Thử nghiệm phát hiện E coli và K pneumoniae sinh ESBL 61

4.1.1 Thử nghiệm ChromID ESBL, ñĩa ñôi, E-test ESBL phát hiện E coli và K pneumoniae sinh ESBL 61

4.1.2 So sánh các thử nghiệm phát hiện E coli và K pneumoniae sinh ESBL65 4.1.3 Phối hợp các thử nghiệm phát hiện E coli và K pneumoniae sinh ESBL66 4.1.4 Đối chiếu thử nghiệm E-test ESBL phát hiện 151 chủng E coli và K pneumoniae sinh ESBL với ñường kính khoanh giấy kháng sinh AMC 66

4.2 Phân bố giá trị MIC cefotaxime và ceftazidime của E coli và

K pneumoniae 67

4.3 Một số ñặc ñiểm lâm sàng của E coli và K pneumoniae 68

KẾT LUẬN 73

KIẾN NGHỊ 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Tóm tắt hệ thống phân loại ß–lactamases và ESBL theo Ambler và

Bush-Jacoby- Medeiros 7

Bảng 1.2: Phân loại các lớp ESBL theo nguồn gốc ñột biến và số lượng các biến thể 11

Bảng 1.3: Tiêu chuẩn sàng lọc vi khuẩn sinh ESBL theo CLSI – 2006 20

Bảng 2.1: Nhận ñịnh kết quả vi khuẩn sinh ESBLtrên môi trường ChromID ESBL36 Bảng 2.2: Nhận ñịnh kết quả vi khuẩn sinh ESBL theo phương pháp ñĩa ñôi 38

Bảng 2.3: Nhận ñịnh kết quả E-test ESBL. 41

Bảng 3.1: Kết quả thử nghiệm ChromID ESBL phát hiện E coli và

K pneumoniae sinh ESBL 47

Bảng 3.2: Kết quả thử nghiệm ñĩa ñôi phát hiện E coli và K pneumoniae sinh ESBL 48

Bảng 3.3: Kết quả thử nghiệm E-test ESBL phát hiện E coli và

K pneumoniae sinh ESBL 48

Bảng 3.4: Kết quả so sánh thử nghiệm phát hiện E coli và K pneumoniae sinh ESBL 49

Bảng 3.5: Kết quả phối hợp các thử nghiệm phát hiện E coli và

K pneumoniae sinh ESBL 50

Bảng 3.6: Kết quả ñối chiếu thử nghiệm E-test ESBL với ñường kính khoanh giấy kháng sinh AMC trong thử nghiệm ñĩa ñôi 51

Bảng 3.7: Kết quả phân bố giá trị MIC cefotaxime của E coli 52

Bảng 3.8: Kết quả phân bố giá trị MIC ceftazidime của E coli 54

Bảng 3.9: Kết quả phân bố giá trị MIC cefotaxime của K pneumoniae 56

Bảng 3.10: Kết quả phân bố giá trị MIC ceftazidime của K pneumoniae 57

Bảng 3.11: Phân bố E coli và K pneumoniae sinh ESBL theo khoa ñiều trị.59 Bảng 3.12: Phân bố E coli và K pneumoniae sinh ESBL theo loại bệnh phẩm 60

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu ñồ 3.1: So sánh thử nghiệm phát hiện E coli và K pneumoniae sinh ESBL 50

Biểu ñồ 3.2: Phân bố giá trị MIC cefotaxime của E coli 53

Biểu ñồ 3.3: Phân bố nồng ñộ MIC ceftazidime của E coli nghiên cứu 55

Biểu ñồ 3.4: Phân bố nồng ñộ MIC cefotaxime của K pneumoniae nghiên cứu 56

Biểu ñồ 3.5: Phân bố giá trị MIC ceftazidime của K pneumoniae 58

10,31,36,38,39,40,42,43,44,50,53,55,56,58 mau 1-9,11-30,32-35,37,41,45-49,51,52,54,57,59-80 den

ATCC American Type Culture Collection (chủng quốc tế)

CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm

phòng chống bệnh tật Hoa Kỳ)

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

CS Cộng sự

CTL Cefotaxime/ clavulanic acid

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

ESBL Extended Spectrum ß-Lactamase (men beta-lactamase phổ rộng)

I Intermediate (trung gian)

ID Identification

MIC Minimal Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi khuẩn ñề kháng kháng sinh luôn là vấn ñề cần phải quan tâm của các nước trên thế giới, ñặc biệt là các nước ñang phát triển Kháng kháng sinh ñã trở thành nguy cơ ñối với sức khỏe mọi người Vi khuẩn và gen kháng thuốc của vi khuẩn nhanh chóng lan truyền khắp mọi nơi, kể cả bệnh viện, cộng

ñồng và trong chăn nuôi Trong khi tốc ñộ ñề kháng kháng sinh ngày càng gia

tăng thì việc nghiên cứu tìm ra các loại kháng sinh mới ñể ñiều trị ngày càng giảm Như vậy trong cuộc chạy ñua dành ưu thế, vi khuẩn luôn vượt lên trước, khoảng cách giữa khả năng vi khuẩn biến ñổi ñể trở thành kháng kháng sinh và khả năng con người kiểm soát ñược vi khuẩn ñã cách xa Vì vậy nếu chúng ta không có các biện pháp làm giảm tốc ñộ kháng thuốc kịp thời sẽ dẫn

ñến hậu quả không còn kháng sinh ñể ñiều trị

Việt Nam là một nước nhiệt ñới, vì vậy bệnh nhiễm khuẩn luôn chiếm

vị trí hàng ñầu trong mô hình bệnh tật Khác với những năm 1990, hiện nay nhiễm khuẩn do các vi khuẩn Gram âm ñang chiếm ưu thế so với các vi khuẩn Gram dương Nhiều nghiên cứu cho thấy ña số căn nguyên nhiễm khuẩn huyết, sốc nhiễm khuẩn, thậm chí bệnh nhân bị tử vong ñược xác ñịnh khoảng 70% là nhiễm trùng do vi khuẩn Gram âm [3] Các vi khuẩn Gram

âm gây bệnh thường gặp tại các bệnh viện là Escherichia coli, Klebsiella

pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii

Kháng sinh nhóm ß -lactam ñược biết ñến sớm nhất trong lịch sử kháng sinh và có vai trò ñặc biệt quan trọng trong ñiều trị các nhiễm khuẩn Hiện nay nhóm ß-lactam có số lượng kháng sinh lớn nhất, chiếm gần ba phần tư tổng số loại kháng sinh hiện ñang lưu hành Trong những năm gần ñây, các kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 ñang ñược các bác sĩ lâm sàng sử dụng một cách rộng rãi như kháng sinh ñầu tay, ñồng thời cũng là thứ “vũ khí” cuối

cùng ñể ñiều trị cho bệnh nhân Do ñược sử dụng rộng rãi nên tỷ lệ vi khuẩn

ñề kháng các kháng sinh này rất cao, nhất là ở các vi khuẩn Gram âm Hiện

nay ñã xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn Gram âm sinh men ß-lactamases phổ rộng (ESBL: Extended Spectrum ß-lactamase) ñề kháng các kháng sinh nhóm ß-lactam, bao gồm cả các kháng sinh phổ rộng như cephalosporin thế hệ 3 và

4 Sinh ESBL vẫn là nguyên nhân chủ yếu gây gia tăng ñề kháng KS nhóm

ß-lactam ở những vi khuẩn Gram âm, ñặc biệt E coli và K pneumoniae và một

số vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn ñường ruột Enterobacteriacae Gen mã hoá

sinh ESBL nằm trên plasmide, một kiểu di truyền nằm ngoài NST Khác với việc truyền gen ñề kháng do ñột biến, lan truyền gen ñề kháng qua trung gian R–plasmide có khả năng lan truyền ngang, các loài vi khuẩn có thể truyền cho nhau gen sinh ESBL một cách nhanh chóng dù chỉ qua một thế hệ, làm cho chủng loại và số lượng vi khuẩn Gram âm sinh ESBL có thể lan rộng nhanh tới mức khó kiểm soát [15] Vi khuẩn sinh ESBL sẽ ñề kháng toàn bộ các penicillin, cephalosporin và aztreonam Hơn nữa chúng còn có khả năng ñề kháng chéo với nhiều nhóm kháng sinh khác như aminoglycoside, fluoroquinolone, tetracyclin, co-trimoxazol [19], [51] Điều này ñã gây không

ít khó khăn cho ñiều trị do việc lựa chọn kháng sinh bị thu hẹp Những bệnh nhân nhiễm khuẩn do vi khuẩn sinh ESBL có bệnh cảnh lâm sàng thường nặng, tỷ lệ tử vong cao do vi khuẩn ñề kháng

Việc phát hiện các vi khuẩn sinh ESBL nhanh, chính xác của phòng xét nghiệm Vi sinh tại các bệnh viện là việc làm hết sức cần thiết, giúp cho các bác sĩ lâm sàng sớm lựa chọn ñược kháng sinh thích hợp, giảm chi phí ñiều trị, cứu sống bệnh nhân Tuy nhiên hiện nay nếu chỉ thực hiện kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuyếch tán thông thường (phương pháp Kirby-Bauer) các khoa Vi Sinh lâm sàng của các bệnh viện sẽ không phát hiện ñược

những vi khuẩn Gram âm như E coli và K pneumoniae sinh ESBL Nhiều tài

liệu trên thế giới ñã ñề xuất một số phương pháp sàng lọc như sử dụng môi trường ChromID ESBL, hoặc khẳng ñịnh bằng phương pháp “ñĩa ñôi”, khoanh giấy phối hợp, E-test ESBL…

Tại Việt Nam, tùy theo ñiều kiện của từng bệnh viện, một số khoa Vi sinh lâm sàng ñã tiến hành thử nghiệm phát hiện vi khuẩn sinh ESBL bằng các phương pháp khác nhau Tuy nhiên một câu hỏi ñược ñặt ra là nên lựa chọn phương pháp nào ñể phát hiện vi khuẩn sinh ESBL nhanh và có ñộ tin cậy cao vẫn ñang cần ñược trả lời

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành ñề tài:

“Đánh giá một số phương pháp phát hiện ß–lactamase phổ rộng (ESBL) của Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae”

Với các mục tiêu sau:

1 Đánh giá các phương pháp ChromID ESBL, ñĩa ñôi, E-test ESBL phát hiện

E coli và K pneumoniae sinh ß–lactamase phổ rộng (ESBL)

2 Xác ñịnh phân bố giá trị MIC ceftazidime và cefotaxime của các chủng E coli và K pneumoniae nghiên cứu

3 Mô tả một số ñặc ñiểm lâm sàng của các chủng E coli và K pneumoniae sinh ESBL phân lập ñược.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Khái quát lịch sử và phân loại ESBL

1.1.1 Vài nét về lịch sử phát hiện ESBL

Năm 1928 chất kháng sinh ñầu tiên ñược phát hiện là penicillin từ loài nấm Penicillium bởi Alexander Fleming, ñây cũng chính là kháng sinh ñầu tiên của nhóm ß-lactam Đến năm 1941 nhóm tác giả tại Oxford gồm Flory,

Chain và Harley ñã tinh chế ñược penicillin G có tác dụng diệt S aureus

nhưng kém hiệu quả với trực khuẩn Gram âm Cùng thời gian này Abraham

và Chain ñã phát hiện ở các trực khuẩn Gram âm có sinh một loại enzyme kháng lại penicillin Tuy vậy, vào ngày 12/02/1941 nhóm tác giả này ñã ñưa penicillin vào ñiều trị trên người, mở ra một kỷ nguyên sử dụng kháng sinh

ñiều trị bệnh nhiễm khuẩn cứu sống hàng triệu người [15], [17]

Đến năm 1944 lần ñầu tiên xuất hiện S aureus kháng penicillin do sinh

enzyme penicillinase Sau ñó vào những năm 1948 ñến năm 1956 các cephalosporins thế hệ ñầu tiên ñược nghiên cứu và ñưa vào sử dụng gọi là cephalosporins thế hệ 1 [17]

Năm 1961 thế hệ pencillin phổ rộng ñầu tiên là ampicillin ñược ra ñời

có tác dụng ñiều trị với cả trực khuẩn Gram âm và cầu khuẩn Gram dương Chỉ vài năm sau, vào năm 1963 tại Athens Hy Lạp từ máu một bệnh nhân tên

là Temoneira người ta phân lập ñược chủng E coli kháng ampicillin có sinh

loại enzyme ß-lactamase và lấy luôn tên bệnh nhân ñặt tên cho enzyme này là TEM-1 [32], [54]

Năm 1965 cũng ở nơi ñây từ E coli người ta phát hiện ra TEM-2 là do

TEM-1 biến ñổi một amino acid Nhờ TEM-1và TEM-2 ñã làm cho vi khuẩn Gram âm kháng lại các penicillins, ampicillin và cephalosporins thế hệ 1

trong một thời gian dài sau ñó, như các thông báo về N gonorrhoeae kháng pencicllin, H influenzae và Shigella spp ñề kháng KS vào những năm 1971 -

1973 ở Châu Á và nhiều nơi trên Thế giới [32], [54]

Cho ñến năm 1974 chủng K pneumoniae có gen mã hoá enzyme

ß-lactamase trên plasmide ñược phát hiện, enzyme này có nhiều thay ñổi về amino acid so với TEM-1 và TEM-2 nên ñặt tên là SHV-1 (Sulphyryl Variable), như vậy vi khuẩn ñã có TEM-1, TEM-2 và SHV-1 nên các penicillins, cephalosporins thế hệ 1 ñã bị kháng lại rất nhiều [54]

Đầu những năm 1980 thì các kháng sinh ß-lactam phổ rộng như cephalosporins thế hệ thứ 2, thế hệ thứ 3 và monobactams ñược ñưa vào ñiều trị các vi khuẩn kháng thuốc Sự ra ñời các kháng sinh ß-lactams mới này ñặc biệt là cephalosporins thế hệ 3, ñã là thành công lớn của khoa học trong cuộc chiến ñấu dài lâu với vi khuẩn gây bệnh có TEM-1, TEM-2, SHV-1 Nhưng rồi một loại enzyme ß-lactamse có khả năng phân huỷ các cephalosporins thế hệ

2, cephalosporins thế hệ 3 và monobactams, có nguồn gốc do TEM-1, TEM-2, SHV-1 ñột biến thay ñổi một số amino acid gọi là ESBL ñã xuất hiện [54]

Năm 1983 ở Đức ñã phát hiện chủng K ozaenae sinh enzyme

ß-lactamase phân huỷ cefotaxime ñược ñặt tên là SHV-2, ñây là trường hợp sinh ESBL ñầu tiên ñược ghi nhận Năm 1984 ñến 1987 tại Pháp ñã phát hiện

chủng K pneumoniae có gen mã hoá ESBL trên plasmide kháng cefotaxime ñặt

tên là CTX-1 Cũng vào những năm 1986 ở Nhật bản Masumato và năm 1989 ở

Đức Bauernfein phát hiện E coli sinh ESBL kháng cefotaxime không phải TEM

và SHV nên ñặt tên là CTX-M-1 Đáng ngại là CTX-M có khả năng phân huỷ hầu hết cephalosporins thế hệ 3 và cả cephalosporins thế hệ 4 [38], [54]

Như vậy, với việc sử dụng các kháng sinh nhóm beta-lactam ngày càng nhiều ñặc biệt là các cephalosporin thế hệ 3 (oxyimino-beta-lactam) và có nhiều ESBL ñược mã hoá qua R- plasmide, nên ngày càng làm gia tăng tỉ lệ

lẫn chủng loại ESBL trong ñó có các ESBL ngoài TEM, SHV, CTX-M như OXA-, PER-, VEB-… Đến nay các ESBL mới vẫn ñang tiếp tục ñược thông báo Điều này cảnh báo một nguy cơ gia tăng vi khuẩn ñề kháng KS và hết kháng sinh ñiều trị trong một tương lai rất gần Tuy nhiên, việc phát hiện sớm các vi khuẩn sinh ESBL tại các bệnh viện vẫn chưa ñược quan tâm nhiều, các phương pháp phát hiện ESBL và thông báo còn chưa có sự thống nhất [44]

1.1.2 Đặc ñiểm phân loại ESBL

Hiện nay các nghiên cứu trên thế giới ñã biết ñến trên 200 loại ESBL Những enzyme này ñược nhiều nhà khoa học phân loại theo các cách khác nhau và cũng khá phức tạp Tuy vậy, có hai hệ thống phân loại chính ñược thống nhất sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới Hệ thống phân loại của Ambler

R P và hệ thống phân loại của nhóm tác giả Bush Karen, Jacoby G A và

Medeiros A A gọi tắt là hệ thống phân loại Bush- Jacoby- Medeiros

1.1.2.1 Hệ thống phân loại theo Ambler

Ambler chia các ß–lactamases thành 4 lớp: A, B, C và D, dựa trên cấu trúc enzyme có sự giống nhau về các amino acid Trong ñó các lớp A, C, D chỉ có serin trong cấu trúc ở vị trí khởi ñộng nên gọi là các Serin-ß-lactamases, còn lớp B do có Metallo ở vị trí khởi ñộng trong cấu trúc enzyme

và các ion Zn nên gọi là các Metallo-ß-lactamases, một số ß–lactamases lớp

A và lớp D ñược gọi là ESBL [18 ], [19], [26], [27]

1.1.2.2 Hệ thống phân loại theo Bush- Jacoby- Medeiros

Cơ sở của hệ thống phân loại này là dựa vào các yếu tố sau:

- Khả năng hoạt ñộng của enzyme hay gọi là phổ tác dụng của enzyme

ñối với các kháng sinh

- Tầm ảnh hưởng của enzyme ñối với các chất ức chế ß-lactamase (thường dùng là clavulanic acid) ở các mức khác nhau như bị ức chế, giảm ức chế hay kháng chất ức chế

- Vị trí gen mã hoá ESBL nằm trên NST hay trên plasmid

- Loài vi khuẩn sinh ESBL thuộc nhóm thường gặp hay hiếm gặp…

Hệ thống phân loại này chia ß-lactamases ra 4 nhóm chính: 1, 2, 3, 4

Trong ñó nhóm chính 2 lại ñược chia thành 8 nhóm phụ gồm: 2a, 2b, 2be, 2br, 2c, 2d, 2e và 2f

Bảng 1.1: Tóm tắt hệ thống phân loại ß–lactamases và ESBL theo Ambler

phân huỷ penicillins, cephalosporins phổ rộng,

bị ức chế bởi clav (ESBL)

2br ß-lactamase kháng chất ức chế 2c Carbenicillinase, ức chế bởi clav 2e Cephalosporinase

A

2f ß-lactamase phân huỷ carbapenem, bị ức chế

bởi clav

B 3 ß-lactamase Zinc-metallo phân huỷ carbapenem

và các ß-lactams, bị ức chế bởi EDTA

C 1 AmpC các Cephalosporinase có gen mã hoá

trên NST thỉnh thoảng trên plasmide, không bị

Gồm các penicillinase, không bị ức chế bởi clavulanic acid thường xuất

hiện ở những vi khuẩn Gram dương như S aureus, Enterococcus spp

- Nhóm 2b

Gồm các type enzyme cổ ñiển như TEM-1-2, SHV-1, bị ức chế bởi

clavulanic acid các type này thường gặp ở E coli, chúng không phân huỷ

ñược các cephalosporins phổ rộng thế hệ 3 [54]

- Nhóm 2be

Đây là nhóm các ß-lactamase phổ rộng phân huỷ penicillin, các

cephalosporins phổ rộng, không phân huỷ carbapenems và cả cephamycins (cefoxitin, cefotetan, cefmetazole…) các enzyme này ñược gọi là ESBL, bị ức chế bởi clavulanic acid, sulbactam và tazobactam

Xuất hiện nhiều ở E coli, K pneumoniae và các Enterobacteriacae

Các type TEM-3 -, SHV-2 - hiện có hơn 100 loại, nguồn gốc ñột biến

từ TEM, SHV và OXA- cổ ñiển thường gặp ở Enterobacteriacae

Type K1 beta-lactamase có gen mã hoá nằm trên NST, là enzyme phân huỷ cefotaxime, có thể giảm nhạy cảm ñến phân huỷ ceftazidime

Enzyme này thường thấy ở K oxytoca Các type CTX-M có nguồn gốc

từ K1 phân huỷ cefotaxime, có thể giảm nhạy cảm ñến phân huỷ

ceftazidime thường gặp ở Enterobacteriacae Type PER-1 và VER-1 gặp chủ yếu ở P aeruginosa [54]

- Nhóm 2br

Gồm các ß-lactamase type TEM kháng chất ức chế clavulanic acid,

sulbactam, nhưng còn bị ức chế bởi tazobactam (IRT: Inhibitor resistant

TEM beta-lactamase)

- Nhóm 2c

Gồm các enzyme CARB, PSE có khả năng phân huỷ carbapenem, thường

xuất hiện ở P aeruginosa, Acinetobacter sp Ngoài ra còn có enzyme BRO gặp ở Moraxella catarrhalis

- Nhóm 2e

Gồm các ß-lactamase type FPM-1, L2, BPS-1 có gen mã hoá nằm trên NST, chúng bị ức chế bởi clavulanic acid và thường xuất hiện ở các loài vi

khuẩn như Proteus vugaris, S maltophilia, B pseudomallei các enzyme

này không phải là các ESBL [27]

- Nhóm 2f

Gồm các enzyme phân huỷ carbapenem, bị ức chế bởi clavulanic acid

* Lớp B

- Nhóm 3

Bao gồm các metallo enzyme, các carbapenemases phân huỷ carbapenem

và một số beta-lactam Chúng bị ức chế bởi EDTA nhưng không bị ức chế bởi clavulanic acid gồm các type IMP-1 ñến 4, VIM-1&2, SPM-1, GIM-1

thường xuất hiện ở các loài vi khuẩn Staphylococci, Enterococci,

Pseudomonas sp và cả Enterobacteriacae ngoài ra còn gặp ở các vi khuẩn

ñược carbapenem, cefepime [54]

Các AmpC enzymes có gen mã hoá nằm trên NST thường gặp ở

Enterobacter spp, Citrobacter spp, Seratia spp Gen mã hoá trên NST

không nằm trên plasmide gặp ở E coli, K pneumoniae và có gen mã hoá không nằm trên NST gặp ở Salmonella spp các Enterobacteriacae

tự nhiên khác [44]

* Lớp D

- Nhóm 2d

Gồm các oxacillinases type OXA-1, chúng có khả năng phân huỷ carbapenem có thể thay ñổi tính ức chế với clavulanic acid

Sơ ñồ 1.1: Phân loại ESBL cấu trúc phân tử, vị trí gen mã hóa,

chất ức chế, kháng sinh cảm thụ và nguồn gốc biến thể theo Ambler - Bush

1.1.2.3 Phân loại các type và lớp của các ESBL

Do hầu hết mối quan tâm của nhiều nghiên cứu là các ESBL nên phân loại ESBL chỉ chú ý các type TEM-3-, SHV-2-, CTX-M ở nhóm 2be nằm

Lớp C NST AmpC Cphs-Inh-

R

Lớp D (ESBL) Pens, espOxa Inh-R

trong lớp A và một số type OXA- ở nhóm 2d thuộc lớp D Các type OXA- là

ESBL ở nhóm 2d lớp D thường chỉ xuất hiện ở P aeruginosa ít gặp ở các

Enterobacteriacae

Trong các hệ thống phân loại trên thì lớp A và D ñược chia thành các type enzyme dựa vào nguồn gốc và các biến thể trong cấu trúc của thành phần enzyme cổ ñiển ban ñầu gồm các TEM, SHV, CTX-M

Ngày nay do sử dụng nhiều kháng sinh nhóm ß–lactam, ñặc biệt là các cephalosporin thế hệ 3 nên số lượng ESBL biết ñến vẫn không ngừng gia tăng

Bảng 1.2: Phân loại các lớp ESBL theo nguồn gốc ñột biến và số lượng

các biến thể [19], [27], [54]

TEM (A) Các ñột biến TEM penicillinase, nguồn

gốc không rõ, các thay thế 1-7 amino acid

Trên 100

SHV (A) Các ñột biến SHV penicillinase, ở K

pneumoniae thì xuất phát từ NST, thay

thế trên 1 amino acid

Trên 50

CTX-M (A) Kluyvera spp, Hầu hết ñều xuất phát từ

NST

Trên 40 trong 5 phân lớp

OXA-15 (D) Đột biến OXA-2, nguồn gốc không rõ 1

OXA-11, 14,

15, 16, 17 (D)

Đột biến OXA-10, ñược biết từ lâu là

penicillinase nguồn gốc không rõ

Trên 5

* Type TEM - (ESBL) lớp A

Từ các TEM ban ñầu do ñột biến thay ñổi vị trí các amino acid tạo thành các enzyme mới, ESBL mới có cấu trúc thay ñổi kể cả có sự thay ñổi

các mức ñộ ảnh hưởng ñối với chất ức chế Hiện nay có ñến trên 100 TEM (ESBL) ñã tìm thấy [26], [27]

* Type SHV- (ESBL) lớp A

SHV-1 có sự tương ñồng 68% các amino acid so với TEM-1 và có cấu trúc tương tự Cũng như TEM type SHV- (ESBL) cũng có sự thay thế 1 hoặc nhiều amino acid quanh vị trí hoạt hóa Trên 50 SHV ñã ñược biết ñến Các type SHV- (ESBL) thường gặp là SHV-5 và SHV-12 [26], [54]

* Type CTX- (ESBL) lớp A

Đặc ñiểm nhấn mạnh của type CTX- là khả năng phân hủy cefotaxime mạnh hơn khả năng phân hủy ceftazidime Hiện nay có trên 40 CTX-M ñược biết ñến tuy nhiên cũng có một số CTX-M khả năng phân hủy cefotaxime yếu hơn ceftazidime, các thành viên CTX-M hay gặp là CTX-M-14, CTX-M-3, CTX-M-2 [26], [54]

* Type khác (ESBL) lớp A

Các type ESBL khác thuộc lớp A gặp không thường xuyên chỉ xuất

hiện ở P aeruginosa và rải rác ở một số vùng ñịa lý như PER-1 phân lập

ñược ở Thổ Nhĩ kỳ, Pháp và Ý Các type VER-1, VER-2 tìm thấy ở Đông

Nam Á, VER-1 tìm thấy trên Acinetobacter spp ở Hàn Quốc và Thổ Nhĩ kỳ

GES-1, GES-2 và IBC-2 thấy ở Nam Phi, Pháp và Hy Lạp Ngoài ra còn các

ESBL lớp A hiếm gặp khác chỉ xuất hiện ở Enterobacteriacae như BES-1,

IBC-1, SFO-1 và TLA-1 [27], [54]

* Type OXA- (ESBL) lớp D

Có tới 12 loại ESBL có nguồn gốc từ OXA-10, OXA-1 hoặc OXA-2 qua ñột biến thay thế các amino acid Các ESBL này thường chỉ gặp ở Thổ Nhĩ Kỳ và Pháp Hầu hết type OXA-(ESBL) ñều giảm ức chế với clavulanic acid, ña số chúng kháng ceftazidime riêng type OXA-17 ñề kháng nhiều hơn với cefotaxime và cefepime [54]

* Ngoài ra một số enzyme khác phân hủy ß-lactam nhưng không phải ESBL nhưng ít có gen mã hóa di truyền qua trung gian plasmid như một số AmpC lớp C và các carbapenemase thuộc lớp A, B và D Chúng cũng là những ß-lactamase rất quan trọng tạo ra các cơ chế ñề kháng KS trong quá trình kháng thuốc của vi khuẩn

1.2 Các vi khuẩn nghiên cứu

E coli và K pneumoniae là hai vi khuẩn gây bệnh cơ hội thường gặp

tại bệnh viện, chúng là những thành viên chính thuộc họ vi khuẩn ñường ruột

Enterobacteriacae gây nhiễm khuẩn bệnh viện do có tỉ lệ ñề kháng KS rất

cao Đặc biệt ñây là hai loài vi khuẩn gắn liền với lịch sử phát hiện cơ chế sinh ESBL ở vi khuẩn Gram âm với các type enzyme TEM, SHV Điều quan trọng là gen sinh ESBL ở các vi khuẩn này chủ yếu di truyền qua trung gian R-plasmide

1.2.1 Escherichia coli [2], [4], [14], [35], [36]

E coli phân lập lần ñầu tiên bởi Escherich vào những năm 1885 Vi

khuẩn này có mặt rất sớm ở ñại tràng sau 3 giờ trẻ sinh ra Bình thường chúng góp phần tiêu hoá thức ăn, phân giải muối mật, giữ thăng bằng hệ vi khuẩn

ñường ruột và có vai trò sản xuất một số sinh tố E coli chiếm 80% các vi

khuẩn hiếu khí ở ñại tràng

- Kháng nguyên: Hiện cĩ 171 loại kháng nguyên thân O, 56 loại kháng nguyên lơng H, 80 loại kháng nguyên bề mặt K, cĩ kháng nguyên ngoại

độc tố LT (labile toxin), ST (stable toxin) Phân loại dựa vào kháng

nguyên O, H, K cĩ khoảng 700 type huyết thanh, dựa vào phage cĩ 50 loại

và theo tính chất ỉa chảy cĩ 5 loại

o EPEC (Enteropathogenic E coli): Gây bệnh đường ruột

o ETEC (Enterotoxigenic E coli): Gây độc tố ruột

o EIEC (Enteroinvasive E coli): Xâm nhập đường ruột

o EHEC (Enterohemorrhagic E coli): Gây chảy máu ruột

o EAEC (Enteroadhenrent E coli ): Bám dính đường ruột

1.2.1.2 Khả năng gây bệnh

E coli gây bệnh cơ hội khi ở ngồi đại tràng như nhiễm khuẩn tiết niệu,

nhiễm khuẩn máu, viêm màng não, màng phổi, nhiễm khuẩn đường mật Tuy

nhiên gặp tại bệnh viện nhiều nhất khơng chỉ là E coli gây ỉa chảy mà chính

là gây nhiễm khuẩn vết thương

1.2.1.3 Chẩn đốn vi sinh vật

Dựa vào nuơi cấy phân lập xác định tính chất sinh vật hố học, định type huyết thanh, miễn dịch huỳnh quang, ELISA phát hiện ST, PCR phát hiện ST hoặc LT

1.2.2 Klebsiella pneumoniae [2], [4], [35]

Thuộc họ Enterobacteriacae, cư trú ở ống tiêu hố, trên da và ngồi

mơi trường Ở người khoẻ mạnh chúng chiếm một tỉ lệ thấp trong hệ vi khuẩn chí đường ruột

1.2.2.1 Đặc điểm sinh học

- Hình thể, tính chất bắt màu: Là trực khuẩn Gram âm, cĩ vỏ, khơng cĩ lơng

- Nuơi cấy: Nhiệt độ thích hợp 37OC, dễ mọc trên mơi trường thơng thường, khuẩn lạc rất nhầy dạng S, màu đỏ tím trên mơi trường Indo

- Tính chất sinh vật hoá học: Lên men các ñường glucose (+), lactose (+), ngoài ra Oxidase(-), Citrat simmons (+), Urease (+), Indole (-), H2S (-), di ñộng (-), VP(+), RM(-)

- Kháng nguyên: Có kháng nguyên thân O, K pneumoniae có rất nhiều

kháng nguyên bề mặt K Phân loại dựa vào kháng nguyên O có 5 nhóm, dựa vào kháng nguyên K có 80 type huyết thanh

1.2.2.2 Khả năng gây bệnh

Gây nhiều bệnh như viêm phổi, viêm xoang, viêm tai giữa, nhiễm trùng

máu, vết thương Đặc biệt viêm phổi sơ sinh do K pneumoniae tỉ lệ tử vong rất cao

- Cấu trúc kháng sinh nhóm ß– lactam

Tất cả các kháng sinh nhóm ß–lactam ñều có vòng ß–lactam trong cấu trúc phân tử Vòng beta-lactam có cấu trúc không gian hoá học 4 cạnh gồm 3 nguyên tử C và một nguyên tử N

Sơ ñồ 1.2: Cấu trúc của vòng ß–lactam

- Cơ chế tác dụng của KS nhóm ß– lactam

Vi khuẩn tổng hợp vách tế bào cần enzyme transpeptidase (PBP: Penicillin Binding Protein), xúc tác tạo các liên kết chéo trong hệ thống peptidoglycans cấu tạo vách tế bào Kháng sinh nhóm ß–lactam gắn ñược vào vị trí hoạt ñộng của transpetidase này nên ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào vi khuẩn, từ ñó vi khuẩn dễ dàng bị tiêu diệt

- Phân loại KS nhóm ß– lactam

Gồm có 2 phân nhóm: penicillins và cephalosporins [7]

 Phân nhóm cephalosporin gồm có:

Cephalosporins thế hệ 1, thế hệ 2, thế hệ 3 và thế hệ 4 Các Cephalosporins phổ rộng như cefotaxime, ceftazidime, ceftriaxone

ñược gọi là oxyimino-beta-lactam Một số kháng sinh về mặt lý thuyết

và thử nghiệm trên invitro không bị phân hủy bởi ESBL gọi là cephamycin như: cefoxitin, cefotetan và cefmetazole Cephamycin gồm

các cephalosporin có chuỗi bên 7α –methoxy bị ngăn chặn bằng thủy phân do các ESBL và các beta-lactamase lớp A và lớp D

1.3.2.2 Cơ chế ñề kháng KS nhóm ß– lactam của E coli và K pneumoniae sinh ESBL

Vòng ß–lactam khi bị ESBL phá huỷ, kháng sinh sẽ tạo thành

pencillinonic acid và cephalosporic acid không còn hoạt tính kháng sinh

Sơ ñồ 1.3: Sự tấn công của ß-lactamase (ESBL) vào vòng ß–lactam trong cấu

trúc kháng sinh nhóm beta-lactam

1.3.2.3 Đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm sinh ESBL [1], [12], [18]

Các vi khuẩn sinh ESBL thường ñề kháng cao với nhiều nhóm kháng sinh, các nguyên nhân chính ñang ñược ghi nhận ñó là:

- Các ESBL thường ñược mã hoá qua trung gian plasmide các gen ñề kháng KS thường liên kết theo nhóm, dẫn ñến gen ñề kháng dễ cùng bị

ñột biến với các kháng sinh khác nhóm

- Khi ñã ñề kháng KS do ESBL sẽ có sự thay thế kháng sinh ñiều trị mới dẫn tới tăng ñột biến cảm ứng tạo gen ñề kháng KS các nhóm kháng sinh thay thế nhiều hơn các vi khuẩn thông thường

- Vi khuẩn sinh ESBL còn có khả năng ñề kháng chéo với các nhóm kháng sinh khác

Như vậy, nhìn từ lịch sử phát hiện cũng như các ñặc ñiểm phân loại và

cơ chế ñề kháng KS thì bản chất của vi khuẩn sinh ESBL sẽ có những ñặc

Sơ ñồ 1.4: Cấu trúc hóa học một số kháng sinh nhóm beta-lactam

1.3 Các phương pháp phát hiện ESBL

Hiện nay các khoa Vi Sinh lâm sàng sử dụng kỹ thuật kháng sinh ñồ theo phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuyếch tán trên thạch (Kirby-Bauer) hoặc một số ít nơi có dùng phương pháp xác ñịnh nồng ñộ ức chế tối thiểu MIC Khi vi khuẩn sinh ESBL sẽ có hiện tượng ña ñề kháng KS hoặc giảm nhạy cảm với các kháng sinh cephalosporin cũng như monobactam

(aztreonam) trên invitro Do ñó NCCLS (National Committee of Clinical

Laboratory Standard) nay là CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) khuyến cáo sàng lọc vi khuẩn sinh ESBL qua một số kháng sinh chỉ

ñiểm tốt và phổ biến như ceftazidime, cefotaxime, ceftriaxone, cefpodoxime,

cefepim và aztreonam [49], [51], [52]

- Mục ñích:

Hầu hết sử dụng CAZ và CTX ñể tìm ESBL do CAZ có khả năng chỉ ñiểm

ñể phát hiện các ESBL có nguồn gốc từ TEM, SHV, còn CTX ñược xem

là chỉ ñiểm tốt ñể phát hiện các ESBL nguồn gốc từ CTX-M Các type hay gặp tại bệnh viện

- Nguyên lý chung:

Các ESBL ñều bị ức chế bởi các chất ức chế ß-lactamase như acid clavulanic, sulbactam, tazobactam Từ ñó dựa vào các chất ức chế nói trên kết hợp với kháng sinh chỉ ñiểm ñể phát hiện ESBL

1.3.1 Tiêu chuẩn sàng lọc vi khuẩn sinh ESBL

- Bằng phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán

Bảng 1.3: Tiêu chuẩn sàng lọc vi khuẩn sinh ESBL theo CLSI – 2006 [31],

Nồng ñộ MIC của cephalosporin ≥ 2µg/ml

1.3.2 Các phương pháp phát hiện vi khuẩn sinh ESBL

1.3.2.1 ChromID ESBL agar

 Giới thiệu

Môi trường ChromID ESBL do hãng Bio-Merieux (Pháp) sản xuất, ñã

ñược nhiều nước trên thế giới sử dụng Đây là môi trường ñược khuyến

cáo dùng ñể sàng lọc các vi khuẩn ñường ruột Enterobacteriaceae sinh

ESBL Việc xác ñịnh vi khuẩn sinh ESBL ñặc biệt quan trọng trong việc phòng và giám sát dịch tễ bệnh nhiễm khuẩn Sử dụng môi trường ChromID ESBL giúp nhanh chóng sàng lọc các vi khuẩn sinh ESBL

tạo thành các khuẩn lạc có màu sắc khác nhau, ñặc trưng cho một số loài

vi khuẩn

 Ưu ñiểm

Dễ dàng tiến hành, giá thành rẻ dễ triển khai ở tất cả các cơ sở Vi Sinh lâm sàng có nuôi cấy vi khuẩn Đặc biệt nhanh chóng sàng lọc các vi khuẩn

ñường ruột sinh ESBL ñồng thời ñịnh danh sơ bộ ñược một số loài vi

khuẩn như E coli và K pneumoniae

 Hạn chế

- Một số vi khuẩn kháng kháng sinh cefpodoxime không phải do sinh ESBL mà theo cơ chế khác hoặc sinh cephalosporinase, penicillinase

có thể mọc trên môi trường này

- Một số vi khuẩn màu sắc khuẩn lạc không ñiển hình, không màu hoặc nhiều loài vi khuẩn có thể có mầu sắc khuẩn lạc giống nhau

- Vi khuẩn sinh ESBL chậm hoặc yếu có thể không mọc trên môi truờng này sau 18 - 48h nuôi cấy

1.3.2.2 Phương pháp ñĩa ñôi (double disk diffusion test) [24], [25], [37], [44], [54]

 Nguyên lý

Các ESBL có khả năng phân hủy các cephalosporin phổ rộng nhưng bị ức chế bởi clavulanic acid, dẫn ñến xuất hiện vùng ức chế vi khuẩn xung

quanh khoanh giấy kháng sinh AMC và mở rộng vùng ức chế giao thoa giữa AMC với CAZ và CTX [44]

vi khuẩn P.aeruginosa và một số vi khuẩn có ESBL giảm ức chế

clavulanic acid thường gặp như ESBL type OXA-

1.3.2.3 Băng giấy E-test ESBL [24], [31], [33], [41], [46],[54]

 Giới thiệu

Băng giấy E-test là thanh plastic mỏng, kích thước 5x 60mm, một mặt không thấm nước, một mặt ñược tẩm kháng sinh với các nồng ñộ khác nhau Băng giấy E-test ESBL là một loại băng E-test ñặc biệt, có một phần chứa các nồng ñộ kháng sinh cephalosporins phổ rộng ñược pha loãng từ thấp ñến cao, tính bằng µg/ml, phần còn lại chứa cephalosporin phổ rộng kết hợp clavulanic acid (CAZ/Clav, CTX/Clav)

 Nguyên lý:

ESBL bị ức chế bởi clavulanic acid nên E coli và K pneumoniae sinh

ESBL sẽ có vùng ức chế vi khuẩn ở phần chứa kháng sinh kết hợp clavulanic acid, phần còn lại không có chất ức chế dẫn ñến kháng sinh bị ESBL phân hủy nên vùng ức chế vi khuẩn nhỏ hơn hoặc không có vùng ức chế do vi khuẩn không bị kháng sinh ức chế hoặc chỉ bị ức chế ở nồng ñộ kháng sinh cao

 Vật liệu

o Thanh CTX/Clav có phần CT chứa cefotaxime nồng ñộ 0,25 - 16µg/ml, phần CTL chứa nồng ñộ cefotaxime 0,016-1µg/ml phối hợp clavulanic acid nồng ñộ 4µg/ml

o Thanh CAZ/Clav có phần TZ chứa ceftazidime nồng ñộ 32µg/ml, phần TZL chứa nồng ñộ ceftazdime 0,064-4µg/ml, trộn lẫn clavulanic acid nồng ñộ 4µg/ml

0,5- Đọc kết quả

Vi khuẩn sinh ESBL (+) sẽ có vùng ức chế hình ellip, hoặc phần kết thúc nồng ñộ MIC biến mất tạo thành bóng ellip hoặc vòng bị biến dạng của hình ellip và nồng ñộ MIC phía kháng sinh không kết hợp clavulanic acid tăng gấp ≥ 8 lần phần còn lại

IRT enzyme (inhibitor resistant TEM) hoặc AmpC enzymes hoặc vi

khuẩn kháng beta-lactam theo cơ chế khác [23], [27], [58]

1.3.2.4 Phương pháp ñĩa kết hợp

Sử dụng một khoanh kết hợp cephalosporin với clavulanic acid 30µg và một khoanh cephalosporin 30µg Nếu ñường kính ức chế ở khoanh kết hợp lớn hơn khoanh còn lại 5mm thì kết luận vi khuẩn ESBL (+)

Từ phương pháp này Sanguinetti M ñã cải tiến ñể phát hiện AmpC dựa vào sự không thay ñổi vùng ức chế, giữa khoanh kết hợp cefodoxime/ clavulanic và khoanh cefodoxime thường [49], [54], [59]

1.3.2.5 Vitek ESBL Card

Phương pháp này dùng card MIC có chứa cephalosporin nồng ñộ bắt

ñầu từ 0,5µg/ml trộn với clavulanic acid nồng ñộ 4µg/ml Kết quả nếu vi

khuẩn có ESBL sẽ cho MIC cephalosporin ≥ 8µg/ml, phương pháp này ñộ nhạy và ñặc hiệu không cao lắm (khoảng 90%) [41], [45], [54], [62]

1.3.2.6 Micro scan panels

Tấm panel nhựa có 4 giếng chứa môi trường kháng sinh cephalosporin

và cephalosporin/clavulanic acid, cấy vi khuẩn vào các giếng ñể tủ ấm 18-24h

ñọc kết quả, nếu ESBL (+) vi khuẩn sẽ không mọc ở giếng có cephalosporin

kết hợp clavulanic acid [54]

1.3.2.7 Máy ñịnh danh vi khuẩn và kháng sinh ñồ BD Phoenix [41], [54]

 Vật liệu

Tấm panel có phần kháng sinh ñồ (AST: Antibiotics Sensitiviti Test) Với

5 hàng giếng có chứa kháng sinh gồm; 2 hàng ñầu cefodoxime, ceftazidime, và các hàng sau là ceftazidime kết hợp clavulanic acid, cefotaxime kết hợp clavulanic acid, ceftriaxone kết hợp clavulanic acid

Giá thành còn cao và phải cài ñặt phần mềm cập nhật thủ công

1.2.3.8 Phương pháp sinh học phân tử PCR (polymerase chain reation)

 Nguyến tắc

Phát hiện gen mã hoá ESBL của vi khuẩn

 Ưu ñiểm

PCR có ñộ nhạy và ñặc hiệu cao

 Nhược ñiểm

Chỉ xác ñịnh gen mã hoá enzyme, không khẳng ñịnh ñược thực tế vi khuẩn

có sinh ESBL trên lâm sàng hay không, giá thành cao

1.4 Các nghiên cứu về E coli và K pneumoniae sinh ESBL trên thế giới

và Việt Nam

1.4.1 Trên thế giới

Từ năm 1983 khi trường hợp ESBL ñầu tiên phát hiện tại Đức, các nghiên cứu về lĩnh vực này từ ñấy ñến bây giờ vẫn không ngừng thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học bởi sự trầm trọng của nó Vì vậy, ESBL ñã là vấn ñề toàn cầu Dù vi khuẩn ñề kháng KS theo cơ chế nào thì cũng luôn có

sự thay ñổi theo thời gian và vùng ñịa lý ESBL cũng vậy, vào những năm thập niên 1980 và 1990 ESBL chủ yếu xuất hiện ở các nước phát triển, có nhiều kháng sinh ñiều trị Sau những năm 2000 - 2001 thì tỉ lệ vi khuẩn sinh ESBL lại tăng cao ở các nước ñang phát triển, mặt khác sự phân bố các type ESBL cũng như các loài vi khuẩn sinh ESBL ñã có sự khác nhau giữa các quốc gia và vùng lãnh thổ [22], [23], [34], [54], [61], [68]

 Ở Châu Âu

Tại Đức sau ca phát hiện ESBL ñầu tiên năm 1983, người ta ñã tiến hành nghiên cứu hơn 100 khoa cấp cứu hồi sức ở nhiều nước thấy trong số

Klebsiella spp có ESBL (+) thì Thuỵ Điển 3% trong khi Bồ Đào Nha ESBL

(+) cao tới 34% Thời kỳ này nghiên cứu khác tại 8 bệnh viện của Thổ Nhĩ kỳ

trên 193 chủng Klebsiella spp thì có tới 58% ESBL (+) [38], [54] Năm 1990

ở Pháp nghiên cứu thông báo có 25- 35% K pneumoniae gây nhiễm trùng

bệnh viện sinh ESBL Tuy nhiên, năm 2000 một nghiên cứu cũng ở Pháp cho

thấy tỉ lệ K pneumoniae ESBL (+) chỉ còn 7,9% Theo Latigue MF (2005) ở

Pháp E coli ESBL (+) tới 36% [38] Tại Bruxell Bỉ E coli ESBL (+) tăng từ

1,25% năm 2001 ñến 3,4% năm 2003 Thông báo tương tự tại Tây Ban Nha tỉ

lệ trước năm 1999 E coli ESBL (+) là 0,36% nhưng năm 2003 là 4,8% [54]

Thổ Nhĩ Kỳ một quốc gia ghi nhận có tỉ lệ vi khuẩn ESBL (+) khá cao, một

nghiên cứu trong 3 năm với 390 chủng Gram âm ESBL (+) thì tỉ lệ của E

coli ESBL (+) 20,9%, K pneumoniae ESBL (+) 50% ngoài ra còn xuất hiện

Acinetobacter spp và P aeruginosa có type PER-1

 Châu Mỹ

Ở Mỹ theo tác giả Shwaber MJ nghiên cứu ở 53 bệnh viện trong 3 năm 1996

ñến 1999, thấy rằng trong 690 vi khuẩn Entrobacteriacae có tới 355 chủng ESBL

(+) [54] Các type ESBL xuất hiện ở Chilê, Argentina từ các vi khuẩn

K pneumoniae , Salmonella typhi chủ yếu là SHV-2, SHV-5 và CTX-M-2 [54]

 Châu Phi

Năm 1996 các thông báo ở vùng Nam Phi K pneumoniae ESBL (+) là

36,1% Tiếp theo là Entrobacteriacae sinh ESBL thấy xuất hiện ở Kenya,

Senegal, Camaroon, Tazania và Nigiêria [20] Tuy nhiên vùng Trung phi những

năm 2003 - 2005 thông báo Entrobacteriacae sinh ESBL chỉ mức 4% [54]

 Australia

Một số thông báo K pneumoniae ESBL (+) với tỉ lệ 5% [20]

 Châu Á

Nhóm các nước có tỉ lệ vi khuẩn ESBL (+) cao như Trung Quốc, Thái

Lan, Philipine, Indonesia và Việt nam Các quốc gia có tỉ lệ thấp hơn là Nhật

Bản, Hàn Quốc, Singarpore và Malaysia Tại những nước này có tỉ lệ E coli

sinh ESBL (+) là 5 - 8% K pneumoniae ESBL (+) cũng chỉ 5% trong khi các

nước khác từ 20 - 50% [20] Năm 1997-1999, ở Bắc Kinh E coli ESBL (+) là

24,5%, K pneumoniae ESBL (+) 30,7% ñáng lưu ý là các E coli phân lập từ

máu tỉ lệ ESBL (+) tới 27% [54], [66], [68]

1.4.2 Việt Nam

Trong khoảng 10 năm trở lại ñây, ở Việt nam bắt ñầu quan tâm ñến vi khuẩn Gram âm sinh ESBL, tuy vậy cũng chưa thật nhiều nghiên cứu về vấn

ñề này Các nghiên cứu chủ yếu mới bước ñầu phát hiện thông báo tỉ lệ dương

tính ESBL và nghiên cứu mới chỉ tập trung ở các bệnh viện lớn

Từ những nghiên cứu ñầu tiên năm 1997, tác giả Võ Thị Chi Mai và CS tại

Bệnh Viện Chợ Rẫy TP Hồ Chí Minh thấy rằng không phát hiện chủng E coli

và K pneumoniae nào sinh ESBL [8]

Năm 1997- 1998 nghiên cứu tại Bệnh viện Bạch mai cho thấy E coli kháng ceftazidime 7,8%, K pneumoniae kháng ceftazidime 7,2% còn

ampicillin thì bị kháng gần 100%, các vi khuẩn ñề kháng này ñược nghĩ ñến

có ESBL (+) Đến năm 2000 - 2001 các nghiên cứu tại 7 bệnh viện ở TP Hồ

Chí Minh ñã thông báo các chủng E coli, K pneumoniae, Proteus mirabilis

kháng ceftazidime 26,6%, cefotaxime 31,5%, cefepime 6%, imipenem 5,6%, sau ñó ña số chủng kháng phát hiện sinh ESBL (+), và ñã xác ñịnh ñược type TEM, SHV, CTX-M và VEB-1

Năm 2004 tại bệnh viện Thanh Nhàn Hà Nội phát hiện ñược 14 chủng

E coli và K pneumoniae sinh ESBL Thông báo năm 2005 tại Bệnh viện Việt Đức tỉ lệ E coli sinh ESBL 34,2% , K pneumonie sinh ESBL 39,3% Tại

Bệnh viện Bạch mai (2005) ESBL (+) với E coli 18,5%, K pneumoniae sinh

ESBL 20,1%

Năm 2006 tại Bệnh viện 108, tỉ lệ K pneumoniae ESBL (+) là 33% Số

liệu năm 2007 tại Bệnh viện 103 tỷ lệ phát hiện ESBL (+) ở các vi khuẩn Gram âm là 21,7% Các bệnh viện vẫn chủ yếu sử dụng phương pháp ñĩa ñôi

ñể phát hiện và thông báo vi khuẩn sinh ESBL (+) [6], [8], [11]

1.5 Đặc ñiểm lâm sàng và ñiều trị vi khuẩn sinh ESBL

1.5.1 Điều trị nhiễm khuẩn sinh ESBL [34], [44], [54], [56]

Khi phát hiện bệnh nhân nhiễm vi khuẩn ESBL (+), cần lựa chọn và phối hợp kháng sinh hợp lý theo hướng dẫn kháng sinh ñồ

- Một số gợi ý lựa chọn kháng sinh: Đối với các trực khuẩn Gram âm họ

ñường ruột Enterobacteriacae sinh ESBL (+), kháng sinh ñầu bảng vẫn là

nhóm carbapenem (imipenem, etarpenem, meropenem) Tuy nhiên, cần cân nhắc ñể dành kháng sinh ñiều trị, ngoài ra có thể sử dụng tốt với các kháng sinh loại có kết hợp chất ức chế ß-betalactamase như: Ampicillin kết hợp sulbactam, amocillin kết hợp clavulanic acid, ticarcillin kết hợp clavulanic acid, piperacillin kết hợp tazobactam hay cefoprazol kết hợp sulbactam Mặc dù vậy cũng cần cân nhắc các yếu tố như loại nhiễm khuẩn và vị trí ổ nhiễm khuẩn ñể ñiều trị như nhiễm khuẩn nặng thì nên dùng carbapenem Nhiễm khuẩn huyết dùng ertapenem (ETP) và imipenem (IMP) Nhiễm khuẩn màng não, nước não tuỷ, ống tuỷ thì nên dùng meropenem (MEM) [44]

- Gợi ý về phối hợp kháng sinh: Phối hợp ß–lactam với aminoglycoside, sự phối hợp này có hiệu quả cao hơn như azlocillin, piperacillin với

aminoglycoside thường ñể ñiều trị P aeruginosa và một số

Enterobacteriacae bởi khi dùng riêng lẻ các kháng sinh nhóm

aminoglycoside hiệu quả không chắc chắn

- Một số kháng sinh không nên dùng: Các kháng sinh nhóm Quinolone, new quinolone dùng riêng lẻ thường không hiệu quả trừ một số nhiễm khuẩn tiết niệu Đặc biệt CDC khuyến cáo khi vi khuẩn ñã xác ñịnh ESBL (+) thì không ñược sử dụng các cephalosporins, mặc dù trên invtro còn nhạy cảm nhưng sẽ không có hiệu quả trên lâm sàng kể cả các cephamycin

1.5.2 Phòng ngừa vi khuẩn sinh ESBL [6], [34], [54]

1.5.2.1 Nguy cơ dịch tễ

Hiện nay vi khuẩn sinh ESBL ñã xuất hiện trên toàn cầu, từ những nước phát triển như Mỹ, Anh, Đức, Nga, Pháp, Thuỵ Điển, Nhật Bản, Australia cho ñến các nước ñang phát triển ở Châu Phi, Châu Mỹ và Châu Á Việt Nam vi khuẩn sinh ESBL ñã ñược thông báo gần chục năm nay ở các bệnh viện lớn ở khu vực Hà Nội, Hải phòng, Huế, TP Hồ chí Minh, Bình

Định và vẫn tiếp tục gia tăng thông báo hàng năm

1.5.2.1 Biện pháp phòng chủ yếu

Tại các bệnh viện cần thực hiện tốt công tác vô khuẩn trong khám chữa bệnh, ñặc biệt trong các thủ thuật nội soi, siêu âm, ñặt nội khí quản, máy thở, tiêm truyền Tránh lạm dụng thủ thuật và cần sử dụng kháng sinh theo kháng sinh ñồ, biện pháp thực hiện ñơn giản nhất là rửa tay sau mỗi lần thăm khám bệnh nhân Khi phát hiện vi khuẩn sinh ESBL, cần cách ly bệnh nhân nếu có

ñiều kiện nhất là ở các khoa cấp cứu, ñiều trị tích cực và buồng hậu phẫu

Tại cộng ñồng cần ñược hướng dẫn sử dụng kháng sinh an toàn và hợp

lý, theo ñơn của bác sĩ Trong cuộc sống cần thực hiện nếp sống sạch sẽ, gọn gàng, ñảm bảo vệ sinh ñề phòng mắc và làm lây lan các vi khuẩn gây bệnh ñã

ñề kháng KS nguy hiểm như vi khuẩn ESBL (+)

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Gồm 200 chủng vi khuẩn (115 E coli và 85 K pneumoniae) phân lập

từ tất cả các loại bệnh phẩm của những bệnh nhân ñến khám ñiều trị tại bệnh viện Bạch Mai (từ tháng 01/01/2009 ñến tháng 31/08/2009), ñược làm kháng sinh ñồ phương pháp Kirby-Bauer có kết quả ñường kính vùng ức chế vi khuẩn ceftazidime (CAZ) ≤ 22 mm và cefotaxime (CTX) ≤ 27 mm, theo hướng dẫn sàng lọc vi khuẩn ñường ruột sinh ESBL của CLSI

2.2 Địa ñiểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1 Địa ñiểm nghiên cứu

Khoa Vi sinh và các khoa lâm sàng - Bệnh viện Bạch Mai

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 01/01/2009 ñến 31/08/2009

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn gây bệnh

 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

- Thạch máu cơ sở ( blood agar base) của hãng Bio-Rad

- Môi trường MacConkey, DCA, Uri-Select 4 của hãng Bio-Rad Mỹ

- Thạch thường (Nutrient agar) của hãng Bio-Rad

- Canh thang giữ chủng glycerol

 Vật liệu ñịnh danh vi khuẩn:

- Thanh ñịnh danh API 20E của hãng Bio-Merieux Pháp

- Máy cấy máu tự ñộng Bactec 9050 và Bactec 9240 của hãng BD Mỹ

- Máy vi tính cài phần mềm ñọc giá ñường API 20E và các loại API khác

Hình ảnh 2.1: Máy cấy máu tự ñộng Bactec 9240

2.3.2 Vật liệu, dụng cụ sinh phẩm làm kháng sinh ñồ

- Môi trường làm kháng sinh ñồ Muller-Hinton

- Nước muối sinh lý 0,85%

- Máy tính cài phần mềm ñọc kháng sinh ñồ Whonet 5.4

- Các chủng quốc tế ñể kiểm tra chất lượng:

E coli ATCC 25922 và P aruginosa 27853

2.3.3 Vật liệu và sinh phẩm xác ñịnh vi khuẩn sinh ESBL

- Môi trường chromID ESBL của hãng Bio-Merieux Pháp

- Khoanh giấy kháng sinh các loại (AMC, CTX, CAZ)