Mô tả đặc điểm mô bệnh học ung thư biểu mô tuyến của phổi

Năm 1924, lần đầu tiên trên y văn, Marchesani ở viện giải phẫu bệnh Innbraok dựa trên nghiên cứu mô học của 26 trường hợp UTP, ụng đó đề nghị một phân loại MBH UTP với 4 typ sau: UTBM tế

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư phổi (UTP) hay ung thư biểu mô phế quản là u ác tính phát sinh

từ phế quản, tiểu phế quản tận, phế nang hoặc từ các tuyến phế quản Đây là một loại ung thư gây tử vong hàng đầu ở nhiều nước trên thế giới Số các trường hợp UTP đã gia tăng nhanh chóng trong những năm gần đây Năm

2002, ước tính số mắc UTP trên toàn thế giới khoảng 1,35 triệu trường hợp, chiếm 12,4% tổng số các loại ung thư Ung thư phổi không còn là bệnh chủ yếu ở nam giới như những năm 1930 -1950 mà hiện nay cũng là bệnh chủ yếu

ở nữ giới do tỷ lệ hút thuốc ở phụ nữ có xu hướng gia tăng (3) Ở Việt Nam, tuy chưa có thống kê đầy đủ, nhưng những số liệu trong các báo cáo đã cho thấy UTP ngày ngày càng tăng Bệnh thường xảy ra ở người trên 40 tuổi, hơn 80% bệnh nhân UTP có tiền sử hút thuốc lá, UTP là loại ung thư có độ ác tính cao, tiến triển nhanh, tiên lượng xấu (2)

Theo nhiều nghiên cứu đã công bố trên thế giới , Ung thư biểu mô tuyến (UTBMT) là một trong 4 týp UTP thường gặp nhất, chiếm 30% UTP, đặc biệt tăng nhanh ở nữ giới Trước đây, UTBM vảy là týp UTP hay gặp nhất Tuy nhiên, từ khoảng thập niên 80 của thế kỷ 20 tỷ lệ UTBM vảy đã giảm xuống

rõ rệt và hiện nay, UTBMT vươn lên vị trí hàng đầu Mặc dù UTBMT đã biết đến từ rất lâu, đã hiện diện trong phân loại mô học UTP ngay từ những phõn loại đầu tiên công bố trên y văn thế giới, song bản chất bệnh học của nó cũn đang được nghiên cứu Týp mô bệnh học (MBH) của UTBMT rất đa dạng và phức tạp vỡ nú có nhiều phân typ nhỏ, có thể nhầm lẫn Vì vậy, việc nghiên cứu đặc điểm MBH cũng như biến đổi gen của UTBMT phổi có ý nghĩa rất quan trọng trong chẩn đoán xác định và đánh giá tiên lượng bệnh

Một trong những gen đang được nghiên cứu sõu trong những năm gần đõy đó là gen ức chế thụ thể yếu tố phát triển biểu bì (Epidermal growth

factor receptor – EGFR) Mục đích nghiên cứu gen này là tỡm ra thuốc ức chế phát triển biểu mô.

Bộc lộ quá mức gen EGFR ở các khối u nói chung liên quan đến hậu quả xấu trờn lâm sàng Các thuốc ức chế EGFR – Tirosine Kinase đã được chứng minh hiệu quả trong điều trị những bệnh nhõn (BN) UTP không tế bào nhỏ đã thất bại với hoá trị trước đó [3]

Tại Việt Nam đã có nhiều tác giả nghiên cứu đặc điểm lõm sàng, mô bệnh học ung thư phổi Tuy nhiên theo hiểu biết của chúng tôi chưa thấy tác giả nào đi sõu nghiên cứu riêng mô học ung thư biểu mô tuyến, đặc biệt là mức

độ bộc lộ EGFR của týp này Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm mục đích:

1 Mô tả đặc điểm mô bệnh học UTBMT của phổi

2 Xác định tần xuất bộc lộ yếu tố phát triển biểu mô và mối liên quan với cỏc phõn týp mô học UTBMT phổi.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 MỘT SỐ ĐĂC ĐIỂM MÔ HỌC CỦA PHỔI

1.1.1 Mô học chung

Phổi là cơ quan nội tạng, nằm trong lồng ngực nhưng lại mở thông với môi trường bên ngoài để đảm nhiệm chức năng trao đổi khí Bởi vậy, phổi có cấu tạo khá phức tạp

- Khí quản: Đi từ thanh quản tới chỗ chia đôi của nó trong trung thất, dài khoảng 10-12 cm, nửa trên nằm ở vùng cổ, nửa dưới nằm trong trung thất

- Phế quản gốc: Được tính từ nơi phân chia của khí quản đến rốn của mỗi phổi

- Cây phế quản: Mỗi phế quản gốc khi đến phổi sẽ chia nhánh nhỏ dần đi vào trong phổi, cỏc nhỏnh chia từ phế quản gốc được gọi là cây phế quản Nhánh nhỏ nhất của phần dẫn khí trong tiểu thuỳ gọi là tiểu phế quản tận Mỗi tiểu phế quản tận chia đôi thành thành hai tiểu phế quản hô hấp Mỗi tiểu phế quản hô hấp lại phân chia thành 2-10 ống phế nang Ống phế nang là đoạn ống mà thành của chúng cú cỏc phế nang độc lập đứng cạnh nhau và các phế nang kết thành chùm

- Cấu tạo mô học: cấu tạo của thành các phế quản không hoàn toàn giống nhau trong suốt chiều dài cây phế quản Tuy nhiên, các phế quản từ lớn đến nhỏ đều có cấu tạo đại cương giống nhau Thành phế quản từ trong ra ngoài gồm 4 lớp:

* Niêm mạc: Gồm có lớp biểu mô trụ giả tầng có lông chuyển Các phế quản lớn có cấu trúc giống khí quản

* Lớp đệm được tạo bởi mô liên kết thưa

* Lớp cơ trơn được gọi là cơ Reissessen.

* Lớp sụn và tuyến: Các mảnh sụn bé dần theo đường kính phế quản

và mất khi đường kính phế quản < 1mm Các tuyến phế quản thuộc loại tuyến nhày và tuyến pha Các tiểu phế quản có biểu mô phủ loại trụ đơn có lông chuyển nhưng ở đoạn cuối lại là biểu mụ vuụng đơn có hoặc không có lông chuyển Tiểu phế quản tận cũng có biểu mô phủ là biểu mụ vuụng đơn Tiểu phế quản hô hấp có biểu mô phủ là biểu mụ vuụng đơn tựa trên màng đáy, gồm các tế bào có lông chuyển, tế bào Clara Các phế nang được lót bởi lớp biểu mô rất mỏng được gọi là biểu mô hô hấp Biểu mô hô hấp lợp vách phế nang gồm hai loại: Tế bào phế nang loại I (chiếm đa số, hình dẹt) và tế bào phế nang loại II ( tế bào này lớn hơn loại I, cú hỡnh cầu) Vách phế nang có một mạng lưới mao mạch dày đặc Trong vách gian phế nang cũn cú một số tế bào mà số lượng của nó phụ thuộc vào tuổi tác cũng như sự mỏng đi của thành phế nang (tế bào chứa mỡ, đại thực bào bụi)

1.1.2 Các loại tế bào chủ yếu.

Tế bào có lông có ở cỏc vỏch phế quản và tiểu phế quản; tế bào hình đài

có nhiều ở các phế quản lớn, cú ớt ở tiểu phế quản; tế bào đáy có nhiều ở phế quản, ít gặp ở tiểu phế quản; tế bào Kulchitsky có nhiều ở phế quản hiếm gặp

ở tiểu phế quản; tế bào vảy ở phế quản và tiểu phế quản; tế bào lớn ưa axit ở tuyến dưới niêm mạc; tế bào Clara chủ yếu ở tiểu phế quản; tế bào phế nang loại I có ở phế nang; tế bào phế nang loại II có ở phế nang

Một số tế bào khác ở phổi: tế bào nội mô, tế bào quanh mạch, tế bào xơ, đại thực bào, dưỡng bào lymphụ bào, tế bào trung tâm biểu mô ở màng phổi,

tế bào sụn, tế bào cơ trơn, tế bào thần kinh ngoại vi và các tế bào cơ biểu mô Chính sự phong phú về nguồn gốc của các loại tế bào ở phổi đã tạo nên hình ảnh đa dạng và phong phú về các u của phổi, đặc biệt là các týp UTBM

1.2 PHÂN LOẠI Mễ BỆNH HỌC UTP

1.2.1 Một số phân loại mô bệnh hoc UTP

Donald L Morton ( 1998 ) đó nhận xột rất chính xác rằng: “UTP đang tăng lên một cách đều đặn và thay đổi nhanh so với một số ung thư khỏc” Cùng với sự thay đổi về hình thái học, sự ra đời của các kỹ thuật HMMD, sinh học phân tử, nuôi cấy tế bào đã làm thay đổi rất nhiều cách nhìn nhận của chúng ta về UTP Đú chớnh là lý do của nhiều phân loại MBH UTP đã được công bố từ đầu thế kỷ trước đến nay Năm 1924, lần đầu tiên trên y văn, Marchesani ở viện giải phẫu bệnh Innbraok dựa trên nghiên cứu mô học của

26 trường hợp UTP, ụng đó đề nghị một phân loại MBH UTP với 4 typ sau: UTBM tế bào đáy, UTBM đa hình , UTBM vảy sừng hoá, UTBM tuyến tế bào trụ Bảng phân loại này đã được chấp nhận trong vòng 25 năm (2)

Tại Anh , năm 1926, qua kết quả nghiên cứu MBH UTP, Barnard kết luận: “Cái gọi là sacụm tế bào lúa mạch của trung thất sau thực chất là một UTBM tuỷ của phế quản” Trong mô tả và ảnh minh hoạ, ông nhấn mạnh tới các đặc điểm của các tế bào lúa mạch nhỏ nhưng cũng cho thấy các u này chứa các tế bào “đa diện” và “hỡnh thoi”, cả hai loại đó đều to hơn chính tế bào lúa mạch Barnard cũng đã mô tả sự hình thành “cỏc ống nhỏ được lót bởi các tế bào trụ và khối” trong typ ung thư này [3] Cũng năm đó ở Đức, Brandt cũng nêu ý kiến tương tự về nguồn gốc tế bào nhỏ trong khi Saupe Schmorl chấp nhận quan điểm của Riesel đó nờu từ trước là u các tế bào nhỏ của thợ

mỏ Schnecberg là các UTBMT thực sự Tính đa hình của typ UTBMT này về sau đã được xác nhận và thảo luận rộng rãi và theo quan điểm hiện nay đõy chớnh là týp UTBM tế bào nhỏ tổ hợp

Warren W.H và cộng sự (1985) dựa vào các kết quả nghiên cứu về HMMD, hoá miễn dịch tế bào, siêu cấu trúc, nuôi cấy tế bào, đã đề nghị một

phân loại mới về một số u của phổi dựa trên các công trình nghiên cứu sâu của họ về u thần kinh nội tiết của phổi như sau [3]:

- U carcinoid

- Ung thư TKNT rất biệt hoá

- Ung thư TKNT ít biệt hoá

- Ung thư TKNT tế bào nhỏ và các týp khác của TKNT bao gồm:

+ UTBM tế bào lớn typ TKNT

+ UTBM tế bào nhỏ hỗn hợp tế bào lớn

+ UTBM tế bào nhỏ tổ hợp

Năm 1985, nhóm tác giả Teplitz R.L, Paladugu R.R, Benfield J.R, Pak H.Y, Ross P.K cũng đã đề nghị áp dụng một phân loại mới cho các khối u carcinoid điển hình và không điển hình

Vào những năm 80 của thế kỷ 20 bắt đầu xuất hiện quan niệm chia UTP thành 2 nhóm lớn: UTBM tế bào nhỏ và UTBM tế bào không nhỏ

Năm 2003, Debra Hawes, Clive R.Taylor, Richard J.Cote đã đưa ra một phân loại các UTBM TKNT như sau :

Typ u Tên cũ Biến thể mô học

UTBM

TKNT biệt

hoá tốt

nang (giả hoa hồng); Giả tuyến; Nhú; Tế bào hình thoi; tế bào lớn ưa axit với xương và sụn

Tế bào hình thoiUTBM

TKNT không

biệt hoá

UTBMTBN Không biệt hoáUTBMTBN typ tế bào lúa mạchUTBMTBN typ tế bào trung gian

UTBMTBN typ hỗn hợp tế bào nhỏ và lớn

UTBMTBN thần kinh nội tiết

UTBMTBN thần kinh nội tiết hỗn hợp tế bào nhỏ/ tế bào lớn

Tế bào lớn TKNT

UTBMTBN tổ hợp

Tế bào lớn TKNT

Năm 1967 ở Gờneve xuất bản một bộ sách Phân loại một bộ sách

“Phõn loại mô học các u của phổi” Năm 1981 cuốn sách này được tái bản lần thứ 2, có thay đổi và sửa chữa

Tuy nhiên, do tính phức tạp mặt về vi thể nên trong vòng 30 năm qua,

đó cú khoảng 40 bảng phân loại khác nhau được công bố trên y văn, trong đó quan trọng nhất và cũng phổ biến nhất là 3 phân loại MBH các u phổi vào các năm 1967, 1981, 1999 của TCYTTG Phân loại mô học các u phổi lần 3 của TCYTTG có nhiều điểm khác biệt với các phân loại trước đó Riêng týp UTBMT có bổ sung thứ týp hỗn hợp và 5 biến thể [3]

PHÂN LOẠI MBH CÁC UTBM PHỔI CỦA

Ung thư biểu mô tuyến đặc với chất nhày 8230/3

Biến thể

IV.UTBM tế bào lớn

Biến thể

8012/3

UTBM thần kinh nội tiết tế bào lớn tổ hợp

VI.UTBM với các phần tử đa hình sarcoma hay dạng

VIII.UTBM tuyến nước bọt

Các loại khác

Bên cạnh các phân loại mô học về toàn bộ các u của phế quản – phổi, cũng có những phân loại mang tớnh chuyờn sõu về mọi nhóm hoặc một týp u

riêng biệt Dựa trên các tiến bộ về hoỏ mụ miễn dịch, hoá miễn dịch tế bào, siêu cấu trúc và nuôi cấy tế bào, Warren W.H và cộng sự ( 1985 ), đã đề nghị một phân loại mới về u thần kinh nội tiết của phổi như sau [3]:

- U carcinoid

- UTBM thần kinh nội tiết rất biệt hoá

- UTBM thần kinh nội tiết ít biệt hoá

- UTBM thần kinh nội tiết týp tế bào nhỏ và các týp khác của u thần kinh nội tiết bao gồm:

+UTBM tế bào lớn

+UTBM tế bào nhỏ cùng với tế bào lớn

+UTBM tế bào nhỏ hỗn hợp

1.2.2 Đặc điểm MBH các phõn týp và các biến thể của UTBMT của phổi

1.2.2.1 Chùm nang

Mô u được tạo bởi cỏc túi tuyến và ống thường được cấu tạo bởi các tế bào chế nhầy giống các tế bào biểu mô tuyến phế quản hay biểu mụ lút phế quản Các cấu trúc nang hoặc ống tuyến chiếm ưu thế cú kốm hay không kốm cỏc vựng nhỳ hay đặc

1.2.2.2.Nhú

U cú các cấu trúc nhú chiếm ưu thế và thay thế cấu trúc phế nang nằm dưới và xâm lấn nhu mô phổi Tế bào u có hoặc không chế nhày, hình khối hoặc trụ thấp, đôi khi là hình chốt phủ lên cỏc lừi liên kết, thay thế các tế bào lút vỏch phế nang và hình thành những nhỏnh nhỳ bậc 2, bậc 3 phức tạp

1.2.2.3.Tiểu phế quản phế nang

Đây là UTBM có một mẫu u tiểu phế quản phế nang thuần khiết và không có bằng chứng xâm nhập mô đệm mạch hay màng phổi Typ này được chia thành ba nhóm:

a Không chế nhày: các tế bào Clara hay tế bào typ II phát triển dọc theo vách phế nang, không xâm lấn mô đệm

b Chế nhày: bào u dạng trụ cao với lượng chất nhày thay đổi trong bào tương, nhân lệch về phía đáy, tế bào u phát triển dọc cỏc vỏch phế nang, không xâm nhập mô đệm Các khoảng phế nang thường lấp đầy chất nhày

c Loại hỗn hợp chế nhày và không chế nhày hoặc typ tế bào trung gian

1.2.2.4.UTBMT đặc với chất nhày

UTBMT không có cỏc tỳi tuyến, ống nhỏ và nhú, nhưng thường xuyên có

tế bào u chứa chất nhầy Nhân tế bào thường to, hạt nhân nổi rõ, lượng bào tương thay đổi

1.2.2.5.UTBMT hỗn hợp

Cấu trúc mô u cho thấy các mẫu chùm nang, nhú hay đặc hoặc tiểu phế quản phế nang pha trộn vào nhau và không có mẫu nào ở dạng thuần khiết Các mẫu hay gặp là mẫu chùm nang với tuyến đặc

1.2.2.6.Các biến thể:

a UTBMT thai biệt hoá cao

b UTBMT nhầy “dạng keo”: Tế bào u nổi trờn cỏc mảng chất nhày và thường gõy gión cỏc phế nang

c UTBMT nang nhầy: Hình ảnh điển hình là một UTBMT nang có sinh rất nhiều chất nhày

d UTBMT tế bào nhẫn: Giống UTBMT chế nhày tế bào nhẫn ở dạ dày ruột Các tế bào u có bào tương sáng, căng phồng, nhân dẹt và lệch về một phía

e UTBMT tế bào sáng: Các mẫu u có thể là tuyến đặc, tuyến nhú hoặc hỗn hợp với các tế bào u hình đa diện, hoặc hơi tròn, có bào tương sáng

1.3 CẤU TRÚC, CHỨC NĂNG CỦA EGFR

1.3.1 Cấu trúc của EGFR

EGFR là một glycoprotein bề mặt màng, trọng lượng phân tử 170 kDaltons, (kDa), gồm một vùng gắn kết các phối tử nằm ngoài màng tế bào, một vựng xuyờn màng đặc hiệu và một vùng trong tế bào với vai trò kích thích sự tăng sinh, biệt hoá của tế vào bình thường và các tế bào ác tính Khi phối tử là yếu tố phát triển biểu mô (Epidermal Growth Factor: EGF) gắn với EGFR sẽ gây nên sự phân cực thụ thể và sự tự phosphoryl hoỏ vựng cú hoạt tính enzym của thụ thể Điều này khởi đầu cho một loạt phản ứng tế bào dẫn đến sự tăng sinh và tiến triển ác tính của khối u: tăng sinh mạch máu, di căn

và ức chế quá trình chết theo chương trình (apotosis) [1]

Các phối tử của EGFR là gia đình protein EGF gồm tám thành viờn bao gồm Epidermal growth factor (EGF), Transformin growth factor (TGFα), Epiregulins (ER), heparin binding EGF like growth factor (HB – EGF), Epigen (EPGN, EPG), Amphiregulin (AR), Betacellulin (BTC) và Neuregulins 1-4 EGF là chuỗi đơn acid polypeptid có 53 acid amin có chứa

ba liên kết disulfua nội phân tử để đảm bảo cấu trúc bậc ba của phân tử EGF Đặc tính quan trọng của EGF chính là truyền vào trong tế bào các tín hiệu từ ngoài tế bào thông qua việc kết nối với các EGFR

Phần ngoài màng của EGFR có trọng lượng khoảng 100 kDa có hai vùng giàu cystein là nơi để gắn kết các phối tử EGF Vựng xuyờn màng trọng lượng nhỏ, chỉ 3 kDa, tập trung tại vùng phân cực phospholipid màng Phần trong tế bào trọng lượng khoảng 60 kDa là protein kinase với đuôi tận cùng carboxyl nơi xảy ra phản ứng tự phosphoryl hoá của EGFR Cấu trúc phần ngoài màng của các thành viên trong gia đình EGFR giống nhau khoảng từ 36 – 40%, phần xuyên màng khoảng 60 – 82%, trong khi phần trong màng của các thành viên gia đình EGFR chỉ giống nhau khoảng 24-32%

Có 4 thành viên trong gia đình EGFR: HER1 (EGFr, ErbB1), HER2 (neu, ErbB2), HER3 (ErbB3), và HER4 (ErbB4) ErbB receptor ở dạng cặp đôi với chính nó hay với ErbB khác (ErbB2) khi gắn kết với các phối tử EGF, chúng hoạt hoá phần trong bào tương của EGFR, mang các gốc phosphat của tyrosin kinase bằng các phản ứng tự phosphoryl hoá Phần tyrosin kinase này được hoạt hoá, kết quả làm phân cực để lộ các gốc phosphat, bằng cách đó làm tăng hoạt tính vùng tyrosin kinase của EGFR Phản ứng tự phosphoryl hoá để lộ những vị trí gắn kết với các protein tín hiệu trong để bào và hoạt hoỏ cỏc con đường tín hiệu ErbB1 thành viên đầu tiên của EGFR, tăng biểu

lộ ở nhiều dòng tế bào biểu mô cả bình thường và ác tính Chỉ riêng EGFr được hoạt hoá khi gắn kết với EGF hoặc TGFα [1]

1.3.2 Chức năng của EGFR

Các EGFR đều có phần để liên kết ngoài màng, phần xuyên màng và phần trong bào tương có hoạt tính tyrosin kinase Phần ngoài màng, vùng III (domain III) chính là cùng để gắn kết các yếu tố hoạt hoá hay ức chế các thụ thể, để dẫn truyền tín hiệu vào trong tế bào làm tế bào có thể phát triển bình thường hoặc trở nên ác tính Vùng IV chính là phần xuyên màng của EGFR Phần trong bào tương, đầu tận carboxy chính là phần đáp ứng trả lời hoạt tính tyrosin kinase và điều hoà chức năng tyrosin kinase Phản ứng tự phosphoryl hoá của tyrosin kinase xảy ra ở vùng này nó đóng vai trò chớnh trong điều hoà sự phát triển tăng sinh của tế bào Khi vắng mặt các phối tử (ví dụ GF, TGF…), vùng tyrosin kinase không phosphoryl hoỏ, chỳng ở dạng đơn phân

và vùng kinase không hoạt động Vùng tyrosin kinase trở nên hoạt hoá khi phối tử gắn với vùng ngoại bào kết quả làm phân cực để lộ các gốc phosphat

và tự phosphoryl hoá tyrosin điều hoá trong vòng hoạt hoá của kinase Sau khi hoạt hoá, việc tự phosphoryl hoá để lộ những vị trí gắn kết các protein tín hiệu và hoạt hoỏ cỏc con đường tín hiệu [1]

Các đột biến phầm ngoài mang EGFRvIII được nghiên cứu nhiều nhất vì chính sự đột biến của vùng này làm cho không có sự gắn các phối tử truyền tín hiệu vào trong nhân thông qua các EGFR Sự tăng biểu hiện EGFRvIII hay gặp trong các khối u ác tính của hệ thống thần kinh, ung thư vú, ung thư buồng trứng Đột biến xảy ra là kết quả của sự sắp xếp lại gen sao chép bị đột biến từ exon 2-7 gồm 801bp Các thụ thể này thiếu từ acid amin 6-273, hoàn toàn thiếu hụt ở phần ngoài tế bào của EGFR và đây cũng là phần chính của EGFR để liên kết với các phối tử Tại vùng này các glycin luân phiên kết nối với nhau chèn vào các vị trí của acid amin cấu trúc EGFR, chính vì thế mà không xảy ra sự sao chép từ acid amin -273 EGFRvIII khác EGFRvI ở chỗ, EGFRvI làm thay đổi liên kết của thụ thể với các phối tử còn EGFRvIII làm

vùng liên kết với phối tử bị mất hoàn toàn Chính vì vậy EGFRvIII kích thích tăng sinh và tăng phát triển khối u ác tính không phụ thuộc tương tác của các phối tư Phản ứng tự phosphoryl của thụ thể TK ở EGFRvIII thấp hơn EGFR thể tự nhiên (wildtypEGFR: wtEGFR) Vì thế, hoạt tính các phối tử TK trong

tế bào của EGFRvIII khác khi so với hoạt tính các phối tử wtEGFR EGFRvIII bền vững và hiện diện trên bề mặt tế bào hơn là phần trong tế bào của thụ thể

Đột biến cấu trúc phần trong bào tương EGFR ít thấy hơn vùng cấu trúc phần ngoài màng Chưa có nghiên cứu nào thấy sự đột biến xảy ra tại vựng cú hoạt tính tyrosin kinase trong tế bào của thụ thể EGF [1]

1.4 CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN EGFR.

1.4.1 Kỹ thuật hoá mô miễn dịch (HMMD)

Kỹ thuật HMMD đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới Đây là bước đột phá trong nghiên cứu bệnh học phân tử góp phần định tính hoặc bán định lượng các phân tử kháng nguyên Kỹ thuật này là phương pháp áp dụng các nguyên lý và kỹ thuật miễn dịch để nghiên cứu tế bào và mô Dựa trên sự biểu

lộ mang tính đặc hiệu kháng nguyên trên bề mặt tế bào hay tại khu vực gian bào, các kháng thể đặc hiệu sẽ giúp cho việc nhận ra và phân loại các tế bào hay mụ trờn cỏc lát cắt tổ chức

Phương pháp sử dụng phức hợp avidin – biotin được hầu hết cỏc phũng xét nghiệm hoá miễn dịch sử dụng trong nghiên cứu tế bào và mô Với kỹ thuật này, ái lực cao của avidin đối với biotin được sử dụng để gắn chất đánh dấu peroxidase

Bộc l c l ộ – Kết hợp – Khuyếch đại

Kháng thể II

g n biotin Kháng thể I Kháng nguyên

Biotin Avidin Men

Bệnh phẩm được cố định formol

Cỏc bước cơ bản của kỹ thuật miễn dịch enzym

Biotin – avidin

1.4.2 Kỹ thuật sinh học phõn tử.

1.4.2.1 Xỏc định nồng độ, độ sạch RNA, cDNA bằng phương phỏp quang phổ kế.

Nguyờn tắc của phương phỏp dựa vào sự hấp thụ mạnh ỏnh sỏng tử ngoại ở bước súng 260 nm của cỏc purin và pyrimidin Giỏ trị mật độ quang ở bước súng 260 nm (OD260 nm – Optical Densit 260 nm ) của cỏc mẫu đo cho phộp xỏc định nồng độ acid nucleic trong mẫu dựa vào tương quan sau:

Một đơn vị OD 260 nm tương ứng với nồng độ là:

- 50 g/ ml cho một dung dịch DNA sợi đụi

- 40 ml cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn

Tuy nhiờn, cỏch tớnh này chỉ đỳng vỳi cỏc dung dịch acid nucleic sach

Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thờm giỏ trị OD ở 280 nm (OD 280 nm) Cỏc protein cú mức hấp thụ cao nhất ở bước súng 280 nm, nhưng cũng hấp thụ ỏnh sỏng ở bước súng 260 nm như cỏc acid nucleic Do đú, làm sai lệch giỏ trị thật của nồng độ acid nucleic Một dung dịch acid nucleic đạt

tiêu chuẩn về độ sạch ( không tạp nhiễm protein) khi tỷ số OD 260 nm/ OD

280nằm trong khoảng 1,8 – 2 [2], [17]

Các mẫu RNA và c DNA trong nghiên cứu được pha loãng ở nồng độ

100 lần và tiến hành đo OD ở bước sóng 260 nm và 280 nm

1.4.3 Phương pháp điện di acid nucleic.

Nguyên lý của phương pháp điện di: dựa vào các đặc tính cấu trúc của các acid nucleic là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mẳt nên khi chịu tác động của một điện trường, di chuyển về cực dương

Việc chọn loại gel cũng như nồng độ các chất tạo thành gel tuỷ thuộc kích thước trung bình của các phân đoạn acid nucleic cần phân tích Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, thường dùng để phân tích những đoạn có kích thước trong khoảng 0,5 – 20 kb Gel được đổ trên một thể giá nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm ngang Các acid nucleic trong gel agarose sẽ hiện hình ( dưới dạng những vạch màu đỏ cam) dưới tia

tử ngoại (UV) với sự có mặt của ethidium bromide Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của acid nucleic và sẽ phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia tử ngoại

Quy trình điện trên gel agarose như sau:

+ Điện di trên agarose 2%: 8µl sản phẩm PCR được trộn với 2µl đệm tra mẫu

+ Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 110V, trong khoảng thời gian từ 20 -30 phút

+ Chụp ảnh và phân tích kết quả điện di đồ trên hệ thống máy Chemidoc EQ – Bio – Rad (URA)

1.4.4 Kỹ thuật RT – PCR tổng hợp cDNA

1.4.4.1 Tổng hợp cDNA sử dụng phương pháp MMLV – RT

Những mẫu RNA đạt được nồng độ tối ưu có độ tinh sạch dao đọng từ 1,8 -2 sẽ được sử dụng để tổng hợp c DNA

Bước 1: Giai đoạn biến tính (denaturation)

Sử dụng 4 -5 µg RNA tổng số, thêm nước khử DEPC cho đủ 6 µl/l ống

Để ở nhiệt đoj 650C trong vòng 5 phút Sau đó, đặc trong đá lạnh 1 phút

Bước 2: Giai đoạn gắn mồi (annealing)

Thêm 2 µl random pimer (5 pmol/ µl) và 5 µl dNTPs(2.5 mM)

Để ở nhiệt độ 250C trong vòng 10 phút Sau đó, đặt trờn đỏ một phút

Bước 3: Giai đoạn tổng hợp cDNA (extention).

thêm vào 7µl/ ống hỗn hợp sau: 4µl 5 x first strand PCR buffer; 1µl DTT (ức chế protein); 1µl HPRI (ức chế Rnase); 1µl MMLV –RT (enzym tổng hợp) Để ở nhiệt độ 37-0C trong 55 phút và 700c trong 15 phút 40 C ~ cDNA được giữ ở nhiệt độ – 200C cho đến khi sử dụng cho PCR

kỳ gồm ba bước như sau:

Bước 1: Giai đoạn biến tính Phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao

hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 950C – 950C trong vòng

30 giây đến 1 phút

Bước 2: Giai đoạn bắt cặp Nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt

cặp với khuôn, dao động trong khoảng 400C đến 700C, tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

Bước 3: Giai đoạn tổng hợp này kéo dài Nhiệt độ được tăng lên 720C để

cho DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase…) hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời giain phụ

thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút

Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn DNA ban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi AND mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng để làm các DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo Sản phẩm cuối của phản ứng PCR

là đoạn DNA chuỗi đụi cú chiều dài bằng khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi,

và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi [2], [85]

Cặp mồi đặc hiệu với HIP, EGFR và GAPDH có trình tự như sau:

HIP –F: 5’ – GCT TAT GGT GCA GAC ATGG – 3’

HIP – G: 5’ – CAG AGA CTA CTC TGA AGC – 3’

GAPDH – R: 5’ – ACA TCC AAT ATG ATT CC – 3’

GAPDH – R: 5’ – TGG ACT CCA CGA CGT ACT CA – 3’

EGFR – F: 5’ – GCT TAT GGT GCA ATG G – 3 ‘

EGFR – R: 5’ – CGA AGT CTC ATA AGA GAC – 3’

Thành phần phản ứng PCR: được tiến hành với tổng thể tích 10 gồm:

150 ng cDNA với cặp mồi HIP, 400 ng cDNA với cặp mồi EGFR và 1200 ng

với cặp mồi GAPDH; 1 x Ex – Tap Plymerase (takara Bio Inc Kyoto, japan).

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR đối với cặp mồi HIP và GAPDH như sau: 940C /5 phút, 35 chu kỳ [940C / 50 giây, 580C / 50 giây], 720C / 50 giây,

720C/ 5 phút

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR đối với cặp mồi RGFR như sau: 940C /10 phút, [940C / 30 giây, 550C / 45 giây, 720C / 45 giây], trong 30 chu kỳ;

1.4.4.3 PCR định lượng điện di mao quản

Sau khi khuếch đại gen HIP và EGFR, phân tích sản phẩm PCR bằng 2 phương pháp điện di trên thạch agarose nồng độ 1,5% và điện di mao quản bởi máy Agilent 2100 Bianalyzer Đậm độ vạch các băng HIP và EGFR bởi thạch agarose (nhuộm ethidium bromide) sẽ được so sánh với nồng độ HIP và EGFR được đo trờn mỏy Agilent 2100 Bioanalyzer

Agilent 2100 Bioanalyzer là công cụ phân tích mẫu acid nucleic cũng như protein đạt các tiêu chuẩn công nghiệp thay thế cho phương pháp điện di trên thạch agarose vốn đòi hỏi nhiều công sức Đặc trưng của Agilent 2100 Bioanalyzer là nó có thể được sử dụng cả trong phân tách điện di ( ví dụ: tỏch cỏc đoạn DNA) và phân tích các chỉ số huỳnh quang tế bào trong phương pháp đếm tế bào dòng chảy (flow cytometry) Nhờ vậy, phân tích kết quả điện

di DNA có thể cho biết đồng thời cả kích thước và nồng độ đoạn DNA được phân tách Kể từ khi được đưa vào sử dụng năm 1999 Agilent 2100 Bioanalyzer được các nhà nghiên cứu ưa chuộng nhờ kết quả chính xác, thời gian phân tích ngắn, lượng mẫu nhỏ (1 -4///) và khả năng tự động hoá caoTrong phản ứng xác định nồng độ gen HIP và EGFR trong các mẫu mô ung thư, khi điện di sản phẩm PCR được khuếch đại bởi các cặp mồi đặc hiệu của hai gen HIP và EGFR, kết quả được thể hiện ở hình 2.2

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN EGFR TRấN THẾ GIỚI

Hiện nay cùng với các phương pháp đang được áp dụng trong chẩn đoán

và điều trị ung thư, các nhà khoa học đã và đang đi sâu vào nghiên cứu các gen , các marker ung thư đặc hiệu trong đó cú nhúm cỏc protein màng tế bào nhằm góp phần chẩn đoán sớm ở mức độ sinh học phân tử

Nhúm các protein màng có vai trò trong việc dẫn truyền tín hiệu tế bào -

tế bào hay khoảng gian bào - tế bào và có chức năng trong việc chưởng thành, phát triển và biệt hoá của tế bào Trong nhúm cỏc protein màng có một protein màng tham gia vào việc dẫn truyền tín hiệu tế bào là thụ thể của yếu

tố phát triển biểu mô (Epidermal Growth Factor Receptor: EGFR) Một số nghiên cứu đã thấy rằng hoạt động của yếu tố phát triển biểu mô (EGF) và thụ thể của nó (EGFR) đóng vai trò quan tọng đối với quá trình phát triển và tái tạo của tế bào EGFR tăng cao trong tế bào ung thư là một yếu tố quan trọng thúc đẩy sự phát triển tế bào u, ngăn chặn sự chết theo chương tình (apoptosis) và tạo thuận lợi cho tiến trình di căn theo các cơ chế khác nhau Ngăn chặn tiến trình này là một trong những mục tiêu nghiên cứu tạo ra các thuốc mới để điều trị đích trong ung thư (3)

Tiến bộ của khoa học kỹ thuật trong lĩnh vực sinh học phân tử protein trong thập kỷ gần đây đã chứng minh có sự tăng cường biểu hiện EGFR ở cả mức độ mRNA và protein trong một số loại ung thư

Tăng hoạt tính của EGFR cũng có thể thúc đẩy khả năng di căn của các

tế bào ung thư Gia tăng biểu lộ các thành viên trong gia đình EGFR khác nhau ở các thể loại ung thư khác nhau: ung thư vú, ung thư phổi , ung thư đại tràng, ung thư dạ dày , ung thư tuỵ, ung thư buồng trứng , ung thư thần kinh , ung thư tiền liệt tuyến, ung thu vùng đầu cổ và một số loại ung thư khác (1)

Ức chế quá trình biểu lộ EGFR là một trong những định hướng của liệu pháp điều trị gen cho một số lại hình ung thư Từ các nghiên cứu này, hai hướng nghiên cứu chính gần đây tiếp cận sản xuất thuốc điều trị ung thư trên lâm sàng là: 1) sản xuất kháng thể đơn dòng ức chế các EGFR ở phần ngoài

màng tế bào; 2) sản xuất chất ức chế tiểu phân tử tyrosin kinase EGFR đặc biệt là các EGFRvI – III Gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu sản xuất được nhiều loại thuốc tác dụng đặc hiệu EGFR Các chất này hoặc ức chế phần ngoài màng tế bào hoặc phần trong tế bào của EGFR nhưng mục đích chính là ngăn chặn dũng thỏc tớnh hiệu đường truyền vào trong tế bào của EGFR

Trên thế giới đã có nhiều tìm hiểu mức độ bộc lộ EGFR trong UTP Cùng với loại mô học, giai đoạn bệnh, EGFR cũng được coi là yếu tố tiên lượng quan trọng

EGFR thường bộc lộ ưu thế trong UTP không tế bào nhỏ, tỷ lệ từ 43-89% [27] Bộc lộ ưu thế thấy nhiều nhất trong UTBM tế bào vảy: 70%, sau đó là UTBMT: 50% và UTBM tế bào lớn Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy UTBM phế quản phế nang có nồng độ cao EGFR [3] Cơ chế về hoạt tính EGFR trong UTP hiện vẫn chưa được biết [3] Sự bộc lộ ưu thế có liên quan tới tiên lượng xấu của bệnh [3]

1.6 ĐIỀU TRỊ ĐÍCH ĐỐI VỚI BỆNH NHÂN UTP LOẠI TUYẾN Cể ĐỘT BIẾN EGFR

Ở những bệnh nhân ung thư khu trú và chưa di căn qua hạch, phẫu thuật

có thể mang lại tỷ lệ thời gian sống còn trong thời gian 5 năm là khoảng 40%

Kể từ khi ghi nhận có bộc lộ quá mức EGFR ở các khối u ở người và có liên quan đến hậu quả sấu trên lâm sàng, các thuốc ức chế EGFR – Tyrosine Kinase (EGFR – TKI) đã được phát triển và chứng minh hiệu quả trong điều trị ở những bệnh nhân NSCLC đã thất bại với hoá trị trước đó

Paez và cộng sự đã khảo sát gen EGFR từ exon 2 đến exon 25 trên 119 mẫu khối u NSCLC (16) Phân tích trình tự DNA cho thấy các đột biến mất đoạn và đột biến (missense) ở tổng số 16 mẫu mô Tất cả các đột biến được biểu hiện trong các exon 18 – 21 của vùng kinase Theo các nghiên cứu trước

đó, bệnh nhân bị đột biến EGFR và có đáp ứng tốt với EGFR – TKI cú cỏc đột biến chủ yếu ở exon 18,19 và 21; trong khi những bệnh nhân bị đột biến

exon 20 có đáp ứng kém (7,8) Người ta thường ghi nhận có sự thay thế xảy ra

ở exon 18 và 21, và có sự mất đoạn ở exon 19(9) Đột biến mất đoạn (in frame) hoặc đột biến thay thế tác động đến các acid amin chuyên biệt; do đó nó có thể làm thay đổi vị trí gắn vào vùng tyrosine kinase Do đó, sự thay thế này ảnh hưởng đến hiệu quả của EGFR – TKI Hơn nữa, người ta ghi nhận có mối liên quan giữa tình trạng đột biến EGFR và tỉ lệ đáp ứng với điều trị bằng EGFR – TKI ở bệnh nhân NSCLC 38,6% trong số những bệnh nhân nghiên cứu không có đột biến EGFR có tăng nồng độ EGFR phosphoryl hoá trong khi 66,6% bệnh nhân đột biến EGFR có tăng EGFR phosphryl hoá Người ta cũng ghi nhận sống còn không có bệnh tiến triển và sống còn toàn bộ tốt hơn

ở bệnh nhân NSCLC có đột biến EGFR Hiệu quả điều trị cao hơn cũng được ghi nhận ở bệnh nhân carcinoma tế bào tuyến có đột biến EGFR (85%) so với không có đột biến (khoảng 40%) Tuy nhiên, trong một nghiên cứu pha II đơn trung tâm, gefitinib được thiết kế nhằm chứng minh hiệu quả kháng ung thư trong điều trị đơn trị bước đầu cho những bệnh nhân NSCLC gia đoạn IIIB/IV chưa được điều trị bằng hoá trị trước đó Các mẫu mô khối u được thu thập

để đánh giá các dấu ấn sinh học Tỷ lệ đáp ứng toàn bộ là 50,9%; tuy nhiên bệnh nhân có đột biến mất đoạn ở exon 19 và đột biến L858R ở exon 22 có tỷ

lệ đáp ứng lần lượt là 95% và 73,9% Đột biến EGFR thể mất đoạn exon 19

và đột biến L858R ở những bệnh nhân carcinoma tế bào tuyến là yếu tố tiên lượng tốt nhất cho thấy có thời gian đến khi điều trị thất bại (TTF) lâu hơn ở bệnh nhân NSCLC giai đoạn tiến triển chưa được điều trị hoá trị sử dụng gefitinib đơn trị bước đầu

Cetuximab là kháng thể đơn dòng gắn lên thụ thể của EGFR Trên những

BN NSCLC có đột biến EGFR qua nhuộm HMMD thì khi phối hợp Cetuximab với hoá trị giúp tăng thời gian sống còn toàn bộ so với hoá trị đơn thuần Tuy nhiên phối hợp này không làm tăng thời gian sống bệnh không tiến triển

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Các BN UTP loại biểu mô tuyến được phẫu thuật tại bệnh viện K từ 1/2009 đến tháng 10/2011

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

- UTBMT phổi các giai đoạn cả nam và nữ

- BN được phẫu thuật cắt thuỳ hoặc cắt một phổi tại bệnh viện K

- BN có đủ hồ sơ bệnh án, u nguyờn phỏt, được mổ lần đầu

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Các khối u di căn

- Mô bệnh học không phải UTBMT

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang hồi cứu và tiến cứu

2.2.2 Tính cỡ mẫu

04 , 96 )

2 , 0 5 , 0 (

) 5 , 0 1 ( 5 , 0 96 , 1 ) (

) 1 (

2 )

2 / 1 (

n

n: Cỡ mẫu nghiên cứu

p: Tỷ lệ EGFR + là 50% = 0,50 ( Theo: Giorgio V Scagliotti 1và cs)

α : Mức ý nghĩa : 0,05

Hệ số tin cậy là 95% thì Z = 1,96 và Z2( 1 − α / 2 ) = 1,96²

(Giá trị Z thu được từ bảng Z ứng với giá trị α lựa chọn)

ε : Giá trị tương đối = 0,2 ( 20% so với p )

Từ công thức trên, chúng tôi dự kiến cỡ mẫu nghiên cứu là 97 đối tượng