Đặc điểm của các hợp chất hữu cơ chứa clo

Đặc biệt, sự đa dạng và mức độ hoạt động của quần xã vi khuẩn kỵ khí VK KK hô hấp loại khử clo tham gia vào quá trình chuyển hóa, phân hủy sinh học các chất độc như thế nào vẫn đang là n

về quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo đã chứng minh có 4 con đường phân hủy, chuyển hóa bởi VSV Trong số đó có 3 con đường xảy ra với

sự có mặt của oxy bao gồm oxy hóa cắt vòng thơm, loại clo ở sản phẩm cắt vòng và phân hủy nhờ cơ chế xúc tác bởi enzyme ngoại bào hay các chất tương tự trao đổi chất hoạt động như enzyme Quá trình thứ tư là loại khử clo xảy ra ở điều kiện không có oxy hay thiếu oxy được gọi chung là hô hấp loại khử clo

Công nghệ phân hủy sinh học đã được áp dụng thành công với quy mô 0,5 m3đến 100 m3 tại Đà Nẵng và quy mô 3.384 m3 tại Biên Hòa Hiệu quả xử lý tại Đà Nẵng đạt 50 – 70% sau gần 2 năm xử lý (Đặng Thị Cẩm Hà, 2005) và tại Biên Hòa đạt hơn 99% sau 27 tháng xử lý (Đặng Thị Cẩm Hà, 2012) Để đạt được hiệu quả

xử lý nêu trên có rất nhiều yếu tố liên quan trong đó có vai trò của VSV, các điều kiện mini sinh thái của mỗi lô xử lý, các nhóm VSV tham gia vào quá trình chuyển hóa, phân hủy và khoáng hóa các hợp chất là thành phần chất diệt cỏ/dioxin Đặc biệt, sự đa dạng và mức độ hoạt động của quần xã vi khuẩn kỵ khí (VK KK) hô hấp loại khử clo tham gia vào quá trình chuyển hóa, phân hủy sinh học các chất độc như thế nào vẫn đang là những câu hỏi cần được giải đáp bằng các nghiên cứu cơ bản với sự hỗ trợ của các kỹ thuật hiện hành

Hiện nay, các nghiên cứu về VK hô hấp loại khử clo trên thế giới đã công bố

có 20 chi và thuộc về 3 ngành là Proteobacteria, Chloroflexi và Firmicute Trong các lô xử lý ở Đà Nẵng, sự có mặt VK Dehalococcoides thuộc ngành Chloroflexi đã

được xác định bằng phương pháp DGGE (Nguyễn Bá Hữu, 2009) Một số VK KSF

thuộc ngành Proteobacteria cũng đã được phát hiện tại khu vực này Đặc biệt,

nhóm VK hô hấp loại khử clo theo cơ chế đồng trao đổi chất mà đại diện là

Pseudomonas đã được phát hiện ở hầu hết các nghiên cứu ở Việt Nam (Nguyễn Bá

Hữu, 2009) Chúng không chỉ có mặt trong các mẫu nguyên thủy mà còn luôn được tìm thấy ở hầu hết các mẫu của quá trình xử lý ở các quy mô khác nhau trong điều kiện thiếu khí Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu sâu nào về nhóm VK KK có khả năng hô hấp loại khử clo một cách có hệ thống Đặc biệt, việc làm giàu các VK KK

hô hấp loại khử clo bắt buộc bắt đầu được nghiên cứu nhưng chưa thành công Để tìm hiểu sự có mặt và vai trò của nhóm VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử

lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại Đà Nẵng và Biên Hòa, chúng tôi thực hiện đề

tài: “Nghiên cứu đa dạng quần xã vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin bằng phương pháp phân hủy sinh học”

Luận án được thực hiện với các mục đích và nội dung chính sau đây:

KK hô hấp loại khử clo từ mẫu đất ở lô xử lý của Biên Hòa

 Đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu bởi quần xã

VK KK hô hấp loại khử clo

Nội dung nghiên cứu

 Xác định sự có mặt của một số nhóm VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử

lý bằng phương pháp nested-PCR

 Nghiên cứu sự đa dạng VK KSF và Dehalococcoides từ các lô xử lý đất nhiễm

chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa bằng phương pháp DGGE

 Đánh giá sự biến động số lượng VK KK sử dụng dioxin và VK KSF trong lô xử

lý 3.384 m3 tại Biên Hòa

 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của quần xã VK KSF và một chủng đại diện được làm giàu, phân lập từ các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam

 Đánh giá khả năng phân hủy hay chuyển hóa các đồng phân PCDD/Fs và các hợp chất vòng thơm từ mẫu làm giàu quần xã VK KK hô hấp loại khử clo và VK KSF

 Sử dụng công cụ Metagenomics để nghiên cứu sự đa dạng của quần xã VK KK cũng như các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin có mặt trong mẫu làm giàu từ đất của 16 vị trí ở lô xử lý khử độc tại Biên Hòa sau 36 tháng

Phương pháp nghiên cứu

1 Phương pháp sinh học phân tử: nested-PCR, DGGE, Metagenomics được sử dụng để đánh giá sự đa dạng VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin và trong mẫu làm giàu

2 Phương pháp nuôi cấy truyền thống: nuôi cấy, làm giàu VK KK trong phòng thí nghiệm và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh trưởng của các VK này

3 Phương pháp hóa học: phân tích các thành phần hóa học trên máy HPLC và GC/MS để đánh giá khả năng phân hủy hay chuyển hóa các chất là thành phần của chất diệt cỏ như các đồng phân của dioxin, 2,4,5-T và sản phẩm phân hủy sinh học của chúng như 2,4-DCP bởi các VK KK trong các mẫu làm giàu từ đất của lô xử lý ở Đà Nẵng, Biên Hòa

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1 Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam làm giàu được quần xã VK KK hô hấp loại khử clo từ đất chôn lấp tích cực liên quan đến xử lý chất diệt cỏ/dioxin Các VK

KK có mặt trong mẫu làm giàu bao gồm cả ba nhóm loại khử clo là hô hấp loại

khử clo bắt buộc (Dehalococcoides, Dehalogenimonas); hô hấp loại khử clo

không bắt buộc (Desulfitobacterium, Desulfovibrio, Desulfococcus, Anaeromyxobacter v.v.); hô hấp loại khử clo đồng trao đổi chất (Pseudomonas, Clostridium, Shewanella v.v.) trong đó Pseudomonas chiếm ưu thế hơn cả

2 Đã đánh giá được khả năng phân hủy và chuyển hóa 55,7% tổng độ độc trên đất

ô nhiễm nặng (41.265 ng TEQ/kg đất khô) bởi quần xã VK KK Đánh giá được hiệu suất phân hủy các chất là thành phần của chất diệt cỏ/dioxin (17 đồng phân PCDD/PCDF, 2,4,5-T) và sản phẩm phân hủy sinh học của 2,4,5-T, 2,4-D là 2,4,5-TCP, 2,4-DCP bởi quần xã VK KK cũng như khả năng phân hủy 2,4,5-TCP, 2,4-DCP bởi chủng VK KSF đã làm sạch

3 Lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng công cụ Metagenomics để đánh giá sự đa dạng quần xã VK KK và các gene chức năng tham gia phân hủy, chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu một năm từ đất sau 36 tháng xử lý ở Biên Hòa trên đất ô nhiễm ở mục (2)

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Đặc điểm của các hợp chất hữu cơ chứa clo

1.1.1 Một số đặc điểm chung của các hợp chất hữu cơ chứa clo

Các hợp chất hữu cơ chứa clo được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp như quá trình sản xuất thuốc trừ sâu, trừ nấm, chất diệt cỏ, các quá trình tẩy rửa, luyện kim loại, sản xuất bột giấy, dùng làm dung môi v.v., trong nông nghiệp và cả trong chiến tranh xâm lược Các hợp chất hữu cơ chứa clo cũng được sinh ra do sự đốt cháy không hoàn toàn (đốt cháy các chất thải rắn), các hoạt động tự nhiên (cháy rừng, hoạt

động kiến tạo vỏ trái đất như động đất, núi lửa) (Schecter, 2006) Thời gian bán hủy

của các chất hữu cơ chứa clo trong môi trường thường kéo dài hàng tuần đến hàng năm, thậm chí hàng chục năm như chất diệt cỏ chứa dioxin tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa Đặc biệt, dioxin là một trong số các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm chứa clo có thể tồn tại hàng trăm năm hay lâu hơn trong môi trường và không bị phân hủy dưới tác dụng của axit mạnh, kiềm mạnh, các chất có tính oxy hóa

Căn cứ vào đặc điểm cấu tạo của các hợp chất hữu cơ chứa clo, các nhà khoa học phân loại chúng thành 3 nhóm chính là chất hữu cơ chứa clo mạch thẳng, vòng

thơm và đa vòng thơm (Hình 1.1) (Tas, 2009)

(i) Các chất hữu cơ mạch thẳng chứa clo thường được sử dụng làm dung môi hữu cơ như tetrachloroethene (PCE), trichloroethene (TCE), chloroform và chúng được thải ra môi trường nhiều nhất (Hiraishi, 2003; Cheng, 2009)

(ii) Các chất hữu cơ vòng thơm chứa clo như hexachlorobenzene, chlorobenzene, chlorophenol (CP) v.v Nhóm chất này được sử dụng làm chất bảo quản gỗ, sản xuất

thuốc nhuộm, chất diệt cỏ, diệt nấm (Tas, 2009)

(iii) Các chất hữu cơ đa vòng thơm chứa clo bao gồm các hợp chất có cấu trúc 2-3 vòng thơm và chứa từ 2 đến 8 nguyên tử clo trong phân tử Đây là các chất có

độ độc cao tùy thuộc vào số lượng và vị trí các nguyên tử clo trong phân tử Các chất này được gọi chung là dioxin Căn cứ vào số nguyên tử clo và vị trí không gian

của những nguyên tử này, dioxin có 75 đồng phân polychlorodibenzo-p-dioxin

(PCDD) và 135 đồng phân polychlorodibenzofuran (PCDF) với độc tính khác nhau Thành phần của chất diệt cỏ mà quân đội Mỹ đã sử dụng trong chiến tranh ở Việt Nam chứa chủ yếu là các hợp chất 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) (Hình 1.1) và nhiều hợp chất vòng thơm khác

cis-1,3-dichloropropene

Tetrachloroethene (PCE)

Trichloroethene (TCE)

Hình 1.1 Một số hợp chất hữu cơ chứa clo điển hình

2,4-D, 2,4,5-T thuộc họ chất diệt cỏ phenoxy có tác dụng làm rụng lá, tồn tại ở dạng axit, muối (chủ yếu là amin), ester Ở nồng độ thấp, 2,4-D kích thích quá trình tổng hợp RNA, DNA và protein, trong khi đó ở nồng độ cao, 2,4-D có thể ức chế sự phân chia và sinh trưởng của tế bào thực vật 2,4,5-T được tổng hợp từ 2,4,5-trichlorophenol (2,4,5-TCP) 2,4,5-T được sử dụng làm tác nhân gây rụng lá trong nông nghiệp và lâm nghiệp

2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD) là sản phẩm phụ của quá

trình sản xuất chất diệt cỏ 2,4,5-T Đây là chất có độ độc cao nhất với tổng độ độc

tương đương là 1 (Schecter, 2006) Dioxin còn bao gồm nhóm các polychlorinated

biphenyl (PCB) là các chất tương tự dioxin, bao gồm 419 đồng phân trong đó có 29

chất đặc biệt nguy hiểm (Schecter, 2006; Đặng Thị Cẩm Hà, 2005) PCB được sản

xuất rất nhiều trong những năm 1930-1970 ở phía Bắc Bán cầu và được sử dụng trong máy biến áp, chất lỏng thủy lực, chất dẻo và trong một số ngành công nghiệp khác (Angelo, 2010)

Nhìn chung, các hợp chất hữu cơ chứa clo thường kỵ nước (do hệ số octan – nước cao) nên chúng bị lắng đọng trong bùn và trầm tích Đây là các hợp chất độc, tồn tại lâu dài trong môi trường, tích lũy trong các chuỗi thức ăn và gây bệnh cho

người và động vật (Smidt, 2000; Schecter, 2006; Tas, 2009; Wagner, 2009)

1.1.2 Ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ chứa clo tới con người và môi trường

Các hợp chất hữu cơ chứa clo đều là các chất có độ độc cao không những đối với người, động thực vật mà còn với cả VSV Hầu hết các chất hữu cơ chứa clo có thể gây ung thư cho người Tuy nhiên, các chất hữu cơ mạch thẳng chứa clo thường

ít độc hơn và thời gian bán hủy ngắn hơn so với các hợp chất vòng thơm chứa clo Các hợp chất PCDD, PCDF và PCB là những chất hữu cơ bền vững, độc hại và khó phân hủy (POP) trong môi trường tự nhiên Hai đồng phân của dioxin có độ độc cao

nhất là 2,3,7,8-TCDD và 1,2,3,7,8-pentachlorodibenzo-p-dioxin (PeCDD) với tổng

độ độc tương đương là 1 Các chất có độ độc thấp hơn như dioxin (HxCDD), tetrachlorodibenzo-p-furan (TCDF), PCB Các chất có độ độc thấp nhất là octachlorodibenzo-p-dioxin (OCDD), octachlorodibenzo-p-furan

hexachlorodibenzo-p-(OCDF), trichlorobenzene (TrCB) với tổng độ độc tương đương là 0,0001

Ở Việt Nam, độ tồn lưu của các chất là thành phần của chất diệt cỏ tại các căn

cứ quân sự cũ của Mỹ vẫn ở mức cao Trong đó, 2,3,7,8-TCDD có thể chiếm tới 99% tổng độ độc ở tại hai sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa (Hatfield, 2011)

EPA đã công nhận dioxin là một chất gây ung thư nhóm 1 cho con người Không có một liều lượng nào là an toàn hoặc ngưỡng dioxin mà dưới nó thì không gây ung thư (Van den Berg, 2006) Ở hàm lượng cao, dioxin có thể gây chết người Khi ở nồng độ thấp, dioxin gây ra các đột biến và di truyền qua nhiều thế hệ khác nhau Dioxin còn có thể liên quan đến một số bệnh nguy hiểm khác như bệnh rám

da, bệnh đái tháo đường, bệnh ung thư trực tràng không Hodgkin, thiểu năng sinh dục cho cả nam và nữ, sinh con quái thai hoặc thiểu năng trí tuệ, đẻ trứng (ở nữ)

v.v Theo WHO 2002, mức phơi nhiễm dioxin cho phép qua thức ăn của mỗi người

là 1-10 pg đương lượng độc (TEQ/ngày) (Van den Berg, 2006) Theo Angelo và đtg, PCB có thể ảnh hưởng đến gan, đường ruột, máu, hệ nội tiết, miễn dịch, hệ thần kinh

và hệ sinh sản (Angelo, 2010)

Theo Bộ Tài nguyên và Môi trường (TN-MT), ngưỡng dioxin cho phép trong vùng đất và trầm tích bị ô nhiễm nặng dioxin tương ứng là 1.000 và 150 ng TEQ/kg đất Cao hơn mức độ này, khu vực đó cần được khoanh vùng, xử lý và hạn chế hay ngừng hoàn toàn việc tiếp xúc của người, động vật cũng như các hoạt động canh tác nông nghiệp, thủy sản (QCVN2012/BTNMT)

Tóm lại, các hợp chất hữu cơ chứa clo mà đặc biệt là các hợp chất đa vòng thơm

có thể gây các bệnh về da, nội tiết, thần kinh, tim mạch, tiêu hóa cho con người Chúng có thể di truyền cho nhiều thế hệ sau qua sinh sản, thậm chí gây tử vong và là nguyên nhân gây một số bệnh ung thư Trong môi trường, chúng tồn tại bền vững qua nhiều năm, gây ô nhiễm đất, nước ngầm, trầm tích, được tích lũy qua các mắt xích của chuỗi thức ăn vào các động thực vật khác và cuối cùng là vào con người

1.2 Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo

1.2.1 Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo trên thế giới

Trên thế giới đã có nhiều biện pháp để kiểm soát tốc độ thải ra môi trường của các chất hữu cơ chứa clo nhưng các chất độc này vẫn được thải ra môi trường rất

nhiều, gây ô nhiễm đất và bùn trầm trọng (Fennell, 2004) Tính đến năm 2003,

trong môi trường có khoảng 3.500 chất hữu cơ chứa clo có nguồn gốc tự nhiên và từ các hoạt động sống của con người (Smidt, 2004) Theo EPA, chỉ tính riêng năm

2001 đã có 150 kg dioxin và các hợp chất tương tự dioxin, 1,13 triệu kg PCB và 16.000 kg hexachlorobenzene (HCB) giải phóng vào môi trường do các hoạt động công nghiệp (EPA, 2006) Tổng số PCB thải vào môi trường trên toàn thế giới tính

đến năm 2003 là 900-1800 triệu kg (Fennell, 2004) Theo Wagner và đtg (Wagner,

2009), tổng số PCDD/Fs trong khí quyển trên toàn thế giới hàng năm vào khoảng 13.000 kg/yard Lượng các chất PCB và PCDD gây ô nhiễm các thủy vực ở Mỹ khoảng 1,2 tỷ m3 (Fennell, 2004) Theo Tas và đtg (Tas, 2009), các hợp chất hữu cơ

chứa clo là các chất gây ô nhiễm môi trường với phạm vi rộng nhất Từ những năm

1980, hàng nghìn tấn HCB được sử dụng làm chất diệt cỏ, diệt nấm, chất bảo quản

gỗ và sản xuất thuốc nhuộm Do HCB có độ độc rất cao nên nó đã bị cấm sử dụng trên toàn thế giới Tuy nhiên, HCB vẫn bị thải vào môi trường hàng năm do các quá trình hóa học xảy ra không kiểm soát được như quá trình đốt cháy không hoàn toàn HCB gây ô nhiễm sông, hồ, biển gần các khu vực có công nghiệp phát triển Nồng

độ HCB trong đất cao nhất là ở Châu Âu (Tas, 2009) Hàng năm, có khoảng 3,9.105

tấn PCB bị thải ra môi trường trên toàn thế giới (Angelo, 2010) Ở nhiều khu vực biển và hệ thủy vực nước ngọt thuộc Bắc Mỹ, Châu Âu và Nhật Bản chứa PCDD với nồng độ từ 36 đến 8.560 g/kg (Ewald, 2007) Tại vịnh Thurston và vịnh Napoleon cũng phát hiện được 15 đồng phân PCDD/Fs và 11 chất PCB giống dioxin với tổng độ độc cao nhất từ 44 đến 136 pg TEQ/g đất khô (Ssebugere, 2013) Ngoài ra, tại các nhà máy sản xuất và sử dụng PCE, TCE cũng bị ô nhiễm các chất này ở phạm vi và nồng độ lớn

Hai hợp chất 2,4-D và 2,4,5-T là thành phần của chất diệt cỏ cũng đã được sử dụng ở rất nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là sử dụng trong chiến tranh Việt Nam, gây ô nhiễm đất và trầm tích trầm trọng Ở những năm 40 - 50 của thế kỷ trước, công nghệ sản xuất chất diệt cỏ còn lạc hậu nên sản phẩm phụ của quá trình sản xuất là dioxin có hàm lượng rất cao Ngày nay, công nghệ và khoa học hiện đại đã làm giảm đi rất nhiều tạp chất của quá trình sản xuất này Tuy hai chất diệt cỏ trên

và nhiều hợp chất hữu cơ chứa clo là thành phần của thuốc bảo vệ thực vật đã bị cấm sử dụng ở nhiều nước trong đó có Việt Nam nhưng một số nước vẫn còn sử dụng trong nông nghiệp (Bộ TN-MT, 2006, Nguyen, 2007)

1.2.2 Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo ở Việt Nam

1.2.2.1 Ô nhiễm các hợp chất hữu cơ nói chung

Ở Việt Nam, tại các nhà máy sản xuất thuốc trừ sâu, thuốc bảo vệ thực vật (Nhà máy Hóa chất Lâm Thao), sản xuất giấy (Nhà máy Giấy Bãi Bằng) cũng bị ô nhiễm trầm trọng các chất hữu cơ chứa clo này Theo các số liệu đã công bố (Bộ TN-MT,

2006), Việt Nam còn khối lượng dầu có chứa PCB có thể lên tới 19.000 tấn, chủ yếu

từ các máy biến thế điện kiểu cũ Tổng lượng chất thải nguy hại ước tính năm 2003 là 160.000 tấn mỗi năm, trong đó 130.000 tấn từ các chất thải công nghiệp, 21.000 tấn

từ các chất thải y tế của các bệnh viện, trạm xá, viện điều dưỡng và 8.600 tấn từ sản xuất nông nghiệp Việt Nam đã và đang sử dụng khoảng 300 loại thuốc trừ sâu, 200 loại thuốc trừ bệnh, gần 150 loại thuốc trừ cỏ, 6 loại thuốc diệt chuột và 23 loại thuốc kích thích sinh trưởng cây trồng Các hoá chất bảo vệ thực vật này nhiều về cả số lượng và chủng loại, trong đó có một số loại thuộc danh mục cấm sử dụng, hạn chế

sử dụng và hết hạn sử dụng

Các chất hữu cơ ô nhiễm khó phân huỷ sử dụng trong nông nghiệp chủ yếu là DDT và HCB hiện còn ở các địa phương chờ được xử lý, còn trong công nghiệp phần lớn là PCB Các hợp chất này đều có tính bền vững và nguy hại đối với môi trường và con người nên đã bị cấm sử dụng (Bộ TN-MT, 2006)

Trong những năm 1961-1971, quân đội Mỹ đã rải xuống miền Trung và miền Nam Việt Nam hàng trăm triệu lít chất diệt cỏ có chứa dioxin Mặc dù chất diệt cỏ được tồn chứa và phân phối cho các vụ phun rải đã trải qua hơn 40 năm nhưng hàm lượng của chúng ở ba sân bay quân sự cũ là Biên Hòa, Đà Nẵng và Phù Cát vẫn ở mức cao và rất cao Mức độ ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sẽ được trình bày chi tiết dưới đây

1.2.2.2 Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Biên Hòa

Sân bay Biên Hòa được chia làm 3 khu vực có mức độ ô nhiễm khác nhau

* Khu vực Nam sân bay: nhiều vị trí có nồng độ dioxin lớn hơn 1.000 ppt trong

* Khu vực Z1: Kết quả phân tích cho thấy nồng độ TCDD tăng dần theo độ sâu:

ở độ sâu 0-30 cm nồng độ TCDD là 36.800 ppt, độ sâu 30 – 60 cm nồng độ là

144.000 ppt, độ sâu 60 – 90 cm nồng độ là 259.000 ppt, độ sâu 150 – 180 cm nồng

độ là 184.000 ppt Hàm lượng TCDD chiếm tới 99% tổng độ độc trong tất cả các mẫu lấy tại khu vực này (Hatfield, 2011) Đây là khu vực có các lô xử lý bằng biện pháp phân hủy sinh học của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Trong lô xử lý 3.384 m3, tổng độ độc trước khi xử lý dao động khoảng 10.000 ng TEQ/kg đất (Đặng Thị Cẩm Hà, 2012)

1.2.2.3 Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Đà Nẵng

* Trong Báo cáo tổng kết của Văn phòng 33 cho thấy khu vực ô nhiễm tại đầu Bắc sân bay (khu vực pha trộn và đóng nạp) có nồng độ TCDD cao nhất xác định được là 361.000 ppt ở độ sâu từ 0 – 10 cm và tỷ lệ đồng phân 2,3,7,8-TCDD chiếm tới trên 99% Ở độ sâu từ 10 – 30 cm, nồng độ TCDD là 330.000 ppt và những mẫu khác ở khu vực này nằm trong khoảng 1.190 đến 36.800 ppt (Báo cáo tổng thể, 2011) Đây là khu vực mà Viện Công nghệ sinh học đã tiến hành xử lý thử nghiệm ở quy mô 10 m3 và 100 m3 bằng biện pháp chôn lấp tích cực Tổng độ độc ban đầu trong đất dao động khoảng 899 – 365.000 ppt TEQ, trung bình khoảng 105.080 ppt TEQ Tổng độ độc của mẫu trầm tích tại hồ A dao động khoảng 68,6 – 6.820 ppt TEQ (Báo cáo tổng thể, 2011)

* Ở khu vực phía Nam sân bay, nồng độ TCDD cao nhất phân tích được là 20.600 ppt ở độ sâu 0-10 cm nhưng tỷ lệ đồng phân 2,3,7,8-TCDD chỉ chiếm có 65% Ở các độ sâu lớn hơn nồng độ TCDD vẫn cao, ở độ sâu 10-30 cm nồng độ TCDD dao động trong khoảng 3.500 đến 5.120 ppt và tỷ lệ đồng phân 2,3,7,8-TCDD chiếm 68,4% Ở độ sâu 30-115 cm, nồng độ TCDD giảm dần theo độ sâu từ

123 đến 4,15 ppt

* Tại khu vực đóng thùng khi thu hồi, các mẫu phân tích trên bề mặt với độ sâu

từ 0-10 cm nằm trong khoảng 5,2 ppt đến 99,7 ppt và tỷ lệ đồng phân độc TCDD chiếm trên 80% Tại khu pha trộn và đóng nạp, nồng độ chất ô nhiễm vẫn ở mức độ cao và nằm trong khoảng 64 đến 11.700 ppt Tất cả các mẫu tại khu vực này

2,3,7,8-có tỷ lệ đồng phân 2,3,7,8-TCDD chiếm tỷ lệ cao 94,9 - 95,7 % (Hatfield, 2009)

1.2.2.4 Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Phù Cát

Khu vực nhiễm độc và hướng lan tỏa trong sân bay Phù Cát có nồng độ ô nhiễm giảm dần theo độ sâu và được chia thành các khu sau:

* Khu nhiễm độc cao: khu chứa chất độc hóa học và nạp chất độc lên phương tiện phun rải Khu vực này có độ ô nhiễm cao nhất với nồng độ khoảng 11.400 – 49.500 ppt

* Khu rửa phương tiện (sau khi phun rải chất phát quang): khu vực này có độ ô nhiễm thấp nhất, chỉ 18 - 270 ppt

* Khu vùng đệm: vùng đệm nằm trên vùng đất từ khu chứa, nạp rửa đến cửa cống qua đường liên khu chảy vào hồ A và có nồng độ ô nhiễm 210 – 2450 ppt

1.3 Phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo

Nhiều nghiên cứu về quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo đã được công bố Trong phần này sẽ đề cập chi tiết về cơ chế phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo bởi VSV, các nghiên cứu về phân hủy chất diệt cỏ, dioxin bởi các VSV hiếu khí và kỵ khí

1.3.1 Cơ chế phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo

Có 4 con đường phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo bởi các

VSV hiếu khí và kỵ khí (Reineke, 2001; Fennell, 2004; Yoshida, 2005) như sau:

(i) Oxy hóa cắt vòng thơm bởi các enzyme hydrocarbon dioxygenase vòng thơm của các VSV hiếu khí

(ii) Loại clo của các sản phẩm cắt vòng bởi các VSV hiếu khí (Hình 1.2) (iii) Phân hủy nhờ xúc tác bởi các enzyme ngoại bào như laccase, mangan peroxidase (MnP), lignin peroxidase (LiP) chủ yếu do nấm và xạ khuẩn sinh ra (Hình 1.3)

(iiii) Loại khử clo bởi các VK KK (Hình 1.4)

Dưới đây là các cơ chế chuyển hóa bởi một số đại diện của một số nhóm VSV khác nhau đã được chứng minh

Hình 1.2 Quá trình loại clo sản phẩm cắt vòng của lindane và pentachlorophenol ở

điều kiện hiếu khí (Reineke, 2001)

Quá trình loại clo ở VSV hiếu khí đối với các hợp chất hữu cơ vòng thơm chứa nhiều clo xảy ra theo hai cơ chế là cơ chế loại clo sớm và cơ chế loại clo muộn Ở cơ chế loại clo sớm, các hợp chất hữu cơ vòng thơm chứa nhiều clo được tạo thành các hợp chất vòng thơm không chứa hoặc chứa rất ít clo, sau đó các hợp

chất này bị phân hủy theo con đường ortho hay meta và cuối cùng đi vào chu trình

Krebs Cơ chế loại clo muộn sẽ tạo ra các hợp chất đã bị cắt vòng vẫn chứa clo như chlorocatechol, chloroprotocatechuate hay chlorohydroquinone Sau đó, các hợp

chất này bị phân hủy theo con đường ortho biến đổi (Reineke, 2001) (Hình1.5)

Khác với vi khuẩn, nấm không sử dụng các hợp chất hữu cơ vòng thơm chứa clo làm nguồn carbon và năng lượng mà quá trình phân hủy các hợp chất này xảy ra nhờ một hệ thống enzyme ngoại bào được tiết ra môi trường bao gồm phenol oxidase, LiP, MnP và laccase ở các nấm phân hủy gỗ Các enzyme này có phổ đặc hiệu cơ chất rộng, chúng có thể xúc tác quá trình phân hủy các hợp chất như

chloroaniline, chlorobenzene, chlorophenol, chlorobiphenyl hay dibenzo-p-dioxin

Các chủng nấm có khả năng sinh enzyme ngoại bào phân hủy các hợp chất này bao

gồm chi Phenarochaete, Pleurotus, Trametes, Sphingomonas, Cordyceps, Pennicilium v.v (Reineke, 2001, Cvančarová, 2013)

Hình 1.3 Con đường phân hủy 2,4-DCP bởi nấm Phanerochaete chrysosporium

(Reineke, 2001) LiP/MnP: sự tham gia của 1 hay cả 2 enzyme LiP và MnP

Hình 1.4 Các con đường loại khử clo của 1,2,3,4-TCDD (A) và 1,2,3,7,8-PeCDD

(B) ở chủng D.mccartyi CBDB1 (Hiraishi, 2003)

Ở điều kiện kỵ khí, quá trình loại khử clo là quá trình phân hủy hay chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo xảy ra nhờ các enzyme nội bào trong điều kiện thiếu oxy và hoàn toàn không có oxy Quá trình này xảy ra với các chất chứa nhiều

clo nhanh hơn các hợp chất chứa ít clo và có tính chọn lọc với các hợp chất, chi và loài vi khuẩn Vị trí các nguyên tử clo trong phân tử cũng ảnh hưởng đến quá trình loại khử clo Ví dụ, quá trình loại khử clo của monochlorobenzoate sẽ ưu tiên ở vị

trí meta-, rồi đến vị trí para- và cuối cùng là vị trí ortho- nhưng quá trình loại khử clo của các hợp chất chứa nhiều clo lại ưu tiên ở vị trí para- hay nguyên tử clo nằm

giữa hai nguyên tử clo khác trong phân tử (Reineke, 2001)

Các VK KK tham gia vào quá trình loại khử clo cũng khá đa dạng, bao gồm

nhóm VK KSF (Desulfovibrio, Desulfitobacterium, Desulfomonile) và một số VK khác (Dehalobacter, Dehalococcoides, Dehalogenimonas) Quá trình loại khử clo của một số hợp chất đa vòng thơm ở D mccartyi CBDB1 được trình bày ở Hình 1.4

Hình 1.5 Sơ đồ khoáng hóa các hợp chất chứa clo vòng thơm với hợp chất trung gian là

chlorocatechol (Reineke, 2001)

Các cơ chế phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo đã trình bày (Hình 1.2 – 1.5) cho ta thấy tiềm năng và sự loại bỏ clo ở những hợp chất này bởi những VSV khác nhau trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí Ở mỗi con đường đều có

sự tham gia của các đại diện thuộc rất nhiều chi VSV khác nhau Cho đến nay, các nhà khoa học cần rất nhiều nghiên cứu sâu sắc bằng các công nghệ cao, hiện đại mới

có thể làm rõ hiệu quả phân hủy và cơ chế phân hủy các hợp chất clo Quá trình phân hủy sinh học có thể triệt để chỉ khi trong công nghệ xử lý có sự kết hợp nhiều cơ chế khác nhau Quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo thường tạo ra hợp chất trung gian là chlorocatechol như ở Hình 1.5 Quá trình chuyển hóa hoàn toàn các hợp chất hữu cơ chứa nhiều clo có thể được tóm tắt trên Hình 1.6 Qua một số cơ chế phân hủy và chuyển hóa các hợp chất chứa clo ở trên, một lần nữa khẳng định vai trò của việc kết hợp nhiều nhóm VSV hiếu khí và kỵ khí trong quá trình chuyển hóa hay khoáng hóa hoàn toàn các hợp chất hữu cơ chứa clo, trong đó không thể không có sự tham gia của các VK KK hô hấp loại khử clo

Hình 1.6 Con đường phân hủy hoàn toàn PCDD/Fs bởi các quần xã VK trong quá trình

phân hủy sinh học (Hiraishi, 2003)

Trong quá trình phân hủy sinh học các chất hữu cơ chứa clo, quá trình loại khử clo là bước mở đầu, bước khử độc ở điều kiện kỵ khí tạo điều kiện cho sự khoáng hóa hoàn toàn các hợp chất này ở điều kiện hiếu khí Tuy nhiên, một số VSV vẫn có khả

năng chuyển hóa hay phân hủy các hợp chất như 2,4-D, 2,4,5-T trong điều kiện hiếu khí Để có bức tranh tổng thể về quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu

cơ chứa clo nói chung và các hợp chất dioxin nói riêng, sự đa dạng các VSV tham gia vào quá trình chuyển hóa, phân hủy chất diệt cỏ/dioxin ở điều kiện hiếu khí và vai trò của các VK KK trong quá trình loại khử clo sẽ được đề cập

1.3.2 Phân hủy hiếu khí chất diệt cỏ/dioxin

1.3.2.1 Phân hủy hiếu khí các chất diệt cỏ chlorophenoxy

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về phân hủy hiếu khí các hợp chất chứa clo nói chung, các chất là thành phần chính của chất diệt cỏ như 2,4-D, 2,4,5-T nói riêng Các nhân tố ảnh hưởng đến phân hủy sinh học 2,4-D, 2,4,5-T bao gồm nồng độ, cấu trúc hóa học, mức độ đa dạng VSV, độ ẩm, nhiệt độ, pH, nồng độ oxy và các điều kiện địa hóa thổ nhưỡng khác (Picton, 2004)

Chuyển hóa 2,4-D bởi dioxygenase phụ thuộc -ketoglutarate do gene tfdA mã hóa

đã được nghiên cứu ở chủng Cupriavidus necator JMP134 (Fukumori, 1993) Các

VSV phân hủy 2,4-D đã được tìm thấy trong một số loại đất, bùn, vùng nước hiếu khí gần bề mặt, phân ủ, bùn hoạt tính, hồ và sông 2,4-D được chuyển hóa thành 2,4-DCP

và sau đó được oxy hóa đến 3,5-dichlorocatechol Quá trình phân hủy 2,4-D được thực

hiện bởi các VK Arthrobacter, Pseudomonas, Cupriavidus (tên cũ Alcaligenes hoặc Ralstonia), Flavobacterium, Burkholderia (tên cũ Pseudomonas), Halomonas và Variovorax thuộc lớpß và γ-Proteobacteria (Itoh, 2004)

Một số nghiên cứu về phân hủy 2,4-D và 2,4-DCP bởi nấm sợi đã được ghi nhận Ryan và Rumbus (1989) nghiên cứu về quá trình khoáng hóa 2,4,5-T bởi nấm

đảm P chrysosporium BKM-F-1767 trong điều kiện nuôi cấy lỏng và trong đất

Vroumsia và đtg (2005) đã nghiên cứu chi tiết về khả năng phân hủy D và

2,4-DCP bởi các loài nấm Aspergillus penicilloides, Mortierella isabellina, Chrysosporium pannorum và Mucor geneevensis

2,4,5-T khó bị phân hủy hơn và các nghiên cứu về phân hủy sinh học hợp chất này ít hơn so với 2,4-D Chủng VK sử dụng 2,4,5-T được nghiên cứu đầy đủ nhất là

Burkholderia phenoliruptrix AC1100 (tên cũ Pseudomonas cepacia AC1100) (Kitagawa,

2002) Một số chủng VK khác sử dụng 2,4,5-T như Nocardioides simplex 3E, Stenotrophomonas maltophilia (Mai, 2001), Burkholderia sp JR7B3 (Rice, 2005), Raoultella planticola (Zharikova, 2006)

Tại Việt Nam, một số nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu các chủng hay quần xã VSV có khả năng sinh trưởng và sử dụng 2,4-D, 2,4,5-T là nguồn carbon theo cơ chế đồng trao đổi chất (Kiều Hữu Ảnh, 2003; Hoàng Thị Mỹ Hạnh, 2004;

Đặng Thị Cẩm Hà, 2005; La Thanh Phương, 2005; Lê Văn Nhương, 2005) Các kết

quả nghiên cứu sẽ được trình bày chi tiết ở phần cuối của chương này nhằm làm sáng tỏ mục tiêu và các đóng góp của luận án

1.3.2.2 Phân hủy hiếu khí các hợp chất dioxin

Theo Field (2008), trong số các nghiên cứu về VK phân hủy các hợp chất PCDD và PCDF có tới 84% kết quả nghiên cứu công bố về phân hủy hiếu khí các hợp chất dioxin chứa 1 hoặc 2 clo Hiện nay, phân hủy sinh học các dioxin chứa ba hay bốn clo đang được quan tâm nghiên cứu Nhìn chung, quá trình phân hủy sinh học của các hợp chất dioxin chứa clo tăng lên khi số nguyên tử clo trong phân tử giảm Các hợp chất PCDD/F chứa 5 nguyên tử clo hoặc nhiều hơn khó bị phân hủy sinh học hiếu khí do độ độc của các hợp chất tăng cùng với số nguyên tử clo trong phân tử Nghiên cứu của Cermiglia (1979), Klecka (1980) cho thấy, dibenzo-dioxin (DD), dibenzo-furan (DBF) và các chất tương tự chứa clo được chuyển hóa đầu tiên

đến các hợp chất dạng cis-dihydroxylate bởi các VK Pseudomonas và Beijerinckia

spp Phân hủy naphthalene và biphenyl bởi VK không triệt để và tạo ra các sản phẩm “ngõ cụt” Phản ứng oxy hóa kép vị trí bên tạo ra DBF đã được hydroxylate hóa và sản phẩm này được chuyển hóa tiếp thông qua quá trình cắt vòng ở vị trí

meta để tạo ra chất chuyển hóa phân cực màu vàng và hấp thụ cực đại ở bước sóng

khoảng 460 nm Một số VK oxy hóa kép vị trí bên của dioxin và các hợp chất tương

tự bao gồm Novosphingobium aromaticivorans IFO15084, N stygium IFO 16085,

N sunterraneum IFO 16086, Porphyribacter sanguineus IAM 12620T, Sphingobacterium yanoikuyae B1, B cepacia F297, B cepacia ET4, Ralstonia sp SBUG290, Pseudomonas sp HL7b v.v Kubota và đtg (2005) đã phân lập 7 chủng

VK Nocardioides aromaticivorans sử dụng DBF Các chủng VK này tạo ra các chất

chuyển hóa màu vàng không hòa tan, hấp thụ cực đại ở bước sóng từ 400 đến 507

Chủng nấm Cerrena sp F0607 có khả năng phân hủy

2,4,8-trichlorodibenzo-p-furan ở nồng độ 10 mg/l trong đó phát hiện được cả 3 loại enzyme ngoại bào phân

hủy lignin (Hidayat, 2013) Nấm Pleurotus ostreatus có khả năng phân hủy penta-,

hexa-chlorobiphenyl Trong môi trường nuôi cấy phát hiện được phức hệ enzyme tham gia vào quá trình phân hủy các hợp chất vòng thơm như enzyme ngoại bào (ligninolytic enzyme) và enzyme nội bào (cytochrome P450 monooxygenase, arylalcohol dehydrogenase, arylaldehyde dehydrogenase) (Cvančarová, 2013) Một số VK khác có cả hai quá trình oxy hóa kép ở vị trí bên và vị trí góc của

các dioxin như VK biển Cycloclasticus pugetti, Comamonas sp KD7, Rhodococcus

sp NCIMB 12038, Rhodococcus opacus SAO 101 (Chang, 2008) và Rhodococcus

sp HA01 (Aly, 2008)

Theo Habe, chủng Rhodococcus opacus SAO101 có khả năng sử dụng MCDD, 2,3-DCDD, 2,7-DCDD; chủng Terrabacter sp DBF63 có khả năng sử dụng 2-MCDD, 2,3-DCDD (Habe, 2001) Theo Aly, chủng Rhodococcus sp HA01 có thể

1-sử dụng DD là nguồn carbon duy nhất nhưng các tế bào sinh trưởng trên DBF có thể

chuyển hóa DD, 2-CDBF và 3-CDBF (Aly, 2008) Chủng P veronii PH03 phân hủy

được 90,7% DD, 79,7% DBF, 88,3% 1-MCDD và 78,6% 2-MCDD sau 60 giờ nuôi cấy với nồng độ ban đầu của các chất là 1 mM (Hong, 2004)

Ở Việt Nam, một số chủng VSV phân lập từ đất hoặc bùn ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin có khả năng sử dụng DBF và sinh trưởng trên môi trường chứa DD, 2-

MCDD như nguồn carbon đồng trao đổi chất Tuy nhiên, các kết quả chi tiết sẽ được trình bày ở phần cuối của chương này

1.3.3 Phân hủy kỵ khí chất diệt cỏ/dioxin

Trong nhiều thập niên qua, quá trình phân hủy kỵ khí các hợp chất hữu cơ chứa clo đã và đang được quan tâm nghiên cứu Nhiều VK KK sử dụng các chất ô nhiễm chứa clo là các chất nhận điện tử trong quá trình hô hấp và được gọi là VK

KK hô hấp loại clo hoặc hô hấp clo (Hiraishi, 2008) Tuy nhiên, số lượng các

nghiên cứu loại khử clo vẫn ít hơn nhiều so với nghiên cứu phân hủy sinh học dioxin, các chất tương tự dioxin và các sản phẩm trung gian của quá trình phân hủy theo cơ chế oxy hóa

1.3.3.1 Phân hủy sinh học kỵ khí các chất diệt cỏ chlorophenoxy

Các VSV tham gia vào quá trình loại khử clo rất đa dạng, chủ yếu thuộc ba

ngành chính là Chloroflexi, Firmicute và Proteobacteria (Hiraishi, 2008; Maphosa,

2010) Nghiên cứu đầu tiên về loại khử clo là quá trình chuyển hóa 2,4,5-T thành

2,5-D bởi quần xã VSV chuyển hóa 3-chlorobenzoate (Suflita, 1984) Theo Bryant

(Bryant, 1992), phân hủy 2,4,5-T được bắt đầu bởi sự loại một nguyên tử clo thành 2,5-D trong mẫu bùn và trầm tích Tuy nhiên, trong các quần xã VSV, quá trình loại khử clo thường xảy ra ở các vị trí bên và 2,4,5-TCP được phát hiện là sản phẩm

đầu tiên của quá trình chuyển hóa kỵ khí 2,4,5-T (Mitsevich, 2000, Nguyen, 2007) Phân hủy 2,4-D chủ yếu bắt đầu bởi sự loại bỏ nguyên tử clo ở vị trí bên (Boyle,

1999a) Quá trình chuyển hóa 2,4-D đến 4-chlorophenoxyacetate cũng đã được

phát hiện (Warner, 2002) Quá trình phân hủy 2,4-DCP ở điều kiện kỵ khí trong các

mẫu trầm tích nước ngọt cũng đã được công bố (Zhang,1990) Trong các quần xã

VK, loại khử clo của các chlorophenol tạo thành từ các chlorophenoxyacetate

thường được bắt đầu bởi phản ứng loại một clo ở vị trí ortho, kết quả là làm tăng

lượng 3,4-dichlorophenol từ 2,4,5-T (Mikesell, 1985; Gibson, 1990), chlorophenol từ 2,5-D (Bryant, 1992; Nguyen, 2007) hoặc 4-chlorophenol từ 2,4-D

3-(Warner, 2002)

1.3.3.2 Phân hủy kỵ khí các hợp chất dioxin

Townsend (Townsend, 1983) đã có nghiên cứu đầu tiên về sự thay đổi các dạng dioxin và sự tích lũy các dạng ít clo trong các mẫu trầm tích Loại khử clo của các hợp chất dioxin bởi VSV đã được phát hiện trong trầm tích, bùn và đất nhiễm

những hợp chất này (Vargas, 2001; Yoshida, 2005; Hiraishi, 2008) Kết quả nghiên cứu của Bunge và đtg cho thấy chủng Dehalococcoides mccartyi CBDB1 có khả

năng loại khử clo của 1,2,3,4-TCDD và 1,2,3,7,8-PeCDD (Bunge, 2003) Chủng

thuần D mccartyi 195 hay quần xã VK có mặt chủng này có khả năng loại khử clo của

1,2,3,4-TCDD tạo ra 1,2,4-TrCDD, 1,3-DiCDD, loại clo của HCB tạo ra 1,2,3,5-TCB, loại clo của 2,3,4,5,6-pentachlorobiphenyl thành 2,3,4,6-TCB, 1,3,5-TrCB, loại clo của 1,2,3,4-tetrachloronaphthalene tạo ra các đồng phân dichloronaphthalene chưa xác định (Fennell, 2004) Việc bổ sung 1,2,3,4-TCB và 2,3,4,5-tetrachloroanisole đã tăng cường quá trình loại clo của 1,2,3,4-TCDD và TCDF của VSV trong các trầm tích (Hiraishi, 2008) Theo Bunge, các mẫu làm giàu VK KK từ bùn có khả năng loại clo 1,2,4-TrCDD và 1,2,3-TrCB tới 1,3-DCB Ngoài ra, trong quá trình loại khử clo, số

VK loại khử clo đã tăng 4 lần so với ban đầu và đạt 11% số lượng VK tổng số có mặt

trong mẫu làm giàu ở cuối chu kỳ nuôi cấy (Bunge, 2008) Các VK Dehalococcoides

có khả năng loại khử clo của các hợp chất hữu cơ chứa nhiều clo thành các hợp chất chứa ít clo như các đồng phân chứa 1-2 nguyên tử clo Các hợp chất này sẽ bị các VSV hiếu khí phân hủy tiếp bằng cách cắt khung carbon (Bunge, 2009)

1.4 Đa dạng các vi khuẩn tham gia hô hấp loại khử clo

Các VK KK hô hấp loại khử clo rất đa dạng và được chia thành 3 nhóm Trong phần này sẽ trình bày chi tiết về đặc điểm của các VK hô hấp loại khử clo nói chung và đặc điểm, đại diện của từng nhóm nói riêng

1.4.1 Đặc điểm chung của các vi khuẩn hô hấp loại khử clo

Đã có nhiều bằng chứng về VK KK tham gia hô hấp loại clo đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa và loại độc tố của các hợp chất hữu cơ chứa clo như chloroethene, chlorobenzene, chlorophenol, PCB, PCDD/Fs Theo công bố của một số

tác giả thì các VK tham gia loại khử clo thuộc 3 ngành chính là Firmicutes (VK Gram

dương có tỷ lệ G + C thấp), Proteobacteria (bao gồm  - và δ- Proteobacteria) và Chloroflexi (Hình 1.7) (Smidt, 2000, 2004; Hiraishi, 2008; Richardson, 2013)

(i) Các đại diện của ngành Firmicutes bao gồm các chi Desulfitobacterium, Dehalobacter, Clostridium, Acetobacterium có khả năng loại khử clo của các hợp chất hữu cơ mạch thẳng, vòng thơm hay cả hai

(ii) Các đại diện của ngành Proteobacteria bao gồm các chi Desulfuromonas, Desulfomonile, Desulfovibrio, Dehalospirillum và một số chi khác như Sulfurospirillum, Anaeromyxobacter, Geobacter, Pseudomonas, Shewanella v.v (Suyama, 2001; Rowe, 2008; Richardson, 2013; Kranzioch, 2013)

(iii) Các đại diện của ngành Chloroflexi bao gồm các chi Dehalococcoides, Dehalobium và Dehalogenimonas Đây là các chi VK có khả năng loại clo của rất

nhiều hợp chất chứa clo vòng thơm, đa vòng thơm và mạch thẳng (Hiraishi, 2008;

Richardson, 2013; Kranzioch, 2013) Ngoài ra, rất nhiều VK thuộc ngành Chloroflexi

không nuôi cấy được cũng có mặt trong các khu vực ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo (Nguyễn Bá Hữu, 2009; Đào Thị Ngọc Ánh, 2013)

Dựa vào đặc tính sinh lý về khả năng loại khử clo, các VK có khả năng hô hấp loại khử clo được chia thành ba nhóm là nhóm hô hấp loại khử clo bắt buộc, nhóm hô hấp loại khử clo không bắt buộc và nhóm loại khử clo đồng trao đổi chất (Hiraishi, 2008)

(a) VK hô hấp loại khử clo không bắt buộc là nhóm có khả năng loại khử clo của các hợp chất chứa clo để sinh năng lượng trong quá trình hô hấp (Hiraishi, 2008) Tuy nhiên, các VK nhóm này vẫn có thể tổng hợp năng lượng khi được nuôi cấy trên các cơ chất hữu cơ không chứa clo khác như hydrocarbon, 2,4,6- trinitrotoluene, 2,4-dinitro-toluene, hexahydro-1,2,3-trinitro-1,3,5-triazine và có thể

là một số hợp chất vô cơ như muối sulfate, thiosulfate, nitrate, nitrite, Mn2+, Fe2+(Barton, 2007) Nhóm này thường có kiểu trao đổi chất đa dạng, dễ nuôi cấy và phân lập Hầu hết các VK KSF thuộc nhóm này Theo một số tác giả (Hiraishi, 2008; Maphosa, 2010; Richardson, 2013), nhóm hô hấp loại khử clo không bắt buộc

bao gồm các loài thuộc chi Anaeromyxobacter, Desulfomonile, Desulfovibrio, Desulfomonas, Geobacter, Sulfurospirillium, Desulfitobacterium

(b) VK hô hấp loại clo bắt buộc là nhóm VK có kiểu sống bị giới hạn, tổng hợp năng lượng cho sinh trưởng từ quá trình loại khử clo của các hợp chất vòng thơm hay mạch thẳng chứa clo với H2 là chất cho điện tử Tất cả các chủng đã phân lập được đều là VK sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ và pH trung tính, sống trong môi trường đất, nước ngọt và nước biển (Hiraishi, 2008) VK hô hấp loại clo

bắt buộc gồm các loài thuộc chi Dehalobacter, Dehalococcoides, Dehalobium, Dehalogenimonas và một số đại diện thuộc ngành Chloroflexi không nuôi cấy

Nhóm VK này thường là kỵ khí bắt buộc và chỉ sử dụng năng lượng sinh ra từ quá trình loại khử clo cho hô hấp và sinh trưởng Nhóm này rất khó phân lập và nuôi cấy ở dạng chủng thuần Tuy nhiên, nhóm VK này có tiềm năng để xử lý các chất ô nhiễm hữu cơ chứa clo do chúng chứa rất nhiều bản sao gene chức năng tham gia

vào quá trình loại khử clo (Krajmalnik-Brown, 2005; Lee, 2006; Richardson, 2013)

(c) Nhóm loại khử clo đồng trao đổi chất là nhóm VK KK bắt buộc hay không bắt buộc, chúng loại khử clo cùng với quá trình trao đổi chất và sinh năng

lượng Đại diện của nhóm này bao gồm Propionigenium, Pseudomonas, Shewanella, Desulfobacterium, Acetobacterium, Clostridium (Hiraishi, 2008) Đây

là các VK kỵ khí bắt buộc hay không bắt buộc nhưng chúng có thể sống trong điều

kiện hoàn toàn không có oxy Đặc biệt là VK Pseudomonas là VK hiếu khí nhưng

cũng sống được trong điều kiện có rất ít hay hoàn toàn không có oxy

Hình 1.7.Cây phát sinh chủng loại của các VK loại khử clo dựa trên trình tự đoạn

gene 16S rRNA Con số trong ngoặc đơn là mã số trên GenBank (Hiraishi, 2008) O: Các VK loại khử clo bắt buộc F: các VK loại khử clo không bắt buộc

+: Các VK có khả năng loại khử clo đồng trao đổi chất

Khi nghiên cứu quần xã VK KK loại clo từ vị trí ô nhiễm các dung môi hữu

cơ ở West Louisiana Hoa Kỳ cho thấy có 42 dòng VK trong đó Dehalobacter chiếm

25 dòng, Clostridium chiếm 5 dòng, Dehalococcoides chiếm 4 dòng, các chi khác

chiếm ít hơn 3 dòng (Grostern, 2006) Ngoài ra, một số VK sinh metan như

Methanosarcina và acetogene như Acetobacterium, Spomusaovate có thể loại clo

theo cơ chế đồng trao đổi chất (EPA, 2006; Hiraishi, 2008) Trong các mẫu làm

giàu từ sông Dương Tử (Trung Quốc) trên PCE, các VK Dehalobacter, Dehalococcoides, Desulfomonile và Desulfitobacterium có mặt và quá trình loại clo

của PCE xảy ra hoàn toàn tới ethene Tuy nhiên, nếu không có mặt Dehalococcoides thì quá trình loại khử clo chỉ dừng lại ở 1,2-cis-DCE (Kranzioch, 2013)

Ngoài ra, có nhiều VSV hiếu khí khác cũng tham gia loại khử clo của DDT

thành DDD như Proteus vulgaris, E.coli, Enterobacter, Bacillus, Flavobacterium, Cyanobacteria Một số VK hiếu khí khác lại phân hủy DDT theo con đường kỵ khí như Hydrogenomonas, Enterobacter aerogenes, Bacillus, E.coli (Gohil, 2011)

Trong số các VK KK có khả năng hô hấp loại khử clo, VK KSF,

Dehalococcoides và Pseudomonas được nghiên cứu nhiều do đặc tính riêng của chúng Cho đến nay, Dehalococcoides được xem là các “thợ khử” clo, thuộc nhóm

hô hấp loại khử clo bắt buộc còn VK KSF thuộc nhóm loại khử clo không bắt buộc,

dễ nuôi cấy VK Pseudomonas có thể sống trong cả điều kiện hiếu khí hay kỵ khí

không bắt buộc và có khả năng loại khử clo (trong điều kiện kỵ khí) hay chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo (trong điều kiện hiếu khí) Do đó, sự đa dạng các nhóm này sẽ được trình bày ở các tiểu mục sau

1.4.2 Đa dạng vi khuẩn khử sulfate

VK KSF có mặt ở hầu hết các môi trường sinh thái như trong nước biển, nước ngọt và cả trầm tích, đất, đặc biệt là những nơi có nồng độ sulfate cao Các VK KSF là nhóm VK KK sử dụng sulfate làm chất nhận điện tử trong quá trình trao đổi năng lượng (Barton, 2007) Về đặc điểm sinh lý và trao đổi chất, các VK KSF thuộc nhóm loại clo không bắt buộc, có thể sử dụng các hợp chất hữu cơ chứa clo làm chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi hô hấp Tuy nhiên, tại các nơi không có các hợp chất chứa clo, các VK này vẫn tồn tại và có thể sử dụng các hợp chất vô cơ như các muối sulfate, muối thiosulfate hay các hợp chất hữu cơ không chứa clo như 2,4-dinitrotoluene, 2,4,5-trinitrotoluene, hydrocarbon v.v làm chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi hô hấp của chúng Do đó, vai trò của nhóm VK này rất quan trọng trong quá trình phân hủy sinh học các chất ô nhiễm hữu cơ chứa clo hay không chứa clo (Barton, 2007) Trong một quần xã VK KSF thường tồn tại nhiều nhóm VK KSF khác nhau, chúng hỗ trợ nhau trong quá trình sinh trưởng Một số chủng sẽ phân hủy các

chất hữu cơ mạch dài thành acetate, chất này sẽ là nguồn carbon và chất cho điện tử để các chủng khác sinh trưởng (Muyzer, 2008)

Các VK KSF thuộc các chi Desulfitobacterium, Desulfovibrio, Desulfomonile, Desulfuromonas, Desulfobacterium có khả năng loại khử clo của cả các hợp chất

hữu cơ vòng thơm chứa clo (chlorobenzene, chlorophenol) và mạch thẳng (PCE, TCE) (Hiraishi, 2008; Kranzioch, 2013) Trong số các VK KSF có khả năng hô hấp

loại clo, Desulfovibrio là VK KK không bắt buộc, chúng có khả năng sống ở môi trường kỵ khí hay vi hiếu khí Desulfovibrio là VK hô hấp loại halogen, có khả năng loại clo, brom của một số hợp chất halogen hữu cơ (Boyle, 1999b; Sun, 2000; Häggblom, 2006) Đây là chi dễ nuôi cấy và phân lập được trong phòng thí nghiệm

và đã được xác định là có mặt trong lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay

Đà Nẵng (Nguyễn Thị Sánh, 2005) Trên thế giới, chi Desulfovibrio được nghiên cứu khá nhiều về khả năng loại khử clo, brom Chủng Desulfovibrio dechloracetivorans SF3 phân lập từ biển có khả năng loại clo ở vị trí ortho của 2- chlorophenol và 2,6-dichlorophenol tạo ra phenol (Sun, 2000) Desulfovibrio phân

lập từ vùng bùn cửa sông có thể sinh trưởng trên lactate kết hợp với loại khử

halogen của 2,4,6-tribromphenol (Boyle, 1999b) Chủng Desulfovibrio sp 2BP-48

có khả năng khoáng hóa 2-bromophenol kết hợp với quá trình khử sulfate Chủng

2BP-48 này khi đồng nuôi cấy với một chủng Desulfovibrio khác có thể loại khử

halogen của các chất 2-bromophenol, 2,6-dibromo-phenol, 2-iodophenol tạo ra

phenol (Häggblom, 2006) Theo Drzyzga, chủng Desulfovibrio sp TBP1 có khả

năng loại khử brom của các hợp chất chứa brom trong trầm tích biển như 2-bromo-,

4-bromo-, 2,4-dibromo-, 2,6-dibromo- 2,4,6-tribromo-phenol (Drzyzga, 2001) Chi Desulfovibrio và chi Desulfitobacterium cùng tồn tại trong mẫu làm giàu từ đất ô nhiễm PCE và loại clo của hợp chất này đến 1,2-DCE Chi Desulfovibrio chiếm ưu

thế trong môi trường có tỷ lệ SO42-/PCE cao (Drzyzga, 2001) Theo Boyle và đtg, các loài Desulfovibrio gigas, D.africanus, Desulfococcus multivorans có khả năng loại clo của lindane tới benzene và chlorobenzene trong vòng 48 giờ (Boyle, 1995) Desulfitobacterium là chi tiềm năng trong quá trình xử lý các chất ô nhiễm

chứa clo bằng phân hủy sinh học Đây là VK KK bắt buộc, khó nuôi cấy trong

phòng thí nghiệm nhưng lại có khả năng loại khử clo của cả hợp chất chứa clo mạch

thẳng và vòng thơm Chẳng hạn, các chủng Desulfitobacterium sp YT1, Desulfitobacterium sp PCE1, Desulfitobacterium sp DCE-S, D frappieri TCE1,

D hafniense TCE1 cũng có khả năng loại clo của PCE và TCE (Duret, 2012) D dehalogenans loại clo của 2,4-dichlorophenol, PCB, các chloroalkane D chlororespirans Co23 loại clo của 3-chloro-4-hydroxybenzoate, D hafniense DCB2

loại clo của pentachlorophenol, 3-chloro-4-hydroxyphenylacetate,

2,4,6-trichloro-phenol, D metallireducens loại clo của PCE, TCE, dichloroethane và chlorophenol Ngoài ra, chủng D hafniense PCP-1 có thể loại khử clo của pentachlorophnol (PCP) tới 3-chlorophenol và các hợp chất vòng thơm chứa clo ở vị trí ortho-, meta-, para- theo thứ tự như sau: PCP loại khử clo tạo ra 2,3,5,6-tetrachlorophenol

(2,3,5,6-TeCP), sau đó tạo ra 3,4,5-trichlorophenol (3,4,5-TCP), tiếp tục loại khử clo tạo ra 3,5-dichlorophenol (3,5-DCP) và cuối cùng tạo ra 3-CP (Bisaillon, 2010)

Chủng D dichloroeliminans DCA1 loại clo của 1,2-dichloroethane (Marzorati, 2007) Chủng Desulfitobacterium sp Viet1 có khả năng loại clo của chlorophenol

và dichoroethane (Ritalahti, 2004)

Ngoài ra, một số VK KSF thuộc các chi khác cũng có khả năng hô hấp loại clo

như chủng Desulfomonile tiedjei DCB-1 và loài D liminaris loại khử clo của

3-chlorobenzoate tạo thành benzoate (Muyzer, 2008) Các VK có khả năng loại khử PCB được phát hiện ở sông Ohio bị nhiễm PCB với mức độ 0,01-8,5 mg/kg bùn bao

gồm Geobacter, Desulfitobacterium, Desulforomonas, Desulfomonile (Angelo,

2010) Trong mẫu nuôi cấy các VK phân hủy PCE đến ethene cũng có mặt các VK

KSF như Desulfomonile, Desulfitobacterium (Kranzioch, 2013)

Trong quá trình loại khử clo, VK KSF sử dụng các chất như hydro phân tử, formate, acetate làm chất cho điện tử và các chất chứa clo làm chất nhận điện tử cuối cùng để tích lũy năng lượng Các VK KSF có thể khoáng hóa hoàn toàn các chất hữu cơ này khi chúng được nuôi riêng rẽ hay kết hợp với các VSV khác (Barton, 2007) Theo Dar và đtg, quá trình khử sulfate chiếm tới 50% các quá trình

phân hủy chất hữu cơ trong môi trường biển, bùn hồ, khu xử lý nước thải và khu

sản xuất dầu (Dar, 2005)

Về đặc điểm di truyền, dựa vào các cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gene 16S rRNA,

các VK KSF được chia thành 6 nhóm, bao gồm nhóm 1 (Desulfuromaculum), nhóm

2 (Desulfobulbus), nhóm 3 (Desulfobacterium), nhóm 4 (Desulfobacter), nhóm 5 (Desulfococcus, Desulfovibrio, Desulfosarcina, Desulfonema), nhóm 6

(Desulfovibrio, Desulfomicrobium) Cả 6 nhóm đều có đại diện của các chi có khả năng hô hấp loại clo của các hợp chất hữu cơ chứa clo (Boyle, 1995; Reineke, 2001;

Muyzer, 2008; Angelo, 2010) Ngoài 6 nhóm này, nhiều VK KSF khác cũng tham gia loại clo của các hợp chất hữu cơ chứa clo như các đại diện thuộc chi

Desulfitobacterium, Desulfomonas, Desulfomonile (Reineke, 2001; Kranzioch, 2013 )

1.4.3 Đa dạng vi khuẩn Dehalococcoides

Dehalococcoides thuộc nhóm VK hô hấp loại clo bắt buộc, chúng sử dụng khí

H2 làm chất cho điện tử và các chất hữu cơ chứa clo làm chất nhận điện tử để tổng hợp năng lượng cho quá trình sinh trưởng

Dehalococcoides là nhóm VK loại khử clo kỵ khí bắt buộc, có thể sinh trưởng

trên một số cơ chất là các axit hữu cơ như pyruvate, lactate, furmarate, formate v.v

Do Dehalococcoides chỉ sinh trưởng trên nguồn chất cho điện tử là H2 nên chúng thường sống trong quần xã, rất khó nuôi cấy và phân lập ở dạng thuần khiết Khi ở trong quần xã, các VK khác có thể lên men các axit hữu cơ tạo ra H2 là nguồn chất

cho điện tử để VK Dehalococcoides sinh trưởng (Hug, 2012; Löffler, 2013)

Dehalococcoides có thể sinh trưởng ở dải nhiệt độ từ 25-40oC, pH trong khoảng trung tính (Kube, 2005; Seshadri, 2005) Các điều kiện môi trường tối ưu cho nhóm

VK này sinh trưởng là pH 7,2, nhiệt độ 30 + 2oC Dehalococcoides cũng có khả năng

kháng kháng sinh, chúng có thể sinh trưởng trên môi trường chứa ampicillin,

vancomycin với nồng độ 5 mg/l (Bunge, 2008; Cheng, 2009) Quá trình loại clo của Dehalococcoides xảy ra tốt nhất ở pH 6,5-8, nhiệt độ từ 15-35oC nhưng nhiệt độ tối

ưu là 25-30oC Các VK này đều cần vitamin B12 cho quá trình sinh trưởng và loại

khử clo (Löffler, 2013)

Dựa trên trình tự đoạn gene 16S rRNA, lượng nucleotide trung bình trong genome và đặc trưng kiểu hình, 6 chủng đã được xác định đặc điểm (gồm các chủng

195, CBDB1, BAV1, VS, FL2 và GT) được xếp vào cùng 1 loài với tên gọi

Dehalococcoides mccartyi, trong đó chủng D mccartyi 195 là chủng chuẩn của loài

(Löffler, 2013) Tuy nhiên, sơ đồ chuyển hóa PCE trên Hình 1.8 cho thấy các chủng

Dehalococcoides khác nhau ở khả năng loại khử clo của các hợp chất khác nhau

Hình 1.8 Quá trình chuyển hóa PCE tạo ra ethen ở một số VK khác nhau Nét đứt

thể hiện quá trình đồng trao đổi chất, nét liền thể hiện quá trình loại khử clo (Futagami, 2008)

Dựa vào sự khác nhau về trình tự nucleotide ở vùng dễ biến đổi (V2 và V6) trong

trình tự đoạn gene 16S rRNA của VK Dehalococcoides, người ta chia các VK Dehalococcoides thành 3 nhóm là Cornell, Victoria và Pinellas (Henrickson, 2002) Đây cũng là một trong các đặc điểm tạo ra sự đa dạng cho nhóm VK Dehalococcoides Dehalococcoides có thể loại khử clo của cả các hợp chất mạch thẳng, vòng thơm, đa vòng thơm (Hendrickson, 2002; Adrian,2007; Bunge, 2008; Cheng, 2009)

Mặt khác, trong số rất nhiều VK có khả năng loại khử clo của PCE và TCE nhưng

chỉ có Dehalococcoides là nhóm VK có khả năng loại khử clo của PCE, TCE tới hợp

chất ethene hoàn toàn không độc (Hình 1.8) (Futagami, 2008) Trong quần xã VK hô

hấp loại khử clo, khi không có mặt Dehalococcoides thì sản phẩm cuối cùng của quá trình loại khử clo của PCE, TCE là 1,2-cis-DCE (không loại khử hoàn toàn tới ethene) (Kranzioch, 2013) Chủng D mccartyi CBDB1 chứa gene mã hóa cho

enzyme CbrA xúc tác cho quá trình loại clo của 1,2,3,4-TCB và 1,2,3-TeCB, gene

này không có trình tự tương đồng trên genome của chủng D mccartyi 195 (Krajmalnik-Brown, 2005; Wagner, 2009) Chủng D mccartyi CBDB1 chứa nhiều

gene chức năng mã hóa cho enzyme tham gia xúc tác các quá trình loại khử clo nhất nên đây là chủng có khả năng loại khử clo của nhiều hợp chất hữu cơ chứa clo khác nhau Chủng này có khả năng loại khử 1-2 nguyên tử clo dẫn tới con đường loại clo phân nhánh của các hợp chất HCB, pentachlorobenzene, cả 3 đồng phân của TCB, 2 đồng phân của TrCB, DD, pentachlorophenol, 3 đồng phân tetrachlorophenol, 6

đồng phân TCP, 3 đồng phân DCP (Wagner, 2009)

Ngoài ra, các chủng Dehalococcoides khác nhau còn có số lượng bản sao gene rdhA trong genome không giống nhau Có chủng chỉ có 2 bản sao như chủng FL2

nhưng có chủng lại có tới 32 bản sao như chủng CBDB1 Chính sự khác nhau về số

lượng bản sao gene rdhA này mà mỗi chủng có khả năng loại khử clo của các hợp

chất hữu cơ chứa clo khác nhau, có chủng chỉ loại khử clo của hợp chất mạch thẳng nhưng có chủng lại loại khử clo của cả các hợp chất vòng thơm, đa vòng thơm

1.4.4 Đa dạng vi khuẩn Pseudomonas

Chi Pseudomonas được biết đến với khả năng tham gia vào nhiều quá trình

chuyển hóa chất ô nhiễm hay sinh tổng hợp các chất thứ cấp Chúng là nhóm “phàm ăn” nhất trong giới VK Chúng có thể sinh trưởng và hoạt động ở khoảng hiệu điện thế oxy hóa khử rất rộng, trong môi trường với biến động rất lớn, từ cực dương cho

đến cận cực âm Chính vì thế Pseudomonas đóng vai trò rất quan trọng trong quá

trình phân hủy dioxin và các chất tương tự Sau đây là các thông tin liên quan trực tiếp đến khả năng chuyển hóa, phân hủy các hợp chất đa vòng thơm và các hợp chất

halogen Pseudomonas sp PS14 có thể phân hủy 1,2,3,5-TCB với sự tham gia của

các enzyme benzene dioxygenase, chloromuconate cycloisomerase, maleylacetate

reductase (Reineke, 2001) Chủng Pseudomonas sp B13 có khả năng phân hủy

chlorobenzoate, 4-chlorophenol như nguồn carbon duy nhất và sử dụng 2-,

3-chloro-phenol như nguồn carbon đồng trao đổi chất P putida GJ31 phân hủy chlorobenzene tới 3-chlorocatechol P.pickettii loại clo của 2,4,6-TCP thành 2,6- dichlorohydro-quinone (Reineke, 2001) Chủng Pseudomonas sp WR912 có khả năng sinh trưởng trên 3-chloro-, 4-chloro-, 3,5-dichlorobenzoate Chủng P aeruginosa JB2 có khả năng sinh trưởng kỵ khí trên 2,5-dichlorobenzoate Chủng

P veronii PH-03 có khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa dioxin là nguồn

carbon và năng lượng duy nhất Chủng này phân hủy được 90,7% DD, 79,7% DBF, 88,3% 1-MCDD, 78,6% 2-CDD sau 60 giờ nuôi cấy với nồng độ các chất ban đầu

là 1 mM (Hong, 2004) P aeruginosa phân lập từ bùn hoạt tính hay từ đất tham gia

loại khử clo của 1,1,trichloro-2,2-di(4-chlorophenyl)ethane (DDT) thành chloro-4-[2,2-dichloro-1-(4-chlorophenyl)ethyl]benzene (DDD) ở điều kiện kỵ khí, sau đó chúng chuyển hóa tiếp bằng cách cắt vòng thơm ở điều kiện hiếu khí Dịch

1-chiết tế bào của Pseudomonas có thể phân hủy các sản phẩm DDT, DDD,

1,1'-(2-chloroethane-1,1-diyl)bis(4-chlorobenzene)(DDMS), phenyl) ethenyl]benzene (DDNU) theo con đường chuyển hóa kỵ khí (Gohil, 2011) Tại Việt Nam, các nghiên cứu về sự đa dạng VSV trong các lô xử lý tại sân bay Đà Nẵng bằng phương pháp DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) hay SSCP (Single-strand chain polymorphism) đều cho thấy có mặt các VK thuộc

1-chloro-4-[1-(4-chloro-ngành Proteobacteria với các lớp -Proteobacteia trong đó lớp

-Proteobacteia chiếm ưu thế Trong số đó, VK thuộc chi Pseudomonas có mặt và

chiếm đa số trong các lô xử lý (Nguyễn Bá Hữu, 2007c, 2008) Chẳng hạn, khi phân tích cấu trúc quần xã VK có mặt ở lô xử lý 0,5 m3 bằng phương pháp SSCP cho

thấy xuất hiện 8 dòng VK Pseudomonas (Nguyễn Bá Hữu, 2009) Ở công thức xử

lý 1,5 m3 có xuất hiện 4 dòng VK Pseudomonas (Nguyễn Bá Hữu, 2008) Ở lô xử lý

10 và 100 m3 xuất hiện 12 dòng Pseudomonas (Nguyễn Bá Hữu, 2009) Ngoài ra,

có nhiều nghiên cứu về chủng thuần hay hỗn hợp chủng Pseudomonas có khả năng

phân hủy các chất là thành phần của chất diệt cỏ/dioxin tại Đà Nẵng cũng đã được

công bố Chủng VK KK không bắt buộc Pseudomonas sp SETDN1 phân lập từ lô

xử lý 10 DNT có khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa dịch chiết đất bao gồm

2,4-D, 2,4,5-T, TCDD, PCDD, PCDF (Nguyễn Thị Sánh, 2005) Chủng

Pseudomonas sp BDN15 có khả năng sinh trưởng trên môi trường muối khoáng

chứa 2,4,5-T ở nồng độ 1000 ppm như nguồn carbon và năng lượng duy nhất Chủng này phân hủy tới 39,37% 2,4,5-T ở nồng độ 1000 ppm sau 5 ngày nuôi cấy (La Thanh Phương, 2005) Hỗn hợp chủng SETDN20 nuôi kỵ khí không bắt buộc trong phòng thí nghiệm có khả năng phân hủy 17,9% tổng độ độc sau 60 ngày ở nồng độ 4.299,243 pg TEQ/ml Bằng phương pháp DGGE đã xác định hỗn hợp này

có ít nhất 3 chủng vi khuẩn (Nguyễn Thị Sánh, 2007) Chủng Pseudomonas sp

HR5.1 phân lập từ bioreactor xử lý chất độc hóa học có mặt 2,4,5-T ở nồng độ 200

ppm (Phạm Ngọc Long, 2009) Chủng Pseudomonas sp BQNR có khả năng phân

hủy TNT tới nồng độ 600 ppm và có thể loại bỏ 99,35% TNT ở nồng độ 100 ppm (Đặng Thị Cẩm Hà, 2009)

Ngoài ra, một số gene mã hóa cho enzyme tham gia phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T

của Pseudomonas cũng đã được công bố Gene tfdA mã hóa cho enzyme tham gia phân hủy 2,4-D được phát hiện ở chủng Pseudomonas sp BHNA1 phân lập từ khu

vực ô nhiễm tại sân bay Biên Hòa (Phùng Khắc Huy Chú, 2012) Ở hỗn hợp chủng

VK KK không bắt buộc SETDN20 có chứa gene mã hóa cho dioxygenase có độ tương đồng cao tới 99% so với trình tự phenylpropionate dioxygenase Kết quả này chứng tỏ ở điều kiện kỵ khí, gene mã hóa cho dioxygenase tham gia vào quá trình

cắt vòng thơm vẫn có mặt (Nguyễn Thị Sánh, 2007) Chủng Pseudomonas sp

BDNR1 có khả năng sinh trưởng trên DCĐ chứa dioxin, 2,4,5-T, 2,4-D, DBF, pyrene (300 ppm) Chủng này cũng có khả năng sinh laccase (Nguyễn Ngọc Bảo, 2010) Các kết quả đã nghiên cứu chứng tỏ trong các lô xử lý và trong đất nhiễm

chất diệt cỏ/dioxin của Việt Nam nhiều đại diện của chi Pseudomonas đã có mặt Vai trò của Pseudomonas và các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy

các hợp chất chứa clo vòng thơm sẽ được làm sáng tỏ ở các nghiên cứu tiếp theo

1.5 Đa dạng các gene chức năng tham gia vào quá trình loại khử clo

Như đã trình bày ở phần trên, các VK KK hô hấp loại khử clo rất đa dạng và được chia thành 3 nhóm khác nhau nên các gene chức năng tham gia vào quá trình

này cũng khác nhau Thông thường, các phản ứng loại khử clo được xúc tác bởi các enzyme RdhA (reductive dehalogenase) Các gene mã hóa cho enzyme RdhA có mặt ở cả nhóm hô hấp loại khử clo bắt buộc, không bắt buộc và loại clo đồng trao đổi chất Tuy nhiên, chúng có mặt ở 2 nhóm loại khử clo bắt buộc và không bắt buộc nhiều hơn, ít có mặt ở nhóm loại khử clo đồng trao đổi chất Khả năng loại khử clo của các VK khác nhau cũng rất khác nhau phụ thuộc vào enzyme có mặt trong tế bào, số lượng, loại gene chức năng mã hóa cho enzyme RdhAcó mặt trong

genome của mỗi chủng (Waller, 2005) Theo Wagner và đtg, các gene rdhA của chủng D mccartyi CBDB1-chủng chứa nhiều gene chức năng rdhA nhất được phân

thành 4 nhóm chính và được chia thành 13 phân nhóm Mỗi phân nhóm có từ 1-5

gene rdhA Mỗi cặp primer được thiết kế cho một phân nhóm (Wagner, 2009)

Các VK KK sử dụng enzyme RdhA xúc tác cho quá trình thay thế các nguyên

tử clo bởi hai điện tử từ H2 và một proton (Hiraishi, 2008; Angelo, 2010) RdhA là enzyme chìa khóa tham gia vào chuỗi hô hấp loại khử clo ở các VK KK Đây là nhóm enzyme có tính đặc hiệu cơ chất rộng, một enzyme có thể xúc tác cho quá trình loại clo của nhiều hợp chất hữu cơ chứa clo khác nhau (Krajmalnik-Brown, 2005) Chẳng hạn, enzyme TceA xúc tác quá trình loại clo của TCE, một số

haloalkane và haloalkene (Wagner, 2009) Tuy các VK có khả năng hô hấp loại khử

clo có quan hệ phát sinh chủng loại khác xa nhau và thuộc về nhiều chi khác nhau nhưng các gene mã hóa cho enzyme RdhA lại có độ tương đồng rất cao về cấu trúc

và chức năng Các enzyme RdhA của các VK KK đều bao gồm các lớp protein Fe/S

có chứa corrinoid (Smidt, 2000)

Chức năng của một số protein được mã hóa từ các gene chức năng của nhóm

VK Dehalococcoides đã được chứng minh (Krajmalnik-Brown, 2005) Ví dụ như

gene mã hóa cho enzyme PceA xúc tác cho quá trình loại clo từ PCE đến ethene

Hình 1.9 Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự axit amin của các enzyme RdhA (các gene

tương ứng có độ tương đồng trên 95%) (Futagami, 2008) Các chủng Dehalococcoides sp CBDB1, BAV1, VS, 195 nay là D mccartyi CBDB1, BAV1, VS, 195(Löffler, 2013)

Mối quan hệ giữa các RdhA ở các VK khác nhau dựa trên trình tự các đoạn axit

amin do gene rdhA tương ứng mã hóa (Hình 1.9) Từ mối quan hệ này cho thấy các

VK khác nhau có thể mang cùng gene rdhA (gene pceA, cprA) và cấu trúc của các

enzyme do chúng mã hóa khá tương đồng với nhau như enzyme PceA của các chủng

Dehalobacter restrictus, Desulfitobacterium hafniense Y51và D hafniense TCE1 Khi phân tích genome của các chủng VK Dehalococcoides khác, Kube và đtg đã phát hiện mỗi chủng còn chứa một lượng lớn các gene rdhA khác cũng tham gia vào quá trình loại khử clo (Kube, 2005) Chủng D mccartyi 195 chứa 17 bản sao, chủng D mccartyi BAV1 chứa 7 bản sao, chủng D mccartyi FL2 chứa 14 bản sao, D mccartyi CBDB1 chứa tới 32 bản sao gene rdhA (Waller, 2005)

Việc biểu hiện các gene mã hóa cho các enzyme RdhA tham gia loại khử clo phụ thuộc vào cơ chất chứa clo có mặt trong mẫu nuôi cấy Điều này cho thấy chính

các chất hữu cơ chứa clo là chất cảm ứng của quá trình phiên mã các gene rdhA Theo Wagner và đtg, 29 trong số 32 gene rdhA của chủng D mccartyi CBDB1 được

sao mã khi chủng này được nuôi cấy trên môi trường chứa 1,2,3-TrCB và

1,2,4-TrCB Mức độ phiên mã cao nhất là của gene cbrA - gene mã hóa cho quá trình loại

khử clo của chlorobenzene ở chủng CBDB1 Gene này xúc tác quá trình loại khử clo của 1,2,3-TrCB tới 1,3-DCB và từ 1,2,3,4-TCB tới 1,2,4-TrCB Cũng trong

nghiên cứu này, số bản sao của gene cbrA tăng hơn 10 lần so với ban đầu khi nuôi cấy trên hai cơ chất 1,2,3-TrCB và 1,2,4-TrCB Gene cbdbA80 cũng được phát hiện khi chủng D mccartyi CBDB1 nuôi cấy trên 2,3-dichlorophenol (Wagner, 2009)

Đối với nhóm VK hô hấp loại khử clo đồng trao đổi chất, ngoài một số ít các

VK mang gene rdhA thì còn có rất nhiều gene chức năng khác tham gia vào quá

trình hô hấp loại clo Các gene này có thể là các gene tham gia vào quá trình cắt vòng thơm như benzoyl-CoA, chlorocatechol dioxygenase, 4-hydroxybenzoyl-CoA thioesterase (Gohil, 2011) Ngoài ra, gene mã hóa cho enzyme 2,4-dichloro-phenoxyacetate/α -ketoglutarate dioxygenase (TfdA) tham gia vào quá trình phân hủy

2,4-D cũng được phát hiện ở một số chủng thuộc chi Pseudomonas (Phùng Khắc Huy

Chú, 2012) Các gene mã hóa cho enzyme benzene dioxygenase, chloromuconate cycloisomerase, maleylacetate reductase tham gia vào quá trình phân hủy 1,2,3,5-

TCB ở chủng Pseudomonas sp PS14 (Reineke, 2001) Quá trình phân hủy các hợp

chất chứa clo đồng trao đổi chất ở các VK hiếu khí còn xuất hiện các gene chức năng như toluene monooxygenase, toluene dioxygenase, phenol monooxygenase and

methane monooxygenase VK Pseudomonas sp B13 mang các enzyme tham gia vào

quá trình phân hủy và chuyển hóa benzoate, chlorobenzoate như 3-oxoadipate lactone hydrolase, 3-oxoadipate:succinyl-CoA transferase, 3-oxoadipyl-CoA thiolase

enol-(Kaschabek, 2002) Chủng P putida KT2440 mang các gene mã hóa cho enzyme

tham gia vào quá trình phân hủy phenylacetate acid như pentylacetyl-CoA ligase, hydroxylating complex, ring-opening enzyme, enoyl-CoA hydratase, acyl-CoA dehydrogenase, putative thioesterase, ketothiolase (Kim, 2009)

ring-Tóm lại, các VK hô hấp loại khử clo cũng như các gene mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình này ở VK KK rất đa dạng Các VK này bao gồm nhiều chi thuộc 3 ngành khác nhau là Chloroflexi, Firmicute, Proteobacteria Các VK hô hấp loại khử clo này có thể nuôi cấy được và không nuôi cấy được phụ thuộc vào các điều kiện trang bị trong phòng thí nghiệm Cho đến nay còn có rất nhiều hạn chế khách quan và chủ quan trong nuôi cấy VSV nói chung và VSV phân hủy dioxin, các hợp chất hữu cơ chứa halogen nói riêng Do đó, cần sử dụng nhiều phương pháp tiên tiến khác nhau để có thể đánh giá sự đa dạng các VSV trong đất và trầm tích ô nhiễm Các phương pháp đó sẽ trình bày dưới đây

1.6 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng vi sinh vật

Theo tổ chức Lương nông Liên hiệp quốc: “Đa dạng sinh học là tính đa dạng của

sự sống dưới mọi hình thức, mức độ và mọi tổ hợp, bao gồm đa dạng gene, đa dạng loài và đa dạng hệ sinh thái” Đa dạng VSV bao gồm đa dạng về loài VSV và đa dạng khả năng trao đổi chất của VSV Đa dạng loài bao gồm độ phong phú loài, tổng số loài

có mặt, độ đồng dạng loài và sự phân bố của loài (Kirk, 2004, Ovreas, 2000)

Để đánh giá hết được số lượng VSV trong các mẫu, cần có các phương pháp phân tích nhanh, đồng thời và lặp lại với nhiều mẫu Ước tính, khoảng 5.000 loài

VK khác nhau đã được mô tả và trong tự nhiên có khoảng từ 107 đến 109 loài VK Xấp xỉ 1% VK có thể nuôi cấy được bằng các phương pháp thực nghiệm chuẩn ở điều kiện phòng thí nghiệm và số liệu 1% này không thể đại diện đầy đủ cho các

VK (Smalla, 2007; Maira 2010) Có ít nhất 99% các VK được quan sát dưới kính hiển vi không nuôi cấy được bằng các kỹ thuật phòng thí nghiệm thông thường (Kirk, 2004) Tuy nhiên, trong số 1% VK có thể nuôi cấy được cũng rất khác nhau

về kiểu hình, di truyền và chỉ phần nhỏ của quần thể được xác định

Các phương pháp xác định tính đa dạng VSV trong đất có thể được chia thành

3 nhóm: các kỹ thuật hóa sinh, VSV và sinh học phân tử

1.6.1 Phương pháp vi sinh vật

Phương pháp thường được sử dụng nhất là đếm số lượng trên thạch đĩa Petri hay đếm số ống có thể nhất (MPN) Đây là phương pháp truyền thống, có ưu điểm

là nhanh, rẻ và có thể cung cấp thông tin về thành phần các VSV trong quần xã Tuy nhiên, phương pháp này được sử dụng với từng nhóm VSV nhất định trên môi trường đặc hiệu nhất cho nhóm đó và kết quả phụ thuộc vào các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH, ánh sáng… Phương pháp này chỉ áp dụng cho các VSV có thể nuôi cấy được và do đó không thể phản ánh hết số lượng VSV trong đất Do đó, kết quả của phương pháp này cũng có thể ảnh hưởng đến sự đánh giá chính xác tính đa dạng của quần xã VSV

1.6.2 Phương pháp hóa sinh

Phương pháp hóa sinh để nghiên cứu sự đa dạng của VSV liên quan đến các chất hữu cơ đa vòng thơm bao gồm đánh giá tính đa dạng VSV dựa trên khả năng

sử dụng nguồn carbon duy nhất hay sử dụng đồng thời một vài nguồn carbon (đồng trao đổi chất) của các quần xã VSV và phân tích axít béo phospholipid Tuy nhiên, việc sử dụng nguồn carbon có thể không đại diện cho tất cả các nguồn carbon trong đất và dẫn đến không đầy đủ về thông tin quần xã VSV Phân tích axít béo phospholipid có thể bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và dinh dưỡng và các acid béo có thể không đại diện cho loài đặc hiệu (một VSV có thể có nhiều acid béo và cũng acid béo có thể có trong nhiều loài) Do vậy, phương pháp hóa sinh thường được sử dụng kết hợp với phương pháp sinh học phân tử khác để đánh giá đa dạng VSV trong đất và nước ô nhiễm

1.6.3 Phương pháp sinh học phân tử

Phương pháp sinh học phân tử là công cụ hiện đại để đánh giá sự đa dạng của các VSV trong đất Phương pháp này dựa vào cấu trúc ở mức độ DNA, RNA hay gene của các VSV để đánh giá sự đa dạng đến loài Các kỹ thuật hiện nay được sử dụng bao gồm: (1) tỷ lệ phần trăm G+C; (2) tái liên kết và lai acid nucleic; (3) DNA microarray (array gene chức năng, array genome cộng đồng, array oligonucleotide phát sinh loài, mẫu dò hệ gene đảo chiều); (4) PCR (nhân đoạn gene 16S rRNA, 18S rRNA, 23S rRNA, PCR đơn giản và PCR đa thành phần, real-time PCR); (5) điện di trên gel với dải nồng độ biến tính (DGGE) hoặc nhiệt độ biến tính (TGGE); (6) đa hình chiều dài đọa cắt bởi enzyme giới hạn (RFLP) hay phân tích cắt enzyme giới

hạn rDNA đã được khuếch đại (ARDRA); (7) đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn cuối (T-RFLP); (8) phân tích khoảng đệm gene ribosome (RISA), phân tích khoảng đệmliên gene ribosome (ARISA); (9) xác định trình tự lặp lại cao hoặc các vùng vệ tinh; (10) đa hình cấu trúc sợi đơn (SSCP) (Nguyễn Bá Hữu, 2009; Maphosa, 2012) Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng Do đó, để

có kết quả phân tích chính xác sự đa dạng VSV trong đất cần kết hợp nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau Trong nghiên cứu này, các phương pháp nghiên cứu đa dạng VSV bao gồm nuôi cấy truyền thống (làm giàu, phân lập VK KK) và phương pháp sinh học phân tử hiện đại như nested-PCR, DGGE đã được sử dụng đánh giá sự

đa dạng các VK KK nuôi cấy được và không nuôi cấy được Ngoài ra, nghiên cứu này cũng đã được tiếp cận với công cụ Metagenomics là công cụ đánh giá sự đa dạng VSV đầy đủ nhất cho đến thời điểm hiện nay

1.6.4 Phương pháp Metagenomics

Trong những năm trở lại đây, Metagenomics đã tạo nên những tiến bộ vượt bậc trong sinh thái học, tiến hóa và đa dạng VSV Đây là định hướng mới, quan trọng và trở thành chiến lược trong phát triển kinh tế bền vững, an ninh quốc phòng, bảo vệ sức khỏe và môi trường trên thế giới hiện nay (Riesenfeld, 2004).Metagenomics là công cụ mới, tổ hợp của rất nhiều kỹ thuật sinh học kết hợp tin sinh học để phân tích, sàng lọc, xây dựng thư viện metabase, quản lý và khai thác cho các mục tiêu phát triển kinh tế, bảo vệ môi trường từ nguồn DNA, RNA được tách chiết thẳng từ môi trường tự nhiên, cơ thể người, động thực vật không thông qua nuôi cấy (Meyer, 2008) Metagenomics đã được nghiên cứu trong 5-10 năm qua nhằm nghiên cứu hệ sinh thái VSV, sự tiến hóa và sự đa dạng VSV bao gồm cả đa dạng chủng loài, gene chức năng Metagenomics cũng có thể sử dụng hiệu quả trong việc giám định pháp y, bảo vệ sinh học (biodefense), phát triển nông nghiệp bền vững (Handelsman, 2004)

Để nghiên cứu quần xã không thông qua nuôi cấy, một loạt các phương pháp

và kỹ thuật đã được sử dụng như kỹ thuật PCR định lượng (qPCR), lai in situ đánh

dấu huỳnh quang, xác định hoạt tính enzyme, phân tích phóng xạ đặc hiệu cơ chất,

nghiên cứu hệ phiên mã (transcriptomics), hệ protein (proteomics) và xác định trình

tự DNA (meta)genome hoặc DNA được khuếch đại bởi phản ứng PCR từ mẫu môi trường bằng máy giải trình tự công năng cao thế hệ mới Các công cụ này được sử dụng kết hợp với nhau để cung cấp những hiểu biết sâu sắc toàn diện hơn về các quá trình vi sinh vật liên quan đến phân hủy loại khử clo (Maphosa, 2012) Metagenomics đã được sử dụng để nghiên cứu quần xã sinh vật trong nhiều loại môi trường khác nhau như ruột mối, đường ruột ở người, hệ thống xử lý nước thải

và hệ thống thoát nước mỏ acid v.v (Beloqui, 2006; Fang, 2011; Hug, 2013) Một cấu trúc quần xã phù hợp giữ vai trò thiết yếu trong quá trình loại khử clo hoàn toàn ở một hệ thống phân hủy sinh học Cho đến nay, nhiều nghiên cứu liên quan đến sự đa dạng của VK hô hấp loại khử clo và quá trình trao đổi chất của chúng (bao gồm cả dòng năng lượng bên trong quần xã VK KK) đã được thực hiện Các quần xã VK cần cho mục đích phân hủy sinh học thường dựa trên sự tương tác đa loài trong theo mạng lưới Các VK hô hấp loại clo thường sống trong quần xã nhưng chúng khó phân lập ở dạng chủng sạch nên cần thiết phải xác định đặc diểm của quần xã dựa vào công cụ Metagenomics Các ứng dụng của công cụ Metagenomics đã đưa một cái nhìn tổng thể về thành phần di truyền của quần xã vi sinh vật bao gồm các thông tin

về định loại và khả năng trao đổi chất tiềm năng (như hoạt động loại khử clo) của các thành viên trong quần xã Hiện nay, hiểu biết về cấu trúc quần xã một cách phù hợp giữ vai trò thiết yếu trong quá trình xử lý bằng loại clo hoàn toàn xảy ra ở các hệ thống phân hủy sinh học Đặc biệt, đối với các VSV tham gia vào quá trình loại khử clo các hợp chất ô nhiễm chứa clo, các VK KK hô hấp loại khử clo rất khó nuôi cấy

và phân lập ở dạng chủng sạch nên khó xác định các đặc điểm sinh học và vai trò của mỗi cá thể trong quần xã

Hiện nay, công cụ Metagenomics đã được một số nhà khoa học trên thế giới sử dụng để đánh giá sự đa dạng quần xã vi khuẩn (KB-1, ANAS, Donnall) tham gia vào quá trình loại khử clo và mối quan hệ về trao đổi chất giữa các VK này trong quần xã (Maphosa, 2012; Hug, 2012, 2013) Chẳng hạn, đối với quần xã VK loại khử clo của

TCE, ban đầu Dehalococcoides xuất hiện và chiếm ưu thế để tham gia quá trình loại

khử clo trong quần xã ANAS Các gene rdhA được phát hiện trong quần xã có cấu trúc gần với các gene đã được công bố trong genome của các chủng D mccartyi

khác nhau Tiếp theo, các gene hydrogenase chiếm ưu thế vì nó tham gia vào quá trình trao đổi chất hydro trong quần xã Phân tích cấu trúc quần xã ANAS giả thiết rằng có sự sinh trưởng mạnh của các VK dị dưỡng sinh hydro khác nhau (các VK lên men, nhóm VK tự dưỡng sinh acetate) và các nhóm tiêu thụ (nhóm loại khử clo

và sinh metan) Hydro cần thiết cho các VK loại khử clo và sinh metan, duy trì ổn định hoạt tính loại clo Tiếp theo là quá trình tổng hợp cobalamin, một cofactor quan trọng của quá trình loại khử clo Gene này có mặt ở một số VK trong đó có

Dehalococcoides Các VK khác trong quần xã cũng có vai trò quan trọng trong quá

trình tổng hợp cobalamin Metagenomics cũng được sử dụng để xác định

metagenome của hỗn hợp gồm hai chủng Dehalobacter sp E1 và Sedimentibacter sp

B4 có khả năng loại khử clo của beta-hexa-chlorocyclohexane (Maphosa, 2012)

Dehalobacter sp không thể được nuôi cấy ở dạng chủng sạch và cần có VK Sedimentibacter để duy trì khả năng loại khử clo (Van Doesburg, 2005) Phân tích metagenome cho thấy Dehalobacter có số lượng gene rdhA tăng lên trong quá trình

loại khử clo của các hợp chất như chloroform, chloroethane, methane Sự có mặt của

nhiều nhóm gene rdhA giả thiết Dehalobacter có khả năng loại khử clo của nhiều hợp chất hơn so với chúng ta đã biết trước đây Sedimentibacter giữ vai trò là chủng hỗ trợ (như tạo ra cofactor) cho Dehalobacter sinh trưởng và duy trì hoạt tính loại clo

Metagenome của hỗn hợp KB-1 có khả năng loại khử clo của TCE chứa các chi

Dehalococcoides, Geobacter, Methanosarcina, Spirochaeeta và Sporomusa Quần xã ANAS loại clo của PCE có Dehalococcoides và một số VK lên men, VK sinh metan

và nhiều VK khác (Hug, 2012, 2013) Phân tích metagenome của các quần xã VK có khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa clo cho thấy các VK KK hô hấp loại khử clo chỉ chiếm một phần rất nhỏ trong tổng số quần xã VSV Hiểu được cấu trúc của quần

xã và chức năng của mỗi cá thể trong quần xã giúp cho việc tăng cường hiệu quả phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo Khi sử dụng các kỹ thuật nhận diện (fingerprinting) phân tử như DGGE, TRFLP từ các đoạn gene 16S rRNA để nghiên