xác định chỉ thị phân tử cho các dòng hoa cúc đột biến do chiếu xạ và đánh giá tính ổn định di truyền của chúng qua các thế hệ in vitro bằng kỹ thuật rapd

Lời mở đầu Ở Việt Nam những năm gần đây, cơ cấu cây trồng nông nghiệp chuyển đổi nhanh chóng trong nền kinh tế thị trường, trong đó có sự phát triển mạnh mẽ của ngành trồng hoa cắt cành. Việc kinh doanh hoa đã và đang được xã hội rất quan tâm vì hoa không chỉ đem lại giá trị trong đời sống tinh thần, mà trên thực tế đã đem lại hiệu quả kinh tế cho người sản xuất, giúp cải thiện và nâng cao đời sống của nông dân. Trong các loài hoa, cây hoa cúc được phát triển nhanh vì nó là loài hoa đẹp, đa dạng, được dùng để trang trí, dùng cho các hoạt động lễ hội và làm dược liệu. Cúc được trồng nhiều nơi trên thế giới bởi tính thích nghi cao, dễ sản xuất, vận chuyển và tiêu thụ. Thực tế việc trồng cây hoa cúc ở Việt Nam nói chung và Đà lạt nói riêng, đã tạo công ăn việc làm cho hàng vạn lao động nông nghiệp, góp phần tích cực trong việc phát triển đời sống kinh tế của người dân. Tuy nhiên, việc phát triển sản xuất hoa cúc ở nước ta còn gặp nhiều hạn chế vì hầu hết các giống hoa cúc có giá trị thương mại trên thị trường hiện nay đều là những giống nhập nội, trong khi đó giống cúc bản địa lại ít có giá trị kinh tế cũng như xuất khẩu. Đó là một trong số nhiều lý do khiến cho việc chọn và tạo giống cúc mới, có tính cạnh tranh thương mại cao trở thành một nhiệm vụ cấp bách cho các nhà khoa học Việt Nam. Để tạo ra các giống cây trồng mới có khả năng cạnh tranh hơn, các nhà chọn tạo giống đã sử dụng nhiều phương pháp như: chuyển gen, gây đột biến thực vật b ng các tác nhân vật lý và hóa học. Trong số đó, phương pháp chiếu xạ gây đột biến đã được sử dụng rộng rãi trong việc cải tạo nâng cao chất lượng các giống cây trồng nói chung và hoa cúc nói riêng, nh m phát triển các giống cây với các đặc điểm sinh học được cải tiến. Muller và Xapeghin là những người đầu tiên đưa ra khả năng sử dụng tia phóng xạ để nâng cao tần số đột biến ở cây trồng, và từ đó sàng lọc ra giống mới từ các cây đột biến. Sau đó phương pháp chọn giống mới này đã thu hút được sự chú ý của nhiều người đặc biệt là các nhà di truyền chọn giống trên khắp thế giới… Có rất nhiều dạng tia phóng xạ và nguồn phóng xạ cho các nhà chọn giống lựa chọn. Các tác nhân phóng xạ được sử dụng là tia X, tia gamma, ion beam… có thể giải phóng nguồn năng lượng dưới dạng hạt hoặc sóng điện từ có thể gây ra tổn thương sinh học cho tế bào dẫn đến sản sinh các đột biến vô hướng có thể có lợi hoặc có hại, thậm chí gây chết tế bào và cơ thể sinh vật. Những đột biến có thể được chọn lọc qua nhiều thế hệ để tạo ra các giống mới có tính trạng khác biệt so với giống ban đầu. B ng phương pháp chiếu xạ kết hợp với kỹ thuật nhân giống in vitro, các nhà khoa học đã tạo ra nhiều giống cây trồng mới có chất lượng tốt hơn so với cây giống nguyên liệu ban đầu và thời gian được rút ngắn đáng kể. Việc nhận dạng và xác định chính xác các giống cây trồng rất quan trọng đối với các nhà chọn giống thực vật cũng như các nhà vườn. Trước đây, các giống cây mới được xác định dựa trên các đặc tính nông sinh học và cảm quan của các nhà chọn giống nên rất khó đánh giá chính xác nguồn gốc và đặc điểm của cây. Gần đây, các kỹ thuật sinh học phân tử không ngừng được phát triển và đã giúp cho việc đánh giá đa dạng di truyền của các giống cây trồng được dễ dàng, thuận lợi và chính xác hơn. Mục tiêu của đề tài - Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định chỉ thị phân tử cho các dòng hoa cúc mới thu nhận được nhờ kỹ thuật bức xạ gây tạo giống. - Khảo sát và đánh giá tính ổn định di truyền của các giống mới được tạo ra nhờ kỹ thuật chiếu xạ gây đột biến qua các thế hệ in vitro.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

DA GOUT A ĐAM

XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHO CÁC DÒNG

HOA CÚC ĐỘT BIẾN DO CHIẾU XẠ

VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH ỔN ĐỊNH DI TRUYỀN CỦA

CHÚNG QUA CÁC THẾ HỆ IN VITRO

BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn: TS NGUYỄN XUÂN TÙNG

Tp HCM, tháng 09 năm 2012

LỜI CÁM ƠN

Trong suốt thời gian học tập và làm luận văn cho khóa cao học vừa qua, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ của những người xung quanh mình, trong đó có những người có ý nghĩa đặc biệt đối với tôi trong suốt quá trình Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

- TS.Nguyễn Xuân Tùng - Người hướng dẫn khoa học – Người Thầy đã quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này

- ThS Lê Ngọc Triệu – Người hướng dẫn, giúp đỡ tôi với từng thí nghiệm cụ thể

và chia sẻ những kinh nghiệm để tôi hoàn thành luận văn này

- Quý thầy cô thuộc trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM vì những kiến thức quý báu đã truyền đạt cho tôi

- Các anh chị em thuộc phòng Bức xạ tạo giống – Trung tâm Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong công nghiệp đã chia sẻ những kinh nghiệm và khích lệ tinh thần

Con xin cám ơn mẹ và anh chị em trong gia đình đã hỗ trợ và nâng đỡ cả về vật chất cũng như tinh thần để con tiến xa hơn trên con đường học vấn của mình

Luận văn được thực hiện tại Phòng Bức xạ tạo giống - Trung tâm Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong công nghiệp

Đà Lạt, tháng 9 năm 2012

Da Gout A Đam

MỤC LỤC

Trang phụ bìa i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục từ viết tắt v

Danh mục bảng biểu vi

Danh mục hình vii

Lời mở đầu 1

Chương 1: Tổng quan tài liệu 4

1.1 Hoa cúc và việc chọn tạo giống đột biến 4

1.2 Chỉ thị phân tử 5

1.3 RAPD 6

1.4 Bức xạ tạo giống 7

1.4.1 Sơ lược lịch sử chọn tạo giống cây trồng 7

1.4.2 Một số thành tựu của thế giới 9

1.4.3 Tình hình thực tiễn ở Việt Nam 10

Chương 2: Đối tượng, vật liệu và các phương pháp nghiên cứu 13

2.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 13

2.1.1 Đối tượng, vật liệu xác định chỉ thị phân tử 13

2.1.2 Đối tượng, vật liệu khảo sát và đánh giá tính ổn định di truyền của các dòng cúc đột biến qua các thế hệ in vitro 17

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Tạo vật liệu nghiên cứu 19

2.2.2 Tách chiết DNA 20

2.2.3 RAPD-PCR 22

2.2.4 Điện di trên gel agarose 23

2.2.5 Thống kê phân tích số liệu 23

2.2.6 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 23

Chương 3: Kết quả và biện luận 25

3.1 Kết quả xác định chỉ thị phân tử 25

3.1.1 Kết quả tách chiết DNA 25

3.1.2 Kết quả phản ứng RAPD 25

3.1.3 Kết quả phân tích đa dạng di truyền 3 giống cúc và các dòng đột biến phát sinh từ chúng 27

3.1.4 Kết quả xác định chỉ thị RAPD cho các dòng cúc 29

3.2 Kết quả khảo sát tính ổn định di truyền của 3 giống cúc và các đột biến phát sinh từ chúng qua các thế hệ in vitro 33

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA 33

3.2.2 Kết quả phản ứng RAPD 34

3.2.3 Kết quả khảo sát và đánh giá tính ổn định di truyền của các dòng cúc nghiên cứu qua các thế hệ in vitro 37

Chương 4: Kết luận và đề nghị 41

4.1 Kết luận 41

4.2 Đề nghị 42

Tài liệu tham khảo 43

Phụ lục 46

Phụ lục 1: Tạo vật liệu nghiên cứu 46

Phụ lục 2: Sàng lọc đột biến 48

Phụ lục 3: Phân tích kết quả RAPD cho từng mồi trong thí nghiệm xác định chỉ thị phân tử cho các dòng đột biến 50

Phụ lục 4: Ma trận thống kê các băng điện di trong thí nghiệm xác định chỉ thị phân tử 64

Ảnh điện di 24 mẫu khảo sát tính ổn định di truyền qua các thế hệ in vitro với 14 mồi RAPD 72

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

C1: Control 1 – Hoa cúc artfarm trắng

C2: Control 2 – Hoa cúc đóa trắng

C3: Control 3 – Hoa cúc saphia vàng

CTAB: Cetyltrimethylammonium Bromide

CxMy: Dòng đột biến y phát sinh từ giống đối chứng x

DES: Diethyl sulfate

DMS: Dimethyl sulfate

DNA: Deoxyribonucleic Acid

FAO: Food and Agriculture Organization – Tổ chức nông lương của

Liên Hiệp QuốcGy: Gray (đơn vị bức xạ)

IAEA: International Atomic Energy Agency – Cơ quan năng lượng

nguyên tử quốc tế

M1V1, M1V2… : Vegetative generations 1,2… of the mutants on

mutagenic treatment - Các thế hệ sinh dưỡng của thể đột biến OD: Optical Density – Mật độ quang

PCR: Polymerase Chain Reaction – Phản ứng trùng hợp chuỗi RAPD: Random Amplification of Polymorphic DNA – DNA đa hình

được khuếch đại ngẫu nhiên

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Số lượng giống cây trồng thu nhận được bằng phương

pháp bức xạ tạo giống qua các năm 10

Bảng 2.1

Giống, kí hiệu, kiểu chiếu, liều chiếu, nguồn gốc và đặc điểm chính của các dòng/giống hoa cúc sử dụng trong nghiên cứu

13

Bảng 2.3 Kí hiệu, đặc điểm hoa và nguồn gốc của các mẫu

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng RAPD-PCR 22

Bảng 3.1 Thống kê số băng DNA thu được của 9 mẫu hoa cúc với

Bảng 3.2 Hệ số tương đồng di truyền giữa 9 mẫu giống hoa cúc 27

Bảng 3.3 Marker nhận dạng các giống/dòng cúc theo nhóm 31

Bảng 3.4 Thống kê số băng DNA thu được của 24 mẫu hoa cúc

Bảng 3.5 Hệ số tương đồng di truyền giữa các thế hệ của các dòng hoa cúc đột biến và đối chứng 38

Bảng 4.1 Marker nhận dạng cho một số dòng hoa cúc đột biến được khảo sát 41

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.2

Giống cúc Red Nero của Ba Lan (trái) và giống Mini Nero (phải) được tạo ra từ Red Nero bằng phương pháp bức xạ tạo giống

5

Hình 1.3 Sơ đồ quy trình RAPD với hai vòng lặp nhiệt ban đầu 7

Hình 3.5 Chỉ thị cho dòng B3 và F7: Mồi OPC2 – lần lượt các

Hình 3.6 Chỉ thị cho dòng B14: Mồi S258 – băng 1200bp 30

Hình 3.7 Chỉ thị cho dòng F29: Mồi OPN7 – băng 250 và 650bp 31

Hình 3.12 Sơ đồ đa dạng di truyền của các dòng cúc đột biến qua

Lời mở đầu

Ở Việt Nam những năm gần đây, cơ cấu cây trồng nông nghiệp chuyển đổi nhanh chóng trong nền kinh tế thị trường, trong đó có sự phát triển mạnh mẽ của ngành trồng hoa cắt cành Việc kinh doanh hoa đã và đang được xã hội rất quan tâm vì hoa không chỉ đem lại giá trị trong đời sống tinh thần, mà trên thực tế đã đem lại hiệu quả kinh tế cho người sản xuất, giúp cải thiện và nâng cao đời sống của nông dân

Trong các loài hoa, cây hoa cúc được phát triển nhanh vì nó là loài hoa đẹp,

đa dạng, được dùng để trang trí, dùng cho các hoạt động lễ hội và làm dược liệu Cúc được trồng nhiều nơi trên thế giới bởi tính thích nghi cao, dễ sản xuất, vận chuyển và tiêu thụ Thực tế việc trồng cây hoa cúc ở Việt Nam nói chung và Đà lạt nói riêng, đã tạo công ăn việc làm cho hàng vạn lao động nông nghiệp, góp phần tích cực trong việc phát triển đời sống kinh tế của người dân Tuy nhiên, việc phát triển sản xuất hoa cúc ở nước ta còn gặp nhiều hạn chế vì hầu hết các giống hoa cúc có giá trị thương mại trên thị trường hiện nay đều là những giống nhập nội, trong khi đó giống cúc bản địa lại ít có giá trị kinh tế cũng như xuất khẩu Đó là một trong số nhiều lý do khiến cho việc chọn và tạo giống cúc mới,

có tính cạnh tranh thương mại cao trở thành một nhiệm vụ cấp bách cho các nhà khoa học Việt Nam

Để tạo ra các giống cây trồng mới có khả năng cạnh tranh hơn, các nhà chọn tạo giống đã sử dụng nhiều phương pháp như: chuyển gen, gây đột biến thực vật

b ng các tác nhân vật lý và hóa học Trong số đó, phương pháp chiếu xạ gây đột biến đã được sử dụng rộng rãi trong việc cải tạo nâng cao chất lượng các giống cây trồng nói chung và hoa cúc nói riêng, nh m phát triển các giống cây với các đặc điểm sinh học được cải tiến Muller và Xapeghin là những người đầu tiên đưa ra khả năng sử dụng tia phóng xạ để nâng cao tần số đột biến ở cây trồng, và

từ đó sàng lọc ra giống mới từ các cây đột biến Sau đó phương pháp chọn giống mới này đã thu hút được sự chú ý của nhiều người đặc biệt là các nhà di truyền

chọn giống trên khắp thế giới… Có rất nhiều dạng tia phóng xạ và nguồn phóng

xạ cho các nhà chọn giống lựa chọn Các tác nhân phóng xạ được sử dụng là tia

X, tia gamma, ion beam… có thể giải phóng nguồn năng lượng dưới dạng hạt hoặc sóng điện từ có thể gây ra tổn thương sinh học cho tế bào dẫn đến sản sinh các đột biến vô hướng có thể có lợi hoặc có hại, thậm chí gây chết tế bào và cơ thể sinh vật Những đột biến có thể được chọn lọc qua nhiều thế hệ để tạo ra các giống mới có tính trạng khác biệt so với giống ban đầu B ng phương pháp

chiếu xạ kết hợp với kỹ thuật nhân giống in vitro, các nhà khoa học đã tạo ra

nhiều giống cây trồng mới có chất lượng tốt hơn so với cây giống nguyên liệu ban đầu và thời gian được rút ngắn đáng kể

Việc nhận dạng và xác định chính xác các giống cây trồng rất quan trọng đối với các nhà chọn giống thực vật cũng như các nhà vườn Trước đây, các giống cây mới được xác định dựa trên các đặc tính nông sinh học và cảm quan của các nhà chọn giống nên rất khó đánh giá chính xác nguồn gốc và đặc điểm của cây Gần đây, các kỹ thuật sinh học phân tử không ngừng được phát triển và

đã giúp cho việc đánh giá đa dạng di truyền của các giống cây trồng được dễ dàng, thuận lợi và chính xác hơn

Mục tiêu của đề tài

- Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định chỉ thị phân tử cho các dòng hoa cúc mới thu nhận được nhờ kỹ thuật bức xạ gây tạo giống

- Khảo sát và đánh giá tính ổn định di truyền của các giống mới được

tạo ra nhờ kỹ thuật chiếu xạ gây đột biến qua các thế hệ in vitro

Mục đích và ý nghĩa của đề tài

Về lý luận khoa học, việc xác định chỉ thị phân tử đặc trưng cho từng dòng cúc đột biến phát sinh từ các giống cúc nguyên liệu giúp khẳng định sự khác biệt

về mặt di truyền của chúng so với giống nguyên liệu và các giống khác Sự ổn định di truyền của chúng qua các thế hệ giúp khẳng định chúng sẽ tồn tại lâu dài như một giống mới hoàn toàn, khác biệt lâu dài về cả hình thái lẫn bộ máy di truyền so với giống gốc Từ đó khẳng định r ng, phương pháp chiếu xạ gây đột biến là một trong những phương pháp có hiệu quả rõ ràng trong việc chọn tạo giống mới cho cây trồng nói chung và hoa cúc nói riêng Kết quả này cũng là cơ

sở cho các nhà khoa học đăng ký giống mới

Về thực tiễn, phương pháp chiếu xạ đột biến sẽ giúp các nhà khoa học, các nhà sản xuất của Việt Nam có một công cụ hữu hiệu trong việc tạo ra nguồn nguyên liệu để chọn ra các giống mới đáp Một khi đảm bảo được tính cạnh tranh với các giống ngoại nhập, các nhà sản xuất sẽ giảm thiểu việc nhập nội giống từ nước ngoài, và thậm chí có thể tiếp cận với thị trường xuất khẩu

Tóm tắt kết quả đã đạt đƣợc

- Đã xác định được chỉ thị phân tử RAPD cho các dòng hoa cúc đột biến tiềm năng và các giống đối chứng của chúng

- Đã khảo sát sự ổn định di truyền của các dòng cúc đột biến và đối chứng

của chúng qua 7 thế hệ in vitro Kết quả cho thấy bộ máy di truyền của

chúng ổn định

- Ngoài việc xác định tính ổn định di truyền b ng kỹ thuật phân tử, các dòng hoa cúc đột biến tiềm năng cũng đã được theo dõi sự ổn định của kiểu hình qua 3 thế hệ trồng ngoài đồng Kết quả, kiểu hình của những dòng đột biến tiềm năng biểu hiện ổn định

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hoa cúc và việc chọn tạo giống đột biến

Hoa cúc (chrysanthemum morifolium Ramat.) bắt đầu được trồng như một

giống cây nông nghiệp từ khoảng hơn 2500 năm trước tại Trung Quốc, và hiện nay, cúc là một trong số các loài hoa được trồng phổ biến nhất trên thế giới Nó

có thể được cắt cành để trang trí trong nhà, văn phòng… hoặc được trồng thành thảm ngoài công viên, vườn hoa… Hoa cúc rất đa dạng về hình thái, từ màu sắc đến hình dạng cánh hoa, tuổi thọ hoa…

Hình 1.1 Hoa cúc (Chrysanthemum morifolium Ramat.)

Tuy nhiên, với nhu cầu ngày càng tăng và thị hiếu tiêu dùng càng đa dạng của con người, các chủng giống hoa cúc tự nhiên vốn có không đủ để đáp ứng

Từ đó, các nhà khoa học đã tiến hành lai tạo, chuyển gen hoặc gây đột biến b ng phóng xạ nh m tạo ra các chủng giống hoa cúc mới để đáp ứng nhu cầu của thị trường Trong các phương pháp chọn tạo giống đó, bức xạ tạo giống là phương pháp đã được các nhà khoa học sử dụng nhiều và cho thấy ưu thế rõ rệt của nó

so với các phương pháp khác

Số liệu thống kê về số lượng các chủng giống nông nghiệp của loài hoa cúc hiện nay khá phức tạp và khác nhau theo từng quốc gia Mỗi quốc gia đều có

một số giống nội địa riêng, bên cạnh đó còn có các giống nhập nội từ các quốc gia khác, và hiện nay còn có thêm các giống mới được tạo ra tại chỗ b ng nhiều phương pháp khác nhau, trong đó có phương pháp bức xạ tạo giống Đến năm

2010, ở Ấn Độ có trên 30 giống cúc mới được tạo ra b ng phương pháp bức xạ tạo giống và được nhà nước sở tại công nhận Cùng thời gian này thì ở Trung Quốc có đến hơn 50 giống mới được công nhận và được đăng ký bảo hộ bản quyền giống

Hình 1.2: Giống cúc Red Nero của Ba Lan (trái) và giống Mini Nero

(phải) được tạo ra từ Red Nero bằng phương pháp bức xạ tạo giống

Ở Việt Nam hiện tại đa số các giống hoa cúc được tiêu thụ trên thị trường đều là giống từ nước ngoài nhập về Các giống địa phương hiện tại vẫn chưa được cải thiện và không đủ sức cạnh tranh

1.2 Chỉ thị phân tử

Chỉ thị phân tử (genetic marker) là một gene hay một đoạn DNA n m trên một vị trí nào đó trên nhiễm sắc thể, có thể được sử dụng để xác định loài, hoặc thậm chí xác định từng cá thể riêng biệt

Ngày nay, chỉ thị phân tử được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: y tế, nông nghiệp, hình sự… Tùy theo từng trường hợp, từng yêu cầu cụ thể của nghiên cứu, ứng dụng mà một hoặc nhiều chỉ thị phân tử có thể được kết hợp sử dụng

Một số chỉ thị phân tử được sử dụng phổ biến hiện nay bao gồm:

 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

 SSLP (Simple Sequence Length Polymorphism)

 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

 RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA)

 VNTR (Variable Number Tandem Repeat)

 Microsatellite polymorphism, SSR (Simple Sequence Repeat)

 SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

 STR (Short Tandem Repeat)

 SFP ( Single Feature Polymorphism)

 DArT (Diversity Arrays Technology)

 RAD markers (Restriction site Associated DNA markers)

tự đã biết, RAPD chỉ sử dụng các mồi oligonucleotid được tổng hợp ngẫu nhiên

từ 9 đến 12 base, bắt cặp ngẫu nhiên với DNA của mẫu thí nghiệm và cho phép khuếch đại chúng lên mà không cần biết trước trình tự nucleotide của mẫu thí nghiệm Khả năng bắt cặp ngẫu nhiên này chính là yếu tố then chốt để RAPD được lựa chọn trong trường hợp nghiên cứu của đề tài này, vì lý do những đột biến có được do chiếu xạ trong đề tài này là những đột biến ngẫu nhiên, không định hướng, thông tin về bộ máy di truyền của chúng hoàn toàn chưa được biết Chỉ thị RAPD chính là những sản phẩm được khuếch đại trên bộ gen của mẫu thí nghiệm

Ưu thế của RAPD là chi phí thấp, có khả năng tạo ra nhiều chỉ thị phân tử với thời gian làm việc ngắn, yêu cầu trang thiết bị không quá khắt khe, phức tạp, đặc biệt là không cần biết trước trình tự của mẫu Tuy nhiên, một điểm bất

lợi luôn được nhắc đến của kỹ thuật này là khả năng lặp lại kết quả không cao so với những phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu

Hình 1.3 : Sơ đồ quy trình RAPD với hai vòng lặp nhiệt ban đầu

1.4 Bức xạ tạo giống

1.4.1 Sơ lƣợc lịch sử chọn tạo giống cây trồng

Chọn tạo giống là việc sàng lọc, lựa chọn, lai tạo và thuần hóa các giống cây trồng theo mục đích của con người Công tác chọn tạo giống cây trồng vốn có lịch sử rất lâu đời và đến nay đã có nhiều phương pháp, kỹ thuật và công nghệ được phát triển để hỗ trợ, trong đó có kỹ thuật chiếu xạ gây đột biến để phục vụ công tác chọn tạo giống, hay còn gọi là bức xạ tạo giống

Năm 1927, H.J Muller đã chứng minh r ng hiện tượng đột biến có thể gây

ra một cách nhân tạo, ông đề nghị nên sử dụng việc chiếu xạ (tia X) trong công

tác chọn tạo giống cây trồng Đến năm 1928, L J Stadler đã mô tả hiệu ứng gây đột biến của tia X và tia Gamma trên lúa mạch và ngô, đây là công trình nền tảng mở đầu cho khoa học bức xạ tạo giống Đến năm 1945 J A Rapoport và các cộng sự đã phát hiện ra tác động gây đột biến của formaldehyde, diethylsulfate và các chất hóa học khác Cùng với các công trình nghiên cứu khác trong thời gian này của C.S Gager A.F Blakeslee, C Auerbach J M Robson cũng như các kết quả nghiên cứu trước đó, các nghiên cứu nêu trên là cơ

sở cho sự ra đời của ngành chọn tạo giống đột biến nói chung và ngành bức xạ tạo giống nói riêng Chủng giống đột biến được tạo ra một cách chủ động đầu tiên với mục đích phục vụ cho chọn tạo giống là vào năm 1934 là chủng thuốc lá Chlorina , giống ngũ cốc đầu tiên được tạo ra là giống đại mạch Jutta tại Đức năm 1944 và giống cây công nghiệp đầu tiên tạo ra là giống bông M.A.9 tại

Ấn Độ năm 1948, các giống này được tạo ra từ nguồn vật liệu qua chiếu xạ tia

X

Phương pháp lai truyền thống và phương pháp chuyển gen cũng là 2 phương pháp hiệu quả trong việc chọn tạo giống Phương pháp lai truyền thống có thể được xem là vô hại đối với sinh giới, vì nó không gây biến đổi bộ máy di truyền của đối tượng mà chỉ đơn thuần là việc lựa chọn các cá thể có những biến dị, kiểu hình tốt và lai tạo chúng với nhau để thu nhận thế hệ con mang những đặc điểm ưu thế lai Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là chỉ có thể tiến hành lai giữa các cá thể cùng loài, việc sàng lọc biến dị và thu nhận thế hệ mang hệ ưu thế lai thường rất mất thời gian Hơn nữa, phương pháp này gần như không tạo

ra được tính trạng mới so với những cá thể tham gia lai ban đầu Phương pháp chuyển gen vượt qua được hạn chế về giới hạn loài, rút ngắn được thời gian thu nhận kết quả và tạo ra được tính trang mới Tuy nhiên, một vấn đề đang gây tranh cãi chưa có hồi kết trong giới khoa học hiện nay đó là ảnh hưởng lâu dài của việc tác động gây biến đổi trực tiếp lên bộ máy di truyền của sinh vật Việc chuyển gen giữa các loài khác nhau nh m tạo ra tính trạng mới bị xem là việc làm trái với sự phát triển tự nhiên của sinh giới Con người vẫn chưa hiểu hết

được cơ chế hoạt động của gen và tác động qua lại của chúng trong bộ gen sinh vật Từ đó, việc chuyển một gen mới và cho biểu hiện ở một sinh vật khác có thể vẫn đang chứa đựng những mối nguy hại tiềm ẩn Dù chưa có kết luận cuối cùng

về lợi hại của việc chuyển gen, nhưng hệ quả trước mắt dễ nhận thấy là các gen

lạ một khi được chuyển thành công vào một sinh vật thì nó có thể phát tán ra ngoài thông qua quá trình giao phấn, giao phối tự nhiên của chúng với các cá thể

có họ hàng gần

Ưu điểm của phương pháp bức xạ tạo giống so với hai phương pháp trên là vừa có thể tạo ra được tính trạng mới, vừa không gây ra tác hại phụ khi cho ra đời các giống cây trồng mới Quá trình bức xạ đột biến vốn là quá trình xảy ra liên tục trong tự nhiên, tuy nhiên chúng xảy ra với tần số rất thấp Bức xạ tạo giống được xem như chỉ đơn thuần việc tăng tần số này lên để tăng cơ hội thu nhận được những tính trạng mong muốn Nhược điểm duy nhất của phương pháp bức xạ tạo giống so với lai và chuyển gen là không định hướng được kết quả, vì các đột biến sẽ xảy ra ngẫu nhiên, vô hướng (tương tự trong tự nhiên)

1.4.2 Một số thành tựu của thế giới

Từ những năm 1970, Cơ quan năng lượng nguyên tử quốc tế (IAEA) và Tổ chức nông lương thế giới (FAO) đã tài trợ mở rộng hướng nghiên cứu gây đột biến cải tạo những giống cây nông nghiệp và cây công nghiệp nhiều nước trên thế giới nh m tạo ra hàng loạt giống mới như: lúa, lúa mỳ, lúa mạch, táo, chanh, mía, chuối và những loại cây trồng khác Cho tới năm 2007 (FAO/IAEA Mutant Varieties Database), trên 2600 giống cây trồng đã được tạo ra b ng gây đột biến thực nghiệm tại nhiều nước trên thế giới Việc ứng dụng kỹ thuật hạt nhân để cải tiến cây trồng đã mang lại hiệu quả cực kỳ to lớn về kinh tế nông nghiệp Ước tính hàng trăm tỷ đô la và hàng trăm triệu hecta gieo trồng b ng những giống cây trồng được tạo ra từ đột biến Cụ thể một số giống cây trồng được tạo giống mới b ng kỹ thuật bức xạ như: c Bermuda, lê, giống lúa nửa lùn Remei, khoai lang, khoai tây, hoa cúc, hoa hồng với màu sắc khác nhau và hình dạng cánh hoa

đa dạng, hoa lan kháng côn trùng và có màu sắc lạ của Nhật bản, cam không hạt của Iran, Vải không hạt A4 của Trung Quốc…

Thành tựu ngành bức xạ tạo giống trên thế giới qua các năm được trình bày

ở biểu đồ bảng 1

1.4.3 Tình hình thực tiễn ở Việt Nam

Ở Việt Nam, các nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống được tiến hành chậm hơn so với thế giới Năm 1966, các nghiên cứu về ảnh hưởng của tia Gamma, nguồn coban 60, DES, DMS đến các biến dị di truyền ở lúa, dâu t m tại

bộ môn Di truyền khoa Sinh Đại Học Tổng Hợp Hà nội (Trịnh Bá Hữu, Phan Phải, Lê Duy Thành) Từ năm 1968 trên đậu Hà Lan của Trần Minh Nam, trên

Nigenla Damastica của Phan Phải (1969-1972), trên lúa Chân Châu lùn và

Trung Quốc 2 của Lê Duy Thành, Trần Duy Quý (1969-1970), tiếp theo là các nghiên cứu trên cây cà chua, táo, lúa ở Viện cây lương thực và thực phẩm (Vũ Tuyên Hoàng và cộng sự 1975-1980) Các nghiên cứu ảnh hưởng của tia gamma của Thái Công Tụng, Nguyễn Văn Mừng (1971-1974)… trên một số cây trồng

Bảng 1.1: Số lượng giống cây trồng thu nhận được bằng phương

pháp bức xạ tạo giống qua các năm

Số lượng giống

Năm 0

500 1000 1500 2000 2500 3000

1966 1971 1976 1981 1986 1991 1996 1999 2002 2007

Sau giải phóng Miền Nam các nghiên cứu chọn tạo giống đột biến phát triển mạnh ở nhiều viện nghiên cứu và các trường Đại học: Đại học Tổng Hợp Hà Nội, Đại học sư phạm Hà Nội, Viện Di truyền Nông Nghiệp, Viện lúa ĐB sông Cửu Long, Viện Khoa Học kĩ thuật Nông Nghiệp Miền Nam, Viện Cây Lương thực và cây thực phẩm, Viện Nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt… Đặc biệt trong những năm gần đây các Viện đi tiên phong và có những thành tựu suất sắc trong nghiên cứu di truyền và chọn giống đột biến ở các cây trồng khác nhau như lúa, ngô, đậu tương, rau hoa: Viện di truyền Nông Nghiệp (Phan Phải, Trần Duy Quý, Nguyễn Hữu Đống, Mai Quang Vinh và các cộng sự, 1984- 2009), Viện Khoa học Nông nghiệp Miền Nam (Đỗ Khắc Thịnh và các cộng sự., 1995-2009), Viện nghiên cứu lúa ĐB sông Cửu Long (Đoàn Văn Ro, Bùi Chí Bửu và các cộng sự., 1990-2009), Viện Cây Lương thực và thực phẩm (Vũ Tuyên Hoàng và cộng sự, 1990-2009), Trường đại hoc sư pham Hà nội I (Nguyễn Minh Công và cộng sự, 1990-2009),Viện Nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt (Lê Xuân Thám và cộng sự, 1998-2009) Viện Di truyền Nông nghiệp là một trong những

cơ sở áp dụng rất sớm kỹ thuật hạt nhân trong chọn giống cây trồng Đến nay, Viện đưa vào sản xuất 12 giống lúa đột biến như DT10, Khang Dân đột biến, Tám thơm đột biến, lúa chịu mặn CM1, các giống lúa nếp DT21, DT22…Trong

đó, giống lúa DT10 được tạo ra từ những năm 1990 đến nay vẫn được sử dụng ở các tỉnh phía Bắc với diện tích khoảng 1 triệu ha gieo trồng Giống Khang dân đột biến hiện đã phát triển hàng vạn h cta và đã được thương mại hóa về bản quyền giống Một số giống cây trồng khác như ngô, lạc đã được Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn công nhận là giống quốc gia, giống khu vực hóa

và được gieo trồng trên hàng vạn h cta trong 20 năm qua Cuối tháng 10/2011, Viện Di truyền nông nghiệp cũng đã công bố nhân giống công nghiệp và bán công nghiệp thành công đối với một số loài hoa và cây lâm nghiệp có giá trị kinh tế cao; tuyển chọn được 18 giống hoa ly ly, 10 giống hồng môn với những sắc màu, kiểu dáng đa dạng có giá trị kinh tế cao và trên 15 vạn cây giống sa nhân, tếch, trầm hương Quy trình công nghệ nhân nhanh giống cây hương liệu

và dược liệu, cây gỗ tếch (một loại vật liệu đóng tàu có giá trị cao) và sa nhân tím (một loài quý hiếm) đã được các nhà nghiên cứu hoàn thiện đưa vào sản xuất

Cho đến nay các nhà khoa học Việt nam chọn tạo được hơn 47 các giống đột biến trên các đối tượng lúa, ngô, đậu tương, cà chua, dâu t m, táo, hoa cúc, hoa hồng… trở thành nước thứ 4 về chọn giống đột biến của châu Á sau Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ và đứng thứ 8 thế giới sau Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật, Liên Xô cũ, Hà Lan, Đức, Mỹ

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng, vật liệu xác định chỉ thị phân tử

Đối tượng được dùng làm vật liệu để xác định chỉ thị phân tử gồm:

 3 đối chứng (nguyên liệu tạo đột biến) là 3 chủng giống nông nghiệp

hoa Cúc thuộc loài Chrysanthemum morifolium Ramat.:

 Giống cúc artfarm trắng, ký hiệu là C1

 Giống cúc đóa trắng, ký hiệu là C6

 Giống cúc Saphia vàng, ký hiệu là C29

 6 dòng cúc đột biến tiềm năng phát sinh từ đối chứng của chúng ở thế

hệ M1V3 (xem chi tiết sàng lọc đột biến ở phụ lục)

 Đột biến của C1: A4 và A34

Loại bức xạ/

1 C1

Giống Artfarm trắng

Giống gốc (đ/c)

- Chiều cao thân cây trung bình 112.67 cm (108

- 117cm)

- Số lượng hoa trung bình 8,33 hoa/cây

- Kích thước cụm hoa trung bình: 5,8 - 8,7 cm

- Hoa màu trắng, cánh hoa xếp xen kẽ khoảng 3 – 4 lớp, phía trong là những cánh nh xếp sít nhau trông như nhụy hoa có màu vàng xanh;

hoa tròn đều

2 A4 Xray 20 Gy

- Cánh hoa chuyển màu vàng, kết cấu bông không có gì thay đổi, hoa hơi m o không tròn đều cân đối

- Cây lùn : 70,2 cm; thân nh

- Cánh hoa chuyển màu tím, cấu trúc hoa không khác biệt so với giống gốc, phần cánh nh như nhụy chuyển màu tím nhưng phần giữa vẫn giữ màu hơi xanh

- Thân cây chuyển màu hơi tím

4 C6

Giống đóa trắng

Giống gốc (đ/c)

- Chiều cao thân cây trung bình 100.07 cm (95,4 - 113cm)

- Số lượng hoa trung bình 10,67 hoa/cây

- Kích thước hoa cái lớn nhất trên cây để bông chùm: 8,2 cm

- Hoa màu trắng cánh hoa nhiều lớp, cánh hoa hơi cong, phía trong là những cánh nh xếp sít nhau có màu hơi vàng; hoa tròn

- Thân cây màu xanh

5 B3 Proton 30 Gy - Hoa chuyển màu vàng, cấu trúc bông bình

Giống gốc (đ/c)

- Chiều cao thân cây trung bình 95.07 cm (90 - 109,6cm)

- Số lượng hoa trung bình 9,67 hoa/cây

- Kích thước hoa cái lớn nhất trên cây để bông chùm: 7,1 cm

- Hoa màu vàng tươi cánh hoa nhiều lớp, cánh hoa thẳng, hơi cong vào giữa (dạng cánh tự cuốn tròn); hoa tròn đều

- Thân cây màu xanh

50 Gy

- Hoa lớn bất thường: hoa nh nhất trên cây đạt kích thước 7,4cm và hoa lớn nhất đạt 8,7 cm

- Hình dạng, kích thước cây bình thường

9 F29 Gamma 50Gy - Hoa màu đ sậm, cấu trúc bông bình thường

Hình 2.1: Hoa cúc artfarm trắng đối chứng

Hình 2.4: Hoa cúc đóa trắng đối chứng

Hình 2.3: Dòng đột biến A34 Hình 2.2: Dòng đột biến A4

Hình 2.7 : Hoa cúc saphia vàng đối chứng

Kỹ thuật RAPD được sử dụng để tìm ra các băng đa hình đặc trưng cho từng dòng cúc Trong nghiên cứu này, 33 mồi RAPD của hãng Operon được sử dụng thuộc các nhóm mồi BIO, OPA, OPC, OPM, OPN, S, và UBC

Bảng 2.2: Tên và trình tự các mồi RAPD

2.1.2 Đối tƣợng và vật liệu khảo sát và đánh giá tính ổn định di

truyền của các dòng cúc đột biến qua các thế hệ in vitro

Mồi RAPD được sử dụng trong việc khảo sát và đánh giá tính ổn định di truyền là 14 mồi: BIO27, OPC10, OPC11, OPN3, OPN5, OPN10, OPN14, OPN15, S201, S202, S208, S256, S285 và UBC706

Vật liệu nghiên cứu là các mẫu được tách chiết ở các thế hệ M1V6, M1V8, M1V10 và M1V12, bao gồm:

Các mẫu đối chứng: C1 và C6

Các mẫu đột biến: A4, A34, B3 và B14

Bảng 2.3 : Kí hiệu, đặc điểm hoa và nguồn gốc của các mẫu nghiên cứu

in vitro

1 C1-1 - Chiều cao thân cây trung bình 112.67 cm (108

- 117cm)

- Số lượng hoa trung bình 8,33 hoa/cây

- Kích thước cụm hoa trung bình: 5,8 - 8,7 cm

- Hoa màu trắng, cánh hoa xếp xen kẽ khoảng 3 – 4 lớp, phía trong là những cánh nh xếp sít nhau trông như nhụy hoa có màu vàng xanh;

5 A4-1 - Cánh hoa chuyển màu vàng, kết cấu bông

không có gì thay đổi, hoa hơi m o không tròn đều cân đối

9 A34-1 - Cánh hoa chuyển màu tím, cấu trúc hoa không

khác biệt so với giống gốc, phần cánh nh như nhụy chuyển màu tím nhưng phần giữa vẫn giữ màu hơi xanh

- Thân cây chuyển màu hơi tím

- Số lượng hoa trung bình 10,67 hoa/cây

- Kích thước hoa cái lớn nhất trên cây để bông chùm: 8,2 cm

- Hoa màu trắng cánh hoa nhiều lớp, cánh hoa hơi cong, phía trong là những cánh nh xếp sít nhau có màu hơi vàng; hoa tròn

- Thân cây màu xanh

22 B14-3 - Cấu trúc hoa bình thường M1V8

2.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tạo vật liệu nghiên cứu

Việc tạo vật liệu nghiên cứu cho đề tài này đã được tiến hành tại Trung tâm Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong công nghiệp từ năm 2009 Trong luận văn này chỉ trình bày sơ lược về các bước tiến hành

Quy trình tạo ra các giống đột biến cũng như cấy chuyền đối chứng qua các thế hệ được thực hiện qua các bước sau:

- Mẫu cánh hoa từ 3 giống đối chứng (C1, C6 và C29) được thu nhận từ

vườn của nông dân để vô mẫu in vitro

- Các mẫu này được trồng lại một lần ngoài đồng để kiểm tra tính ổn định của kiểu hình và để đảm bảo không bị nhầm giống

- Sau khi trồng kiểm tra lại ngoài đồng, các mẫu cánh hoa được thu nhận lại

từ một cánh hoa duy nhất từ mỗi giống để đảm bảo tính đồng nhất về bộ máy di truyền của mẫu thí nghiệm

- Các mẫu này được nuôi cấy in vitro và cho ra chồi trong ống nghiệm

- Các chồi khi đạt độ dài khoảng 2-3 cm sẽ được cắt để làm hạt nhân tạo, chuẩn bị cho việc chiếu xạ

- Tạo hạt nhân tạo:

o Chồi nuôi cấy trong môi trường MS l ng, có chứa natri alginate

o Dùng ống hút (pipet nhựa) hút chồi và cả môi trường nuôi cấy của

nó và nh vào ly chứa calcium chloride

o Natri alginate và calcium chloride sẽ phản ứng tức thì và tạo ra một lớp màng tinh thể bọc phía ngoài, bên trong chứa môi trường và chồi

- Các hạt nhân tạo sau khi vớt ra kh i ly calcium chloride được bảo quản trong chai chứa dầu ăn để thuận tiện vận chuyển

- Các hạt nhân tạo được đưa sang Nhật Bản để chiếu xạ với các liều chiếu đã tính toán Việc chiếu xạ được tiến hành với 50hạt/liều chiếu/loại chiếu xạ Song song với các hạt được chiếu xạ thì mỗi mẫu cũng được giữ lại 50 hạt đối chứng

- Các hạt chiếu xạ và không chiếu xạ được đem về Việt Nam, cho tái sinh cây và trồng ra đồng ruộng để sàng lọc đột biến

- Quy trình cho cây in vitro ra đồng ruộng:

o Cây con trong chai từ phòng nuôi cấy được đem ra đồng (đem cả chai) và cho cây tập nắng từ 3 đến 4 ngày

o Sau đó, cây được lấy ra kh i chai, rửa sạch môi trường và trồng trên

vĩ chứa giá thể sạch (Đất sạch Bến Tre - loại được bán phổ biến trên thị trường) trong nhà nilon có lưới che 50% nắng

o Sau 7-8 ngày trên vĩ, cây bắt đầu xanh lại (cây tỉnh) thì có thể phun chất kích thích sinh trưởng để cây phát triển tốt hơn Các vĩ vẫn đặt trong nhà nilon

o Sau 25-30 ngày thì cho cây ra đất bình thường và ra kh i nhà nilon Cây con được trồng thành các luống và chăm sóc theo các quy trình chăm sóc bình thường của nông dân

- Sau khi sàng lọc được các đột biến tiềm năng, các bước tiếp theo để thu nhận vật liệu nghiên cứu được trình bày chi tiết trong phụ lục 1

2.2.2 Tách chiết DNA

Phương pháp tách chiết DNA tổng số dựa theo quy trình CTAB (Kurt Weising DNA fingerprinting, 2005) có cải tiến

Quy trình tách chiết DNA:

1 Nghiền tối đa 3g mẫu lá tươi thành bột mịn b ng cối và chày sứ trong dung dịch nitrogen l ng

2 Chuyển mô được nghiền vào 800l dung dịch đệm CTAB làm ấm trước ở

600C trong ống eppendorf 2ml có nắp đậy Đệm CTAB được (cải tiến) bổ sung dung dịch SDS 10%

3 Ủ 30 phút ở 600C trong bể ổn nhiệt Đảo nhẹ 10 phút/lần

4 Bổ sung dung dịch chloroform–isoamyl với tỷ lệ 1:1, trộn nhẹ nhàng nhưng đủ để xuyên suốt đầu tới cuối để đảm bảo sự nhủ tương hóa các pha

5 Ly tâm 11.000 vòng trong 15 phút, nhiệt độ phòng Pha l ng (phía trên)

có thể được chiết lại một lần với dung dịch chloroform–isoamyl sạch với tỷ lệ 1:1

6 Chuyển phần pha l ng cuối cùng vào eppendorf

7 Thêm dung dịch isopropanol tinh khiết với tỷ lệ 1:1, bọc b ng parafilm, trộn nhẹ nhưng xuyên suốt đầu cuối b ng cách đảo ngược ống vài lần Ở giai đoạn này, phức DNA-CTAB có thể kết tủa ở dạng mạng hơi trắng Trong trường hợp này, mang phần kết tủa ra kh i dung dịch b ng cách sử dụng móc thủy tinh (như pipet Pasteur cong), chuyển nó sang ethanol 70% (bước 8) và để cho khô (bước 9) Nếu mẫu xuất hiện tình trạng đóng cục, vẫn đục hay trong như nước sau khi trộn với isopropanol (vốn thường xảy ra trong trường hợp này), thu tủa

b ng việc ly tâm 11,000 vòng trong 15 phút ở nhiệt độ phòng Nếu quan sát được các viên vón, tiếp tục bước 8 Nếu không, để dung dịch trong tủ lạnh âm -

200C trong từ 30 phút đến qua đêm và ly tâm lại lần nữa, có thể ở tốc độ cao hơn

8 Thêm 100l ethanol 70%, rung động nhẹ nhàng phần vón vài phút sau đó thu b ng cách ly tâm 11.000 vòng trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Phần CTAB

dư được loại b trong bước này

9 Lật ngược ống và cho dịch thoát ra vào giấy thấm khoảng 1 giờ Cẩn thận

để phần vón không được trượt ra kh i thành ống eppendorf Phần vón nên không chứa ethanol dư mà cũng không được trở nên quá khô Trong cả hai trường hợp, việc hòa tan lại sẽ khó khăn

10 Cho thêm một thể tích thích hợp nước cất và để cho các viên vón hòa tan lại ở 400C mà không cần phải rung động Sự hòa tan của DNA trong lượng phân

tử cao có thể diễn ra từ vài giờ đến qua đêm

11 Bổ sung RNase A được xử lý làm nóng đến nồng độ 250g/ml Trộn, ủ ở

370C trong 2 giờ

12 Thêm 5% thể tích dung dịch NaCl 5M (nồng độ cuối là 0.25M), trộn đều

13 Thêm 3.5% thể tích cồn 100%, trộn b ng cách đảo ngược và giữ trong nước đá khoảng 10 phút Polysaccharide sẽ kết tủa trong bước này

14 Ly tâm 11,000 vòng trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Chuyển dịch nổi sang ống mới

15 Bổ sung dung dịch isopropanol theo tỷ lệ thể tích 1:1, trộn b ng cách đảo nhẹ vài lần và giữ trong 1 giờ ở -200C

16 Ly tâm 11.000 vòng trong 15 phút ở nhiệt độ phòng, rửa tủa trong ethanol 70% và ly tâm lại lần nữa

17 Đổ b dịch nổi và hòa tan lại trong nước cất Bảo quản ở -200C

2.2.3 RAPD-PCR

RAPD-PCR được tiến hành với các thành phần phản ứng như sau:

DNA mẫu 25ng, dung dịch đệm PCR 1X, MgCl2 2mM, dNTP 10µM, Taq polymerase 1U, mồi RAPD 1µM và bổ sung H2O để tổng thể tích phản ứng

là 15µl Chu trình nhiệt phản ứng PCR được trình bày ở bảng 2

Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng RAPD-PCR

Bước Phản ứng Nhiệt độ ( o C) Thời gian Chu kỳ

40

2.2.4 Điện di trên gel agarose

Sản phẩm PCR được phân tách b ng điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TBE 1X Thực hiện điện di ở điện thế 100 V, 90mA trong khoảng 30 phút Nhuộm bản gel với ethidium bromide trong 10 phút Hiển thị sản phẩm khuếch đại dưới ánh sáng đèn cực tím (UV) của máy soi gel Sản phẩm khuếch đại được nhận biết nhờ kích thước của chúng dựa vào thang DNA chuẩn 1kb

2.2.5 Thống kê, phân tích số liệu

Các số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Microsoft Office Excel 2003 Các băng DNA được ghi nhận sự có mặt (1) hoặc vắng mặt (0) của chúng trên gel Các số liệu được xử lý b ng chương trình Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System computer program version 2.01 (NTSYS-pc2.01) (Rohlf., 2000) để xác định hệ số tương đồng di truyền và xây dựng cây phân loại

Tính toán hệ số tương đồng được dựa theo công thức:

Trong đó: - nij là số băng DNA có ở cả hai mẫu i và j

- ni và nj là tổng số băng RAPD của từng cá thể i và j tương ứng

- Jij là hệ số tương đồng giữa hai mẫu i và j

 Chạy phản ứng PCR và soi gel

- PCR buffer 1X, MgCl2 2mM, dNTP 10µM, Taq polymerase

1U, H2O

- Ethidium bromide

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1 Kết quả xác định chỉ thị phân tử

3.1.1 Kết quả tách chiết DNA xác định chỉ thị phân tử

3 giống đối chứng và 6 dòng đột biến tiềm năng được thu nhận mẫu lá ở thế

hệ M1V3 để tách chiết DNA Kết quả tách chiết này được kiểm tra b ng điện di trên gel agarose 0.8% và đo OD ở bước sóng 260nm và 280nm

9 băng DNA thu được của các mẫu khá gọn và đồng đều chứng t chất lượng DNA của các mẫu là tốt, không bị đứt gãy hay lẫn tạp Tỉ lên OD260/OD280

n m trong khoảng 1,8-2.0, đủ tiêu chuẩn thực hiện các nghiên cứu tiếp theo Kết quả điện di cũng cho thấy DNA có nồng độ tương đối cao

Hình 3.1 : Kết quả tách chiết DNA của 3 giống đối chứng và 6 dòng đột biến

3.1.2 Kết quả các phản ứng RAPD xác định chỉ thị phân tử

Số liệu thống kê kết quả RAPD với 33 mồi (297 phản ứng PCR) được trình bày ở bảng 6

Qua bảng thống kê cho thấy: số băng nhân lên được với 297 phản ứng PCR

là 1511 băng, trong đó 155 băng đa hình (chiếm 63,01%) và 91 băng đơn hình (chiếm 36,99%) Kích thước băng nh nhất dưới 200bp và kích thước băng lớn nhất khoảng 3000bp 21 băng chỉ có ở một mẫu duy nhất và 16 băng chỉ thiếu

vắng ở một mẫu duy nhất Mồi OPA2 nhân lên được tổng số băng nhiều nhất (74 băng) và mồi OPA6 nhân được tổng số băng ít nhất (19 băng)

Bảng 3.1: Thống kê số băng DNA thu được của 9 mẫu hoa cúc với 33 mồi RAPD

Hình ảnh và phân tích kết quả RAPD cho từng mồi: xem phụ lục 3 và 4

3.1.3 Kết quả phân tích đa dạng di truyền 3 giống cúc và các đột biến

phát sinh từ chúng

Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD với 33 mồi được thống kê và phân tích b ng chương trình NTSYS 2.1 từ đó đã thiết lập được bảng hệ số tương đồng di truyền như bảng dưới

Bảng 3.2: Hệ số tương đồng di truyền giữa 9 mẫu giống hoa cúc

Hệ số tương đồng:

Kết quả thu được cho thấy, hệ số tương đồng giao động từ khoảng 0,62 đến 0,96 Trong đó, hệ số tương đồng cao nhất 0,96 là giữa cặp C1-A4 Hệ số tương đồng nh nhất: 0,62 là giữa cặp F7-B14

Mức độ đa dạng di truyền giữa 9 dòng/giống cúc nghiên cứu ở mức trung bình Mức độ đa dạng thấp hơn giữa các dòng cúc đột biến cũng được tác giả Lema báo cáo[10]

Dựa vào mức độ đa dạng di truyền này có thể thấy, các dòng đột biến tuy có khác biệt so với giống đối chứng, nhưng sự biến đổi là không nhiều Khoảng cách di truyền giữa các đột biến với đối chứng của chúng (hệ số tương đồng trên 85%) vẫn gần hơn rất nhiều so với khoảng cách di truyền giữa các giống đối chứng (hệ số tương đồng dưới 75%) Chúng ta có thể thấy rõ điều đó qua cây sơ

đồ dưới, các mẫu hoa cúc đột biến được nghiên cứu được xếp rõ ràng thành từng nhóm chung với giống đối chứng của chúng

Hình 3.2: Cây sơ đồ đa dạng di truyền của 9 dòng/giống cúc nghiên cứu

3.1.4 Kết quả xác định chỉ thị RAPD cho từng dòng cúc đột biến

Kết quả phân tích hình điện di và ma trận dữ liệu về sự xuất hiện/thiếu vắng các băng cho thấy có sự xuất hiện/thiếu vắng một cách đặc biệt của 37 băng, trong đó có 21 băng chỉ có ở một mẫu duy nhất và 16 băng chỉ thiếu vắng ở một mẫu duy nhất

Phân tích chi tiết một số hình điện di điển hình giúp xác định chỉ thị RAPD cho từng dòng cúc đột biến:

Hình 3.3: Chỉ thị cho dòng A34: Mồi OPC10 – băng 350bp

Hình 3.4: Chỉ thị cho dòng A4: Mồi OPN10 – băng 650bp

Hình 3.5: Chỉ thị cho dòng B3 và F7: Mồi OPC2 – lần lượt các băng 550 và 650bp

Hình 3.6: Chỉ thị cho dòng B14: Mồi S258 – băng 1200bp

Hình 3.7: Chỉ thị cho dòng F29: Mồi OPN7 – băng 250 và 650bp

Ngoài một số các chỉ thị đã phân tích ở trên, các dòng cúc đột biến còn có các mồi và băng chỉ thị khác Chi tiết được tổng hợp đầy đủ ở phần kết luận Như đã nói ở trên, các mẫu khảo sát có thể phân thành 3 nhóm, mỗi nhóm bao gồm một giống gốc và các dòng đột biến phát sinh từ chúng

Qua khảo sát, chúng tôi cũng nhận thấy sự xuất hiện của 24 băng chỉ có ở tất cả các mẫu trong của hai nhóm mà không có ở nhóm còn lại và 32 băng chỉ

có ở tất cả các mẫu trong một nhóm mà không có ở hai nhóm còn lại Dựa vào

cả hai kiểu xuất hiện băng này đều có thể sử dụng cho nhận dạng/phân biệt 3 nhóm, các marker nhận dạng như vậy được trình bày trong bảng sau trong bảng sau:

Bảng 3.3: Marker nhận dạng các giống/dòng cúc theo nhóm

TT Băng/mồi Sự xuất hiện hay thiếu vắng băng

Nhóm C1 Nhóm C6 Nhóm C29

1 1.450bp mồi OPM9 + + -

2 1.300bp mồi OPM9 + - -

3 700bp mồi S256 - + -