nghiên cứu chuyển cấu trúc rnai chứa đoạn gen cpi của smw vào giống thuốc lá c9-1 phục vụ tạo cây chuyển gen kháng virus

Phương pháp chuyển gen để tạo ra cây trồng kháng virus được xem là biện pháp có hiệu quả trong ngành chọn giống cây trồng nói chung và chọn giống đậu tương nói riêng.. Nhiều giống cây tr

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

- 2014

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

i

LỜI CAM ĐOAN

Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng ai công bố trong một công trình nào khác

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 8 năm 2014

Tác giả luận văn

Nguy

ii

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi đ

- KTNN đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tậ

iii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thành phần các loại môi trường tái sinh in vitro……… 22

Bảng 2.2 Thành phần đệm tách DNA tổng số……… 25

26

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen CPi 26

Bảng 2.5 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen CPi 27

Bảng 3.1 Kết quả cảm ứng chồi từ mảnh lá……… 31

9-1……… 33

3.2 Các mảnh lá được ngâm trong dung dịch huyền phù vi

khuẩn A.tumefaciens , mảnh lá sau khi rửa khuẩn được cấy

trên môi trường chọn lọc và các cụm chồi được tạo thành sau hai tuần

nuôi cấy trên môi trường chọn lọc……… 31

, chồi màu xanh được tách ra trên môi trường chọn lọc và chồi cây chuyển gen sau 3

tuần trên môi trường tạo rễ………… ……… 33

0

Hình 3.5 Hình ảnh điện di DNA tổng số tách từ các dòng thuốc lá

Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của cấu

trúc pK7GW-SMV-CPi trong các cây thuốc lá chuyển

gen 36

v

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

BAP 6-Benzyl Amino Purine

BGMV Bean Golden Mosaic Virus

bp Base pair (cặp base)

CP Coat protein (protein vỏ)

EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

GA3 Gibberellic acid

GM Môi trường tạo chồi

hpRNA Hairpin RNA (cấu trúc RNA kẹp tóc)

IhpRNA Intron hairpin RNA (Cấu trúc kẹp tóc mang intron) IBA Indole-3butyric acid

LB Luria and Bertani

MS Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) PCR Polymerase chain reaction

vi RISC RNA-inducing silencing complex

RM Môi trường ra rễ

RNA Ribonucleic acid

RNAi RNA interference

dsRNA Double Stranded ribinucleic acid

siRNA Short interfering RNA

SMV Soybean mosaic virus

TAE Tris Acetate EDTA

TMV Tobacco Mosaic Virus

Ti- plasmid Plasmid tạo khối u

Vir Virulence Region

YEP Yeast extract peptone

vii

Trang

LỜI CAM ĐOAN……… i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC BẢNG iii

DANH MỤC CÁC HÌNH iv

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT v

MỤC LỤC vii

MỞ ĐẦU……… 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 3

1.1 BỆNH KHẢM DO SMV TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG…… 3

…… 3

1.1.2 Bệnh khảm do virus trên cây đậu tương 7

……… 8

1.2 KỸ THUẬT RNAi 10

1.2.1 Cơ chế ức chế gen của RNAi 10

1.2.2 Ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo cây trồng chuyển gen kháng virus 12

1.3 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở CÂY THUỐC LÁ 13

1.3.1 Phương pháp chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens……… 13

16

18

viii

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

20

2.1.1 Vật liệu 20

2.1.2 Hóa chất 20

2.1.3 Thiết bị 20

21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua Agrobacterium tumefaciens 21

2.2.2 Phương pháp lây nhiễm và tạo cây thuôc lá chuyển gen 21

2.2.3 Phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen pK7GW-SMV-CPi bằng phương pháp PCR……… 24

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28

in vitro ……… 28

3.2 Kết quả chuyển cấu trúc pK7GW-SMV-CPi vào thuốc lá 29

3.3 Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong các dòng thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR 35

……… 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 40

1

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill] thuộc cây họ đậu (Fabaceae),

đây là cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao Ở Việt Nam, theo số liệu thống kê chính thức của Chính phủ, đậu tương được trồng ở

28 tỉnh trên khắp cả nước, trong đó 70% ở miền Bắc và 30% ở miền Nam Gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát hiện đậu tương có vai trò chữa và điều trị một số bệnh nan y như ung thư, đái tháo đường, béo phì, huyết áp cao, chảy máu não và tim mạch [4] Tuy nhiên, hiện nay diện tích trồng cây đậu tương còn khá phân tán, năng suất đậu tương giảm và chất lượng chưa ổn định bởi nhiều nguyên nhân đó là sâu bệnh , môi trường, chất lượng hạt giống, kĩ thuật canh tác Đậu tương là loại cây trồng dễ mẫn cảm với nhiều tác nhân gây bệnh, trong đó có những bệnh do tác nhân là virus gây ra Bệnh khảm ở cây đậu tương do Soybean mosaic virus (SMV) gây ra, lần đầu tiên được ghi nhận tại Hoa Kỳ vào năm 1915 bởi Clinton (1916) và được Gardner và Kendrick đặt tên năm 1921 Sau đó được tìm thấy ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Canada, Brazil, Úc và nhiều quốc gia khác

SMV thuộc chi Potyvirus và có vật liệu di truyền là sợi RNA đơn dương [42] SMV lây truyền do rệp, bọ trĩ làm môi giới Sự lan truyền từ cây bệnh sang cây khỏe do rệp ở ngoài đồng là chủ yếu, bệnh còn truyền qua hạt

Bọ trĩ, rệp càng nhiều tỉ lệ nhiễm bệnh càng lớn Hiện nay mới dừng lại ở biện pháp phòng mà chưa có thuốc trị Phương pháp chuyển gen để tạo ra cây trồng kháng virus được xem là biện pháp có hiệu quả trong ngành chọn giống cây trồng nói chung và chọn giống đậu tương nói riêng

Gần đây, RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật bởi nó là một quá trình sinh lý tự nhiên

2

tế bào Cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen lặp lại đảo chiều của virus mục tiêu đƣợc sử dụng để chuyển vào cây, nó sẽ đƣợc biểu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hpRNA) trong cây chuyển gen và kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây Nhiều giống cây trồng kháng đƣợc các loại bệnh virus khác nhau đã đƣợc tạo ra bằng kỹ thuật chuyển gen

Xuất phát từ những lí do trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên

cứu chuyển cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV vào giống thuốc lá C9-1 phục vụ tạo cây chuyển gen kháng virus”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Chuyển đƣợc cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV vào giống thuốc lá C9-1 và tạo đƣợc cây chuyển gen

3 Nội dung nghiên cứu

(1) Lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium tái tổ hợp vào mảnh lá của

giống thuốc lá C9-1;

(2) Tái sinh và tạo cây thuốc lá ;

(3) Phân tích sự có mặt của đoạn gen chuyển trong cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR

3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 BỆNH KHẢM DO SMV TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.1.1 Nguồn gốc

Đậu tương có tên khoa học Glycine max (L) Merrill là một trong những

loài cây trồng được biết đến từ rất sớm Các bằng chứng về lịch sử, địa lí và khảo cổ học đều chỉ ra rằng đậu tương có nguồn gốc từ Trung Quốc Đậu tương được thuần hóa và trồng làm cây thực phẩm ở Trung quốc vào khoảng thế kỉ 17 trước công nguyên Sau đó, nó được truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng thế kỉ thứ 8, du nhập vào nhiều nước châu Á khác như Indonesia, Thái Lan, Ấn Độ, Việt Nam…vài thế kỉ sau đó Ngày nay, Hoa Kì là quốc gia sản xuất đậu tương hàng đầu thế giới, chiếm 50% sản lượng trên toàn thế giới, tiếp theo các nước Trung Quốc, Ấn Độ…[43]

Đậu tương là cây trồng thuộc bộ Đậu Fabales, họ đậu Fabaceae, họ

phụ cánh bướm Papilionoideae, chi Glycine Có nhiều hệ thống phân loại khác nhau, trong đó hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể do Hymowit và Newell (1984) xây

dựng được xây dựng rộng rãi Theo cách phân loại này thì ngoài chi glycine còn có chi phụ Soja Chi glycine được chia thành 7 loài hoang dại lâu năm, chi Soja gồm 2 loài trong đó có loài đậu trồng Glycine max (L) Merrill [6]

Ở Việt Nam, đậu tương được trồng đã lâu đời, từ thế kỷ 13 Lê Quý Đôn đã ghi trong “Vân đài loại ngữ” là cây đậu tương được trồng ở một số tỉnh vùng Đông Bắc, miền Bắc nước ta [4], [6] Mặc dù, được trồng từ rất sớm nhưng chỉ trong vài chục năm gần đây đậu tương mới được quan tâm, phát triển và ngày nay nó được xem là một giống cây trồng có giá trị dinh

4 dưỡng cao, chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế Nhưng diện tích trồng và sản lượng chưa cao so với các nước trên thế giới

Đậu tương (Glycine max (L.) Merril) là cây hai lá mầm, thân thảo

Thân cây có nhiều lông nhỏ, khi còn non thân có màu xanh hoặc màu tím, khi

về già chuyển màu nâu nhạt Màu sắc của thân cây cho ta biết màu của hoa sau này Nếu thân có màu xanh, hoa sẽ có màu trắng, nếu thân có màu tím thì sau hoa sẽ có màu tím đỏ Chiều cao của thân từ 0,3 - 1m Khác với những cây trồng khác thân cây đậu tương phát triển mạnh nhất lại chính vào lúc cây

ra hoa rộ nhất Đây là lúc mà giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng và sinh trưởng sinh thực cạnh tranh nhau dẫn đến khủng hoảng dinh dưỡng Vì vậy, trồng trọt cần chú ý cung cấp đầy đủ dinh dưỡng cho cây trước khi chúng bước vào giai đoạn này [6]

Cây đậu tương có 3 loại lá là lá mầm, lá nguyên và lá kép Lá mầm (lá

tử diệp) khi mới mọc có màu vàng hay xanh lục, khi tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh Hạt giống to thì lá mầm chứa nhiều dinh dưỡng nuôi cây mầm, cho nên khi trồng đậu tương nên làm đất tơi nhỏ và chọn hạt to cây

sẽ mọc khoẻ, sinh trưởng tốt Lá nguyên (lá đơn) xuất hiện sau khi cây mọc từ 2-3 ngày và mọc phía trên lá mầm Lá đơn mọc đối xứng nhau Lá đơn to màu xanh bóng là biểu hiện cây sinh trưởng tốt Lá đơn to xanh đậm biểu hiện của một giống có khả năng chịu rét Lá đơn nhọn gợn sóng là biểu hiện cây sinh trưởng không bình thường Mỗi lá kép có 3 lá chét, có khi 4-5 lá chét Lá kép mọc so le thường có màu xanh tươi khi già biến thành màu vàng nâu Lá có nhiều hình dạng khác nhau tuỳ theo giống, những giống lá nhỏ và dài chịu hạn khoẻ nhưng thường cho năng suất thấp Những giống lá to chống chịu hạn kém nhưng thường cho năng suất cao hơn Nếu 2 lá kép đầu to và dày thường biểu hiện giống có khả năng chống chịu rét [6]

5

Hoa của đậu tương được phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân Hoa đậu tương mọc thành từng chùm, mỗi chùm thường có 3-5 hoa Hoa lưỡng tính nên đậu tương là cây tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn là rất thấp chỉ chiếm 0,5 – 1% Thời gian bắt đầu ra hoa s m hay muộn, dài hay ngắn phụ thuộc vào từng giống đậu tương Căn cứ vào phương thức ra hoa người ta chia đậu tương ra làm 2 nhóm: nhóm ra hoa hữu hạn, hướng ra hoa từ trên xuống dưới và từ ngoài vào trong và nhóm ra hoa vô hạn, hướng ra hoa từ dưới lên trên và từ trong ra ngoài [6]

Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, dài từ 2-7cm Mỗi quả thường có 2-3 hạt Hạt đậu tương có hình tròn hoặc bầu dục, giồng có hạt vàng có giá trị thương phẩm cao Khối lượng 1000 hạt dao động trung bình từ 100 – 200g Hình dạng và màu sắc của rốn hạt đặc trưng cho mỗi giống [6]

Bộ rễ đậu tương gồm rễ chính và rễ phụ Trên rễ có rất nhiều nốt sần,

đó là kết quả của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ Nốt

sần có thể dài 1cm, đường kính 5 – 6mm, khi mới hình thành nó có màu trắng sữa, khi phát triển tốt nhất nốt sần có màu hồng Nốt sần tập trung nhiều ở tầng đất có độ sâu từ 0 – 20cm, có vai trò quan trọng trong việc cố định đạm

từ nito không khí, với lượng đạm cung cấp cho cây khoảng 30 – 60kg/ha [6]

Chu kì sống của cây đậu tương được chia ra 5 giai đ phát triển là giai đoạn nảy mầm – cây con; giai đoạn sinh trưởng thân, lá; giai đoạn ra hoa; giai đoạn hình thành quả, hạt và giai đoạn chín [6]

Giai đoạn nảy mầm – cây con được tính từ khi gieo hạt giống xuống đất, hạt hút ẩm trương lên, rễ mọc ra, thân vươn lên đội hai lá mầm lên khỏi mặt đất, lá mầm xòe ra, thân mầm tiếp tục phát triển thành thân chính Trong giai đoạn này cây con chủ yếu sống dựa vào nguồn chất dinh dưỡng dự trữ ở hai lá mầm, đến khi hết chất dinh dưỡng các lá mầm này chuyển dần sang

6 màu vàng rồi rụng và đồng thời cùng lúc đó mà bộ rễ phát triển đủ khả năng hút nước và chất dinh dưỡng để nuôi cây Giai đoạn này dài hay ngắn tùy thuộc ở điều kiện ngoại cảnh Nếu gieo vào vụ hè thì giai đoạn này ngắn hơn giai đoạn ở vụ đông Thông thường thời gian này khoảng 15 – 20 ngày sau khi gieo Thời kì này chính là thời kì quyết định mật độ của cây con cũng như sức sinh trưởng của cây đậu tương sau này

Kể từ khi cây con ra được 1 – 2 lá kép thì bắt đầu giai đoạn sinh trưởng của thân và lá kéo dài tới khi cây bắt đầu ra hoa Thời kỳ đầu của giai đoạn này cây con sinh trưởng rất chậm, trong khi đó rễ của nó lại phát triển nhanh

cả về chiều sâu lẫn chiều ngang, các nốt sần được hình thành và phát triển,

mở đầu cho hoạt động cố định đạm khí trời để cung cấp cho cây Đến thời kì cây chuẩn bị ra nụ, ra hoa thì tốc độ sinh trưởng của cây tăng lên nhanh Chính lúc này là mấu chốt để tạo ra thân cây to, mập, các đốt ngắn Giai đoạn này dài hay ngắn cũng tùy thuộc vào giống, thời vụ, điều kiện ngoại cảnh, nhưng nói chung vào khoảng 20 – 40 ngày

Khác với một số cây khác là cây đậu tương khi đã ra hoa thì các bộ phận khác như rễ, thân, lá vẫn tiếp tục sinh trưởng và phát triển Giai đoạn này sinh trưởng dài hay ngắn tùy thuộc vào đặc tính của giống là chín sớm hay muộn Thời kì này cây đậu tương rất mẫn cảm với điều kiện khí hậu thời tiết bất thuận như mưa to, gió lớn, khô, nóng, lúc đó mặc dù số hoa của mỗi cây có rất nhiều nhưng kết quả cuối cùng là số hoa được thụ phấn và kết quả

sẽ rất ít, vì thông thường 75% số hoa thường bị rụng

Quả đậu tương đầu tiên được hình thành trong vòng 7–8 ngày kể từ lúc hoa nở Trong điều kiện bình thường sau khoảng 3 tuần lễ là quả phát triển đầy đủ Lúc các chùm quả non đã xuất hiện thì các chất dinh dưỡng trong lá được vận chuyển về nuôi hạt làm cho hạt nảy mầm Vào thời kì này sự sinh

7 trưởng của cây chậm lại dần Các yếu tố nhiệt độ, độ ẩm trong giai đoạn này

sẽ có tác động rất lớn đến tốc độ phát triển của quả và hạt

Khi hạt đã phát triển đạt đến kích thước tối đa, các khoang hạt đã kín, quả đã đủ mẩy thì cây ngừng sinh trưởng Khi các hạt đã rắn dần và đạt đến

độ chín sinh lý vỏ hạt có màu sắc đặc trưng của giống, còn vỏ quả thì chuyển dần sang màu vàng, vàng tro, xám, lá của cây cũng chuyển dần sang úa vàng

và rụng dần Hàm lượng dầu trong hạt được ổn định sớm vào thời kì hạt đang phát triển nhưng hàm lượng protein thì vẫn còn chịu ảnh hưởng của điều kiện dinh dưỡng của cây cho đến cuối thời kì của quá trình chín

Dựa vào thời gian sinh trưởng, đậu tương được chia làm các loại: chín rất sớm: thu hoạch sau 80 – 90 ngày, chín sớm thu hoạch sau 90 – 100 ngày, chín trung bình thu hoạch sau 100 – 110 ngày, chín muộn trung bình cho thu hoạch sau 110 – 120 ngày, chín muộn cho thu hoạch sau 130 – 140 ngày, chín rất muộn cho thu hoạch sau 140 – 150 ngày Thời gian sinh trưởng của mỗi giống được đánh giá theo từng vùng và vụ trồng nhất định do thời gian sinh trưởng của nó chịu ảnh hưởng nhiều bởi thời gian chiếu sáng và nhiệt độ [6]

1.1.2 Bệnh khảm do virus trên cây đậu tương

Bệnh khảm là một trong những bệnh xuất hiện và gây thiệt hại ở nhiều nơi trồng đậu tương trên thế giới và được ghi nhận đầu tiên ở Mỹ vào những năm đầu của thập niên 1900 Triệu chứng bệnh: khi bị bệnh lá bị mất màu, loang lổ giống như tấm khảm, lá nhỏ lại, phát triển không đều, bìa lá cong xuống làm lá biến dạng Phiến lá bị xếp nếp nhăn nhúm, có màu loang lỗ xanh nhạt và xanh đậm, thường dày hơn lá bình thường Các triệu chứng ở trên lá này gần giống với triệu chứng khi đậu tương bị ngộ độc thuốc diệt cỏ 2,4 D Cây lùn do các lóng thân phát triển kém Do đó, quả và hạt phát triển chậm lại, nhất là các quả ở phần trên của cây Hạt nhỏ và vỏ hạt bị biến đổi thành

8 màu nâu nhạt và đậm không đều, từ tễ hạt lan ra, có vị đắng Từ đó làm giảm năng suất và sản lượng đậu tương Triệu chứng bệnh biểu hiện rõ ở 18,5oC Ở nhiệt độ cao trên 30oC bệnh không biểu hiện triệu chứng ra ngoài [23]

SMV lan truyền qua rệp vừng, bọ trĩ và hạt giống bị nhiễm bệnh Rệp

có thể lây lan từ cây này sang cây khác là do chúng ăn Trên 30 loài rệp truyền virus SMV trên toàn thế giới Nghiên cứu gần đây đã khẳng định rệp

vừng ở đậu tương (Aphis Glycine) là vector của virus khảm đậu tương Rệp càng nhiều thì tỉ lệ nhiễm bệnh càng cao Vậy cách hiệu quả nhất kiểm soát bệnh là tạo ra giống đậu tương kháng virus SMV nhằm nâng cao năng suất và chất lượng đậu tương

1.1.3 Virus gây bệnh khảm đậu tương

1.1.3.1 Hệ gen của SMV

Soybean mosaic virus (SMV) thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae gây

bệnh khảm lá đậu tương Virus SMV phổ biến nhất và đang gây thiệt hại nghiêm trọng, không thể kiểm soát được ở nhiều vùng đậu tương ở Việt Nam

và trên thế giới [37] Thiệt hại về năng suất có thể lên đến 8-50% trong điều kiện tự nhiên [23], cá biệt lên tới 100% [28] Mức độ của bệnh tùy thuộc vào giống và khí hậu Bệnh xuất hiện khá sớm (vào 4 tuần sau khi gieo) và biểu hiện rõ nhất là giai đoạn ra hoa SMV tương đối ổn định ở mức pH = 6 và mất tính lây nhiễm ở giá trị 4<pH<9

SMV bao gồm một lớp vỏ hình sợi mềm đó là các phân tử protein được

bố trí đối xứng xoắn ốc xung quanh sợi RNA, với chiều dài và chiều rộng là: 650-760nm và 15-18nm Hệ gen của SMV gồm các gen trên RNA sợi đơn, có kích thước khoảng 10,4kb Thành phần bộ gen bao gồm 24,3%G; 29,9%A; 14,9%C và 30,9%U [22] Phân lập và giải trình tự nucleotide của 45 dòng SMV cho thấy có tất cả 7 chủng G1-G7 và các gen có kích thước

9 khoảng 9600 nucleotide [25] Có một loại protein (VPg) nối hệ gen của virus vào đầu 5’ và poly (A) liên kết vào đầu 3’

Hệ gen của virus SMV gồm các gen mã hóa cho 3066 amino acid, gồm

10 chuỗi polypeptid: P1 proteinase (P1) là protein đầu tiên, Helper component proteinase (HC-pro) là các thành phần trợ giúp hoặc là proteinase, Protein P3 (P3), 6 Kda protein 1 (6K1), Cytoplasmic inclusion protein (CI) bao gồm protein hình trụ, 6 Kda protein 2 (6K2), Viral genome-linked protein (VPg), Nuclear inclusion protein A (NIa), Nuclear inclusion protein B

(NIb), Coat protein (CP) (Jayaram và cs) Cấu trúc hệ gen của SMV đƣợc

thể hiện hình 1.1

Hình 1.1 ấu trúc hệ gen của SMV

cơ sở trình tự gen của SMV chủng G2 và G7 theo Jayaram và cs, 1992

CP là protein vỏ của virus, C1 là protein hình trụ; HC-Pro là thành phần trợ giúp và protease; NIb là RNA polymerase phụ thuộc RNA; P1, P3, và NIa là

protease; VPg là protein liên kết; PolyA: đuôi polyA; protein 6K1, 6K2:

Theo nghiên cứu trình tự gen CP mã hóa cho protein vỏ của SMV thông qua hai chủng SMV-G1 và SMV-G6 của tác giả Qusus (1997) Sau khi hoàn chỉnh trình tự nucleotide của gen CP cho thấy gen CP của cả 2 chủng này phù hợp với trình tự gen CP của 2 chủng SMV-G2 và SMV-G7[25] Kết quả đọc trình tự gen CP cho thấy, sản phẩm gen tách dòng từ 2 chủng virus

10 SMV-G1 và SMV-G6 đều có kích thước 798 nucleotide, mã hóa cho 265 amino acid

Protein CP của Potyviruses đã tham gia vào một số chức năng sinh học, với chức năng chính là giữ hình dạng virus ổn định và bảo vệ RNA Ngoài ra protein CP còn tham gia tương tác với tế bào thực vật (vật chủ) [15][16][17][21]

1.2 KỸ THUẬT RNAi

1.2.1 Cơ chế ức chế gen của RNAi

RNAi là cơ chế để kiểm soát chuỗi thông tin di truyền hay cách vô hiệu

hóa hoạt động của các gen xác định do hai nhà khoa học Mỹ là Andrew Fire

và Craig Mello khám phá ra và công bố trên tạp chí Nature vào ngày 19/12/1998 Khám phá cũng báo hiệu sự khởi đầu của một lĩnh vực nghiên cứu mới Fire và Mello đã vinh dự nhận giải thưởng Nobel về Y học và sinh lí học vào năm 2006 cho phát minh quan trọng này Cơ chế này được kích hoạt khi các phân tử ARN kép (dsRNA) xuất hiện trong tế bào Khi đó chuỗi dsRNA kích hoạt “cỗ máy” sinh hoá, làm suy biến các phân tử mRNA được sao mã di truyền từ DNA không biểu hiện được chức năng giải mã, cho ra chuỗi protein tương ứng Đặc biệt, can thiệp RNA với chuỗi dsRNA ngắn trực tiếp có thể thực hiện trong các tế bào động vật có vú mà không gây nên các hiệu ứng không đặc hiệu

11

Hình 1.2 Cơ chế gây bất hoạt gen của RNAi

Các phần tử quan trọng tham dự vào cơ chế can thiệp RNA này là Dicer và Argonaute và những RNA kích thước nhỏ (siRNA) được tạo ra từ RNA sợi đôi (ds RNA) Khi có sự xâm nhập của chuỗi xoắn kép RNA vào tế bào, Dicer lập tức cắt những chuỗi kép RNA này ra những đoạn ngắn hơn, khoảng 21-28 nucleotides, gọi là siRNA Sau khi bị cắt ngắn bởi Dicer, chuỗi kép RNA can thiệp được tách ra làm hai chuỗi đơn, và chỉ một chuỗi đơn RNA với đầu 5' có lực bắt cặp base (base-pairing) nhỏ nhất được chọn để tiếp tục liên kết với Argonaute Quá trình lựa chọn chuỗi đơn RNA này xảy ra trong phức hệ RISC (RNA-induced silencing complex), trong đó có chứa Argounaute và Helicase Phức hệ RISC sau đó thu nhận các phân tử phiên mã mRNA của tế bào có trình tự tương đồng với trình tự của đoạn chuỗi đơn RNA can thiệp lúc này đang có mặt trong phức hệ RISC Sau khi nhận dạng mRNA qua việc bắt cặp các bases tương đồng với trình tự của siRNA, mRNA

và cắt phân tử mRNA của virus thành những siRNA dẫn tới không tổng hợp đƣợc protein và không biểu hiện bệnh

1.2.2 Ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo cây trồng chuyển gen kháng virus

Gần đây, RNAi đƣợc xem là một kỹ thuật hiện đại nhằm chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế hoạt động của siRNA và coi đó là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại virus ở thực vật [18] Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng chuyển gen mã hoá protein của virus (gen mã hoá protein vỏ CP, enzyme phiên mã RdRp ) có khả năng kháng lại chính virus đó đã đƣợc chứng minh bằng thực tế trong những nghiên cứu tạo cây trồng kháng các loại virus khác nhau nhƣ: Potato virus Y PVY [38][33] cucumber mosaic virus CMV, Plum pox potyvirus PPV [19] Tobaco mosaic virus TMV và Potato virus Y PVY [35],

Cho đến nay, đã có các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus đƣợc công nhận nhƣ: Đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng (papaya ringspot virus, PRSV) đã đƣợc công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc, Philippine; Bí đao chuyển gen kháng ba loại vi rút Cucumber mosaic virus, Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, đã đƣợc công nhận

và trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus,

13 được công nhận và trồng ở Trung Quốc … Ngoài ra rất nhiều các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo nghiệm để được công nhận là giống cây trồng thương mại như: Sắn chuyển gen kháng African cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyển gen kháng Maize steak virus (Mastrevirus); Khoai tây chuyển gen kháng đồng thời 3 loại virus Potato virus X (Potexvirus), Potato virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus (Polerovirus); Lúa chuyển gen kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus); Khoai lang chuyển gen kháng Sweet potato feathery mottle virus (Potyvirus) Năm 2007, Bonfim và cs đã tạo ra được một dòng cây đậu chuyển gen kháng virus BGMV (Bean golden mosaic virus) với tính kháng lên đến 93% Lim và

cs (2007) nghiên cứu chuyển gen HC-pro vào cây đậu tương đã nhận thấy rằng, cây chuyển gen khi bị lây nhiễm SMV sau 2 tuần triệu chứng nhiễm bệnh khảm lá do SMV biến mất và lượng SMV đã giảm đáng kể, tuy nhiên HC-Pro của SMV đã gây biến đổi hình thái lá và giảm sự tạo hạt ở các cây đậu tương chuyển gen

Ở Việt Nam gần đây đã có một số nghiên cứu theo hướng ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen chống lại các bệnh do virus gây ra Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học do

Lê Trần Bình và Chu Hoàng Hà đứng đầu là nhóm nghiên cứu đầu tiên

ở Việt Nam đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus [8]

các cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV) và kháng đồng thời cả 2 loại virus trên

1.3 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở CÂY THUỐC LÁ

Chuyển gen là biện pháp công nghệ được ứng dụng để tạo dòng thuốc lá kháng virus Do hệ thống tái sinh cây thuốc lá tương đối đơn giản và thời gian

14 phân hóa từ mô đến cây hoàn chỉnh khá ngắn nên trên những nghiên cứu về chuyển gen các nhà khoa học thường chọn cây thuốc lá là cây mô hình Vì vậy những nghiên cứu về chuyển gen trên cây thuốc lá đã được tiến hành khá sớm Cây thuốc lá chuyển gen kháng diệt cỏ được tiến hành tại Mỹ và Pháp năm 1986 Cây thuốc lá là đối tượng chuyển gen kháng sâu đầu tiên vào năm

kanamycine vào mô thuốc lá N tabacum) bằng vi khuẩn A.tumefaciens [3] cho đến nay, phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens đã được ứng dụng phổ biến và thành công đối với cây thuốc lá

Theo Somers và cộng sự (2003), có ba yêu cầu chính để tạo nên một hệ thống chuyển gen hiệu quả [34]: (i) một nguồn tế bào tổng năng có tác dụng tiếp nhận DNA cung cấp; (ii) các hệ thống đưa DNA vào các tế bào đích; (iii)

một hệ thống để lựa chọn hoặc nhận biết tế bào chuyển gen

1.3.1 Phương pháp chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens (A tumefaciens) là loài vi khuẩn đất, có

khả năng chuyển một đoạn DNA từ Ti plasmid (tumor-inducing plasmid) vào

tế bào thực vật Ti plasmid là một phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có trong lượng phân tử bằng 3-5% so với trọng lượng phân tử của nhiễm sắc thể vi khuẩn Ti plasmid có kích thước khoảng 200kb, trong tế bào chúng tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập gồm 4 vùng tương đồng: A, B, C và D Để

khai thác và sử dụng A tumefaciens như là một vector chuyển gen các nhà

khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hóa opine của Ti plasmid

và thay thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của Ti plaismid và các gen vir Gen chuyển được xen vào giữa

15 các vùng bờ của Ti plasmid Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật

Các vector dùng trong chuyển gen thông qua A tumefaciens là: vector

liên hợp và vector nhị thể, hai loại vector này đang được sử dụng rất có hiệu quả Hệ vector nhị thể đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần riêng biệt: Ti plasmid và vector T – DNA Khắc phục tình trạng khó nhân bản

trong A tumefaciens, loại vector nhị thể được thiết kế bao gồm các phần như sau: i) Vị trí ghép nối đa điểm; ii) Đoạn khởi đầu tái bản hoạt động cả ở E coli và A tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực vật.; iv) gen có khả năng vận chuyển (như oriV, oriT, trfA), chỉ cần khi chuyển gen thông qua A tumefaciens, không cần khi chuyển gen trực tiếp; v)

Đoạn T – DNA ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại biên phải bắt buộc phải có Ngoài ra còn một số thành phần phụ trợ khác như đoạn kích thích vận chuyển T – DNA

Quá trình chuyển DNA vào thực vật

Đoạn T- DNA muốn được chuyển, trước tiên nó phải được hoạt hoá Chính hoạt động của các gen vir đóng vai trò này Hiện tượng này xảy ra khi

A tumefaciens bắt đầu tiếp xúc với hợp chất chứa phenol được tiết ra từ vết

thương của cây hoặc từ tế bào nuôi cấy hay protoplast Đầu tiên là sự hoạt động của các sản phẩm được tạo ra từ gen virA Potein này nằm ở màng trong

của tế bào A tumefaciens, đóng vai trò như một chất thụ cảm đối với

acetosyringon có trong môi trường Tín hiệu này sẽ được truyền dẫn qua sự hoạt hoá gen virG Protein virG sau đó lại gắn vào gen chỉ huy nằm sát gen khởi động thuộc các gen vir khác nhau Bằng cách như vậy, protein của gen virG đã được hoạt hoá làm tăng quá trình hoạt hoá của chính nó đồng thời làm giảm quá trình này của các operon B, C, D và E Trong tiến trình chuyển T-

16 DNA, ở giai đoạn đầu xuất hiện các vết cắt Ti-plasmid tại hai trật tự biên, ở vị trí giữa bazơ nitơ thứ ba và thứ tư của mạch đơn nằm phía dưới Từ đó một mạch đơn T-DNA được giải phóng ra khỏi Ti-plasmid và thay thế vào đó là một mạch đơn mới được tổng hợp theo chiều 5’ – 3’, bắt đầu từ chỗ đứt của trật tự biên phải Điều này giải thích tại sao đầu biên phải cần thiết cho quá trình chuyển T-DNA vào thực vật Trong quá trình di chuyển, sợi đơn DNA phải chui qua rất nhiều màng trước khi vào được đến nhân tế bào thực vật Vì vậy, để giữ được tình trạng nguyên vẹn thì T- DNA sợi đơn được gắn với virE Sản phẩm của gen vir B nằm trên màng tế bào vi khuẩn có nhiệm vụ chuyển trực tiếp DNA sợi đơn sang tế bào thực vật Sau khi T-DNA chui được qua màng tế bào, chúng đi thẳng vào nhân và kết hợp với DNA nhân thực vật ở những vị trí ngẫu nhiên Tại đó các gen trên T- DNA dưới sự điều khiển của gen thực vật bắt đầu sản sinh ra auxin

1.3.2

Hệ thống tái sinh

Giai đoạn biến nạp và tái sinh cây là 2 giai đoạn cùng có ý nghĩa quan trọng và quyết định đến thành công của một thí nghiệm chuyển gen Nếu quá trình biến nạp xảy ra mà tế bào không tái sinh được thành cây hoặc sự tái sinh diễn ra mà không có sự biến nạp thì thí nghiệm chuyển gen chưa thành công [5] Các phương pháp chuyển gen đều chuyển gen vào các tế bào hay

mô, nói cách khác tế bào và mô là đơn vị tiếp nhận gen mới Do vậy, các mẫu

tế bào, mô dùng cho quá trình chuyển gen cần phải có khả năng phân chia in vitro nhanh, phải có khả năng tiếp nhận gen mới Các loại mô được sử dụng trong hệ thống tái sinh như phôi non, phôi trưởng thành; Mô sẹo có nguồn gốc từ các bộ phận khác nhau ở cơ thể thực vật; Mô lá, thân mầm

17 Cây tái sinh có tỷ lệ sống cao (khi đưa ra ngoài đất trồng), tần số biến

dị thấp và khả năng hữu thụ cao để có thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban đầu nhằm tiếp tục tiến hành các thí nghiệm ở các thế hệ tiếp theo

Như vậy, có thể thấy hoàn thiện hệ thống tái sinh là điều kiện tiên quyết

để thực hiện thành công quá trình biến nạp gen ở thực vật

Tính toàn năng của tế bào thực vật đã tạo điều kiện cho sự tái sinh cây

hoàn chỉnh in vitro qua quá trình phát sinh cơ quan (hình thành chồi) hay phát

sinh phôi khi chúng được nuôi cấy trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp và

bổ sung các chất kích thích sinh trưởng cần thiết Các chồi bất định hay phôi được hình thành từ các tế bào đơn được hoạt hóa là những bộ phận dễ dàng tiếp nhận sự biến nạp và có khả năng cho những cây biến nạp hoàn chỉnh (không có tính khảm)

Phần lớn thực vật được tái sinh dễ dàng bằng con đường nuôi cấy mô tế bào Từ một tế bào biến nạp có thể tạo ra một cây chuyển gen, trong đó mỗi tế bào mang DNA ngoại lai và tiếp tục chuyển cho thế hệ sau sau khi nở hoa và tạo hạt [26]

Hệ thống chọn lọc

Trong các quá trình chuyển gen để xác định một cách nhanh chóng và

dễ dàng các mô đích đã thực sự mang gen chuyển hay chưa cần có một hệ thống chọn lọc hiệu quả Hệ thống này thường chọn lọc thông qua gen chọn lọc (selectable marker gens) và gen chỉ thị (reporter gens) Các gen này thường tổng hợp nên các phân tử protein giúp phân biệt các tế bào đã được biến nạp khỏi các tế bào không được biến nạp (gen chọn lọc), hoặc ghi nhận

sự hoạt động của gen biến nạp (gen chỉ thị)

Gen chọn lọc thường có tính trội, thông thường có nguồn gốc từ vi khuẩn nhưng hoạt động của chúng được kiểm soát bởi các promoter kiểu

18

Eukaryote Các gen chọn lọc phổ biến gồm: Các gen kháng kháng sinh như kanamycin (nptII), hygromycin (hpt),…; Các gen kháng chất diệt cỏ như glyphosate hoặc bialaphos (phosphinothricin, basta – gen bar có nguồn gốc vi khuẩn mã hóa cho enzyme làm bất hoạt basta là phosphinothricin acetyltranferaza (PAT)); Các gen khác như pmi – phosphate manose isomerase – chuyển hóa manose thành glucose Nhờ vậy, cây có thể sống trên môi trường không có glucose (manose là nhân tố chọn lọc) [5]

Gen chỉ thị là các gen có trách nhiệm thông báo là gen cần biến nạp đã gắn vào hệ gen thực vật và bắt đầu hoạt động hay chưa Các gen chỉ thị thường dùng bao gồm: β-galactosidase, β-glucuronidase (GUS), Neomycin-phosphatase (NPT), protein phát huỳnh quang xanh lục GFP (green

flourescence protein) và các dẫn xuất của nó [5],…

1.3.3

Trung quốc là quốc gia đã thương mại hóa cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh (kháng virus khảm lá thuốc lá), kháng sâu (Zhao Rong min, Yang Ying Chang và cs, 1993) Wong và cs (1992) cũng đã tạo được cây thuốc lá chuyển

gen crylA(c) mRNA có độc tố cao gấp 10-20 lần so với cây thuốc lá chuyển

gen dùng CaMV35S promoter, hàm lượng protein độc tố thu được chiếm gần

1% lượng protein hòa tan tổng số trong lá Gen cryIII cũng được chuyển vào

cây thuốc lá và cây khoai tây để kháng sâu Colorado potato beetle

(leptiontarsa deeecemlineata) (perlak và cs, 1993) [30] Gen crylA(b) và cryA(c) cũng được chuyển vào cây để phòng trừ côn trùng cánh v y (Van der

Salm và cs, 1994)

100% sâu xanh chết khi ăn lá của cây thuốc lá được chuyển gen cry2Aa2,[27]

Selvapandian và cs (1998) chuyển gen crylIa5 vào thuốc lá và cũng thể hiện

Sự kết hợp kỹ thuật chuyển gen và RNAi sẽ là biện pháp công nghệ sinh học có hiệu quả trong việc cải thiện và tăng cường khả năng kháng virus ở cây trồng.

Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam là một trong những đơn vị đi đầu và thành công trong việc ứng dụng công nghệ RNAi để tạo cây trồng kháng virus và một số cây trồng kháng virus đã được tạo ra bằng kỹ thuật này [7] [8], [5] Nguyễn Liên Chi và cs (1989) [3] đã chuyển thành công gen kháng

kanamycine vào mô thuốc lá (N.tabacum) bằng vi khuẩn A.tumefaciens Trần

Đăng Kiên và cs (1999) [9] đã nghiên cứu phương pháp biến nạp gen tạo giống thuốc lá có khả năng kháng sâu bệnh, trong đó đã xác định được mô lá

là bộ phận tốt nhất biến nạp Vũ Thị Bản và cs (2007) [1] đã tiến hành nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá vàng sấy kháng bệnh virus TMV (bệnh khảm lá)

và đã chuyển được gen CP mã hóa vỏ virus gây bệnh khảm lá thuốc lá vào giống thuốc lá K326 và giống C9-1, thể hiện tính kháng bệnh TMV ở thế hệ

T0

SMV [11

[29tương [12]