Các nướcđông nam Á, trong đó có Việt nam có tỷ lệ UTVMH trung bình.Virut Epstein - Barr EBV, các yếu tố môi trường khác và sự nhạy cảm di truyền đều cho là liên quan đến nguyên nhân ung
Trang 1ĐẶT VẤN ĐỀ
Tỷ lệ ung thư vòm mũi họng (UTVMH) thay đổi rất khác nhau ở các quần thể dân cư và các vùng địa lý khác nhau trên thế giới Nơi có tỷ lệ ung thư vòm cao nhất là miền Nam Trung Quốc và Grơnlen, trong khi ở châu Âu lại có tỷ lệ rất thấp Các nướcđông nam Á, trong đó có Việt nam có tỷ lệ UTVMH trung bình.Virut Epstein - Barr (EBV), các yếu tố môi trường khác và sự nhạy cảm di truyền đều cho là liên quan đến nguyên nhân ung thư vòm mũi họng và EBV là yếu tố được nghiên cứu nhiều nhất
EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng thể ung thư biểu mô không biệt húa và tồn tại các thể nhiễm tiềm ẩn I và II, trong đó EBV biểu lộ các gen quan trọng là EBNA1, LMP1 và 2 EBNA1 giúp duy trì bộ gen EBV trong tế bào chủ, trong khi LMP1 lại là một gen có chức năng quan trọng liên quan đến dẫn truyền tín hiệu, chống lại sự chết theo chương trình của tế bào và có khả năng sinh ung thư trong các tế bào bị nhiễm Các gen này nằm xa nhau trong bộ gen và được biểu lộ nhờ những promoter khác nhau EBNA1 được biểu lộ trong các thể nhiễm tiềm ẩn nhờ sự hoạt húa các promoter, bao gồm Cp, Wp và Qp Tuy nhiên trong ung thư vòm mũi họng hai promoter Cp và Wp không hoạt động mà chỉ có Qp điều hũa biểu lộ gen EBNA1
Ngoại di truyền được cho là có vai trò rất quan trọng trong điều hũa biểu lộ gen, chúng bao gồm methyl húa ADN vùng promoter, sửa chữa histon và nucleosom Mức độ methyl húa xảy ra ở các vị trí CpG của ADN tại vùng promoter và exon1 có vai trò trong điều hũa biểu lộ gen, có thể làm giảm biểu lộ hoặc không biểu lộ hoàn toàn một gen mà bình thường vẫn được biểu lộ Việc xác định mức độ methyl húa vùng khởi động của một gen có ý nghĩa quan trọng trong tìm hiểu cơ chế bệnh sinh của bệnh liên quan đến chức năng gen đó trong nhiều quá trình bệnh lý như ung thư, đồng thời dấu ấn này cũng
22
Trang 2góp phần trong chẩn đoán sớm trong ung thư Ngoài ra, việc làm mất methyl húa có tác dụng làm gen hoạt động trở lại và thực hiện chức năng của chúng, giúp cho việc điều trị những rối loạn hay bệnh lý khác nhau
Hiện nay, nhờ những tiến bộ của sinh học phân tử người ta có thể xác định được mức độ methyl húa của một gen đặc hiệu hay toàn bộ bộ gen Các kỹ thuật này dựa vào những nguyên lý khác nhau, có những kỹ thuật rất phức tạp, nhưng có những ký thuật đơn giản và thông dụng Chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl húa theo nguyên lý xử lý ADN bằng phương pháp bisulfite để xác định mức độ methyl húa các promoter Wp, Cp và Qp liên quan đến biểu lộ gen EBNA1, đồng thời phát triển PCR đa mồi đối với các promoter đó Việc phát triển PCR đa mồi đặc hiệu methyl húa giúp ích cho nghiên cứu ngoại di truyền ở mức độ ADN của nhiều gen, đặc biệt là các gen ức chế ung thư
Đề tài này nhằm mục đích sau:
1 Tìm điều kiện tối ưu cho một phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu methyl húa cho các promoter Wp, Cp và Qp của EBV, sử dụng các nguyên liệu là các tế bào dòng.
2 Ứng dụng PCR đa mồi đặc hiệu xác định mức độ methyl húa các promoter điều hũa biểu lộ gen EBNA1 trong các mẫu sinh thiết bệnh nhân ung thư vòm mũi họng.
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
22
1.1.Tình hình ung thư vòm mũi họng trên thế giới và Việt Nam.
Ung thư vòm mũi họng (UTVMH), một khối u phát triển từ các tế bào biểu
mô nằm ở vị trí cửa mũi sauvà vòm họng, là loại đứng hàng đầu trong số các ung thư vùng đầu mặt cổ, với tính chất dịch tễ học khá đặc biệtlà liên quan tới địa lý.Tỷ
lệ mắc chuẩn theo tuổi trên thế giới có thể xếp thành 3 vùng rất khác nhau:Khu vực
Trang 3có tỷ lệ mắc cao nhất là miền Nam Trung Quốc và Grơnlen với tỷ lệ mới mắc từ 30
- 40/100.000 dân/năm Ngược lại, vùng có tỷ lệ mắc thấp, gồm châu Âu, Mỹ chỉ
từ 0,7 - 1/100.000 dân/ năm Còn lại là vùng có tỷ lệ mắc trung bình nhưng ngày càng có xu hướng tăng lên, đó là vùng Bắc Phi, vùng biển Caribee và đông nam
Á với tỷ lệ từ 8 - 12/100.000 dân (23,39)Ở Việt nam UTVMH đứng hàng thứ 5 trong các ung thư nói chung và đứng hàng đầu trong các ung thư ở vùng đầu mặt
cổ [4]
1.2 Những yếu tố nguy cơ liên quan đến UTVMH
1.2.1 Vai trò của virut Epstein - Barr
VirutEpstein - Barr (EBV), là một trong các yếu tố môi trường và được nghiên cứu nhiều nhất cho thấy có liên quanchặt chẽ của nú với UTVMH Người ta phát hiện thấy EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng thể ung thư biểu
mô không biệt húa (UCNT) và EBV được phát hiện là từ tế bào UTVMH chứ không phải từ lympho thâm nhiễm đã được chứng minh từ chuột trụi lông được truyền khối u lấy từ bệnh nhân UTVMH, khối u này không chứa lympho thâm nhiễm (Klein và cs 1974) [trích từ 89] Ngoài ra, các sản phẩm gen của EBV là EBER, EBNA1 và LMP-1,-2 đã được xác định ở hầu hết các mẫu sinh thiết UTVMH hoặc ở tổn thương quá sản tại biểu mô vòm họng gồm những dòng tế bào tiền ác tính nhiễm EBV Điều này phù hợp với giả thuyết cho rằng EBV làmột trong những yếu tố khởi phát trong cả quá trình nhiều bước dẫn đến sự phát triển của UTVMH [124]
22
Ngoài việc phát hiện EBV và sản phẩm của nú trong khối u vòm họng, người ta cũng xác định được các kháng thể chống EBV trong huyết thanh bệnh nhân Lượng kháng thể IgG và IgA trong huyết thanh bệnh nhân UTVMH cao hơn
8 - 10 lần so với những bệnh nhân ung thư đầu mặt cổkhác hoặc người khỏe về lâm sàng (Henle và cs 1970, 1973; Klein và cs 1970) [trích từ 89 c.binh] Đặc biệt IgA/ VCA (kháng nguyên vỏ của EBV), một xét nghiệm sử dụng rộng rãi, thường qui
ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam [6],[8],[7],[13],[18],[25],[156] , có
Trang 4giá trị để theo dõi và phát hiện nguy cơ mắc UTVMH, đồng thời cũng có giá trị là một dấu ấn quan trọng theo dõi tái phát sau điều trị bệnh khi nó tăng cao( ref) Người ta cho rằng sự tái hoạt hóa, sao chép và nhân lên của EBV là hiện tượng xảy ra trong suốt quá trình phát triển của UTVMH và nó tương quan với nồng độ IgA/VCA[89]
1.2.2 Môi trường sống và thói quen sinh hoạt
Nhiều tác giả đã đề cập đến môi trường sống như khí hậu, bụi, khói ô nhiễm liên quan đến UTVMH, nhưng được nói đến nhiều nhất là tập quán ăn uống Nhiều nghiên cứu bệnh - chứng được tiến hành đã thu được những kết quả phù hợp với ý kiến cho rằng, tập quán ăn cá mối của người Trung Quốc (vùng Quảng Đông) là nguyên nhân quan trọng gây UTVMH, mối liên quan này lớn hơn nếu ăn cá muối ngay từ nhỏ Dùng cá muối hàng ngày có thể làm tăng tỷ lệ UTVMH lên 1.8 đến 7.5 lần Sử dụng thuốc là cây cỏ cũng liên quan đến UTVMH thông qua hoạt hóa EBV hoặc trực tiếp thông qua ảnh hưởng đến tăng trưởng đến các tế bào chuyển dạng do EBV Các bằng chứng khác như hút thuốc lá hoặc dùng formadehyde có giá trị thấp trong bệnh sinh ung thư vòm họng
1.2.3 Yếu tố di truyền
Người ta thấy rằng người Trung Quốc sinh ra ở Bắc Mỹ có một tỷ
lệ mắcthấp hơn so với những người sinh ra ở đất nước Trung Quốc, nhưng tỷ lệ
22
mắc chuẩn vẫn cao hơn dân số nói chung [2] Điều đó cho thấy rằng yếu tố
di truyền có vai trò trong bệnh sinh của UTVMH.Ở Việt Nam, việc nghiên cứu mối liên quan giữa HLA và UTVMH cho thấy có tăng nguy cơ mắc UTVMH với tăng tần suất các kháng nguyên A11, A2, B17 và liên kết mất cân bằng A2-B17, A11- B17 [13],[20] Việc xác định các gen khác liên quan với tính cảm thụ bệnh
lý cũng đã được nghiên cứu : CYP 2E1 (chuyển hóa nitrosamine), glutathion transferase M1 [111],[153] Cơ chế tác động của chúng cho đến nay vẫn chưa được
rõ ràng, song điều hiện nay đã và đang được khẳng định là sự phát triển UTVMH
là do sự phối hợp tác động của 3 yếu tố môi trường sống, EBV và HLA
Trang 51.3 Virut Epstein - Barr
1.3.1 Sinh học của EBV
Trên thực tế, hơn 90 % người trưởng thành trên thế giới nhiễm EBV và nú tồn tại lâu dài trong cơ thể nhiễm Việc lây nhiễm EBV chủ yếu thông qua nước bọt và ở lứa tuổi rất sớm của đời sống con người mà thường không có triệu chứng Ngoài ra, EBV có thể được lây nhiễm qua máu, tổ chức và cũng có thể qua sữa của
mẹ truyền sang con, thậm chí là thông qua quan hệ tình dục EBV nhân lên trong tuyến nước bọt, sau đó qua biểu mô vòm họng rồi xõp nhập vào tế bào lympho B qua thụ thể CD21 trên bề mặt tế bào Sau khi đi vào nhân tế bào, EBV tồn tại ở dạng vòng là chủ yếu và tự nhân lên nhờ nguyên liệu của tế bào Tuy nhiên, EBV cũng tích hợp vào DNA của nhiễm sắc thể tế bào chủ, ví dụ ở tế bào dòng Namalwa, nú tích hợp vào nhiẽm sắc thể ở vị trí 1p35 Ở thể nhiễm tiềm ẩn trong lympho B, EBV biểu lộ rất ít kháng nguyên, hơn nữa với số lượng tế bào nhiễm quá thấp (1 tế bào lympho B/ 1ml máu) do đó EBV khó bị tiêu diệt bởi hệ miễn dịch Khi ở thể dung giải, EBV nhân lên nhiều và giải phóng ra ngoài rồi lại nhiễm vào các tế bào
22
lympho khác, chúng đến tuyến nước bọt và hình thành chu kỳ nhân lên trong
cơ thể
Với những tế bào biểu mô không biểu lộ rexeptơ CD21, người ta cho rằng virut có thể vào bằng những cách sau:Khả năng thứ nhất: có thể xảy ra là sự tiếp cận giữa tế bào biểu mô vòm họng và tế bào nhiễm EBV Tế bào B đi vào chu trình dung giải, bung ra các bản sao của virus, cung cấp một số lượng lớn các hạt virus mới cho các tế bào khác trên một diện rộng (Bayliss và Wolf 1980,1981) [trích từ
89] Và khả năng thứ hai: virus vào tế bào biểu mô bởi hiện tượng thực bào qua trung gian rexeptơ với IgA (Sixbey và Yao, 1992) [trích từ 89].Ngoài ra, phân tử MHC lớp II cũng có thể là con đường chính virus xâm nhập vào tế bào biểu mô [10] Ngoài các tế bào lympho B và tế bào biểu mô, đôi khi EBV còn bị tấn công bởi các tế bào máu khác như đai thực bào, lympho T hoặc tế bào diệt tự nhiên (Nature Killercell)
Trang 61.3.2 Cấu trúc của EBV
EBV thuộc loại virut herpes, gamma-1, chiều dài bộ gen của nú khoảng 172
- kb và ADN là chuỗi đôi, GC chiếm 60% tổng số nucleotid.Suốt chiều dài của gen
có thể chia làm 4 vùng chính: 1 chuỗi ngắn duy nhất (US- short unique ), 1 chuỗi lặp ( IR- internal repeat), 1 chuỗi dài duy nhất (UL - long unique ) và 1 chuỗi lặp cuối cùng ( TR - terminal repeat ) EBV hình thành phân tử DNA dạng vòng ở tế bào bị nhiễm bởi đầu TRcủa nú (hình 1A) Khi xử lý EBV của dòng tế bào B95 - 8 bằng emzym cắt giới hạn BamHI, các đoạn gen tạo ra được ký hiệu theo bảng chữ cái và theo thứ tự kích thước giảm dần (hình 1B) Thuật ngữ sử dụng cho từng đoạn như sau: Theo mỗi chữ là ký hiệu cho từng đoạn ( A, B …), đọc trực tiếp ( trái hoặc phải) và số bắt đầu theo thứ tự (1,2,3…) ví dụ như BARF0, BARF1 EBV của dòng tế bào B95 - 8 được giải trình tự gen đầu tiên, và có mã số tại ngân hàng gen là V01555 [1]
22
trong nhân tế bào chủ, cũng như chức năng phiên mã của virut [65, 66] Vùng gắn ADN của protein EBNA1 tương tác với hai vùng nằm ở vùng oriP của prụmụtơ Cp, bao gồm gia đình lặp đi lặp lại FR (Family of Repeat) có chứa 20 đoạn nucleitid có trình tự lặp, đoạn DS (Dyat Symetry) có 4 vị trí gắn, và một vùng
có hai vị trí gắn xuôi chiều của Qp
Hình 2 Cấu trúc của EBNA1
Liên kết EBNA1 với vùng FR có ái tính cao nhất so với DS và Qp và khi gắn với FR thì nó điều hòa phiên mã các gen EBNA Các gen này được biểu lộ dưới sự kiểm soát của prômôtơ Cp hay các prômôtơ Wp EBNA1 cũng có thể liên kết với các intron đầu tiên xuôi chiều của prômôtơ Qp làm tự điều hòa biểu lộ protein EBNA1 [72] Ở các thể nhiễm tiềm ẩn I và II, các prômôtơ Cp không hoạt động và biểu lộ của EBNA1 được thực hiện bởi Qp Cp không hoạt động do các yếu tố phiên mã và methyl hóa ADN [73, 74]
1.3.4.2 EBNA2
Trang 7Protein EBNA2, có trọng lượng phân tử từ 75-105 kDa Do có trình tự gen khác nhau ở các chủng EBV mà người ta xếp thành EBNA2A và EBNA2B, cũng
là dấu ấn quan trọngđể xếp loại EBV typ I và typ II [78] Các protein EBNA2A và EBNA2B chứa 484 và 443 axit amin một cách tương ứngvà giống nhau về trình tự khoảng 57% [79, 80] EBNA2 là một trong những protein virut đầu tiên được biểu
lộ ở các tế bào lympho B bị nhiễm, xuất hiện 24-48 giờ sau khi nhiễm EBV ở nuôi cấy tế bào in vitro[81] Protein này là mộtchất kích hoạt phiên mã gen đặc hiệu của virut và tế bào bao gồm cả những gen như CD21, CD23, Bcl-2 và c-myc [82, 83],
và là cần thiết cho sự bất tử của tế bào B trong in vitro [84, 85] EBNA2 không
gắn trự tiếp với ADN, nhưng tác động thông qua các protein in khác nhưRBP-JK), PU1 các protein các tế bào khác
22
B: Phiên mã bị chặn bởi tăng methyla húa trong vùng prụmụtơ
Do đó sự methyl húa ADN của các gen trong các tế bào ung thư hiện nay là một mục tiêu hấp dẫn điều trị và là một kiến thức mới trong lĩnh vực chẩn đoán phân tử, tức là, phát hiện sớm bệnh bằng sử dụng PCR để xác định methyl húa ADN [ luận án]
1.4.2 Methyl húa ADN các promotor của EBNA1
EBNA1 được biểu lộ trong tế bào nhiễm nhờ sự hoạt húa của các promoter khác nhau ở những thể tiềm ẩn khác nhau (Wp, Cp và Qp) và chu kỳ dung giải (Fp) Ở chu kỳ dung
Trang 8giải, EBNA1 biểu lộ do promoter Fp hoạt húa, trong khi các promoter khác không hoạt động Ngược lại, trong thể nhiễm tiềm ẩn Wp, Cp và Qp được hoạt húa, tuy nhiên phụ thuộc vào từng thể nhiễm tiềm ẩn I, II hay III Ở thể nhiễm tiềm ẩn I và
II chỉ có Qp hoạt động, còn thể nhiễm tiềm ẩn III, cả hai promoter Wp và Cp hoạt động Hai promoter này hoạt động luân phiên và Wp được hoạt động trước ở một thời gian ngắn, sau đó mới chuyển sang Cp hoạt động lâu dài hơn
Hình 4 Các vùng promotor của EBV điểu khiển phiên mã.
22
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2 1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu.
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 1/ 2011 đến tháng 10/2011
- Mẫu được thu thập tại Khoa xạ trị tổng hợp, Bệnh viện K
Hà Nội
- Các kỹ thuật được tiến hành tại Phòng thí nghiệm của bộ môn Miễn dịch – Sinh lý bệnh; Labo Trung tâm Y - Sinh học, Trường Đại học Y Hà Nội; Khoa Giải phẫu bệnh - Bệnh viện K Hà Nội
Trang 92.2 Đối tượng nghiên cứu.
2.2.1 Nhóm bệnh nhân
2.2.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân.
- Bệnh nhân mới nhập viện, được chẩn đoán xác định là UTVMH dựa vàotriệu chứng lâm sàng và kết quả giải phẫu bệnh trên mô sinh thiết lấy từ khối u vòm họng
Các bệnh nhân được chọn vào nghiên cứu này được xếp loại giai đoạn từ II đến IVB với T 1 - 4 N 0 – 3 M0 theo cách phân loại T N M và giai đoạn lâm sàng của Hiệp hội quốc tế chống ung thư năm 1997
-Tiêu bản mô sinh thiết
Những tiêu bản mô sinh thiết tươi và tiêu bản mô sinh thiết đúc farafin của bệnh nhân đã được chẩn đoán là UTVMH thể không biệt húa
2.2.3 Tiêu chuẩn loại trừ.
- Các thể mô bệnh học khác ngoài UCNT
- Các bệnh nhân ở giai đoạn 1 hoặc đã có di căn
- Bệnh nhân đến khám định kỳ
22
2 3 Phương pháp và chỉ tiêu nghiên cứu:
2.3.1 Phương pháp nghiờn cứu:
- Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang
- Trình tự kỹ thuật cần thực hiện:
+ Thiết kế mồi
+ Chiết tách AND, ARN, Protein
+ Xử lý AND bằng Bisulfite
+ Chạy kỹ thuật PCR đơn mồi
+ Chạy kỹ thuật PCR đa mồi đặc hiệu
2.3.2 Biến số và chỉ số nghiên cứu:
2.3.3 Phương pháp thu thập thông tin
- Quan sát và ghi kết quả xét nghiệm
Trang 10- Hồi cứu thông tin từ hồ sơ bệnh án và điền phiếu theo mẫu (phụ lục kèm theo)
2.4 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được làm sạch trước khi nhập vào máy tính Xử lý số liệu bằng phần mềm chương trình SPSS 15 0 với các test thống kê thích hợp trong y học
2.5 Sơ đồ nghiên cứu
22
DỰ KIẾN KẾT LUẬN