xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm phenicol trong một số loại thực phẩm tươi sống trên địa bàn hà nội bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

Nhưng với những đặc điểm ưu việt và độ chính xác nên chỉ các phương pháp phân tích sắc ký khối phổ GC-MS, LC-MS được coi là phương pháp phân tích khẳng định, có giá trị pháp lý để phát h

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Vũ Thị Ngân

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH NHÓM PHENICOL TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM TƯƠI SỐNG TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

KHỐI PHỔ (LC/MS/MS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 12/2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Vũ Thị Ngân

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH NHÓM PHENICOL TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM TƯƠI SỐNG TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

KHỐI PHỔ (LC/MS/MS)

Chuyên nga ̀nh: Hóa phân tích

Mã số: 604429

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Xuân Trung

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 12

1.1 Kháng sinh và các vấn đề liên quan 12

1.1.1 Khái niệm và phân loại kháng sinh 12

1.1.1.1 Khái niệm kháng sinh 12

1.1.1.2 Phân loại thuốc kháng sinh [7] 12

1.1.2 Các vấn đề có liên quan đến tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm có nguồn gốc từ động vật 17

1.1.2.1 Tồn dư kháng sinh 17

1.1.2.2 Tình hình tồn dư kháng sinh [7] 18

1.1.2.3 Nguyên nhân tồn dư kháng sinh trong thực phẩm 20

1.1.2.5 Tình hình quản lý và sử dụng kháng sinh [7] 21

1.2 Nhóm kháng sinh phenicol [9, 12, 14] 22

1.2.1 Nguồn gốc 22

1.2.2 Phân loại: Cấu tạo và đặc tính 23

1.2.2.1 Chloramphenicol (C11H12 Cl2 N2O5)(CAP) 23

1.2.2.2 Thiamphenicol : (C12H15Cl2NO5S) (TAP) 27

1.2.2.3 Florfenicol: (C12H14ClFNO4S) (FF) 27

1.2.3 Giới hạn tồn dư cho phép đối với nhóm Phenicol 28

1.3 Một số phương pháp phân tích công cụ trong phân tích tồn dư kháng sinh 30

1.3.1 Phương pháp tách và làm giàu 30

1.3.2 Phương pháp phân tích 31

1.3.2.1 Phương pháp sinh hóa 31

1.3.2.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 32

1.3.2.3 Phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao 33

1.3.2.4 Phương pháp sắc ký khối phổ 34

1.3.2.4.1 Nguyên tắc hoạt động của HPLC 36

1.3.2.4.2 Pha tĩnh trong HPLC [11] 36

1.3.2.4.3 Pha động trong HPLC [11] 37

1.3.2.4.5 Detector trong HPLC [11, 15] 38

1.3.2.5 Detector khối phổ (Mass Spectrometry) [15, 17] 38

Chương 2 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42

2.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu 42

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 42

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 42

2.2 Phương tiện nghiên cứu 43

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 43

2.2.1.1 Thiết bị 43

2.2.1.2 Dụng cụ 43

2.2.2 Dung môi, hóa chất 44

2.3 Phương pháp nghiên cứu 45

2.3.1 Lựa chọn nền mẫu cho khảo sát phương pháp và xử lý mẫu sơ bộ 45

2.3.2 Phương pháp khảo sát các điều kiện tách chiết mẫu 46

2.3.3 Tối ưu hóa điều kiện chạy sắc ký 48

2.3.3.1 Điều kiện phân tích trên LC-MS 48

2.3.3.2 Phân tích định tính và định lượng bằng LC-MS/MS 49

2.4 Phương pháp đánh giá [16] 49

2.5 Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm 50

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51

3.1 Tối ưu điều kiện xác định Phenicol trên thiết bị LC/MS/MS 51

3.1.1 Tối ưu các điều kiện chạy của detector khối phổ (MS) 51

3.1.2 Pha tĩnh 54

3.1.3 Khảo sát hệ pha động và chương trình gradient 54

a/ Thành phần pha động 54

b/Tỉ lệ pha động 59

c/ Chương trình Gradient 63

d/ Tốc độ dòng pha động 65

3.2 Đánh giá phương pháp 68

3.2.1 Khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 68

3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 70

3.2.3 Độ chính xác của phép đo 72

3.2.4 Độ lặp lại và độ thu hồi 73

3.3 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu 76

3.3.1 Lựa chọn nền mẫu cho khảo sát phương pháp và xử lý mẫu sơ bộ 76

3.3.2 Khảo sát dung môi tách chiết ban đầu và làm giàu sơ bộ 77

3.3.4 Khảo sát loại cột chiết 79

3.3.5 Khảo sát thể tích rửa giải 80

3.4 Phân tích các mẫu thực tế 82

Chương 4: KẾT LUẬN 85

TÀI LIỆU THAM KHẢO 86 PHỤ LỤC

Chromatography) KPH Không phát hiện

LC-MS Sắc ký lỏng – Khối phổ (Liquid Chromatography – Mass

Spectrometry) LOD Giới hạn phát hiện (Limit Of Detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit Of Quantitation)

MRL Giới hạn tồn dư cho phép lớn nhất (Maximum Residue Limit)

MDL Giới hạn phát hiện của phương pháp (Method Detection

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Giới hạn tồn dư cho phép lớn nhất(MRL) đối với Florfenicol ở một số

nước 29

Bảng 2.1 Đặc điểm lý hóa của một số loại dung môi 47

Bảng 3.1 Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI 51

Bảng 3.2 Kết quả bắn phá ion mẹ 52

Bảng 3.3 Kết quả tối ưu tự động các điều kiện chạy MS/MS 52

Bảng 3.4 Các thông số tối ưu cho phân tích định tính và định lượng CAP và FF trên MS/MS 53

Bảng 3.5 Kết qả khảo sát các thành phần pha động 58

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát tỉ lệ pha động 62

Bảng 3.7 Chương trình gradient tối ưu cho pha động phân tích CAP và FF 64

Bảng 3.9 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Phenicol 69

Bảng 3.10 Sai số và độ lặp lại của phép đo tại các nồng độ khác nhau 73

Bảng 3.11 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp ở các mức nồng độ 75

khác nhau 75

Bảng 3.12 Một số thành phần cơ bản của đối tượng mẫu phân tích 76

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát dung môi tách chiết ban đầu 78

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát với hai loại cột chiết pha rắn 79

Bảng 3.15 Kết quả khảo sát các mức thể tích rửa giải trong chiết pha rắn 80

DANH MỤC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

Hình 1.1 Sơ đồ thiết bị lỏng khối phổ (LC/MS) 27 Hình 1.2 Kĩ thuật ESI bắn phá với chế độ ion dương 30 Hình 1.3 Kĩ thuật APCI bắn phá với chế độ ion dương 31 Hình 3.1 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha độngkhảo sát MeOH – CH3COOH 0,1% 47 Hình 3.2 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát MeOH – H2O 48 Hình 3.3 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát MeOH – CH3COONH4 0,1% 48 Hình 3.4 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát ACN – H20 49 Hình 3.5 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát ACN –

CH3COOH 0,1% 49 Hình 3.6 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát ACN –

CH3COONH4 0,1% 49 Hình 3.7 Sắc đồ hai mảnh ion con định lượng của CAP và FF với tỉ lệ pha động khảo sát MeOH:CH3COOH 0,1% = 30:70 (v/v) 51 Hình 3.8 Sắc đồ hai mảnh ion con định lượng của CAP và FF với tỉ lệ pha động khảo sát MeOH:CH3COOH 0,1% = 50:50 (v/v) 52 Hình 3.9 Sắc đồ hai mảnh ion con định lượng của CAP và FF với tỉ lệ pha động khảo sát MeOH:CH3COOH 0,1% = 60:40 (v/v) 52 Hình 3.10 Sắc đồ hai mảnh ion con định lượng của CAP và FF với tỉ lệ pha động khảo sát MeOH:CH3COOH 0,1% = 70:30 (v/v) 53 Hình 3.11 Sắc đồ hai mảnh ion con định lượng của CAP và FF với tỉ lệ pha động khảo sát MeOH:CH3COOH 0,1% = 80:20 (v/v) 53 Hình 3.12 Sắc đồ hai mảnh ion con định lượng của CAP và FF với tỉ lệ pha động khảo sát MeOH:CH3COOH 0,1% = 90:10 (v/v) 54 Hình 3.13 Sắc đồ các 2 mảnh ion con định lượng của FF và CAP (lần lượt theo thứ tự từ trái sang phải) khi chạy chương trình gradient ở bảng 3.7 57 Hình 3.14 Sắc đồ các mảnh ion con của CAP và FF khi chạy tốc độ dòng 0,2mL/phút58

Hình 3.15 Sắc đồ các mảnh ion con của CAP và FF khi chạy tốc độ dòng 0,3mL/phút58 Hình 3.16 Sắc đồ các mảnh ion con của CAP và FF khi chạy tốc độ dòng 0,4mL/phút58 Hình 3.17 Sắc đồ các mảnh ion con của CAP và FF khi chạy tốc độ dòng 0,5mL/phút59 Hình 3.18 Sắc đồ hai mảnh định lượngcủa CAP và FF thêm chuẩn trên nền mẫu trắng phương pháp với nồng độ 0,03 ng/ml 63 Hình 3.19 Tương quan giữa hiệu suất thu hồi với dung môi tách chiết 70 Hình 3.20 Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào thể tích rửa giải trong chiết pha rắn 73

MỞ ĐẦU

Hiện nay, khi mức sống của người dân từng bước được nâng cao thì vệ sinh

an toàn thực phẩm đang trở thành vấn đề được quan tâm của toàn xã hội Đặc biệt, khi Việt Nam gia nhập WTO thì đây là một thách thức to lớn Vệ sinh an toàn thực phẩm không chỉ là rào cản khắc nghiệt đối với hàng hóa xuất khẩu mà còn làm giảm sức cạnh tranh tại thị trường tiêu thụ nội địa

Trong khoảng 10 năm trở lại đây, các ngành nghề chăn nuôi được mở rộng, năng suất và sản lượng các sản phẩm chăn nuôi ngày càng cao, góp phần đáng kể vào việc cung cấp nguyên liệu cho xuất khẩu cũng như thị trường nội địa, tạo công

ăn việc làm, xóa đói giảm nghèo và nâng cao mức sống cho người dân Tuy nhiên,

do sự phát triển mang tính tự phát, phân tán nhỏ lẻ, thiếu sự qui hoạch và kiểm soát môi trường kém đã làm cho dịch bệnh diễn biến ngày một phức tạp Trong điều kiện đó, cùng với sự thiếu hiểu biết, ý thức cộng đồng kém nên người chăn nuôi coi hóa chất và thuốc thú y là giải pháp duy nhất để tăng năng suất và sản lượng Điều

đó, đồng nghĩa với việc hóa chất và thuốc thú y được sử dụng thường xuyên hơn Trên thực tế điều tra cho thấy việc sử dụng kháng sinh không đúng nguyên tắc, lạm dụng quá mức trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản vẫn đang tiếp diễn (Phạm Kim Đăng, 2007, 2011)

Việc lạm dụng, sử dụng bất hợp pháp hoặc sử dụng sai nguyên tắc thuốc thú

y nói chung và kháng sinh nói riêng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản có thể gây hiện tượng nhờn thuốc hoặc gây tồn dư trong sản phẩm ảnh hưởng xấu đến sức khỏe cộng đồng, môi trường cũng như hiệu quả điều trị bệnh Để tăng cường kiểm soát dư lượng, các nước phát triển đã có những qui định rất chặt chẽ và kiểm soát nghiêm ngặt Chẳng hạn, EU đã ban hành quyết định số 2377/90 EC nay được thay bằng quyết định 37/2010 quy định giới hạn tồn dư cho phép thuốc thú y trong sản phẩm động vật (CE, 1990; 2010), theo đó các sản phẩm có nguồn gốc từ động vật phải được kiểm soát tuân thủ quy trình của chỉ thị số 96/23 EC (EU, 1996)

Những năm gần đây, vệ sinh an toàn thực phẩm là một chủ đề được Chính phủ, các bộ, ngành liên quan đặc biệt quan tâm và là một trong những vấn đề nóng được đưa ra chất vấn và thảo luận trong các kỳ họp Quốc hội gần đây Chính vì thế, các bộ ngành liên quan đã liên tục hoàn thiện và ban hành các quy định và nhiều chỉ thị để hướng dẫn kiểm soát dư lượng, trong đó quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24/02/2005, số 26/2005/QĐ – BTS ngày 18/8/2005 của Bộ thủy sản (nay là bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, gần đây nhất là thông tư 69/2010/TT-BNNPTNT ngày 6/12/2010 liên quan đến danh mục hóa chất và kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản Tồn dư tối đa các hóa chất, thuốc thú y, độc tố trong thực phẩm đã được Bộ Y tế quy định bởi quyết định

N046/2007/QĐ-BYT ngày 19/12/2007 [1, 2, 3, 4]

Để kiểm soát dư lượng hóa chất nói chung và kháng sinh nói riêng, đã có nhiều phương pháp phân tích được khuyến cáo sử dụng Nhưng với những đặc điểm

ưu việt và độ chính xác nên chỉ các phương pháp phân tích sắc ký khối phổ

(GC-MS, LC-MS) được coi là phương pháp phân tích khẳng định, có giá trị pháp lý để phát hiện và định lượng nồng độ các chất tồn dư, đặc biêt đối với nhóm chất cấm hoặc cần được kiểm soát ở lượng vết hay siêu vết Tuy nhiên, do tích chất phức tạp, tính đặc hiệu của phương pháp nên việc ứng dụng, vận hành ổn định và giá thành phân tích luôn là thách thức đối với người làm công tác phân tích Để giảm thiểu chi phí phân tích xu hướng chung của các nước là phát triển và chuẩn hóa các phương pháp phân tích có khả năng phát hiện và định lương đồng thời nhiều chất trong một lần phân tích Vì vậy, để góp phần nâng cao năng lực phân tích và chiến lược kiểm soát dư lượng kháng sinh ở nước ta, việc nghiên cứu tối ưu và chuẩn hóa các phương pháp phân tích nói chung và phương pháp khẳng định lý hóa nói riêng như phương pháp sắc ký lỏng khối phổ là rất cần thiết Xuất phát từ thực tế đó, đề tài này được thực hiện nhằm tối ưu hóa phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS

có khả năng xác định đồng thời hai chất trong nhóm Phenicol (Chloramphenicol và Florfenicol) tồn dư trong một số thực phẩm tươi sống chính được bán trên thị trường Hà Nội

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Kháng sinh và các vấn đề liên quan

1.1.1 Khái niệm và phân loại kháng sinh

1.1.1.1 Khái niệm kháng sinh

Thuật ngữ kháng sinh được Vuillemin sử dụng từ năm 1889 Năm 1954, Turpin Velu định nghĩa: kháng sinh là chất hóa học do vi sinh vật tổng hợp hoặc hóa tổng hợp hữu cơ tạo ra, có hằng số hóa trị liệu cao, với liều lượng thấp có tác dụng điều trị thông qua ức chế một số quá trình sống của vi khuẩn và một số vi sinh vật đơn bào Định nghĩa này quá rộng bao gồm cả một số Sunfamit, Sunfon, Isoniazit… một số Ancaloid và cả nhiều sát trùng [14]

Năm 1929, Fleming ở Anh lần đầu tiên thấy trong môi trường nuôi cấy tụ

cầu vàng, nếu có lẫn nấm penicilium notatum thì khuẩn lạc gần nấm sẽ không phát

triển được Năm 1939, Florey và Chain đã chiết ra được từ nấm đó chất Peniciline dùng trong điều trị Năm 1940, đã sản xuất thành công Peniciline thô và đã thử nghiệm trên động vật có kết quả tốt Đến năm 1946, Peniciline kết tinh đã được sản xuất và tạo ra một bước đột phá trong y học [7]

Kháng sinh tên quốc tế là Antibiotics Ngày nay kháng sinh được định nghĩa là: “Kháng sinh là chất do vi nấm hoặc vi khuẩn tạo ra , hoặc là chất tổng hợp hay bán tổng hợp có tác dụng điều trị đặc hiệu với liều lượng thấp do ức chế một số quá trình sống của vi sinh vật” [9, 12]

Cho đến nay đã có hàng nghìn chất kháng sinh được tìm ra nhưng không phải tất cả đều có thể được sử dụng trong lâm sàng, vì có những chất đã tìm ra thường gây các triệu chứng độc, có tác dụng phụ, có hại cấp tính hoặc do hoạt phổ kháng sinh quá hẹp hoặc do giá thành quá cao…

1.1.1.2 Phân loại thuốc kháng sinh [7]

Theo sự phát triển của khoa học hiện đại, ngày nay có nhiều loại kháng sinh mới đã được tổng hợp Để giúp cho việc định hướng lựa chọn kháng sinh có hiệu

quả trong nghiên cứu và điều trị, các nhà khoa học đã phân loại kháng sinh theo nhiều nhóm, có thể dựa theo nhiều cách: Phân loại theo nguồn gốc hoặc theo hoạt phổ kháng khuẩn, theo mức độ tác dụng hoặc theo cấu trúc hóa học Trong đó cách phân loại theo cấu trúc hóa học được sử dụng rộng rãi nhất vì hoạt phổ tác dụng, mức độ, cơ chế và cấu trúc hóa học đều có liên quan tới nhau Với cơ sở này, kháng sinh được chia làm các nhóm chính sau:

1) Nhóm Beta-lactams:

a) Phân nhóm các Penicilline

Penicillin G (Benzine – Penicillin) và các dẫn xuất của Penicilline G được

chiết xuất từ môi trường nuôi cấy nấm Penicillium notatum

Penicillin V (Phenocipenicillin) chẳng hạn Penocimethine, Penicillin, Oracilline là loại Penicillin bán tổng hợp do có nhóm phenocys giúp phân tử chống chọi với H+, hấp thu tốt, phân phối nhanh vào mô bào (trừ tế bào thần kinh)

Penicillin M (Methicilline) bao gồm các thuốc: Methicilline, Dieloxacilline, Oxacilline, Choxacilline, Nafcilline

Penicilline có hoạt phổ kháng sinh rộng, nó có tác dụng khá mạnh đối với trực khuẩn Gram âm và Proteus

b) Phân nhóm Cephalosporine

Phân nhóm này được chiết xuất từ các chủng Cephalosporium, bao gồm các thế hệ sau:

Thế hệ thứ nhất (Cephazocine, Cephalecine, Cephaloridine, Cephathine…):

có phổ tác dụng gần giống Ampicilline và Methicilline, có tác dụng đối với các cầu khuẩn Gram dương, trực khuẩn Gram âm, nhóm trực khuẩn đường ruột và

Heamophilus

Thế hệ thứ hai (Cefamandole, Cefotetane, Cefuroximeacetyl, Cefuroxime, Cefocitine…): so với thế hệ thứ nhất thì thế hệ thứ hai có khả năng chống chiụ với Penicillinaza của vi khuẩn tốt hơn, phổ tác dụng rộng và mạnh hơn với vi khuẩn

Gram âm, Heamophilus influenzae và Pseudomonas

Thế hệ thứ ba (Cefotaxime, Cefoperazone, Ceftriaxone, Ceftizoxime, Ceftazidime, Ceficime,…): Đối với các cầu khuẩn Gram dương thì tác dụng yếu hơn các Penicilline và Cephalosporine thế hệ một, còn với cầu khuẩn Gram âm thì tác dụng với lậu cầu mạnh hơn thế hệ một và hai

Thế hệ thứ tư: mới chỉ được sử dụng trong nhân y còn thú y chưa được sử dụng

- Macrolides thực thụ gồm : Erythromycin, Oleandomycin, Spiramycin…

- Macrolides có nhiều đường nối đôi, có bốn vòng lacton lớn: các kháng sinh chống nấm

- Macrolides họ hàng, trong phân tử có vòng lớn, chứa nhân thơm: Rifamycine các thuốc trong nhóm này ức chế protein vi khuẩn

Nhóm Macrolid là những chất đại phân tử, có tính kìm khuẩn đối với cầu khuẩn gram (+) cũng như đối với Mycoplasma Thuốc đào thải qua mật Nhóm thuốc này đối kháng với nhóm tetracycline (ở tụ cầu, liên cầu)

4) Nhóm Licosamides

Cấu trúc phân tử khác với Macrolides, không có vòng lacton Phổ tác dụng

và cơ chế tác dụng rất giống nhóm Macrolides Gồm Lincomicin và Clindamycin

5) Nhóm Phenicols

Chloramphenicol được chiết ra từ môi trường nuôi cấy streptomyces venezuelae Trong cấu trúc phân tử của CAP có hai cacbon bất đối xứng nên có bốn

đồng phân lập thể, chỉ có đồng phân D (-) Threo có tác dụng kháng sinh

Hiện nay, đã tổng hợp được Thiamphenicol và Azdamphenicol Các kháng sinh trong nhóm này có hoạt phổ kháng sinh rộng, tác dụng kìm hãm phát triển cầu

khuẩn, trực khuẩn, ricketsia và mycoplasma

- Loại có tác dụng ngắn: Tetracycline, Oxytetracycline, Chlortetracycline

- Loại có tác dụng trung bình: Metacycline, Rolitetracycline, Demethyl Chlortetracycline

- Loại có tác dụng kéo dài: Doxycyclin, Minocyline…

Nhóm thuốc này có hoạt phổ kháng sinh rộng, dùng để điều trị bệnh

Brucella, bệnh Leptospira, rickettsia, Ecoli,…thuốc rất độc đối với gan, thận, thần

kinh (Rowland M, 1989)

7) Nhóm Polypeptides (đa peptide )

Trong cấu trúc phân tử có nhiều liên kết peptide Gồm các chất Bacitracin, Subtiline, Tyrothricine, các Polymycine A, B C, D và E (Colistine, Colimycine) Đây là các chất diệt khuẩn, tác dụng với cả vi khuẩn đang phát triển và ngừng phát triển Chúng có hoạt phổ kháng sinh hẹp Bacitracin, Subtiline, Tyrothricine diệt vi khuẩn gram dương, các Polymicine A, B, C, D và E diệt vi khuẩn gram âm

8) Các kháng sinh khác: gồm các loại sau:

- Vancomycine và Teicoplanine: là những glycopeptide, gồm phần ose và acid amin, ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn, chỉ diệt vi khuẩn gram dương

- Novobiocine: tác dụng kìm khuẩn thông qua ức chế tổng hợp acid nhân

- Acid fusidic: là kháng sinh duy nhất có cấu trúc steroid, cơ chế giống nhóm Macrolides, ức chế tổng hợp protein, tác dụng lên khuẩn gram dương và âm

- Fosfomycine: ức chế quá trình tạo vách tế bào vi khuẩn, có hoạt phổ kháng sinh rộng

9) Nhóm kháng sinh chống nấm: các kháng sinh trong nhóm này không tác dụng

trên vi khuẩn, được phân theo nguồn gốc thành các nhóm sau:

- Thuốc có nguồn gốc sinh học: nhóm polyens gồm Nystatine và Amphotericine B, có tác dụng kìm hãm vừa diệt nấm, thông qua việc gắn vào steroid của màng, huỷ màng và làm rối loạn tính thấm màng tế bào nấm Nhóm Griseofulvines có tác dụng kìm nấm

- Thuốc có nguồn gốc tổng hợp: 5-fluorocytosine có tác dụng theo cơ chế kháng chuyển hoá Dẫn xuất imidazol có phổ tác dụng rộng, diệt nấm dạng men và dạng sợi

10) Thuốc có tác dụng như kháng sinh (antibiomimetic)

Là thuốc tổng hợp, có cấu trúc và xuất xứ rất đa dạng, nhưng các cơ chế tác dụng như kháng sinh, bao gồm:

* Nhóm Quinolones: còn được gọi là thuốc ức chế gyrase vì đích phân tử của nhóm này là DNA-gyrase (enzyme tham gia tạo dây xoắn DNA) dẫn đến ức chế tổng hợp AND của vi khuẩn Gồm hai loại:

+ Quinolone kinh điển gồm acid nalidixic, Oxolinic, Pipemidic, Piromidic và Flumequine Trong cấu trúc không có Flo và nhân piperazin trừ Flumequin

+ Quinolone mới gồm Rosoxacine, Pefloxacine, Ofloxacine, Ciprofloxacin, Norfloxacin

* Nhóm Ntro-imidazoles: gồm ba dẫn xuất Metronidazole, Orndazole, Tinidazole có tác dụng diệt đơn bào và vi khuẩn kỵ khí

* Nhóm các dẫn xuất Nitrofuranes: các kháng sinh loại này không bị hủy bởi

pH dạ dày, nhưng khi gặp ánh sáng sẽ giải phóng gốc nitrit – NO2 độc Gồm ba loại thuốc sau :

+ Loại 1 gồm Nitrofurantoine, Hydroxymethyl-nitrofurantoine, Niforfoline + Loại 2 gồm: Furazolidone, Nifuratel

+ Loại 3 gồm: Nitrolural, Nifuroxazid

Dẫn xuất Nitrofuran ức chế chu trình Kreb của vi khuẩn, làm giảm sản xuất năng lượng cần cho sinh sản và tồn tại của vi khuẩn Nồng độ thuốc hợp lý sẽ gây

ức chế hoặc ngừng hẳn tổng hợp AND, ARN của vi khuẩn

* Các dẫn xuất của Sulfamid

Được đặc trưng bởi một cấu trúc đơn giản thuộc nhóm sulfolamid, người ta

có thể chia làm 5 loại:

- Thải nhanh: Sulfafurazon, sunfadimidin,…

- Thải hơi chậm: Sulfadimethoxin, sulfamethoxypyridazin,…loại này ít dùng vì khó thải trừ, gây khó khăn khi tai biến

- Thải rất chậm: Sulfadoxin (fanasil) có trong fansida chữa sốt rét

Các thuốc sulfamid thường hấp thu nhanh qua ống tiêu hóa, hầu như hoàn toàn, và thải trừ qua thận

1.1.2 Các vấn đề có liên quan đến tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm có nguồn gốc từ động vật

1.1.2.1 Tồn dư kha ́ ng sinh

Theo khái niệm của chỉ thi ̣ 86/469 của Uỷ ban Châu Âu thì “chất tồn dư là chất có tính dược đô ̣ng ho ̣c và các chất chuyển hóa trung gian của chúng nguy hiểm đến sức khỏe người tiêu dùng”

Về mặt VSATTP , EU đã quy đi ̣nh mức giới ha ̣n tồn dư tối đa (MRL – Maximum Residue Limit) của từng loại kháng sinh cho phép sử dụng đối với từng loại thực phẩm Tức là lượng kháng sinh cao nhất được phép tồn dư trong thực phẩm mà không ảnh hưởng đến cơ thể người và vâ ̣t nuôi khi sử du ̣ng sản phẩm đó

làm thức ăn MRL có thể được quy đi ̣nh rất khác nhau ở các nước căn cứ vào đă ̣c điếm sinh lý , sinh thái, nhất là đă ̣c điểm dinh dưỡng , thói quen ăn uống của người dân từng nước

Giá trị MRL được xác định bởi 3 yếu tố:

- Lượng tối thiểu có tác dụng trên động vật thí nghiệm hay điều trị gây ra hiệu quả được công nhận

- Độ an toàn trong khoảng 1% hay thấp hơn , nếu được chấp nhâ ̣n trong y ho ̣c , hoă ̣c độ an toàn cao hơn 1% nếu có bất cứ bằng chứng nào ch o thấy có nguy cơ giống như các thí nghiê ̣m trên những hợp chất tương tự

- Các yếu tố để cân bằng các tỷ lệ trong các mô ở một khẩu phần ăn trung bình Nói chung, không đươ ̣c dùng thực phẩm có tồn dư kháng sinh cao hơn MRL Lươ ̣ng ăn hằng ngày chấp nhâ ̣n được lần đầu tiên được sử du ̣ng trong hô ̣i nghi ̣ của các chuyên gia Tổ chức lương thực thế giới (FAO) và WHO về những chất thêm vào trong thực phẩm năm 1958 Đó là khoảng ước lượng của hàm lượng chấ t thêm vào trong thực phẩm, đươ ̣c diễn tả theo thể tro ̣ng, là lượng hằng ngày có thể tiêu thụ trong suốt cuô ̣c sống mà không gây mô ̣t nguy hiểm nào cho sức khỏe (FAO, 1993)

Cách tính lượng ăn hằng ngày chấp nhận được phụ thuộ c vào chất gây đô ̣c Ảnh hưởng của chất gây độc được xác định thông qua nghiên cứu độc tính trên bộ gen, sinh ung thư , sai lệch về chức năng và ảnh hưởng trên hê ̣ thồng miễn di ̣ch lẫn hoạt động sinh dục

1.1.2.2 Tình hình tồn dư kha ́ ng sinh [7]

Hê ̣ thống nghiên cứu chất tồn dư trong thực phẩm cho con người đã được tiến hành ở nhiều nước trong vài năm trước : Huber (1971), đã báo cáo tỷ lê ̣ tồn dư kháng sinh khi kiểm tra hơn 4000 gia súc ở Mỹ Kết quả báo cáo cho thấy tỷ lệ tồn

dư kháng sinh là 27% trong nhóm 1381 con lợn, 9% trong 580 con bò, 17% trong số 788 con bê, 21% của 238 con cừu thương phẩm và 20% trong 926 con gà Kháng sinh đươ ̣c tìm thấy nhiều nhất là Penicillin , Tetracycline, Oxytetracycline, Tylosin, Dihydrotreptomycine

Tại Bỉ và Hà Lan , tồn dư Doxycycline thường gă ̣p ở thi ̣t gà , Oxytetracycline ở thịt bò, Oxytetracycline và Doxycycline ở t hịt lợn

Từ đầu những năm 1970 đã có những tiến bô ̣ làm giảm tồn dư kháng sinh Đây

là kết quả của việc nâng cao nhận thức về tiền năng sản sinh tồn dư kháng sinh của người sản xuất và tăng hê ̣ thống giám sát bởi các cơ quan pháp chế Theo Hall (1986), tồn dư kháng sinh trong thi ̣t lơ ̣n giảm từ 5,7% năm 1978 xuống trung bình chỉ còn 0,4% trong suốt năm 1980 – 1984 Tuy nhiên , vấn đề tồn dư sulfonamide vẫn tiếp tu ̣c ở lợn Từ năm 1973 – 1984, tỷ lệ % lợn có tồn dư rất cao , từ 4,4% tới mức cao nhất 13,1% năm 1977

Hiê ̣n nay EU quy đi ̣nh thực phẩm nhâ ̣p khẩu vào Châu Âu có mức dư lượng kháng sinh bằng 0, nhưng thực phẩm ho ̣ đang sử du ̣ng và xuất đi các nước khác la ̣i không đáp ứng được các quy đi ̣nh đó Năm 2002 Trung tâm Di ̣ch vu ̣ phân t ích và thí nghiệm thuộc Sở Khoa học Công nghệ và môi trường thành phố Hồ Chí Minh phát hiện 6 loại thực phẩm đóng hộp nhập khẩu từ EU và Mỹ có tồn dư kháng sinh đang đươ ̣c bán ta ̣i thi ̣ trường Viê ̣t Nam (trong số 8 loại được kiểm nghiê ̣m ) Đó là: loại thịt bò muối của Pháp (0,3 phần tỷ), cá trích trộn nước sốt ớt của Đức (0,4 phần tỷ) và cá anchovy trộn dầu olive và muối (0,3 phần tỷ)

Kháng sinh tồn dư trong thịt gà ở nước ta là khá tr ầm trọng do sử dụng thức ăn bổ sung có chứa kháng sinh không được kiểm soát chă ̣t chẽ Trong kết quả một khảo sát ở thành phố Hồ Chí Minh đã phát hiện thấy 52% mẫu thịt gà chứa tồn dư kháng sinh Các kháng sinh tồn dư đư ợc phát hiện gồm : Ampicilin , Oxytetracycline cao hơn tiêu chuẩn cho phép của EU hàng nghìn

lần, có mẫu tồn dư kháng sinh Chloramphenicol mà nhiều nướ c cấ m

Theo Đinh Thiê ̣n Thuâ ̣n và cs , 2002, kiểm tra 149 mẫu thi ̣t, gan gà trên đi ̣a bàn tỉnh Bình Dương nghi ngờ tồn dư kháng sinh bằng phư ơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho thấy có 44,96% số mẫu tồn dư quá quy đi ̣nh (so với tiêu chuẩn của Malaysia ), Chloramphenicol chiếm tỷ lê ̣ cao nhất (87,5%), tiếp theo là Flumequine (83,33%), Chlotetracycline (62,5%), Amoxilin (60%) Trong số 70 mẫu

thịt kiểm tra có tới 42 mẫu có phát hiê ̣n tồn dư kháng sinh , trong đó 25 mẫu vượt quá tiêu chuẩn EU quy định

Kiểm tra 280 mẫu thi ̣t được lấy ta ̣i các chợ lớn và các điểm giết mổ tâ ̣p trung trên đi ̣a bàn Hà Nô ̣i , Nam Đi ̣nh, thành phố Hồ Chí Minh , Bình Dương và Cần Thơ cho thấy 25,7% tổng số mẫu kiểm tra có dư lượng kháng sinh vượt quá giá tri ̣ MRL Theo tác giả , điều này chứ ng tỏ quy trình chăn nuôi , giết mổ không được đảm bảo nghiêm ngă ̣t, vâ ̣t nuôi trước khi giết mổ vẫn cho ăn thức ăn công nghiê ̣p có bổ sung kháng sinh; nguồn gốc tồn dư kháng sinh trong thi ̣t gây ra chủ yếu do kháng sinh bổ sung vào thức ăn với mu ̣c đích dự phòng các bê ̣nh nhiễm khuẩn đã dẫn tới tỷ lê ̣ nhiễm kháng sinh giữa hai nhóm gia súc ăn cỏ và ăn cám công nghiê ̣p có sự khác biê ̣t (P < 0,05) Trong số 72 mẫu (chiếm 25,7%) cho kết quả phân tích tồn dư kháng sinh vươ ̣t quá giá tri ̣ MRL phát hiê ̣n 36 mẫu (chiếm 50%) có Tetracycline, 40 mẫu (chiếm 55,6%) có Chloramphenicol và đặc biệt phát hiện 4 mẫu (chiếm 5,6%) tồn

dư cả hai loa ̣i kháng sinh

Theo kết quả điều tra sơ bô ̣ của Vi ên khoa ho ̣c Kỹ thuâ ̣t Nông nghiê ̣p Viêt Nam , có tới 75% số mẫu thịt và 66,7% số mẫu gan của gia súc , gia cầm bán tại các chợ có mức tồn dư kháng sinh vượt quá ngưỡng cho p hép

Theo báo cáo của Cu ̣c Thú y năm 2006 tại Đà Nẵng, kiểm tra 90 mẫu thi ̣t gà,

bò, lơ ̣n thấy 6 mẫu có Chloramphenicol, trong đó nhiều mẫu vượt quá giới ha ̣n cho phép của EU với hàm lượng rất cao

Kháng sinh tồn dư trong thịt , gan, trứ ng gà ta ̣i Thái Nguyên chiếm tỷ lê ̣ 19,04% Trong đó , cao nhất là gan (28,57%), sau đó đến thi ̣t (23,81%) và thấp nhất

là trứng gà (4,76%) Tỷ lệ tồn dư kháng sinh Tetracycline (23,81%); Oxytetracycline (33,33%) và không phát hiện thấy Chloramphenicol

1.1.2.3 Nguyên nhân tồn dư kháng sinh trong thực phẩm

Một trong những vấn đề sống còn của ngành chăn nuôi đó là hiệu quả Chăn nuôi chỉ tồn tại khi có hiệu quả Để nâng cao hiệu quả, cùng với việc quan tâm đến các yếu tố như giống, thức ăn, vệ sinh, người chăn nuôi còn quan tâm đặc biệt đến

phòng và chữa bệnh cho vật nuôi Trong chăn nuôi đặc biệt là chăn nuôi thâm canh việc dùng kháng sinh là khó có thể tránh khỏi Vì vậy, những nguyên nhân dẫn đến tồn dư kháng sinh có thể do thức ăn tiếp xúc với môi trường có chứa kháng sinh hoặc do lạm dụng hoặc do sử dụng bất hợp pháp thường xuyên kháng sinh với mục đích khác nhau như:

- Trộn kháng sinh vào trong thức ăn, cho ăn thường xuyên với mục đích kích thích tăng trọng

- Kháng sinh cho vào trong nước uống để phòng bệnh trong mùa dịch

- Sử dụng điều trị cho vật nuôi nhưng không đúng quy trình như thời gian ngừng sử dụng thuốc trước khi giết thịt

- Trộn kháng sinh vào trong thức ăn cho vật nuôi với mục đích bảo quản

- Có thể cho thẳng kháng sinh vào thực phẩm với mục đích ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật để bảo quản thực phẩm

- Không tuân thủ tuyệt đối thời gian ngừng sử dụng kháng sinh trước khi giết

Để kiểm soát dư lượng kháng sinh trong các sản phẩm có nguồn gốc từ động vật, Ủy ban Châu Âu đã ban hành Nghị định 96/23/EC (EU, 1996) theo đó các nước thành viên thuộc Châu Âu hàng năm phải phân tích mẫu của tất cả các sản phẩm của nước mình Số lượng mẫu phải phân tích phụ thuộc vào sản lượng hoặc số gia

súc giết thịt trong một năm Các nhóm chất phải kiểm soát được nêu rõ trong phụ lục của nghị định này Bên cạnh đó Ủy ban Châu Âu còn ban hành quy định việc sử dụng thuốc thú y cần tuân thủ giới hạn tồn dư tối đa được quy định trong chỉ thị số 37/2010/EC (EC, 2010)

Liên quan đến phương pháp phân tích kiểm soát kháng sinh trong thực phẩm

có nguồn gốc từ động vật, các nước thành viên của Ủy ban Châu Âu phải đáp ứng các tiêu chuẩn tối thiểu về hiệu năng của phương pháp phân tích được quy định trong quyết định số 2002/657/CE (EC, 2004)

*/ Tại Việt Nam

Trong thời gian gần đây Bộ Y tế, Bộ Thủy sản nay là Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Việt Nam đã đưa ra nhiều tiêu chuẩn ngành và các quy định cơ bản

về sản xuất, kinh doanh, sử dụng thuốc và hóa chất nhằm đáp ứng được những quy định ngày càng nghiêm ngặt về Vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP) của các nước nhập khẩu như : Quyết định của Bộ trưởng Bộ thủy sản về việc ban hành danh mục hóa chất, kháng sinh bị cấm và hạn chế sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản (số 07/2005/QĐ-BTS ngày 22 tháng 02 năm 2005); Quyết định 46/2007/QĐ-BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007 về giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm

Thiamphenicol là dẫn chất tổng hợp của Chloramphenicol Florfenicol là kháng sinh thế hệ mới của nhóm này

Cấu tạo: Hai cấu tử đặc biệt: -para- nitrophenyl, cacbongemdiclor

1.2.2 Phân loại: Cấu tạo và đặc tính

Khi thải vào môi trường CAP hiện diện dưới dạng thể khí là chủ yếu CAP phát tán trong không khí chủ yếu bởi lắng khô, bám trên các lớp trầm tích và chất lắng sinh học sống trong nước Khả năng thay đổi của CAP trong đất cao, nhưng nó không bốc hơi, kể cả đất khô lẫn đất ẩm Dưới tác động phân giải của vi sinh vật, CAP có thể bị phân giải trong đất và nước CAP cũng bị phân giải bởi các sinh vật đường ruột theo đường phân hủy thành gốc amin

Ở người CAP được hấp thụ chủ yếu qua đường miệng hoặc sử dụng CAP dưới dạng dược phẩm Ngoài ra, nó cũng có thể được hấp thụ qua xông thuốc, thoa

da, tiếp xúc với nước và đất có chứa CAP

CAP được tìm thấy trong huyết thanh, huyết tương, dịch não tủy, tim, gan, phổi thận, lá lách, dịch màng phổi, tinh dịch, dịch cổ trướng, nước bọt và nước tiểu

Nó có khả năng thẩm thấu nhanh qua dạ dày và phân tán nhanh trong cơ thể Mặt khác, CAP rất dễ hấp thụ vào cơ thể nên khi dùng CAP chữa bệnh hoặc thêm vào thức ăn gia súc sẽ dễ tồn dư trong thịt, trứng, sữa

a Tính chất hóa lý

CAP tồn tại ở dạng bột kết tinh màu trắng, trắng xám hoặc trắng vàng với tinh thể hình kim hoặc phiến dài, không mùi, có vị rất đắng CAP chứa từ 97,0% đến 103,0% C11H12Cl2N2O5

Tính tan: CAP tan tốt trong các dung môi phân cực như etanol 96%, propylen glycol, rất dễ tan trong Axeton và Etylaxetat, khó tan trong nước

Dung môi Độ tan Nước (25o

C) 2,5mg/ml Propylen glycol 150,8 mg/ml

Nhiệt độ nóng chảy: 149 – 153oC; năng suất quay cực: +18,50 đến +20,50(trong dung dịch etanol); áp suất hơi: 1,73x10-12 mmHg

CAP thăng hoa trong chân không dưới áp suất cao Gốc nitro trong công thức hóa học của CAP dễ dàng phân hủy thành gốc amin Trong 4 dạng đồng phân lập thể , chỉ có αR, βR (hay D-threo) là có hoạt tính

Độ bền: Dung dịch CAP trong nước bền vững ở giới hạn pH rộng Ánh sáng làm cho CAP mau hỏng Khi đưa dung dịch CAP trong nước ra ngoài ánh sáng , dung dịch này bị đậm màu dần và pH chuyển sang vùng axit

Dung dịch ở 37°C giữ được 1 tháng

b/ Sự hấp thu và bài tiết

CAP được hấp thu qua hệ tiêu hóa và khi tiêm chích được phân phối đi các

mô Ở gan CAP kết hợp với Axit glucurosamid hoặc bị chuyển thành Arylamin không còn hoạt tính kháng sinh nữa

CAP được bài tiết chủ yếu qua thận ở dạng este của axit glucuroamid và arylamin

Dư lượng kháng sinh có thể tồn tại trong thời gian dài, tế bào thận sẽ chuyển hóa CAP thành dạng tan bằng cách hình thành glucuronit Vì vậy dư lượng CAP trong máu phụ thuộc vào chức năng của thận trong việc bài tiết qua nước tiểu

c/ Tác dụng

CAP có thể xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và gắn với phần 50S của Ribosom

ức chế tổng hợp protein làm cho vi khuẩn không tổng hợp được protein dẫn đến yếu

đi và chết Tế bào thường không có Ribosom 50S nên không bị ảnh hưởng, tuy nhiên trong vi lập thể của động vật có vú cũng có Ribosom 50S nên cũng bị ảnh hưởng – điều này giải thích độc tính cao của CAP

CAP là kháng sinh có hoạt phổ rộng, tác dụng lên phần lớn các vi khuẩn và một số loại vi rút Nó có nhiều khả năng kháng khuẩn hơn Penicilin và Streptomycin, diệt nhiều loại vi khuẩn Gram dương và Gram âm, xoắn khuẩn Ricketsia và với cả những vi khuẩn đã kháng Penicilin và Streptomycin

Ở người, CAP được dùng để chữa thương hàn, viêm não, ít được dùng cho các trường hợp khác do độc tính cao Ngoài ra CAP còn được bổ sung vào thuốc mỡ tra mắt nhằm điều trị bệnh nhiễm trùng mắt như viêm kết mạc, viêm giác mạc hoặc có trong thành phần thuốc mỡ bôi cục bộ để điều trị vết thương ngoài da và tai Đôi khi CAP được điều chế ở dạng viên uống hoặc có thể tiêm vào tĩnh mạch trị các bệnh

Trong thú y, CAP được sử dụng một cách rộng rãi: ngoài việc chữa bệnh, CAP còn được cho vào thức ăn của gia súc để phòng bệnh và cho vào môi trường sống để chữa bệnh Tác dụng chữa bệnh của CAP đối với gia súc tương tự đối với người chủ yếu dựa vào phổ kháng khuẩn của nó

d/ Độc tính:

CAP gắn trên tiểu phần 50S (chỉ có trên VSV), còn gắn trên cả tiểu phần 70S hiện diện ở cả VSV và tế bào vật chủ Do đó CAP có thể gây suy tủy, phá hủy cấu trúc tủy xương dẫn đến thiếu máu vô tạo Điều này thường gặp khi sử dụng liều cao

kéo dài, ở liều điều trị thấp thường ít gặp hơn Tuy vậy nếu gặp thì thường rất nặng

và có thể gây tử vong

CAP có thể tương tác với ADN và ARN dẫn đến những sai lệch về di truyền CAP gây giảm hồng cầu, mức độ ảnh hưởng tùy thuộc vào lượng thuốc sử dụng Sự thay đổi thành phần máu xảy ra nếu hàm lượng thuốc trong máu lớn hơn 25μg/ml

CAP gây nên triệu chứng xanh tím ở trẻ em sơ sinh do chưa có đủ men gan

để khử hoạt CAP

CAP gây viêm lưỡi, miệng do thiếu vitamin B2 và PP, buồn nôn, ói, tiêu chảy

Do CAP có khả năng tồn tại lâu trong thực phẩm, khi ăn liên tục con người

có thể gặp những nguy cơ như: hệ sinh vật cũng như quá trình tổng hợp vitamin ở ruột bị thay đổi trở nên quá nhạy cảm đối với kháng sinh (dị ứng thuốc), hoặc nhờn thuốc do các vi sinh vật gây bệnh đã được làm quen và thích nghi với thuốc Do đó muốn tiêu diệt được cần phải có liều kháng sinh càng ngày càng cao khiến người bị nhiễm bệnh ngày càng nặng hơn, khó chữa trị hơn Việc sử dụng CAP lâu dài có thể dẫn đến hiện tượng kháng CAP của một số loài Salmonella làm ảnh hưởng đến khả năng chữa bệnh khi cần thiết Ngoài ra CAP còn có thể gây ung thư

Vì vậy việc xác định CAP trong thực phẩm là cần thiết để tránh gây tác hại cho người sử dụng

Trong ngành thú y những năm trước đây, hầu hết người chăn nuôi đều biết đến hiệu quả điều trị “thần kỳ” của Chloramphenicol, một kháng sinh của nhóm Phenicol Nhưng bên cạnh công năng điều trị hiệu quả nhiều bệnh do vi khuẩn thì Chloramphenicol lại có không ít nhược điểm, trong đó đáng chú ý nhất là ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng khi sử dụng thịt còn tồn dư một lượng lớn thuốc Chính vì thế mà Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Việt Nam đã ra Quyết định 29/2002/QĐ- BNN ngày 24/04/2002 về việc cấm sử dụng Chloramphenicol trong phòng, điều trị bệnh trên gia súc-gia cầm Chloramphenicol

chỉ giới hạn sử dụng ở các gia súc không cung cấp thực phẩm cho người: chó, mèo, ngựa

Florfenicol tác dụng mạnh hơn Chloramphenicol (invitro) và Thiamphenicol, không độc tính như Chloramphenicol, kháng được sự vô hoạt của

vi khuẩn cả trên những vi khuẩn đã kháng Chloramphenicol (đặc biệt vi khuẩn gây bệnh đường ruột) Được khuyến cáo sử dụng cho gia súc cung cấp thực phẩm cho người, thay thế những kháng sinh phổ rộng mà có độc tính và tồn dư trong sản phẩm động vật

Việc thay thế nhóm p-NO2 bằng CH3SO2 giúp loại độc tính gây thiếu máu

vô tạo và thay thế nhóm OH bằng F hạn chế sự phát triển đề kháng của Vi khuẩn

Do đó, cả Thiamphenicol và Florfenicol không gây thiếu máu vô tạo, nhưng lại ức chế sự tạo máu có hồi phục nhiều hơn Chloramphenicol

Florfenicol (kháng sinh nhóm Phenicol) đã ra đời, không những có những tính năng “thần kỳ” như Chloramphenicol mà còn khắc phục được các nhược điểm gây nguy hiểm đến sức khỏe con người

Florphenicol là kháng sinh thế hệ mới nhất của nhóm Phenicol, có hiệu quả trong điều trị các bệnh do vi khuẩn Gram âm, Gram dương Khi Florphenicol ra đời, một số bệnh như viêm phổi, thương hàn đã được điều trị một cách nhanh chóng và rất hiệu quả nhưng đa số các công ty đều sản xuất dạng dung dịch tiêm với thời gian kéo dài trong 3 đến 5 ngày, gây tốn kém chi phí, nhân công và đặc biệt là làm cho đối tượng điều trị bị stress Nhu cầu cần có một sản phẩm dung dịch tiêm chứa Floramphenicol nhưng chỉ cần tiêm 1 đến 2 liều là chặn đứng ngay bệnh và chỉ sử dụng một lượng nhỏ khi tiêm giúp hạn chế stress trên đối tượng điều trị

1.2.3 Giới hạn tồn dư cho phép đối với nhóm Phenicol

Do tính chất nguy hiểm ảnh hưởng lớn tới sức khỏe con người, Chloramphenicol đã bị cấm sử dụng cho tất cả các động vật làm thực phẩm ở các nước EU, Mỹ và Canada Chính vì vậy (đối với những hợp chất đã cấm sử dụng) Giới hạn định lượng cho phép lớn nhất cho các phương pháp phân tích xác định Chloramphenicol trong các thực phẩm có nguồn gốc động vật như thịt, hải sản, trứng, sữa, mật ong đưa ra bởi EU, Canada, Mỹ là 0,3ppb

Florfenicol là kháng sinh thế hệ mới trong nhóm kháng sinh Phenicol, khả năng điều trị bệnh của nó tương tự Chloramphenicol nhưng độc tính lại thấp hơn, không gây thiếu máu vô tạo, song lại ức chế sự tạo máu có hồi phục nhiều hơn Chloramphenicol Chính vì thế các nước vẫn đưa ra quy định về lượng tồn dư kháng sinh này trên động vật làm nguồn thức ăn cho con người Sau đây là một số giá trị MRL tham khảo đối với Florfenicol ở một số nước [26]:

Bảng 1.1 Giới hạn tồn dư cho phép lớn nhất(MRL) đối với Florfenicol ở một số

Thận Gan Thịt

Ở đây chúng ta thấy rõ giá trị MRL của flofenicol có sự chênh lệch rất lớn tới hàng nghìn lần giữa các quốc gia Đây cũng là một lưu ý khi chúng ta xây dựng phương pháp xác định đồng thời nhóm hợp chất này

Những giá trị MRL này cũng là tiêu chí mà ngành chăn nuôi cần đạt được để đảm bảo các sản phẩm đến người tiêu dùng là sạch, an toàn với sức khỏe con người

Ở nước ta, thị trường bán các sản phẩm có nguồn gốc động vật rất đa dạng từ siêu thị cho tới các chợ đầu mối, chợ lớn nhỏ, và hàng năm chúng ta cũng đã và đang hướng tới xuất khẩu rất nhiều các sản phẩm thủy hải sản ra nước ngoài Chính

vì thế kiểm soát tồn dư kháng sinh lại càng trở nên cấp thiết hơn, không chỉ là vấn

đề đảm bảo chất lượng các sản phẩm có nguồn gốc động vật để xuất khẩu mà quan trọng hơn còn là đảm bảo cho sức khỏe của chính chúng ta

Xuất phát từ những mục tiêu đó, cần có những phương pháp phân tích chính xác và tin cậy, đảm bảo chất phân tích có thể kiểm soát được ở mức nồng độ ppb

1.3 Một số phương pháp phân tích công cụ trong phân tích tồn dư kháng sinh 1.3.1 Phương pháp tách và làm giàu

Để thực hiện một quy trình phân tích tổng thể bất kì một chất hoặc cấu tử nào, đều phải thực hiện các bước sau: xác định vấn đề/đối tượng phân tích; lựa chọn phương pháp phân tích; chọn mẫu và xử lý mẫu; tách và làm giàu; đo định lượng

chất phân tích; đánh giá kết quả Đối với nhóm chất phenicol, do tính chất hầu như

tan rất yếu trong nước và tan tốt trong dung môi hữu cơ, đồng thời trong thực phẩm thường tồn tại ở dạng vết vì vậy chúng thường được tách, làm giàu và định lượng riêng

- Tách và làm giàu sơ bộ [15]:

Trước đây, các phương pháp tách và làm giàu sơ bộ thường được sử dụng là: chiết lỏng - lỏng, chiết soxhlet, cất lôi cuốn hơi nước, chiết siêu tới hạn Ngày nay người ta còn sử dụng một số phương pháp tách chiết hiện đại hơn như phương pháp chiết bằng lò vi sóng hay phương pháp chiết siêu âm Các phương pháp này chỉ sử dụng một lượng nhỏ các dung môi và tiết kiệm thời gian

- Làm sạch: đây là giai đoạn loại bỏ các chất bẩn và các cấu tử gây cản trở phép xác định Các vật liệu rắn dùng cho giai đoạn làm sạch thường là: ôxit nhôm, magiê silicat nhân tạo (florisil), silica-gel, silicagel ankyl hóa, polime Các vật liệu làm sạch này có khả năng loại trừ ảnh hưởng của hợp chất béo, các hydrocacbon thơm, các hợp chất cơ phốt pho và các hợp chất hữu cơ chứa nitơ… Đặc biệt hơn, phương pháp làm sạch mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn (solid phase extraction - SPE) hoặc vi chiết pha rắn (solid phase microextraction - SPME) hiện nay đang được sử dụng rộng rãi để chiết và làm giàu nhóm chất kháng sinh trong các đối tượng môi trường

và trong cơ thể sinh vật Các loại cột chiết pha rắn thường dùng là: cyano, diol,

R-NH2, C18, C8, silicagel,…

1.3.2 Phương pháp phân tích

Phân tích tồn dư kháng sinh từ cách đây khá lâu đã là vấn đề được rất nhiều nhà khoa học quan tâm vì nó liên quan trực tiếp đến sức khỏe con người Đặc biệt hơn nó là đối tượng đa ngành bao gồm của cả khối y dược, sinh học và hóa học

1.3.2.1 Phương pháp sinh hóa

Trong phân tích dư lượng kháng sinh, phương pháp vi sinh vật (VSV) đã và đang được sử dụng rộng rãi và đóng một vai trò quan trọng trong kiểm soát dư lượng kháng sinh trong các sản phẩm có nguồn gốc động vật [28] Nhiều phương pháp VSV đã được nghiên cứu, thích ứng và ứng dụng trong chiến lược kiểm soát ở các nước phát triển [21] như phương pháp bốn đĩa của Châu Âu (Four Plate Test) [19], test thận của Bỉ (Belgian Kidney Test) hay test một đĩa (One Plate Test) [24], phương pháp năm đĩa mới của Hà Lan (NAT: Nouws antibiotic test) hay STAR (Screening Test for Antibiotic Residues) protocol của Pháp [28]… Trong bối cảnh cần kiểm soát và phân tích một số lượng mẫu lớn thì những phương pháp sàng lọc này đã được khuyến cáo áp dụng trước khi dùng các phương pháp đặc hiệu để định lượng

Là nhóm chất có hoạt tính sinh học, do đó dựa trên đặc tính này phương pháp

phòng thí nghiệm trên thế giới cho phân tích kháng sinh đặc biệt là Chloramphenicol[6] Về nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm

cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện Tuy nhiên ELISA chỉ có tính chất bán định lượng, các mẫu dương tính và dương tính giả sau đó cần kiểm tra lại bằng các kỹ thuật sắc ký Tại Việt Nam, phòng thí nghiệm NAFIQAVED4 – thành phố Hồ chí Minh sử dụng phương pháp này kết hợp với LC/MS để xác định Chloramphenicol trong các mẫu thủy sản với giới hạn phát hiện 0,1ppb

Tuy nhiên, đối với yêu cầu kiểm soát và định lượng và đặc biệt với những kháng sinh đã bị cấm sử dụng thì áp dụng các phương pháp hóa học lại tỏ ra ưu việt

và cần thiết Ngày nay với sự phát triển các kỹ thuật phân tích công cụ việc định lượng chất phân tích đã trở nên dễ dàng hơn với độ nhạy và khả năng phát hiện cũng như khả năng định lượng ngày càng tốt Trong phân tích người ta đã và đang tiến dần tới những mức định lượng ở cấp lượng vết, siêu vết và hơn nữa là cấp độ phân tử Đối với việc định lượng nhóm Phenicol, trên Thế giới đã có nhiều nghiên cứu với các phương pháp hiện đại từ quang phổ hấp thụ, sắc ký lỏng hiệu năng cao, điện di mao quản…

1.3.2.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Các tác giả của khoa dược học, trường Đại học Benin, Nigeria đã tiến hành phản ứng khử Chloramphenicol trong một hỗn hợp Axit axetic và nước bằng Titan (III) Clorua tại nhiệt độ phòng trong 10 phút Sản phẩm của phản ứng cho kết hợp với p-dimetylaminobenzandehit và được gia nhiệt trong vòng 20 phút Sau hai bước phản ứng thu được sản phẩm cuối cùng là hợp chất màu vàng có khả năng hấp thụ

mạnh tại bước sóng 440nm Độ thu hồi của phương pháp là trên 90%, hệ số biến thiên từ 0,61 đến 2,17% tại khoảng nồng độ từ 1,05 đến 17,8μg/ml Đây là một phương pháp nhanh, hiệu quả và chi phí khá rẻ, song giới hạn phát hiện của phương pháp đạt được chưa cao 1,05 μg/ml Kết quả phát hiện và định lượng của phương pháp được các tác giả so sánh phương pháp phân tích vi sinh vật cho thấy không có

sự khác nhau có ý nghĩa thống kê Công trình nghiên cứu này được công bố năm 2003[20]

1.3.2.3 Phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Từ năm 1978, hai tác giả Robert L.thies và Lawrence J.Fischer đã tiến hành xác định Chloramphenicol trong nền mẫu sinh học (nước tiểu, dịch tủy não, huyết thanh) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Chất phân tích từ các nền mẫu được chiết với Dietyl ete, sau khi li tâm, thu lớp hữu cơ phía trên và làm bay hơi bằng dòng N2

ở nhiệt độ phòng Sau đó dùng Metanol để hòa cắn và đưa vào phân tích trên hệ thống HPLC Phương pháp sử dụng cột tách pha đảo, detector UV tại bước sóng 278m, dung môi rửa giải là Metanol và nước với tỉ lệ thể tích lần lượt là 30/70 Quá trình rửa giải kéo dài trong khoảng 5.5 phút Phương pháp có thể xác định được 1μg CAP trong 1ml dung dịch mẫu Hiệu suất thu hồi của phương pháp với các đối tượng mẫu khoảng 80% [31]

Gần đây nhất (10/2011), một công trình nghiên cứu của hai tác giả Fuad Rimawi và Maher Kharoaf đã phân tích Chloramphenicol và dẫn chất liên quan 2-Amino-1-(4-nitrophenyl)propane -1-3-diol trong thuốc bằng sắc ký lỏng pha đảo và detector UV-VIS Nghiên cứu tiến hành phân tích với detector UV-VIS tại bước sóng 278nm, sử dụng cột pha đảo C18, chạy chế độ đẳng dòng 2mL/phút, và pha động là hỗn hợp Natri pentasunfonat (0,012M), Acetonitril, Axitaxetic băng với tỉ lệ thể tích là 85:15:1 Phương pháp xây dựng nồng độ hai chất trong khoảng tuyến tính

Al-từ 0,04-0,16mg/mL, đạt độ thu hồi là 100% với độ lệch chuẩn 0,1% Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng đối với CAP lần lượt là 0,005% và 0,015% Đây là phương pháp có độ chính xác, độ nhạy và độ thu hồi rất tốt, song nó chỉ được ứng

1.3.2.4 Phương pháp sắc ký khối phổ

Nhìn chung các công trình nghiên cứu trước đó với các phương pháp phân tích sinh hóa, quang phổ, sắc ký lỏng, điện di mao quản đều cho ngưỡng phát hiện cỡ ppm Nhưng khi khối phổ ra đời, ban đầu chỉ được dùng chủ yếu cho xác định cấu trúc các chất, nhưng khi được ghép nối với sắc ký lỏng hiệu năng cao nó đã trở thành một hệ thống có ưu thế vượt trội trong phân tích các chất với khả năng phát hiện ở nồng độ rất thấp

Trong những năm gần đây, kỹ thuật sắc ký khối phổ đang được nghiên cứu và

áp dụng khá rộng rãi đối với nhóm kháng sinh Phenicol, nhất là khi Chloramphenicol đang dần được thay thế bằng những kháng sinh thế hệ mới của nó thì việc phân tích và định lượng không chỉ dừng lại ở phân tích riêng CAP mà còn

mở rộng sang cả nhóm kháng sinh này

Trên tạp chí về sắc ký công bố năm 2009, tác giả Janzhong Shen cùng với cộng sự đã xác định đồng thời CAP, TAP, FF và FF amin trong cơ và gan gia cầm bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ với quá trình ion hóa hóa học âm (GC-NCI/MS) Phương pháp sử dụng nội chuẩn CAP-d5, chạy MS với chế độ SIM và đạt được độ thu hồi từ 78,5 đến 105,5%, độ lệch chuẩn liên quan (RSD) <17% Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,1ng/g mẫu đối với CAP, 0,5ng/g mẫu đối với các chất còn lại [25]

Trên tạp chí phân tích thế giới, các tác giả Rebecca S Nicolich và cộng sự đã nghiên cứu thành công và áp dụng phương pháp phân tích đó để kiểm soát CAP trong các mẫu sữa tại thị trường Brazil bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ Phương pháp có độ thu hồi trên 95% và giới hạn phát hiện là 0,09ng/mL [30]

Cục quản lý dược và thực phẩm của Mỹ cũng đưa ra một số quy trình tham khảo để phân tích và kiểm soát CAP trong một số mẫu thủy sản bằng kỹ thuật LC-MS/MS vơí khả năng phát hiện 0,08ppb [18, 23]

Trong điều kiện của nước ta, do chiến lược kiểm soát dư lượng các chất tồn dư nói chung và kháng sinh nói riêng chưa thực sự rõ ràng, khi triển khai gặp rất nhiều khó khăn Các yêu cầu về nghiên cứu phương pháp để lựa chọn được những điều kiện phân tích và có khả năng ứng dụng vẫn đang đặt ra đặc biệt là khi chất phân tích cần kiểm soát ở lượng vết cũng như cần phải sử dụng thiết bị phân tích yêu cầu

kĩ thuật cao như sắc ký khối phổ

Phương pháp HPLC phát triển vững chắc trong đầu những năm 70, khi các vật liệu hiệu quả cao được sản xuất cùng với các tiến bộ về thiết bị cho phép thực hiện đầy đủ năng lực của các loại vật liệu này Tiếp sau đó kĩ thuật ghép nối HPLC với khối phổ được ra đời, ngày càng phát triển mạnh hơn và thể hiện tính ưu việt của nó trong phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau Nguyên lý hoạt động của nó là các cấu tử được tách khỏi cột sắc ký sẽ lần lượt được đưa vào nguồn ion của máy khối phổ Tại đó, chúng được phân mảnh và được tách khối nhờ một từ trường rồi đi vào bộ nhân quang để chuyển hóa thành tín hiệu điện Ứng với mỗi một pic trên sắc ký đồ sẽ nhận được một khối phổ đồ riêng biệt và hoàn chỉnh [8]

Kỹ thuật ghép nối LC-MS này được phát triển rất nhanh và cho đến nay đã trở nên khá phổ biến với nhiều ưu điểm đặc trưng đó là: sử dụng các hợp chất đồng vị đánh dấu làm chất chuẩn để làm tăng độ chính xác của phép phân tích, có thể xác định thành phần nguyên tố của hợp chất nếu sử dụng thiết bị có độ phân giải cao và có thể phân tách được các pic sắc ký không phân tách trên cơ sở sự khác nhau về phổ khối của chúng, nghiên cứu được các hợp chất không bền, tách và nhận biết đồng thời hỗn hợp nhiều cấu tử, lượng mẫu nhỏ Ngoài ra, thiết bị sắc ký lỏng còn có thể ghép nối với nhiều thiết bị phổ khác nhau như: cộng hưởng từ hạt nhân, phổ hồng ngoại chuyển hóa Fourier, quang phổ phát xạ và hấp thụ nguyên tử…[15, 17]

Hình 1.1 Sơ đồ thiết bị lỏng khối phổ (LC/MS)

1.3.2.4.1 Nguyên tắc hoạt động của HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có đặc thù riêng, đó là sắc ký lỏng pha liên kết, sắc ký phân bố lỏng-lỏng và sắc ký trao đổi ion lỏng – rắn, sắc

ký hấp phụ lỏng – rắn (trong đó một dạng đặc biệt là sắc ký ái lực) v.v [11]

Trong LC/MS, phần sắc ký lỏng đóng vai trò tách chất để đưa vào MS nhận biết

và định lượng Do đó hai yếu tố quan trọng để thực hiện vai trò của HPLC cần nói tới ở đây là lựa chọn pha tĩnh (cột nhồi) và pha động cho quá trình chạy chất phân tích Trong luận văn này chúng tôi chỉ xin đề cập tới hai yếu tố đó trong sắc ký lỏng pha liên kết – đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi do những tính chất ưu việt của nó

1.3.2.4.2 Pha tĩnh trong HPLC [11]

Sắc ký pha thường: Khi dùng trực tiếp silicagen làm pha tĩnh ta có thể tách

đa dạng các chất không phân cực hay ít phân cực Pha động là các dung môi không phân cực, thí dụ n-hexan, toluene… nên gọi là sắc ký pha thường hay còn gọi là sắc

ký trực tiếp (silicagen trần) Khi silicagen được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực như các aminopropyl: -(CH2)3NH2, cyanopropyl: -(CH2)3CN, propyldiol: -(CH2)3-O-CH2-CH(OH)-CH2OH, như vậy pha tĩnh phân

cực mang những tính chất khác nhau, còn pha động không phân cực, đây cũng là sắc ký pha thường

Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh là silicagen có gắn gốc ankyl mạch dài, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37 cho nên không phân cực, còn pha động phân cực Nó được sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng, từ rất phân cực,

ít phân cực tới không phân cực

Tạp chí “Analytical Chemistry” đã có tổng kết khá lý thú về các công trình sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được công bố: khoảng 74% các công trình thuộc về phương pháp sắc ký pha liên kết, trong đó 60% là sắc ký pha đảo, phần còn lại là của sắc ký pha thường

1.3.2.4.3 Pha động trong HPLC [11]

Trong sắc ký pha thường, pha động là các dung môi không phân cực như benzene, n-hexan, toluene… còn trong sắc ký pha đảo, pha động là các dung môi phân cực có thể là nước, methanol, axetonitril… Tuy nhiên, người ta thường dùng hỗn hợp hai hay ba dung môi để có một pha động có độ phân cực phù hợp với phép phân tích Tách các hỗn hợp mẫu phức tạp người ta phải dùng pha động có thành phần là hỗn hợp các dung môi Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trường hợp này người ta gọi là rửa giải gradient nồng độ

Pha động phải thỏa mãn các điều kiện sau:

- Trơ với pha tĩnh

- Hòa tan được mẫu phân tích

- Bền vững trong thời gian chạy sắc ký

- Có độ tinh khiết cao

- Phù hợp với detector

- Không quá đắt

Một ưu điểm của sắc ký pha đảo là sử dụng hệ pha động phân cực, thường là nước và một dung môi hữu cơ khác như methanol, axetonitril… Như vậy có thể đáp

ứng được mục đích về kinh tế, hơn nữa do tính chất đa dạng của pha tĩnh có thể tách được nhiều loại mẫu khác nhau

 Detector huỳnh quang RF: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang Đối với những chất không có khả năng như vậy, cần phải dẫn xuất hoá chất phân tích, gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang hoặc chất phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo thành sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang

 Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: các ion kim loại chuyển tiếp

Hiện nay, các detector hiện đại ngày càng được cải tiến như diot-aray, khối phổ, nó giúp người phân tích xác định chính xác chất phân tích Ngoài ra do kĩ thuật tin học phát triển, người phân tích có thể thực hiện phép tách theo chương trình định sẵn, có thể thực hiện các phép tách tự động nhiều mẫu phân tích

1.3.2.5 Detector khối phổ (Mass Spectrometry) [15, 17]

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng

và điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa, Các ion tạo thành này được tách theo

tỉ số m/z, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích và detector Trước hết, các mẫu được ion hóa trong nguồn ion, sau đó đưa

vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z Các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính để xử lí và lưu trữ

*/ Nguồn ion

Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và được ion hóa Một số kĩ thuật ion hóa được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như: ion hóa phun điện tử (electrospray ionization – ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (atmospheric-pressure chemical ionization – APCI), ion hóa bắn phá nguyên tử nhanh (fast-atom bombardment – FAB) Dưới đây là

phương pháp ion hóa được sử dụng trên thiết bị khối phổ mà chúng tôi nghiên cứu: Ion hóa phun điện tử – ESI

Kĩ thuật này chuyển hóa các ion từ dung dịch lỏng thành các ion ở dạng khí Dung dịch mẫu được dẫn vào vùng có trường điện từ mạnh được duy trì ở hiệu điện thế cao 4kV Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện và được hút tĩnh điện tới lối vào của thiết bị phân tích khối phổ Các giọt nhỏ trước khi vào thiết bị phân tích khối phổ sẽ được kết hợp với dòng khí khô để làm bay hơi dung môi Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dương và ion âm

Hình 1.2 Kĩ thuật ESI bắn phá với chế độ ion dương

Đây là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao Kĩ thuật này ứng dụng phân tích các chất không phân cực như: protein, peptit, cacbonhydrat, nucleotit, polyetilen glycocol, và các chất phân cực có khối lượng phân tử nhỏ

*/ Bộ phận phân tích khối lượng

a) Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser)

Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống để các ion bay qua Một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF) Các tứ cực được đóng vai trò như một

bộ lọc khối Khi một trường điện từ được áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trường RF Chỉ những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua được bộ lọc này

b) Bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)

Loại thiết bị này bao gồm một điện cực vòng (ring electrode) với nhiều điện cực bao xung quanh, điện cực đầu cột (end-cap electrode) ở trên và ở dưới Trái với

loại thiết bị tứ cực ở trên, các ion sau khi đi vào bẫy ion theo một đường cong ổn định được bẫy lại cho đến khi một điện áp RF được đặt trên điện cực vòng Các ion khác nhau m/z sau đó trở nên không ổn định và sẽ có hướng đi về phía detector Do điện áp RF khác nhau trong hệ thống này mà thu được một phổ khối lượng đầy đủ

Các ion tồn tại trong bẫy có thể được chọn riêng và phân tích theo sự khác nhau về m/z, đồng thời có thể chọn riêng và thực hiện quá trình bắn phá để thu được các mảnh ion con, từ đó thực hiện phân tích theo m/z của ion con (khối phổ 2 lần)

Về nguyên tắc các ion có thể tồn tại trong bẫy thời gian đủ lâu có thể thực hiện đến

MS n lần, tuy nhiên trong thực tế thường chỉ có khả năng thực hiện đến khối phổ 3 lần

c) Bộ phân tích thời gian bay (Time of Flight Analyser)

Phân tích thời gian bay dựa trên cơ sở gia tốc các ion tới detector với cùng một năng lượng Do các ion có cùng năng lượng nhưng lại khác nhau về khối lượng

nên thời gian đi tới detector sẽ khác nhau Các ion nhỏ hơn sẽ đi tới detector nhanh hơn do có vận tốc lớn hơn còn các ion lớn hơn sẽ đi chậm hơn, do vậy, thiết bị này được gọi là thiết bị phân tích thời gian bay do tỉ số m/z được xác định bởi thời gian bay của các ion Thời gian bay của một ion tới detector phụ thuộc vào khối lượng, điện tích và năng lượng động học của các ion Độ phân giải của bộ phân tích thời gian bay thấp nhưng nó có ưu điểm là khối lượng ion có thể phân tích không bị hạn chế

*/ Bộ phận phát hiện

Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối lượng, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang

Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất,

có độ nhạy cao Các ion đập vào bề mặt dinot làm bật ra các electron Các electron thứ cấp sau đó được dẫn tới các dinot tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron

Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị nhân electron, các ion ban đầu đập vào một dinot tạo ra dòng các electron Khác với detector nhân electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn phôtpho và giải phóng ra các photon Các photon này được phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron Ưu điểm của phương pháp này là các ống nhân quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được các khả năng nhiễm bẩn