ứng dụng kỹ thuật sắc ký điện di mao quản phân tích acesulfame-k, saccharin, aspartame trong đồ uống

Trong đó phương pháp quang phổ UV-VIS tuy có thể dùng để định lượng riêng các chất, nhưng có nhược điểm là khó phân biệt phổ của chất khi có lẫn các chất cản trở như : chất bảo quản, phẩ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



TRẦN PHÚC NGHĨA

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ ĐIỆN DI MAO

QUẢN PHÂN TÍCH ACESULFAME-K,

SACCHARIN, ASPARTAME TRONG

ĐỒ UỐNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA HOÁ HỌC



TRẦN PHÚC NGHĨA

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ ĐIỆN DI MAO

QUẢN PHÂN TÍCH ACESULFAME-K,

SACCHARIN, ASPARTAME TRONG

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương I: TỔNG QUAN 2

1.1.Giới thiệu về đường hóa học 2

1.1.1 Định nghĩa 2

1.1.2 Phân loại 2

1.1.3 Tác hại của đường hóa học 2

1.1.4 Tình hình sử dụng đường hóa học trong thực phẩm, đồ uống hiện nay 2

1.2 Đại cương về chất phân tích 4

1.2.1 Acesulfame-K 4

1.2.2 Aspartam 5

1.2.3 Saccharin 6

1.3 Tổng quan về các phương pháp phân tích Ac-k, Sac, As 7

1.3.1 Các phương pháp và xu hướng nghiên cứu trong nước 7

1.3.2 Các phương pháp trên thế giới 7

1.3.2.1 Phương pháp quang phổ UV – VIS 8

1.3.2.2 Các phương pháp HPLC 10

1.3.2.3 Phương pháp điện di mao quản 12

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1.Đối tượng, nội dung và mục tiêu nghiên cứu 14

2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 14

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Phương pháp sử lý mẫu 15

2.2.2 Phương pháp sắc ký điện di mao quản 15

2.2.2.1 Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản 15

2.2.2.2 Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản 15

2.2.2.3 Đặc điểm của điện di mao quản 16

2.2.2.4 Phân loại điện di mao quản 16

2.2.2.6 Dòng điện thẩm (Electroosmotic flow-EOF) 17

2.2.2.7 Các thông số phân tích của CE 20

2.2.2.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điện di 21

2.2.2.9 Các loại detector thông dụng trong phương pháp điện di mao quản 21

2.2.2.10 Điện di mao quản vùng (CZE) 22

2.3 Phương tiện nghiên cứu 22

2.3.1 Nguyên vật liệu 22

2.3.1.1 Chất chuẩn đối chiếu 22

2.3.1.2 Hóa chất dung môi 23

2.3.1.3 Thiết bị dụng cụ 23

2.4 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất 24

2.4.1 Pha dung dịch chuẩn gốc 24

2.4.2 Pha dung dịch đệm 25

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Tối ưu hóa các điều kiện xác định Ace-K, Sac, Asp bằng kỹ thuật sắc ký điện di mao quản 27

3.1.1 Một số điều kiện cố định 27

3.1.2 Khảo sát các điều kiện 27

3.1.2.1 Hệ đệm 28

3.1.2.2 Xác định điều kiện nhiệt độ 32

3.1.2.3 Xác định thế đặt vào hai đầu 33

3.1.2.4 Xác định bước sóng định lượng 34

3.1.2.5 Kết luận 36

3.2 Thẩm định phương pháp 36

3.2.1 Tính chọn lọc Error! Bookmark not defined 3.2.2 Các chất cản trở gây ảnh hưởng 38

3.2.2.1 Ảnh hưởng của chất bảo quản 39

3.2.2.2 Ảnh hưởng của các loại đường 40

3.2.2.3 Ảnh hưởng của phẩm màu 42

3.2.3 Khảo sát lập đường chuẩn 44

3.2.4 Giới hạn phát hiện LOD 47

3.2.5.Giới hạn định lượng LOQ 49

3.2.6 Khoảng tuyến tính 50

3.2.7 Đánh giá độ chính xác (độ đúng, độ chụm ) của phương pháp 50

3.2.8 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp 52

3.3 Phân tích mẫu thực tế 54

3.4 Bàn luận về qui trình rửa giải 61

KẾT LUẬN 63

KIẾN NGHỊ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

PHỤ LỤC 69

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả sự phụ thuộc giữa diện tích píc của các chất vào các loại đệm 28

Bảng 3.2 Kết quả sự phụ thuộc giữa diện tích píc của các chất vào giá trị pH 29

Bảng 3.3 Kết quả sự phụ thuộc của thời gian lưu của các chất chuẩn 31

vào nồng độ đệm borat 31

Bảng 3.4 Kết quả thời gian lưu của asp, sac, ace-k ở các nhiệt độ khác nhau 32

Bảng 3.5 Thời gian lưu của asp, sac, ace-k khi thay đổi điện thế 34

Bảng 3.6 Diện tích píc của asp, sac, ace-k ở các bước sóng khác nhau 35

Bảng 3.7 Kết quả thể hiện tính chọn lọc của phương pháp 38

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của chất bảo quản lên diện tích pic của Ace-K, Sac, Asp 39

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của đường Glucose, Fructose, Cyclamate và Saccharose 40

lên diện tích pic của Ace-K, Sac, Asp 40

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của phẩm màu Tarta và Brill, Sunset và Qui 42

tới diện tích pic của Asp, Sac, Ace-K 42

Bảng 3.11 Sự phụ thuộc diện tích píc vào nồng độ Asp, Ace-K, Sac 44

Bảng 3.12 Giá trị phương sai và Ftính của Asp, Sac, Ace-K 47

Bảng 3.13 Giới hạn phát hiện (LOD) theo phương pháp lý thuyết tính theo 49

phương trình đường chuẩn 49

Bảng 3.14: Giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 49

Bảng 3.15 Khoảng tuyến tính của Asp, Sac, Ace-K 50

Bảng 3.16 Sai số và độ lặp lại của phép đo tại các nồng độ khác nhau 51

Bảng 3.17 Diện tích píc của As, Sac, Ac-k ở các nồng độ khác nhau 53

Bảng 3.18 Kết quả độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp 53

Bảng 3.19 Kết quả diện tích pic đối với mẫu thêm chuẩn và không thêm chuẩn 55

Bảng 3.19 Kết quả phân tích Asp, Sac, Ace trong các mẫu 61

MỤC LỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo máy điện di muản 15

Hình 2.2 Mặt cắt ngang của mao quản 17

Hình 2.3 Cấu trúc lớp điện kép trên thành mao quản 18

Hình 2.4 Dòng EOF và lớp điện kép trong mao quản 18

Hình 2.5 Các kiểu dòng chảy và pic sắc ký trong CE 19

Hình 2.6 Hệ thống phân tích CE: Máy điện di Agilent, máy tính, máy in 23

Hình 3.1: Phổ hấp thụ UV – VIS của asp (a), sac (b), ace- k (c) trong môi 27

trường nước ( L= 65cm, i.d=50 μm, áp suất 50 mbar, I = 50 mA, E = 25 kV) 27

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc của các chất 28

vào các loại đệm 28

Hình 3.3 Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất chuẩn asp, sac, ace-k trong điều kiện 29

Đệm borat 20 mM pH 9,00 ( L=65 cm, I=50 mA, V=25kV, t =25oC, áp suất 50 mbar) 29 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc của 30

asp, sac, ace-k vào giá trị pH của đệm borat 20 mM 30

Hình 3.5 Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất chuẩn asp, sac, ace-k trong điều kiện (Đệm borat pH 9,5, L=65 cm, I= 50mA, V= 25kV, t=25oC áp suất 50 mbar) 30

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa thời gian lưu của asp, sac, ace-k 31

vào nồng dộ đệm borat pH 9,5 31

Hình 3.7 Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất trong điều kiện đệm borat 20 mM 31

( pH 9,5 và I=50 mA, V=25kV, L= 65 cm, t =25oC, áp suất 50 mbar) 31

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa thời gian lưu 32

của asp, sac, ace-k vào nhiệt độ 32

Hình 3.9 Điện di đồ của hỗn hợp asp, sac, ace-k ở nhiệt độ 25oC trong điều kiện 33

( Đệm borat 20 mM, pH 95, và I=50 mA, V=25kV, L= 65 cm, áp suất 50 mbar) 33

Hình 3.10 Đồ thị biểu diện sự phụ thuộc giữa thời gian lưu 34

của asp, sac, ace-k vào điện thế 34

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc 35

của asp, sac, ace-k vào bước sóng 35

Hình 3.12 Sắc đồ các chất chuẩn trong hỗn hợp ở bước sóng 215,5 nm 35

(L=65 cm, V=25kV, I=50mA, đệm borat 20mM, pH=9,5, t = 20oC, áp suất 50 mbar) 35

Hình 3.13 Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất trong điều kiện điện di lựa chọn 36

(L=65cm, I=50 mA, V=25 kV, áp suất 50 mbar, t =25oC, đệm borat 20 mM, pH= 9,5 ) 36 Hình 3.14 Điện di đồ về thời gian lưu của chuẩn đơn Aspartame (hình c), 37

Acesulfame-k (hình b), Saccharin( hình a) trong điều kiện (L=65cm, I=50 mA, V=25 kV, áp suất 50 mbar, t =25oC, đệm borat 20 mM, pH= 9,5 ) 37

Hình 3.15 Điện di đồ khi thêm các yếu tố ảnh hưởng(axit benzoic 43,04 ppm, 43

axit sorbic 46,08 ppm, glucose 46,24 ppm, fructose 43,04 ppm, saccharose 41,80 ppm, cyclamate 50 ppm, sunset yellow 67,52 ppm , brilliant 18,6 ppm, quilenol 57,12 ppm , tartarin 48,64 ppm ) trong điều kiện (L=54cm, I=50 mA, V=25 kV, áp suất 50 mbar, 43

t =25oC, đệm borat 20 mM, pH= 9,5 ) 43

Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ Asp 45

và đường chuẩn của Aspartame 45

Hình 3.17 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ Saccharin 45

và đường chuẩn của Saccharin 45

Hình 3.18 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ Acesulfame-K 46

và đường chuẩn của Acesulfame-K 46

Hình 3.19 Đường chuẩn thêm chuẩn của Aspartame (a), Saccharin (b), 56

Acesulfame-K (c) trong mẫu Samurai 56

Hình 3.20 Đường chuẩn thêm chuẩn của Aspartame (a), Saccharin (b), 57

Acesulfame-K (c) trong mẫu Sprite 57

Hình 3.21 Đường chuẩn thêm chuẩn của Aspartame (a), Saccharin (b), 58

Acesulfame-K (c) trong mẫu Lemon C2 58

Hình 3.22 Đường chuẩn thêm chuẩn của Aspartame (a), Saccharin (b), 59

Acesulfame-K (c) trong mẫu Coca Cola 59

Hình 3.23 Đường chuẩn thêm chuẩn của Aspartame (a), Saccharin (b), 60

Acesulfame-K (c) trong mẫu Trà xanh Oo 60

MỞ ĐẦU

Acesulfame-k, saccharin, và aspartame là những chất ngọt tổng hợp thường được

sử dụng trong các ngành sản xuất chế biến dược phẩm, mỹ phẩm, cũng như trong thực phẩm (đặc biệt là các loại đồ uống) Các chất này có thể gây ảnh hưởng tới sức khỏe người dùng ở các mức độ khác nhau tuỳ thuộc vào liều lượng đưa vào cơ thể Vì vậy, một vấn đề được đặt ra không chỉ với các cơ quan quản lý chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm, mà còn với những nhà sản xuất là phải xây dựng phương pháp phát hiện, định lượng các chất kể trên nhằm phục vụ cho công tác thanh tra, kiểm định và kiểm soát hàm lượng nằm trong tiêu chuẩn cho phép

Hiện nay việc phân tích acesulfame-k, saccharin,và aspartame có thể được tiến hành chủ yếu dựa vào kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Ưu điểm của HPLC là độ chính xác và độ lặp lại cao nhưng chi phí tốn kém và độc hại do sử dụng dung môi hữu

cơ Thêm vào đó, các chất được khảo sát là các chất phân cực, nên việc phân tích bằng HPLC trên thực tế gặp khá nhiều khó khăn

Do đó, trong đề tài nghiên cứu này chúng tôi đã chọn phương pháp điện di mao quản

để xác định đồng thời hàm lượng aspartame, acesulfame-k, và saccharin trong các loại đồ uống Phương pháp này có ưu điểm là thiết bị tương đối đơn giản, chi phí thấp và đặc biệt

có thể tích hợp với nhiều loại đetectơ khác nhau như đetectơ quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis), huỳnh quang, khối phổ, điện hóa (đo dòng, đo thế và đo độ dẫn), nên sẽ cho khả năng nhận dạng và định lượng các chất một cách khá chọn lọc

Nghiên cứu được chúng tôi tiến hành nhằm thực hiện 2 mục tiêu:

- Xây dựng, thẩm định phương pháp tách và định lượng đồng thời acesulfame-k, saccharin, và aspartame - một số chất chất ngọt tổng hợp hay dùng trong đồ uống, nước giải khát

- Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để phân tích các chất khảo sát kể trên trong một số sản phẩm đang lưu hành trên thị trường

trong bánh kẹo, nước giải khát…[11]

- Chất tạo ngọt sinh năng lượng là những chất tạo ngọt sinh ra lượng năng lượng lớn hơn 2% lượng đường tạo ra cùng vị ngọt, thường được sử dụng gồm fructose, xylitol, sorbitol, mannitol, lactitol, lactulose, maltitol, isomalt…

1.1.3 Tác hại của đường hóa học

Tâm lý người tiêu dùng ngày nay hướng về những gì có xuất xứ tự nhiên Trong đó đường hóa học là vấn đề gây nhiều lo ngại, nhất là khi có nhiều tai tiếng là đường hóa học

gây ung thư

Theo báo New York Time đăng tải: Thượng nghị Sĩ Howard Metzenbaum đã viết một dự luật đề nghị phải có một lời cảnh báo được in trên các nhãn hiệu của các sản phẩm

có chứa chất "Aspartame", đặc biệt lưu ý đối với người mang thai và trẻ em Dự luật cũng

sản phẩm có sự hiện diện của các chất này gây ra các chứng co giật, thay đổi trong não bộ

và hệ thần kinh, cùng các biến chứng về tính cách

Aspartame khi vào cơ thể, bản thân nó không hấp thụ vào máu mà tan ra trong ruột thành ba chất: aspartic acid (40%), phenylalanin (50%) và methanol (10%) Đây là cơ sở của nhiều ý kiến về tác động bất lợi cho sức khỏe con người từ aspartam

Saccharin khi đi vào cơ thể, nó không bị hấp thụ vào các bộ phận trong cơ thể mà được thải hồi sau đó qua đường tiểu tiện Do đó, có thể nói saccharin không tạo ra năng lượng cho cơ thể và không ảnh hưởng đến lượng đường trong máu Dùng nhiều lượng saccharin có thể sinh ra chứng béo phì

Acesulfame-K có thể gây nên một số biến chứng như : Đi tiểu thường xuyên, tiểu gắt, nước tiểu đậm màu, ngứa ngáy, khó thở, tức ngực nếu dung hàm lượng nhiều

Tại Hoa Kỳ, các loại đường aspartame, saccharin, dextrose, maltodextrin, sucralose…đã được FDA chấp nhận, nhưng vẫn chưa có những kết quả nghiên cứu về mức an toàn cũng như độ độc hại Hiện nay tại VN chỉ có các chất tạo ngọt manitol, acesulfam K, aspartam, isomalt, saccharin (và Na, K, Ca của nó), sorbitol và sirô sorbitol, sucraloza được Bộ Y tế cho phép sử dụng trong chế biến thực phẩm với giới hạn tối đa và

có qui định rõ ràng

1.1.4 Tình hình sử dụng đường hóa học trong thực phẩm, đồ uống hiện nay

Trong những năm gần đây, nền kinh tế của nước ta chuyển sang cơ chế thị trường Các loại thực phẩm sản xuất, chế biến trong nước và nước ngoài nhập vào Việt Nam ngày càng nhiều chủng loại Việc sử dụng các chất phụ gia trong sản xuất trở nên phổ biến Các loại phẩm màu, đường hóa học đang bị lạm dụng trong pha chế nước giải khác, sản xuất bánh kẹo, chế biến thức ăn sẵn như thịt quay, giò chả, ô mai … Tình hình sản xuất thức

ăn, đồ uống giả, không đảm bảo chất lượng và không theo đúng thành phần nguyên liệu cũng như quy trình công nghệ đã đăng ký với cơ quan quản lý đang là nỗi nhức nhối với toàn xã hội Chính vì nhờ độ ngọt cao, giá thành lại rẻ nên tại TP HCM, nhất là ở các hàng quán vỉa hè, tiểu thương vẫn dùng các loại đường hóa học chế biến thức ăn, luộc bắp hay ngâm trái cây, làm kem, nước phở … để tăng vị ngọt.[23]

Theo báo cáo đầu năm của đoàn kiểm tra trung tâm y tế dự phòng quận Ninh Kiều (Cần Thơ) đã phát hiện cơ sở rang cà phê Thái Dương (phường An Bình, Ninh Kiều)

dùng đường cyclamate trong chế biến cà phê về hành vi sử dụng phụ gia trái quy định Trên thực tế, ngày 17/5 vừa qua, Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm tỉnh Cà Mau đã phát hiện kem tại điểm bán số 41, ấp Cây Trâm, xã Định Bình, TP Cà Mau (Cà Mau) sử dụng đường hóa học cyclamat (hiện cấm sử dụng tại Việt Nam) và đường Aspartame Không chỉ kem, mà sữa đậu nành cũng bị phát hiện chứa đường hóa học Ngày 15/4, phòng Cảnh sát phòng chống tội phạm về môi trường công an tỉnh Thái Bình, đã kiểm tra phát hiện 563 thùng sữa đậu nành thương hiệu 199 Hoàng Hà là của Công ty TNHH Chế biến thực phẩm Hoàng Hà ở Trịnh Nguyễn, phường Châu Khê, Từ Sơn, Bắc Ninh.có chứa hàm lượng Aspartame và Saccharin vượt mức cho phép

Theo báo cáo của cơ quan quản lý vệ sinh an toàn thực phẩm sở Y tế TPHCM đã thanh tra một cơ sở sản xuất nước mắm ở quận Bình Tân Đoàn thanh tra phát hiện 120 chai nước mắm loại 20ml; 168 chai siêu hạng loại 350ml; sáu chai loại 720ml đều được chế biến bằng đường hóa học Aspartame và cyclamate.[23]

1.2 Đại cương về chất phân tích

1.2.1 Acesulfame-K

 Tính chất

-Tên IUPAC: potassium 6 - methyl - 2,2 - dioxo-oxathiazin – 4 - olate

- Công thức hóa học: C4H4KNO4S

- Công thức cấu tạo:

O O

- Có dạng tinh thể màu trắng với cấu trúc hóa học tương tự saccharin

- Ổn định hơn Aspartam ở nhiệt độ cao và môi trường acid

 Vai trò

Được sử dụng để tạo vị ngọt trong thức ăn, đồ uống, dược phẩm nhằm tăng cường

vị và che dấu những vị khó chịu Thường được dùng phối hợp với các chất ngọt tổng hợp khác như Aspartam, Cyclamat Không được chuyển hóa trong cơ thể và nhanh chóng đào thải ra khỏi cơ thể Hàng ngày không nên đưa vào cơ thể một lượng lớn hơn 15 mg/kg

O O

- Độ tan: tan ít trong nước, tan rất ít trong ethanol

- Dung dịch 1%(KL/TT) ở 20oC có pH 5,2

- Tương kỵ với calci hydrophosphat, magnesi stearat

- Tỷ trọng: 1,347 g.cm-3

- Nhiệt độ sôi: 247 °C

- Khối lượng mol phân tử: 294,3 g/mol

- Không để lại dư vị khó chịu, không ổn định ở nhiệt độ và pH cao

- Là một dipeptid, màu trắng, không mùi, vị ngọt mạnh (độ ngọt của nó cũng bằng khoảng 180-200 lần độ ngọt của sucrose)

- Giống như các dipeptid khác, aspartam có chứa năng lượng khoảng 4 Kcal/g (17 Kj/g) Tuy nhiên, chỉ cần một lượng rất nhỏ aspartam đã tạo ra độ ngọt cần thiết Do đó năng lượng chúng ta đưa vào cơ thể sẽ không đáng kể

- Vị ngọt của nó chúng ta cảm nhận được chậm hơn và kéo dài lâu hơn so với đường

- Phân hủy dần trong nước nên nước ngọt có aspartam không giữ được lâu Cho trộn aspartam với saccharin hoặc acesulfam K thì hỗn hợp ngọt hơn và ổn định hơn khi hai chất đứng riêng một mình

 Vai trò

Được sử dụng để tạo vị ngọt trong thức ăn, đồ uống, dược phẩm, bánh kẹo… nhằm tăng cường vị ngọt và che dấu những vị khó chịu Thường được dùng phối hợp với các chất ngọt tổng hợp khác như Acesulfam K, Cyclamat Là một chất không độc song các dạng chuyển hóa của nó lại độc như: Axit Aspartic , phenylalanine

O

O O

- Tinh thể màu trắng trong, không mùi, tan ít trong nước và ete

- Độ tan : Nước là 1g/290 ml ; Ethanol(95%) là 1g/31ml

- Ngọt gấp 300 - 400 lần saccharose, ổn định ở môi trường acid nên dùng được

trong nước ngọt, thường dùng dưới dạng muối natri hay canxi

- Trong cơ thể saccharin qua hệ thống tiêu hóa mà không hề bị hấp thu Nó không

gây ảnh hưởng đến hàm lượng insulin trong máu và cũng không cung cấp năng lượng cho

cơ thể Vì thế nó được xếp vào nhóm chất tạo ngọt không calo

 Vai trò

Được sử dụng để tạo vị ngọt hoặc che dấu mùi vị trong thức ăn, đồ uống, kem đánh răng, nước súc miệng Nó thường được sử dụng ở nồng độ 0,02-0,5% (KL/KL) Phản ứng bất lợi do saccharin đã được ghi nhận: mề đay, nhạy cảm với ánh sáng Hàng ngày không nên đưa vào cơ thể một lượng Saccharin dưới dạng muối (Natri, kali) lớn hơn

5 mg/kg trọng lượng

1.3 Tổng quan về các phương pháp phân tích Ac-k, Sac, As

1.3.1 Các phương pháp và xu hướng nghiên cứu trong nước

Hiện nay, tùy thuộc vào điều kiện cơ sở vật chất mà các phòng thí nghiệm có thể tiến hành phân tích đối tượng nghiên cứu theo các phương pháp khác nhau Một số phương pháp phổ biến có thể kể đến như quang phổ hấp phụ phân tử UV-VIS, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, điện di mao quản vùng CZE Trong đó phương pháp quang phổ UV-VIS tuy có thể dùng để định lượng riêng các chất, nhưng có nhược điểm là khó phân biệt phổ của chất khi có lẫn các chất cản trở như : chất bảo quản, phẩm màu, các loại đường…, nên hiện nay ít được sử dụng HPLC với những ưu điểm của nó như khả năng tách chất, độ chính xác cao, độ lặp lại tốt thường được sử dụng để phân tích các chất ngọt tổng hợp nói chung và nhóm chất khảo sát nói riêng

Sử dụng kỹ thuật điện di mao quản để phân tích các chất ngọt tổng hợp đang có xu hướng phát triển ở nước ta trong những năm gần đây Với ưu điểm là tiết kiệm, ít độc hại, trong khi vẫn đảm bảo được độ chính xác và tính chọn lọc cao, nên nó ngày càng nhận được sự quan tâm nghiên cứu nhằm thay thế cho HPLC

1.3.2 Các phương pháp trên thế giới

Như đã nói, HPLC và điện di mao quản là hai kỹ thuật phân tích phù hợp cho việc xác định đồng thời hỗn hợp các đường hóa học kể trên, và đã được sử dụng rộng rãi trên

thế giới Vậy nên trong mục này, chúng tôi chỉ đề cập tới những công trình nghiên cứu tiêu biểu đã được triển khai trên các hệ thống này

1.3.2.1 Phương pháp quang phổ UV – VIS

a Xác định saccharin [22]

 Phương pháp chung cho đồ uống không cồn

Nguyên tắc: Saccharin được trích ly từ một lượng mẫu axit hóa với diethyl ete

Các dung môi được loại bỏ và dung dịch còn lại được đồng hoá với HCl, sau đó được xử

lý bằng thuốc thử Nessler và đo độ hấp thụ quang của sản phẩm ở bước sóng 425 nm

Quy trình: Thêm 2 ml HCl vào 50g mẫu Trích ly với 50 ml diethyl ete (3 lần)

Lọc dung dịch trích ly vào bình tam giác 250 ml sạch và làm bay hơi dung môi.Thêm 6

ml HCl và 5 ml nước cất và bay hơi khoảng 1 ml trong chậu nước nóng Một lần nữa thêm 6 ml HCl và 5 ml nước và bay hơi 1 ml Pha loãng dung dịch thành 50 ml với nước cất Hút 2 ml dung dịch này vào bình định mức 25 ml, thêm 1 ml thuốc thử Nessler và dùng nước cất định mức tới vạch Tương tự hút 0,5; 1; 2; 3 và 4 ml dung dịch chuẩn (200 mg/ml) vào bình định mức 25 ml và tạo màu với thuốc thử Nessler Đo độ hấp thụ quang của mẫu tại bước sóng 425 nm.Từ đó tính hàm lượng saccharin trong mẫu từ đồ thị hiệu chuẩn

 Phương pháp đo màu Phenol-H 2 SO 4

Nguyên tắc: Saccharin được trích ly từ mẫu axit hóa với chloroform và benzene

sau đó làm bay hơi dung môi Dung dịch thu được xử lý với phenol-H2SO4 và đun nóng ở

175 oC trong 2 giờ Sau đó kiềm hoá với NaOH và đem đo độ hấp thụ tại bước sóng 558

nm

Chuẩn bị mẫu: Nước giải khát (đồ uống có ga và các đồ uống có lượng calo thấp):

Loại bỏ CO2 của nước giải khát bằng cách lắc liên tục và đổ nhanh từ cốc này sang cốc khác, lặp đi lặp lại nhiều lần Chuyển 10 ml mẫu đến bình tách lỏng125 ml có khoá Teflon Thêm 15 ml nước và 0,5 ml NaOH 1N Trích ly với 50ml hỗn hợp benzen chloroform Để cho tách lớp và loại bỏ các lớp dung môi (axit benzoic và benzoates không ảnh hưởng) Kẹo ngọt và chất lỏng cô đặc: Nghiền 10-20 viên kẹo thành bột mịn Cân chính xác 0,5 gram bột hoặc hút 10 ml mẫu chất lỏng cô đặc vào bình định mức 500

tích Nếu chất lỏng cô đặc chứa chất bảo quản parabens, thì axit hóa bằng cách thêm 5 ml HCl và trích ly với 20 ml CCl4 Loại bỏ CCl4 và tiến hành như trong phần “cách xác định” bắt đầu từ "trích ly bằng cách lắc 1 phút mỗi lần"

Cách xác định: Chuyển dich lọc của mẫu đã chuẩn bị, dung dịch chuẩn (1-3 mg

saccharin) đã làm ở trên vào bình tách lỏng Thêm 5 ml HCl và trích ly bằng cách lắc một phút Mỗi lần với 50, 30 và 20 ml hỗn hợp dung môi chloroform – benzen (95 +5) hoặc với ether: benzen (95 +5) theo quy định trong mẫu chuẩn bị Lọc dung dịch này qua phễu vào bình định mức 100 ml Pha loãng đến vạch định mức với hỗn hợp dung môi được sử dụng ở trên và lắc đều Sau đó chuyển 20 ml vào bình tam giác 50 ml Bay hơi dung môi đến khô trong chậu nước nóng và làm khô hoàn toàn trong lò 100 ºC trong 20 phút Dùng pipet hút 1 - 5 ml phenol nóng chảy vào bình tam giác và lắc cho đến khi hỗn hợp sau bay hơi hòa tan Thêm 1,2 ml H2SO4, lắc và xoay đều

Đậy chặt bình, bao bằng lá nhôm và đun trong 2 giờ ở 175 oC trong lò Để nguội

và thêm khoảng 30 ml nước nóng vào và lắc đều Thêm 10 ml dung dịch NaOH 20% và lắc đều Chuyển dung dịch đó vào bình định mức 100ml và pha loãng đến vạch Đọc độ hấp thụ của dung dịch trong máy đo quang phổ ở bước sóng 558 nm Xác định nồng độ bằng cách so sánh với đường cong hiệu chuẩn

b Xác định Aspartame [11]

Nguyên tắc: Aspartame được trích ly từ các viên kẹo bằng dung môi methanol và

độ hấp thụ của dung dịch sau khi lọc được đo ở bước sóng 258 nm

Chuẩn bị mẫu: Cân chính xác bột viên kẹo (đã được nghiền) tương đương với

trọng lượng trung bình của 4 viên, cho vào một bình định mức Thêm 50 ml hỗn hợp dung môi và lắc trong 30 phút Sau đó định mức tới vạch bằng hỗn hợp dung môi Lọc qua giấy lọc Whatman No 1, loại bỏ 20 ml dịch lọc đầu tiên và thu lấy dịch lọc trong bình định mức

Quy trình: Đo độ hấp thụ của dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu tại bước sóng

258 nm Tính toán hàm lượng aspartame của viên kẹo từ độ hấp thu của mẫu và dung dịch chuẩn

Ngoài ra người ta còn ứng dụng phương pháp quang phổ UV-VIS kết hợp với phương pháp hiệu chuẩn đa biến để xác định chất ngọt nhân tạo: Phương pháp quang phổ

UV-VIS không phải là thường được sử dụng để phân tích các chất ngọt vì phổ hấp thụ của các chất có sự chồng chéo lên nhau và ảnh hưởng của các chất cản trở là rất lớn như chất bảo quản, phẩm màu, các loại đường Tuy nhiên, kỹ thuật này, kết hợp với các phương pháp hiệu chuẩn đa biến, có thể được sử dụng để xác định chất ngọt nhân tạo Natalia E Llamas và đồng nghiệp [31], đã sử dụng phương pháp này để xác định saccharin và acesulfame-K Giới hạn phát hiện là 2-15 mg.L-1 đối với saccharin, acesulfame-K là 2-20 mg.L-1 và 2-25 mg.L-1 đối với aspartame Hiện nay aspartame thường có mặt ở trong mẫu thực phẩm Vì vậy phương pháp này đã được áp dụng thành công để xác định đồng thời saccharin và acesulfame-K trong các chất ngọt và nước trái cây mà không cần các bước loại bỏ aspartame

Một phương pháp mới để xác định hỗn hợp của hai chất làm ngọt thương mại là aspartam và acesulfame-K, phương pháp đã kết hợp các tiêu chuẩn đã được sử dụng để hiệu chỉnh trong ma trận tập trung Axit salicylic đã được sử dụng như là chuẩn nội để đánh giá việc điều chỉnh các mẫu thực sự trong mô hình PLS-2 Mô hình này thu được từ việc đo độ hấp thụ quang của chất trong vùng tử ngoại, nồng độ các chất phân tích trong các mẫu thương mại được phát hiện thông qua detecter huỳnh quang Phương pháp PLS-2

đã được đánh giá và kiểm định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng (HPLC), sai số tương đối giữa PLS-2 và các phương pháp HPLC ít hơn 10% Hiệu suất thu hồi trong các mẫu thực tế là 99,2%, độ lệch chuẩn là 3,2% Phương pháp đã được áp dụng để xác định hỗn hợp aspartam và acesulfame-K trong các chất làm ngọt nhân tạo.[12]

1.3.2.2 Các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Ở các nước có nền khoa học kỹ thuật phát triển thì việc áp dụng HPLC để định lượng các chất ngọt tổng hợp (trong đó có nhóm chất khảo sát) đã được tiến hành từ lâu

Có thể kể đến một số công trình tiêu biểu của các tác giả sau:

Xác định đồng thời 9 chất ngọt nhân tạo có nồng độ cao trong thực phẩm (acesulfame-K, alitame, aspartame, axit cyclamic, dulcin, neotame, neohesperidine dihydrochalcone, saccharin và sucralose) bằng HPLC của các tác giả Andrzej Wasik, Josephine McCourt, Manuela Buchgraber Phương pháp có độ chính xác khá tốt với hiệu suất thu hồi trong khoảng 93 ÷ 109%, LOD dưới 15μg.g−1 và giá trị LOQ dưới 30 μg.g−1,

Xác định đồng thời một số chất phụ gia (acesulfame-K, saccharin, caffeine, axit benzoic và axit sorbic) trong nước ngọt và các loại thực phẩm khác ở dạng lỏng bằng HPLC với detector FID (Flame Ionization Detector) của hai tác giả Orawan Kritsunankul, Jaroon Jakmunee[34] Phương pháp sử dụng pha động là đệm phosphate 0,025 mol L−1,

pH 3,75, thời gian phân tích các chất trong vòng 15 phút với độ chính xác cao (RSD < 5% cho tất cả các chất phân tích

Phương pháp xác định đồng thời aspartame, cyclamate, dulcin, và saccharin được Hermann cùng các cộng sự của ông phát triển [13], sử dụng phương pháp HPLC kết hợp với detector UV để phát hiện chất phân tích Hệ thống HPLC với cột (12,5 cm x 4,6 mm hoặc 10 cm x 4 mm) của Lichrosorb, pha động là tetrabutylammonium toluene-p- sulphonate (II) 5 mM - Glycine (pH 3,5) 10 mM có chứa 12% methanol, bước sóng chung

để phát hiện các chất là 267 nm Phương pháp này đã được áp dụng trong phân tích sữa chua, mứt và sô cô la với hiệu suất thu hồi trong khoảng 88 ÷ 102 %, các phép lặp cho hệ

số RSD nhỏ hơn 4,7%

Phương pháp xác định aspartame, cyclamate, acesulfame-K và natri saccharin trong thực phẩm và nước giải khát của các tác giả Yan Zhu, Yingying Guo, Mingli Ye, Frits S James [19] sử dụng phương pháp HPLC-IC Phương pháp này cho độ tuyến tính,

độ nhạy cao, và độ lặp lại khá tốt Giới hạn phát hiện của đường aspartame, natri cyclamate, acesulfame-K, natri saccharin tương ứng là 0,87; 0,032; 0,019; 0,045 mg / L Hiệu suất thu hồi trong khoảng 97,96 ÷ 105,42%

Ji C và các đồng nghiệp của ông đã dựa vào kỹ thuật sắc ký lỏng siêu hiệu suất (UPLC) để tách và xác định đồng thời bốn chất ngọt tổng hợp (natri saccharin, aspartame, acesulfame và neotame) trong một loại thuốc tiêm [24] Quá trình tách được thực hiện trên cột ACQUITY UPLC C18 (Beh) với chương trình gradient cho pha động và phát hiện ở bước sóng chung là 220 nm Hiệu suất thu hồi trung bình trong các mẫu là 80,5% - 95,2%, với độ lệch chuẩn tương đối RSD là trong khoảng 0,50% - 8,7% Phương pháp này cũng đã được áp dụng trong việc xác định các chất ngọt nhân tạo trong đồ uống và sữa bột

Xác định đồng thời chất ngọt phi dinh dưỡng trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC / ESI-MS (công trình nghiên cứu do Da-jin Yang và Bo Chen thuộc Phòng thí

nghiệm Hóa chất Sinh học và Nghiên cứu Y học cổ truyền Trung Quốc công bố năm

2008) [20] Chất ngọt phi dinh dưỡng là các chất có calo thấp, được sử dụng để thay thế

đường và những chất khác Xác định các chất ngọt trong thực phẩm là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng sản phẩm Trong nghiên cứu này, bảy loại đường nhân tạo là (aspartame, saccharin, acesulfame-K, neotame, sucralose, đường hoá học, và alitame) và một chất ngọt tự nhiên (steviosid) đã được xác định đồng thời trong các loại thực phẩm khác nhau bằng cách sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp với (ESI-MS) Các hợp chất cần xác định đã được định lượng bằng cách sử dụng một bộ phận ghi nhận phát hiện các mảnh ion hóa có chọn lọc (SIR) tại m / z = 178; 397; 377; 293; 641; 312,

162 và 182, với natri warfarin (SIR m / z = 307) được sử dụng làm chất chuẩn nội Các hệ

số tương quan của đường cong hiệu chuẩn tốt hơn so với r =0,998 (n = 6), trong khoảng 0,05-5 μg / ml cho đường hoá học, 0,3-30 μg / ml cho sucralose, 0,1-10 μg / ml cho neotame, 0,2 đến 20 μg / ml cho aspartame, 0,5-15 μg / ml cho steviosid, 0,08-8 μg / ml cho alitame, 0,1-15 μg / ml cho acesulfame-K, và 0,05-5 μg / ml cho saccharin Giới hạn phát hiện (LOD) thu được dưới 0,1 μg / ml, trong khi giới hạn định lượng (LOQ) là dưới 0,3 μg / ml

1.3.2.3 Phương pháp điện di mao quản

Tách và định lượng chất ngọt nhân tạo sử dụng điện di mao quản đã được chứng minh là phương pháp nhanh chóng và đơn giản Có thể kể đến một số công trình nghiên cứu đã được triển khai thành công trên hệ thống này trong việc xác định các chất ngọt tổng hợp như sau

Phương pháp xác định đồng thời aspartame, cyclamate, saccharin, và

acesulfame-K trong đồ uống và các chất làm ngọt bằng điện di mao quản với detector độ dẫn của các

tác giả Ana Beatriz Bergamo, José Alberto Fracassi da Silva, Dosil Pereira de Jesus [14]

Trong công trình nghiên cứu này các tác giả đã sử dụng hỗn hợp đệm tris(hydroxymethyl)aminomethane 100 mmol L−1 (TRIS) and histidine (His) 10 mmol

L−1, với thời gian phân tích các mẫu trong vòng 6 phút, và hiệu suất thu hồi các chất trong khoảng 94 ÷ 108%

Xác định đồng thời aspartame, saccharin, acesulfame-K, alitame, dulcin, axit

Boyce[ 29] Phương pháp sử dụng hệ đệm phosphate 10 mM và đệm borat 10 mM ở pH 8.6 với dung dịch deoxycholate 50 mM Phương pháp này đã được áp dụng thành công trong việc phân tích các loại nước giải khát và sữa bột Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi rất tốt 98,6 – 102%, và độ lệch chuẩn 0,2 – 0,6%

Rainer Schuster và Angelika Gratzfeld-Hüsgen sử dụng điện di mao quản vùng (CZE) để tách riêng biệt một số chất ngọt nhân tạo phổ biến: aspartame (và các sản phẩm phân hủy của nó là phenylalanine và acid aspartic), cyclamate, saccharine và acesulfame cùng với các chất bảo quản (propyl-, ethyl, và methyl), sorbic acid và acid benzoic Điều kiện điện di được thực hiện ở 25°c,bằng cách sử dụng dung dịch đệm natri tetraborat 20

mM ở pH 9,4 với thể 20 KV Độ lặp lại về nồng độ với tất cả các chất cho RSD < 0,15%

và thời gian lưu cho RSD từ 1 đến 7 % (9% đối với phenylalanine).[32]

Phương pháp xác định đồng thời các chất làm ngọt, chất bảo quản trong trái cây bằng sắc ký điện động học Micellar (MEKC) của các tác giả Lin, Yu Chou, Shin S, Sheu, Fuu Shyu, Yuan T [26] Các chất ngọt nhân tạo dulcin, aspartam, saccharin, và acesulfame-K và các chất bảo quản axit sorbic, axit benzoic, dehydroacetate natri và methyl-, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, và isobutyl-p-hydroxybenzoate trong trái cây đã được phân tách bằng phương pháp điện động học Micellar Quá trình tách được thực hiện bằng cách sử dụng cột mao quản silica 57 cm với một bộ đệm bao gồm dung dịch deoxycholate 0.05M, đệm borate, phosphate 0.02M (pH 8,6), và acetonitrile 5%, bước sóng chung để phát hiện là 214 nm Hiệu suất thu hồi trung bình cho tất cả các chất ngọt

và chất bảo quản khoảng 90% với độ lặp lại tốt, và các giới hạn phát hiện khoảng từ 10 đến 25 mg/g Năm mươi mẫu trái cây bảo quản đã được sử dụng cho mục đích phân tích Các chất ngọt nhân tạo và chất bảo quản được tìm thấy trong 28 mẫu là aspartame (0,17-11,59 g / kg) hoặc saccharin (0,09-5,64 g / kg), benzoic acid (0,02-1,72 g / kg) và axit sorbic (0,27-1,15 g / kg)

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Đối tượng, nội dung và mục tiêu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

Hiện nay nhiều nhà máy, công ty và một số cơ sở sản xuất đồ uống, nước giải khát

vì lợi nhuận cao mà không quan tâm đến sức khỏe của người tiêu dùng đã lạm dụng các các loại đường hóa học vượt quá giới hạn cho phép để tăng độ ngọt của sản phẩm Trong

đó có đường saccharin, acesulfame-K, aspartame, hàm lượng các loại đường hóa học náy trong đồ uống quá cao sẽ gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người, có thể gây ra các biến chứng về sau Do đó, mục tiêu của đề tài là nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời aspartame, saccharin, acesulfame-K trong đồ uống bằng phương pháp sắc

ký điện di mao quản

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, cần nghiên cứu một cách có hệ thống các vấn đề sau:

 Tập hợp các tài liệu phân tích định lượng đường hóa học trong nước và quốc tế

 Nghiên cứu các điều kiện để xác định đồng thời aspartame, saccharin, K:

acesulfame- Điều kiện chạy máy

- Cố định một số điều kiện như áp suất bơm mẫu, chiều dài cột, dòng điện và thời gian tiêm mẫu

- Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp

 Áp dụng phương pháp mới xây dựng để phân tích một số mẫu đồ uống, nước giải khát trên địa bàn Hà Nội

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp sử lý mẫu

Đối với mẫu phân tích trong luận văn này là các loại đồ uống ở dạng lỏng, có nền mẫu không phức tạp lắm do đó phương pháp xử lý mẫu tương đối đơn giản Các mẫu có cặn như nước cam, nước yến… đem ly tâm lọai bỏ cặn Với các mẫu có ga tiến hành loại

bỏ hết bọt khí nhiều lần sau đó tiến hành rung siêu âm khoảng 30 phút đối với các mẫu và lọc bằng màng lọc 0,2μm trước khi tiến hành chạy điện di

2.2.2 Phương pháp sắc ký điện di mao quản

2.2.2.1 Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản

Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tách các chất Dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phần tử chất tan trong mao quản (đường kính 25-100μm) trên nền của dung dịch chất điện giải có pH thích hợp, dưới tác dụng của điện trường nhất định được cung cấp bởi một nguồn thế cao một chiều (15-40 kV) đặt vào hai đầu mao quản.[7]

2.2.2.2 Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản

Sơ đồ hệ thống điện di được trình bày ở hình 2.1

Quá trình điện di được thực hiện trên mao quản silica dài 25-100cm, đường kính trong 25 – 100 µm, đường kính ngoài 300 – 400 µm Sử dụng áp suất để đưa dung dịch mẫu và dung dịch đệm lên mao quản, điện thế một chiều đặt vào hai đầu mao quản tạo ra quá trình tách: các chất phân tích được phát hiện nhờ một detector thích hợp khi di chuyển về một đầu mao quản.[6]

Detector hay dùng nhất là detector UV hay detector mảng diot DAD Vị trí phát hiện nằm ngay trên mao quản gọi là “cửa sổ”

Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo máy điện di muản

2.2.2.3 Đặc điểm của điện di mao quản

- Có hiệu lực tách các chất rất cao trong mao quản thủy tinh hoặc Teflon có đường kính trong 25 – 100 µm

- Điện thế rất cao, thường từ 10 – 30 kV ( 200 – 500 V/cm) được đặt ở 2 đầu ống mao quản

- Số đĩa lý thuyết của cột mao quản rất lớn, thường từ 105 – 106 nên có khả năng tách rất tốt các mẫu chứa hỗn hợp phức tạp

- Thể tích tiêm mẫu rất nhỏ, cỡ 5 – 50 nl nên tiết kiệm mẫu

- Có rất nhiều kiểu CE nên khả năng ứng dụng vào thực tế rất đa dạng

- Sự tách được thực hiện chủ yếu trong môi trường nước với sự có mặt của chất điện ly nền nên rất kinh tế và không độc hại

- Có khả năng tự động hóa nên dễ dàng khi phân tích số lượng mẫu lớn

2.2.2.4 Phân loại điện di mao quản

Điện di mao quản có nhiều kiểu khác nhau, nhưng tùy theo cơ chế, bản chất, và đặc điểm của sự tách (sự điện di) xảy ra trong ống mao quản mà có thể phân chia thành các loại hay các kiểu điện di với các tên gọi riêng khác nhau [7] Cụ thể như sau:

1 Điện di mao quản cổ điển (Capillary Electrophoresis: CE)

2 Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis: CZE), cơ chế tách: Linh độ khác nhau của các chất (phụ thuộc điện tích và kích cỡ ion)

3 Sắc ký điện di mao quản điện động học Mixen (Micellary Capillary Kenetic Chromatogrphy: MEKC hay MCEKC), cơ chế tách là: Tương tác phân cực/không phân cực hạt mixen trong dung dịch và linh độ của chất

Electro-4 Sắc ký điện di mao quản gel (rây phân tử), (Capillary Gel Electrophoresis Chromatography: Gel-CEC), cơ chế tách là dựa vào linh độ của chất và tương tác các loại

Trong đó điện di mao quản vùng (CZE) là kiểu điện di đơn giản nhất, được sử dụng rất rộng dãi Đây cũng là kỹ thuật được sử dụng trong nghiên cứu của luận văn này

2.2.2.5 Mao quản (cột tách) trong phương pháp điện di mao quản

Mao quản chính là cột tách, một bộ phận quan trọng trong điện di mao quản Đây

là một trong các yếu tố chính quyết định sự điện di của hỗn hợp chất mẫu Mao quản được chế tạo chủ yếu bằng silica, được gọi là mao quản silica Trong một số trường hợp người ta cũng dùng mao quản teflon, khi mao quản silica không phù hợp, ví dụ mẫu có iôn F-

và tách ở pH thấp

Hình 2.2 Mặt cắt ngang của mao quản

Mao quản trong CE thường có đường kính trong (ID) từ 25 đến 150 m và có thành dày từ 80-120 m Còn chiều dài của mao quản là tùy thuộc vào hỗn hợp chất mẫu cần tách Nhìn chung, hiện nay hay được dùng là các mao quản có tổng chiều dài (Ltot) từ

30 đến 120 cm, với chiều dài hiệu dụng (Leff) từ 20 đến 100 cm Tuy nhiên, cũng có trường hợp hai chiều dài này có giá trị bằng nhau (Ltot = Leff) như đối với đêtectơ khối phổ (MS) Mao quản được làm bằng silica, phủ bên ngoài một lớp polyme (ví dụ polyimit, PVC) có độ dày từ 200 đến 350 m, làm cho mao quản có độ dẻo, có thể uốn lại được mà không gãy (tương tự như cột mao quản trong sắc ký khí) Tuy nhiên, chính lớp polyme này lại làm cho mao quản có nhược điểm là sự truyền nhiệt từ trong mao quản ra môi trường bên ngoài kém đi, ảnh hưởng đến quá trình điện di.[6]

2.2.2.6 Dòng điện thẩm (Electroosmotic flow-EOF)

Là sự di chuyển của khối dung dịch trong mao quản dưới tác dụng của điện trường

Hình 2.3 Cấu trúc lớp điện kép trên thành mao quản

Hình 2.4 Dòng EOF và lớp điện kép trong mao quản

 Nguồn gốc

Bề mặt bên trong thành mao quản chứa nhóm silanol (Si-OH) Tùy theo pH của dung dịch đệm điện li mà bề mặt thành mao quản có thể tích điện âm hay dương Khi dung dịch đệm có pH ≥ 3 thì nhóm silanol sẽ bị ion hoá thành silanoat (SiO-) Ở phần thực nghiệm, chúng tôi đều sử dụng đệm có pH ≥ 3 vì thế dưới đây chúng tôi sẽ trình bày

sự hình thành EOF khi bề mặt mao quản tích điện âm

Khi bề mặt đã có điện tích, thì các nhóm silanoat sẽ hút các cation của dung dịch đệm và hình thành một lớp cation trên bề mặt trong thành mao quản Do mật độ các

Lớp khuếch tán

Lớp điện kép

Chiều dày lớp điện kép

Khoảng cách (nm)

Thành mao quản silica với nhóm

silanol

V zet

cation này không đủ trung hoà các nhóm silanoat nên sẽ hình thành thêm một lớp cation linh động thứ hai

[6] Khi đặt vào hai đầu mao quản một điện thế, dưới tác dụng của lực điện trường lớp cation linh động thứ hai sẽ di chuyển về phía cathod Còn các anion sẽ hướng về phía anod Vì các cation này bị solvat hoá do đó sẽ lôi kéo các chất trong dung dịch đệm di chuyển cùng và hình thành dòng EOF Nếu tốc độ của các anion nhỏ hơn tốc độ của EOF, thì nó sẽ bị dòng EOF kéo đi Khi đó cả cation và anion đều nằm trong dòng chảy khối

 Đặc điểm của dòng EOF [7]

Khác với dòng thủy động lực ở sắc ký, trong CE, dòng EOF có thiết diện gần như phẳng nên sự phân tán của vùng mẫu là nhỏ nhất và như thế chúng ta thu được pic các chất là gọn và sắc nét (hình 2.5)

Đưa tất cả các phần tử chất tan trong dung dịch di chuyển theo cùng một hướng khi dòng EOF đủ lớn

Hình 2.5 Các kiểu dòng chảy và pic sắc ký trong CE

A- Kiểu dòng chảy không có áp suất (dòng EOF); B- Kiểu dòng chảy có áp suất

(dòng Laminar)

 Kiểm soát EOF (duy trì, thay đổi độ lớn, đổi chiều):

Thường thông qua xem xét và thay đổi các yếu tố liên quan sau:

- Các chất đệm, chất điện giải, thành phần pha động điện di và pH của nó

- Điện thế đặt vào hai đầu mao quản

- Nhiệt độ mao quản trong quá trình điện di

- Mao quản, các đặc trưng và tính chất bề mặt của nó

- Chất phụ gia

2.2.2.7 Các thông số phân tích của CE

L: Chiều dài tổng cộng của mao quản (cm)

μi: linh độ điện di toàn phần của ion (cm2/V.s)

E: điện trường trong mao quản do thế V sinh ra

 Thời gian dịch chuyển (Migration time, tm):

Thời gian dịch chuyển là thời gian một chất bắt đầu đi vào mao quản cho đến khi chất đó đi qua detector (xuất hiện pic trên điện di đồ)

i

l t v



l: chiều dài hiệu dụng của mao quản (cm)

Thời gian dịch chuyển là thông số có thể dùng để định tính trong CE

w

)2N: số đĩa lý thuyết

W: chiều rộng đáy pic

W1/2: chiều rộng của pic đo ở ½ chiều cao

t1: thời gian dịch chuyển của chất thứ nhất (phút)

t2: thời gian dịch chuyển của chất thứ hai (phút) (t2 > t1)

w1: độ rộng đáy pic thứ nhất

w2: độ rộng đáy pic thứ hai

2.2.2.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điện di

- Kích thước (chiều dài, đường kính, độ dày thành) của ống mao quản

- Loại mao quản và bề mặt mao quản

- Nếu mao quản có nhồi pha tĩnh xốp thì loại pha tĩnh, kích thước, cỡ hạt và độ xốp của nó cũng góp phần ảnh hưởng đến sự tách của các chất phân tích

 Lượng mẫu, kỹ thuật và điều kiện nạp mẫu vào mao quản

 Các chất phụ gia thêm vào pha động điện di hoặc vào mẫu phân tích

Trên đây là các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình tách các chất trong mao quản Ngoài ra còn có các yếu tố về trang thiết bị phát hiện chất phân tích

2.2.2.9 Các loại detector thông dụng trong phương pháp điện di mao quản

Detector là bộ phận quan trọng quyết định đến độ nhạy của phương pháp phân tích; tuỳ thuộc bản chất lý hoá của chất phân tích mà chúng ta đưa ra lựa chọn detector phù hợp [7]:

triển, người phân tích có thể thực hiện phép tách theo chương trình định sẵn, có thể thực hiện các phép tách tự động nhiều mẫu phân tích

2.2.2.10 Điện di mao quản vùng (CZE)

Điện di mao quản vùng là một kiểu được ứng dụng đầu tiên và phổ biến của kỹ thuật CE do tính đơn giản của các hoạt động tách và tính linh hoạt của nó

Cơ sở tách: Dựa trên sự khác nhau về linh độ điện di của phần tử các chất trong

dung dịch Khi đặt vào hai đầu mao quản một điện thế và dòng EOF đủ lớn thì thứ tự rửa giải: cation, chất trung hòa và sau cùng là anion.[7]

Ứng dụng của CZE: CZE được ứng dụng chủ yếu để tách các chất có cấu tạo

ionic (hợp chất có liên kết ion, hợp chất mà khi tan trong pha động điện di chúng có thể phân ly thành các ion âm và dương) trong nhiều lĩnh vực như: sinh hóa, dược phẩm, thực phẩm, môi trường

Có thể thay đổi các điều kiện của CZE để mở rộng phạm vi phân tích:

- Tách các chất đồng phân đối quang bằng cách cho thêm các chất chọn lọc đối quang như cyclodextrin

- Thực hiện đảo thế để tách các anion nhanh hơn nếu mẫu chỉ yêu cầu phân tích anion

2.3 Phương tiện nghiên cứu

2.3.1 Nguyên vật liệu

2.3.1.1 Chất chuẩn đối chiếu

- Aspartam (Sigma, hàm lượng 98,54 %)

- Axit Sorbic (Merck, hàm lượng 99,34%)

- Benzoic (Merck, hàm lượng 99,62%)

- Saccharin (Sigma, hàm lượng 99,50 %)

- Acesulfam - K (Sigma, hàm lượng 99,67%)

- Cyclamate (Sigma, hàm lượng 99,5%)

- Fructose (Merck, hàm lượng 99,72%)

- Glucose (Merck, hàm lượng 99,8%)

- Cyclamate (Merck, hàm lượng 99,8%)

- Brilliant Blue (Sigma, hàm lượng 99,5%)

- Tartarin (Sigma, hàm lượng 99,5%)

- Quinolin (Merck, hàm lượng 99,78%)

- Sunset Yellow (Merck, hàm lượng 99,8%)

2.3.1.2 Hóa chất dung môi

- Natri tetraborat (Na2B4O7.10H2O) (PA, Merck, Đức)

- Kali dihydrophosphat (KH2PO4.H2O) (PA, Merck, Đức)

- Dikali hydrophosphat (K2HPO4.H2O) (PA, Merck, Đức)

- Natri hydroxyd (NaOH) (PA, Merck, Đức)

- Ethanol (C2H5OH) (PA, Merck, Đức)

- Axit clohydric (HCl), (PA, Merck, Đức)

- Axit Phophoric (H3PO4), (PA, Merck, Đức)

- Methanol (Merck, hàm lượng 99,8%)

- Nước siêu tinh khiết: là nước cất 2 lần được lọc qua bộ lọc siêu tinh khiết có cột trao đổi cation, anion và màng lọc 0,2 μm

2.3.1.3 Thiết bị dụng cụ

- Máy điện di mao quản Agilent (Mỹ) có trang bị detector UV-VIS kết nối với máy tính và máy in

Hình 2.6 Hệ thống phân tích CE: Máy điện di Agilent, máy tính, máy in

- Mao quản silica nung chảy: đường kính trong i.d = 50 μm, chiều dài tổng cộng

L = 64 cm (Agilent, Mỹ) và L = 52 cm

- Bộ lọc nước siêu tinh khiết Elga : Model ELGASTAT MAXIMA SC áp suất tối

đa 1,4 bar/20psi(bơm vào), 4,1 bar/60 psi (hoạt động), (Elga Ltd, Anh)

- Máy rung siêu âm ULTRASONIC LC30 (Elma - Đức)

- Máy đo pH Metrohm (Thuỵ Sĩ) cho kết quả đến ± 0,01 đơn vị pH

- Đầu lọc có đường kính lỗ lọc d = 0,2 μm

- Cân phân tích 4 số OHAUS (Mỹ)

- Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống nghiệm, pipet chính xác…

- Micropipet 100 ; 200 ; 1000 ; 5000 μL

-Tủ lạnh Sanyo MDF-236 (bảo quản mẫu)

2.4 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất

2.4.1 Pha dung dịch chuẩn gốc

Aspartam, Saccharin, Acesulfam-K, Cyclamate, Saccharose, Glucose, Fructose, Brilliant Blue, Tartarin, Quinolin, Sunset Yellow được pha trong dung môi là nước Axit Sorbic, Axit Benzoic hòa tan trong Methanol Cụ thể:

-Lần1: Cân chính xác 0,0500g (Aspartam, Saccharin, Acesulfam-K, Cyclamate ) mỗi loại đem hòa tan bằng nước cất siêu tinh khiết chuyển vào bình định mức 50ml, định mức bằng nước cất tới vạch, sau đó đem rung siêu âm 30 phút thu được các dung dịch gốc

có nồng độ là 1000ppm Dung dịch chuẩn được bảo quản trong tủ lanh dưới 100C, có thể dùng được trong 3 tháng

-Lần 2: Cân chính xác 0,0378g Acesulfame-K, 0,0257g Saccharin, 0,0267g Aspartame, hòa tan định mức 50 ml bằng nước cất siêu tinh khiết và đem rung siêu âm thu được dung dịch gốc có nồng độ lần lượt là Ace 756 ppm, Sac 514 ppm, Asp 534 ppm

-Lần 3: Cân chính xác 0,0269g Saccharin, 0,0303g Acesulfame-K, 0,0270g Aspartame hòa tan định mức 25 ml bằng nước cất siêu tinh khiết và đem rung siêu âm thu được dung dịch gốc có nồng độ lần lượt là Ace 1212 ppm, Sac 1076 ppm, Asp 1080 ppm

- Chất bảo quản: Cân chính xác 0,0288g Axit Sorbic, 0,0269g Axit Benzoic hòa tan bằng dung dịch Methanol theo tỷ lệ 40 mg/1 ml Methanol rồi sau đó mới thêm nước cất siêu tinh khiết đem rung siêu âm 30 phút và định mức 25 ml bằng nước cất siêu tinh khiết được dung dịch có nồng độ Axit Sorbic 1152 ppm, Axit Benzoic 1076 ppm

- Các loại đường cân chính xác 0,0261g Saccharose, 0,0269g Fructose, 0,0289 Glucose, hòa tan bằng nước cất siêt tinh khiết, định mức 25ml, đem rung siêu âm thu được các dung dịch có nồng độ Saccharose 1044 ppm, Fructose 1076 ppm, Glucose 1156 ppm

- Phẩm màu: Cân chính xác 0,0232g Brilliant Blue, 0,0304g Tartarin, 0,0357g Quinolin, 0.0211g Sunset Yellow hòa tan bằng nước cất siêt tinh khiết, định mức 25ml, đem rung siêu âm thu được các dung dịch có nồng độ Brilliant Blue 928 ppm, Tartarin

1216 ppm, Quinolin 1428 ppm, Sunset Yellow 844 ppm

- Từ các dung dịch chuẩn trên ta có thể các dung dịch chuẩn làm việc có các nồng

độ khác nhau như dung dịch chuẩn:200; 150; 100; 80; 60; 50; 45; 35; 25; 20; 10; 5 ppm…Các dung dịch làm việc được pha hàng ngày

2.4.2 Pha dung dịch đệm

 Dung dịch đệm borat 20 mM pH 6,.00; pH 7,50; pH ,50; pH 9,00; pH 9,50; pH 10,00

+ Natri borat được sấy ở 105o

C/2h + Cân 1 lượng tùy theo thể tích cần pha

+ Pha trong khoảng 80% thể tích nước: điều chỉnh về pH 8,50; pH 9,00 bằng acid HCl 1M, điều chỉnh về pH 9,50; pH 10,00 bằng NaOH 1M trên máy đo pH rồi thêm nước

đủ đến vạch

Dung dịch đệm borat 15 mM 25 mM và 30 mM cũng được pha tương tự

 Dung dịch đệm Kali phosphat 20 mM pH 7.5

+ Pha dung dịch K2HPO4 nồng độ 20 mM

+ Pha dung dịch KH2PO4 nồng độ 20 mM

Đo pH của dung dịch K2HPO4, thêm từ từ dung dịch KH2PO4 vào dung dịch

K2HPO4 cho đến khi pH về 7.5 thì dừng lại

 Dung dịch đệm Kali phosphat 20 mM, pH 3,00

+ Pha dung dịch KH2PO4 20 mM bằng 80% thể tích nước, sau đó điều chỉnh về pH 3,00 bằng acid H3PO4 1M và thêm nước vừa đủ

+ Dung dịch đệm có thể được sử dụng nhiều ngày (cụ thể: pH 3,00 dùng được trong một tháng, pH ≥ 7 dùng được trong 1 tuần), nhưng phải kiểm tra pH hàng ngày trước khi sử dụng

 Dung dịch đệm Acetat 20 mM pH 6,0

+ Pha dung dịch CH3COONa 20 mM bằng 80 % thể tích nước, sau đó điều chỉnh

về pH =6,00 bằng Axit Acetic 1M và thêm nước vừa đủ

Tất cả các dung dịch đều được pha bằng nước siêu tinh khiết, lọc qua màng lọc 0,2

μm và rung siêu âm loại khí trước khi sử dụng và đều phải được kiểm tra độ pH trước khi

sử dụng

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tối ưu hóa các điều kiện xác định Ace-K, Sac, Asp bằng kỹ thuật sắc ký điện di mao quản

3.1.1 Một số điều kiện cố định

- Cột mao quản: chiều dài L= 65cm, đều có đường kính trong i.d = 50 μm

- Tiêm mẫu: áp suất 50 mbar trong thời gian 5 s với cường độ dòng điện là 50 mA

- Bước sóng phát hiện được lựa chọn dựa vào độ hấp phụ của từng chất:

+ Aspartam: 191nm

+ Saccharin: 202 nm + Acesulfam - K: 226 nm

(a) (b)

(c)

Hình 3.1: Phổ hấp thụ UV – VIS của asp (a), sac (b), ace- k (c) trong môi

trường nước ( L= 65cm, i.d=50 μm, áp suất 50 mbar, I = 50 mA, E = 25 kV)

3.1.2 Khảo sát các điều kiện

3.1.2.1 Hệ đệm

 Khảo sát loại đệm và pH của đệm

Đầu tiên chúng tôi tiến hành khảo sát 3 loại đệm ở 3 vùng pH: Đệm photphat 20

mM (pH 3,00), đệm Acetat 20mM (pH 6,0), và đệm borat 20 mM (pH 9,00)

Quá trình điện di thu được kết quả ở bảng 3.1, và hình 3.3 và phụ lục 1

Bảng 3.1 Kết quả sự phụ thuộc giữa diện tích píc của các chất vào các loại đệm

Chất chuẩn

Nồng độ (ppm)

Diện tich (mau.s) Đệm phosphat Đệm acetat Đệm borat

Đệm phosphat pH=3

Đệm acetat pH=6

Đệm borat pH=9

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc của các chất

vào các loại đệm

Hình 3.3 Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất chuẩn asp, sac, ace-k trong điều kiện Đệm borat 20 mM pH 9,00 ( L=65 cm, I=50 mA, V=25kV, t =25 o C, áp suất 50 mbar) Nhận xét: Từ kết quả thu được ở bảng 3.1, phụ lục 1 và hình 3.2, hình 3.3 chúng

tôi nhận thấy khả năng tách của các chất phân tích ở đệm borat pH 9,00 là tốt nhất, qua sắc đồ hình 3.3 ta thấy các píc rõ ràng, cân đối và diện tích píc của các chất là lớn nhất, còn ở pH 3,00 thời gian lưu của các chất tách ra khỏi nhau là rất dài, đường nền nhiễu và dòng không ổn định, tín hiệu phát hiện các chất kém Ở pH = 6 với đệm acetat cho tín hiệu các píc rõ dàng hơn nhưng không cân đối Vì thế đệm borat được lựa chọn là loại

0 50 100 150 200 250 300

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc của asp, sac, ace-k vào giá trị pH của đệm borat 20 mM

min

Norm.

0 20 40 60 80 100 DAD1 E, Sig=215,5 Ref=off (MIXDUONG HH\STD000082.D)

pH=9.5

Hình 3.5 Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất chuẩn asp, sac, ace-k trong điều kiện (Đệm

borat pH 9,5, L=65 cm, I= 50mA, V= 25kV, t=25 o C áp suất 50 mbar)

Nhận xét: Qua các điện di đồ ở phụ lục 2, hình 3.4, hình 3.5 và bảng 3.2 thể hiện ở

trên có thể thấy khi pH hệ đệm tăng thì diện tích píc các chất đều tăng Tại pH 10,0 diện tích píc của acesulfame-k giảm, còn saccharin diện tích píc tăng mạnh Ở pH 9,5 các chất được tách tốt nhất, hình dáng pic cân đối, gọn nhất, đồng thời tín hiệu đường nền ổn định

và diện tích píc của các chất tăng đều Do vậy đệm borat, pH 9,5 được lựa chọn cho các bước khảo sát tiếp theo

 Khảo sát nồng độ đệm:

Sau khi lựa chọn được hệ đệm và pH của đệm chúng tôi tiếp tục khảo sát nồng độ của hệ đệm Đối với kỹ thuật CZE thì nồng độ đệm sử dụng phải đủ lớn nếu không sẽ tạo

ra các vùng dẫn điện khác nhau trong mao quản Nhưng nồng độ đệm lại tỷ lệ thuận với thời gian dịch chuyển và độ lớn của dòng điện trong mao quản Nên cần lựa chọn hệ đệm

có nồng độ thích hợp Cụ thể nồng độ đệm borat pH 9.5 như sau: 15 mM, 20 mM, 25mM, 30mM

Bảng 3.3 Kết quả sự phụ thuộc của thời gian lưu của các chất chuẩn

vào nồng độ đệm borat

Chất chuẩn

Nồng độ (ppm)

Thời gian lưu ( phút)

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa thời gian lưu của asp, sac, ace-k

vào nồng dộ đệm borat pH 9,5

Hình 3.7 Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất trong điều kiện đệm borat 20 mM

o C, áp suất 50 mbar)