nghiên cứu phương pháp định lượng một số phtalat trong thực phẩm

Vì vây, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu phương pháp định lượng một số phtalat trong thực phẩm” để phần nào đánh giá được mức độ ô nhiễm các phtalat trong thực phẩm... Theo tài li

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TẠ THỊ THẢO

Hà Nội, năm 2013

MỞ ĐẦU 1

TỔNG QUAN 3

1.1Tên gọi, cấu trúc của một số phtalat 3

1.1.1 Công thức và tên gọi các phtalat 3

1.1.2 Tính chất lý hóa của các este phtalat 4

1.1.3 Ứng dụng của các este phtalat và nguồn gốc phát tán vào thực phẩm 5

1.1.4 Độc tính của các phtalat 7

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 9

1.3 Các phương pháp xác định phtalat 9

1.3.1 Các phương pháp HPLC xác định phtalat 9

1.3.2 Các phương pháp khác xác định các phtalat 12

1.3.3 Phương pháp chiết tách các phtalat ra khỏi nền mẫu thực phẩm 14

THỰC NGHIỆM 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Các loại phtalat thường có trong thực phẩm 16

2.3 Chất chuẩn, hóa chất, thiết bị 17

2.3.1 Chất chuẩn 17

2.3.2 Hóa chất sử dụng 17

2.3.3 Thiết bị, dụng cụ 18

2.4 Phương pháp phân tích 18

2.4.1 Phương pháp xử lý mẫu 18

2.4.2 Phương pháp phân tích 19

2.5 Nghiên cứu điều kiện tối ưu và đánh giá phương pháp phân tích 20

2.5.1 Phương pháp nghiên cứu điều kiện tối ưu 20

2.5.2 Đánh giá phương pháp phân tích 20

2.5.3 Phương pháp đối chiếu 21

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1.2 Cột tách 24

3.1.3 Detector 25

3.1.4 Bước sóng hấp thụ cực đại của các este phtalat 25

3.1.5 Khảo sát và chọn thành phần pha động phù hợp 26

3.1.6 Khảo sát độ lặp lại của thiết bị 40

3.1.7 Điều kiện tối ưu hóa cho quá trình tách các phtalat 42

3.2 Đường chuẩn hỗn hợp xác định 08 phtalat 42

3.2.1 Dựng đường chuẩn 42

3.2.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 45

3.2.3 Kiểm tra sự khác nhau có nghĩa giữa hệ số a và giá trị 0 47

3.2.4 Kiểm tra sự sai khác giữa b và b’ 49

3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 50

3.3.1 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp xử lý mẫu 50

3.3.2 Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp 51

3.4 Phân tích mẫu thực tế 53

3.5 Đối chiếu kết quả phân tích 53

3.5.1 Kết quả phân tích hàm lượng phtalat trên hệ GC-MS 53

3.5.2 So sánh hai kết quả thu được 54

3.5.3 Hàm lượng cho phép của các phtalat trong thực phẩm 55

KẾT LUẬN 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC 61

Phụ lục 1: Định tính các phtalat khi chạy hệ dung môi pha động MeOH-nước 61

Phụ lục 2: Định tính các phtalat khi chạy hệ dung môi pha động ACN-Nước 62

Phụ lục 3: Các gradient khảo sát với pha động ACN-nước 63

Phụ lục 4: Khảo sát tỷ lệ pha động với pha động ACN-trietylamin 0,04%, pH 2,8 64

Phụ lục 5: Các gradient tốc độ dòng được khảo sát với pha động ACN-trietylamin 65

Phụ lục 8: Khảo sát độ lặp của hệ máy HPLC 67

Phụ lục 9: Đường chuẩn 08 phtalat 68

Phụ lục 10: Đánh giá hiệu suất thu hồi quá trình xử lý mẫu 70

Phụ lục 11: Độ lặp xử lý mẫu 71

Phụ lục 12: Phân tích mẫu thực 72

Bảng 1.1: Tên gọi, cấu tạo, KLPT của một số phtalat điển hình 3

Bảng 2.1: Thông tin về mẫu phân tích được chọn 16

Bảng 3.1: Gradient định tính các phtalat với hệ MeOH-nước 27

Bảng 3.2: Thời gian lưu của các cấu tử: 27

Bảng 3.3: Các gradient thử nghiệm với pha động MeOH-Nước 28

Bảng 3.4: Chế độ chạy với pha động ACN- nước 29

Bảng 3.5: Độ phân giải, thời gian lưu ứng với các gradient 29

Bảng 3.6: Thời gian lưu của các cấu tử ứng với hệ dung môi 3: 31

Bảng 3.7: Kết quả phân tích của 2 tỷ lệ ACN: pha nước chứa trietylamin 31

Bảng 3.8: Các gradient tốc độ dòng 33

Bảng 3.9: Độ phân giải, thời gian lưu, hệ số đối xứng pic khi chạy gradient 6 35

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ trietylamin 0,01% 36

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ trietylamin 0,08% 36

Bảng 3.12: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ trietylamin 0,04% 37

Bảng 3.13: Thời gian lưu, độ phân giải và hệ số đối xứng pic 39

Bảng 3.14: Độ lặp lại thời gian lưu của các phtalat 40

Bảng 3.15: Độ lặp lại diện tích pic các phtalat 41

Bảng 3.16: Các dung dịch dựng đường chuẩn 43

Bảng 3.17: Diện tích pic trung bình thu được của các phtalat 43

Bảng 3.18: Đường chuẩn các phtalat 44

Bảng 3.19: Phương trình đường chuẩn các phtalat 45

Bảng 3.20: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các phtalat 47

Bảng 3.21: Kết quả so sánh giữa giá trị a của phương trình đường chuẩn DCHP với giá trị 0 47

Bảng 3.22: Chuẩn F-tính của các phtalat 48

Bảng 3.23: Kết quả so sánh giữa b và b’ trong phương trình hồi quy của DCHP 49

Bảng 3.24: Độ lặp xử lý mẫu 50

Bảng 3.25: Nồng độ các phtalat ở các mức thêm chuẩn 51

Bảng 3.28: Kết quả phân tích mẫu Bơ thực vật 53 Bảng 3.29: Kết quả mẫu Bơ thực vật đối chiếu 54 Bảng 3.30: Kết quả so sánh hàm lượng mẫu Bơ thực vật bằng chuẩn Student 55

Tên viết tắt Tên đầy đủ

ACN Acetonitril

BBP Benzylbutyl phtalat

CPSC Consumer Product Safety Commissions: Ủy ban An toàn sản phẩm

tiêu dùng CRM Certified Reference Materials: mẫu chuẩn đƣợc chứng nhận

ECD Electron capture detector: detector bắt điện tử

FID Flame ionization detector: detector ion hóa ngọn lửa

GC-MS Gas chromatography – mass spectrometry: sắc ký khí khối phổ HPLC High performance liquid chromatography: sắc ký lỏng hiệu năng

cao KLPT Khối lƣợng phân tử

LOD Limit of Detection: Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantitation: Giới hạn định lƣợng

PDA Photo-diode-array: mảng điot điện tử

ppm Part per million: phần triệu

PVC Polyvinyl clorua

RP-HPLC Reverse phase-HPLC: sắc ký lỏng pha đảo

UV-Vis Ultra-violet: tử ngoại và khả kiến

Hình Tên Trang

3.2 Sắc ký đồ thể hiện 3 gradient đã khảo sát 30 3.3 Sắc đồ chạy đẳng dòng pha động ACN-nước 33 3.4 Sắc ký đồ 06 chương trình gradient đã khảo sát 35 3.5 Sắc đồ khảo sát nồng độ trietylamin trong pha nước 38

3.7 Sắc đồ khảo sát độ lặp lại của hệ máy 42

MỞ ĐẦU

Cuộc sống ngày càng trở nên hiện đại hơn, mọi thứ đều được thiết kế sao cho tiện dụng hơn, dễ sử dụng hơn, hiệu quả hơn và giá thành rẻ Thực phẩm hầu hết được đóng hộp, bảo quản trong những chất liệu như nhựa PVC hoặc hộp inox Những loại bao bì đó lại chưa được quản lý chất lượng một cách chặt chẽ nên rất dễ dẫn đến việc nhiễm một số chất ảnh hưởng tới sức khỏe con người Hơn nữa, tình trạng sản xuất thực phẩm theo phương thức công nghiệp công với việc các nhà sản xuất không tuân thủ các tiêu chuẩn chất lượng đã có, nên nhiều chất phụ gia được thêm vào Chúng được thêm vào để tạo sự hấp dẫn hơn của thực phẩm đó hoặc để thay thế một số chất trong tự nhiên vì hóa chất công nghiệp rẻ tiền và sẵn có hơn

Vì vậy nếu không được quản lý một cách chặt chẽ, những thực phẩm mà chúng ta

sử dụng rất dễ nhiễm các chất độc hại vào thực phẩm và đi vào cơ thể con người… Các chất đó không những ảnh hưởng tới sức khỏe mà còn ảnh hưởng lâu dài tới cuộc sống

Các phtalat hiện nay được sử dụng rất phổ biến trên hầu hết các lĩnh vực của cuộc sống Từ trong những sản phẩm hàng ngày làm bằng nhựa PVC như thau, chậu, hộp đựng thức ăn, bàn ghế, chai lọ Hầu hết các sản phẩm từ nhựa PVC đều

có các phtalat vì nhóm các chất này được thêm vào nhựa để làm tăng độ dẻo, đàn hồi của nhựa, thậm chí nhóm này còn được gọi là “plasticizers” nghĩa là các chất dẻo giống nhựa Thành phần nhựa có thể chiếm từ 0,1-40% những chất này, thậm chí có thể lên tới 60% hay 80%[25] Hơn nữa, những chất này không tạo liên kết trong mạng lưới của nhựa mà chỉ được thêm vào nhựa như một chất phụ gia vì vậy rất dễ thôi nhiễm ra ngoài môi trường (nhất là môi trường nhiều chất béo như dầu, mỡ ) Chúng còn được sử dụng trong ngành công nghiệp xây dựng như trong một

số mặt hàng sơn tưởng, sơn gỗ lát nền nhà và thậm chí trong cả đồ chơi trẻ em và sản phẩm chăm sóc cho trẻ[21] Các phtalat còn được sử dụng trong mỹ phẩm như các loại sơn móng tay, gel vuốt tóc, kem dưỡng da, nước hoa Thêm chúng vào mỹ phẩm sẽ làm cho sơn móng tay có độ bóng và bám bề mặt tốt hơn, trong gel vuốt

tóc và kem dưỡng da làm cho bề mặt kem trông tươi mịn và hấp dẫn hơn, trong nước hoa chúng được dùng như chất định hương để giữ cho mùi thơm nước hoa lâu phai hơn [13] Tất cả các phtalat ở trong các sản phẩm kể trên đều có khả năng thôi nhiễm ra ngoài môi trường không khí hay thức ăn một cách dễ dàng Chúng có thể hấp thụ qua da do tiếp xúc, qua đường hô hấp do hít phải và qua đường tiêu hóa như ăn uống Về lâu về dài chúng gây ra những tác hại to lớn đối với cơ thể con người và môi trường Chúng gây ung thư ở chuột (chưa có thử nghiệm nào trên cơ thể người)[24], các phtalat này có thể làm xáo trộn nội tiết trong cơ thể con người, ở

bé gái có thể gây dậy thì sớm, ở bé trai thì làm teo tinh hoàn Nếu bị tích lũy lâu trong cơ thể, chúng sẽ lắng đọng lại ở phổi, gan và lá lách và dần dần sẽ làm suy giảm chức năng của các bộ phận đó[26]

Trong thực phẩm, nguyên nhân sự xuất hiện các phtalat có thể là do bị thôi nhiễm từ bao bì sản phẩm bằng nhựa dẻo hoặc túi nilon nếu thực phẩm chứa trong

đó là các loại thực phẩm giàu chất béo Hoặc một số loại đồ uống có cồn cũng có thể nhiễm các phtalat do nguyên nhân này Còn một nguyên nhân khác đáng chú ý hơn vì mức nồng độ các phtalat này cao hơn hẳn mức nồng độ do bị thôi nhiễm Đó

là do các nhà sản xuất sử dụng trực tiếp các phtalat, chủ yếu là DEHP, DINP để làm chất tạo đục trong các sản phẩm chứa nước, bởi vì phtalat rất kém tan trong môi trường này[7] hoặc trong các sản phẩm bơ, dầu ăn làm cho thực phẩm nhìn có vẻ tự

nhiên hơn[20] Vì vây, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu phương pháp định lượng một số phtalat trong thực phẩm” để phần nào đánh giá được mức độ ô

nhiễm các phtalat trong thực phẩm

Chương I:

TỔNG QUAN

1.1Tên gọi, cấu trúc của một số phtalat

1.1.1 Công thức và tên gọi các phtalat

Công thức cấu tạo của các phtalat nhƣ sau:

Đây là công thức cấu tạo chung của các este o-phtalats hay còn đƣợc gọi là

đi-este của axit benzenedicarboxylic R và R' là 2 gốc của 2 rƣợu đã tác dụng với axit phtalic để thu đƣợc este phtalat Hai nhóm này có thể giống nhau hoặc khác nhau tùy thuộc rƣợu tham gia phản ứng Cấu trúc khác nhau của 2 nhánh này sẽ tạo

ra những tính chất hóa học và vật lý rất riêng của phân tử và làm thay đổi hoạt tính sinh học của chúng[22,25] Bảng 1.1 chỉ ra một số phalat thông dụng, tên gọi vả cấu tạo của một số phtalat thông dụng

Bảng 1.1: Tên gọi, cấu tạo, KLPT của một số phtalat điển hình [6]

hiệu

(g/mol)

1 Dimethyl phtalat DMP C6H4(COOCH3)2 194

2 Diethyl phtalat DEP C6H4(COOC2H5)2 222

3 Diallyl phtalat DAP C6H4(COOCH2CH=CH2)2 246

4 Di-n-propyl phtalat DPP C6H4[COO(CH2)2CH3]2 250

5 Di-n-butyl phtalat DBP C6H4[COO(CH2)3CH3]2 278

6 Diisobutyl phtalat DIBP C6H4[COOCH2CH(CH3)2]2 278

7 Butyl cyclohexyl

CH3(CH2)3OOCC6H4COOC6H11 304

8 Di-n-pentyl phtalat DNPP C6H4[COO(CH2)4CH3]2 306

9 Dicyclohexyl phtalat DCHP C6H4[COOC6H11]2 330

10

Butyl benzyl phtalat BBP CH3(CH2)3OOCC6H4COOCH2C

11 Di-n-hexyl phtalat DNHP C6H4[COO(CH2)5CH3]2 334

12 Diisohexyl phtalat DIHxP C6H4[COO(CH2)3CH(CH3)2]2 334

13 Diisoheptyl phtalat DIHpP C6H4[COO(CH2)4CH(CH3)2]2 362

16 Di(n-octyl) phtalat DNOP C6H4[COO(CH2)7CH3]2 390

17 Diisooctyl phtalat DIOP C6H4[COO(CH2)5CH(CH3)2]2 390

18 n-Octyl n-decyl

CH3(CH2)7OOCC6H4COO(CH2)

19 Diisononyl phtalat DINP C6H4[COO(CH2)6CH(CH3)2]2 418

20 Diisodecyl phtalat DIDP C6H4[COO(CH2)7CH(CH3)2]2 446

21 Diundecyl phtalat DUP C6H4[COO(CH2)10CH3]2 474

22 Diisoundecyl phtalat DIUP C6H4[COO(CH2)8CH(CH3)2]2 474

23 Ditridecyl phtalat DTDP C6H4[COO(CH2)12CH3]2 530

24 Diisotridecyl phtalat DIUP C6H4[COO(CH2)10CH(CH3)2]2 530

1.1.2 Tính chất lý hóa của các este phtalat

- Nhóm các este phtalat là những chất lỏng dạng dầu, dễ bay hơi, có mùi nhẹ, không tan trong nước và cacbon tetraclorua, nhưng lại tan tốt trong các dung môi hữu cơ như metanol, acetonitril, hexan, các dung dịch dầu ăn, chất béo Chúng có thể tan được trong máu và những chất dịch cơ thể có chứa lipoprotein

- Khi bị phân hủy bởi nhiệt các phtalat này cho khí mùi hơi chát

- Phtalat không có tương tác với những muối nitrat, kiềm, axit hay những chất oxy hóa mạnh

1.1.3 Ứng dụng của các este phtalat và nguồn gốc phát tán vào thực phẩm

1.1.3.1.Ứng dụng của các este phtalat

Phtalat là một nhóm các hợp chất hóa học được phát triển vào cuối thế kỷ trước Chất hóa học dạng dầu này không tồn tại riêng rẽ trong một sản phẩm nào mà được thêm vào các sản phẩm khác để tăng những hoạt tính khác nhau Hơn 87% các lượng phtalat được sử dụng như một loại nhựa (làm cho nhựa linh hoạt hơn, dẻo hơn, đàn hồi tốt hơn) Phtalat được sử dụng trong nhựa PVC dẻo như các sản phẩm tiêu dùng hàng ngày Nó được tìm thấy ở rất nhiều vật dụng hàng ngày như đồ chơi trẻ em, núm vú ngậm bằng cao su, vỏ đồ hộp, áo mưa, vòi tắm, sàn nhà, sơn tường, thau, chậu rửa, hộp đựng thức ăn, ống nước, và một số công thức thuốc trừ sâu Một số còn được dùng trong sản xuất các chất sơn tường, sơn sàn nhà, sàn nhà vinyl, dung môi, các loại nhựa sử dụng cho xây dựng [12] Ngoài ra do tính chất không tan trong nước nên chúng còn được sử dụng làm chất tạo đục trong các sản phẩm nước như thạch rau câu, sữa, nước ngọt đặc trưng như DEHP và DINP được

sử dụng trong thực phẩm như dầu cọ công nghiệp[7] Tuy nhiên, lượng phtalat có trong thực phẩm còn có một lượng nhỏ là do bị thôi nhiễm từ vỏ bao bì bằng nhựa PVC[22,24,25] Trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, phtalat còn có mặt trong một

số loại mỹ phẩm như sơn móng tay, keo vuốt tóc, dầu gội, kem dưỡng da, thuốc nhuộm tóc, son môi, phấn Những chất này được thêm vào trong mỹ phẩm để tạo

độ tươi mới, tạo độ mịn và hấp dẫn cho loại mỹ phẩm đó, hơn nữa trong sơn móng tay các phtalat còn làm cho màu sơn sáng bóng hơn và bền lâu hơn, bám dính hơn Chất DEP còn được dùng như một chất định hương trong nước hoa, giúp nước hoa giữ mùi thơm được lâu hơn và mùi không bị biến mùi trong các điều kiện thời tiết khác nhau [17,18] Trong ngành sản xuất các loại dụng cụ, thiết bị y tế, các phtalat thường có trong những túi nhựa đựng máu, dây truyền nước và hóa chất, ống thông tiểu, ống súc dạ dày Chúng còn được sử dụng trong ngành dược như DEP được dùng như một chất trị bệnh ghẻ vì nó có tính diệt khuẩn (hiện tại bây giờ không còn

sử dụng chất này để điều trị nữa) Đặc biệt, DEP được dùng làm chất hóa dẻo trong bao phim viên thuốc, nhưng lớp phim bao này thường rất mỏng cộng với việc sử dụng hàng ngày chỉ một lượng nhỏ nên coi như lượng vào cơ thể không đáng kể[19]

Theo ước tính sản lượng hàng năm của các este của axit phtalic (PAE's) năm

1998 là khoảng năm triệu tấn Gần như các este phtalat có mặt ở hầu hết mọi nơi trong môi trường sống, cơ thể con người bị nhiễm phtalat là một điều rất dễ xảy ra Nhưng khi chúng đi vào cơ thể có những tác hại gì đối với con người là điều cần xem xét

1.1.3.2 Nguồn gốc phát tán các phtalat vào thực phẩm

Phtalat trong thực phẩm chủ yếu là do bị nhiễm trong quá trình sản xuất và

do thôi nhiễm[14] Nên một số phtalat hay được dùng trong nhựa phổ biến cũng sẽ

có mặt một lượng nhỏ trong các mẫu thực phẩm như DBP, BBP, DINP, DNOP, DIDP khi dùng vỏ hộp nhựa đựng đồ ăn nóng và nhiều dầu mỡ, hoặc cho quay nóng trong lò vi sóng Tsumura (2001) đã chỉ ra rằng sự tăng lên của nồng độ DEHP trong thịt gà mức từ 80 µg/kg trước khi nấu đến 13.100 µg/kg sau khi rán trong chảo được tráng Teflon, và còn cao tới 16.900 µg/kg sau khi đóng gói Làm nóng thực ăn trong các vỏ bọc trực tiếp của đồ ăn nhanh tạo điều kiện rất lớn cho sự thôi nhiễm các phtalat từ vật liệu bọc vào thức ăn Trong khi kiểm tra các bữa ăn được chuẩn bị tại 3 bệnh viện tại Nhật cũng cho thấy việc sử dụng gang tay cao su cũng đóng góp 600 µg mỗi ngày Hàng ngày, các bữa ăn ở bệnh viện đó chứa trung bình khoảng 160 µg DEHP, 12,5 µg DEHA và 4,7µg DINP, 3,4µg BBP[14]

Trên thực tế các phtalat này có trong thực phẩm không chỉ do nguyên nhân thôi nhiễm từ các vật chứa hoặc tiếp xúc mà đôi lúc còn có mặt trong thực phẩm do được cố tình thêm vào Những sản phẩm giàu chất béo như bơ, phomai, mayonaise đều được thêm một lượng nhỏ các phtalat vào để làm chúng trông tươi ngon và mịn hơn Theo tài liệu [7] các phtalat còn được dùng như chất tạo đục trong một số loại thực phẩm Nguyên nhân của hiện tượng này là do sự không trộn lẫn nhau giữa các phtalat và các dạng thức ăn ít béo, chứa nước Chúng tạo thành dạng

nhũ tương giữa hai hay nhiều pha trong một dạng thức ăn Vì vậy các phtalat thường được thêm vào nước hoa quả hoặc đồ uống có cồn để làm tăng độ đục và tạo cảm giác tự nhiên hơn cho các loại thực phẩm đó Trên thực tế mặc dù các phtalat bị cấm sử dụng trong các trường hợp như vậy, tuy nhiên theo Cục quản lý Thực phẩm

và Thuốc Đài Loan, vẫn có những cơ sở sản xuất sử dụng các phtalat để làm chất tạo đục để giảm giá thành so với các sản phẩm tự nhiên như dầu cọ, gum arabic và tạo được độ ổn định trong sản phẩm Chủ yếu phtalat được dùng là DEHP và DINP [7] Thường thì các nhà sản xuất nếu có dùng các phtalat này trong thực phẩm thì cũng khó có thể ghi nó lên thành phần của thực phẩm đó vì nhiều lý do, cho nên trong nghiên cứu này chúng tôi đã nghiên cứu một phương pháp để xác định các phtalat trong thực phẩm, để xem xét mức hàm lượng của chúng có trong mỗi loại thực phẩm khác nhau, giúp người tiêu dùng có những cái nhìn đúng đắn hơn về những thực phẩm chứa những chất có hại đối với cơ thể

1.1.4 Độc tính của các phtalat

Có rất nhiều các loại đồ dùng có chứa các phtalat xung quanh chúng ta, hơn nữa do các tính chất của chúng khiến chúng rất dễ bị nhiễm vào cơ thể con người Nhưng với mỗi một nguồn nhiễm khác nhau thì lại khác nhau về lượng và về tác động trực tiếp đến cơ thể con người Vì vậy trước khi xem xét độc tính của phtalat đối với cơ thể con người nên nhìn lại cách mà chúng xâm nhập vào cơ thể chúng ta

1.1.4.1 Con đường lây nhiễm phtalat

Từ các tính chất và ứng dụng của các phtalat đã nêu ở trên chúng ta có thể biết được các phtalat xâm nhập vào cơ thể con người theo những đường nào Gần như đến 90% các phtalat đều được sử dụng trong quá trình sản xuất nhựa PVC, nhưng cấu tạo phân tử của chúng thì lại cho thấy chúng không hề tham gia vào mạng lưới của nhựa mà chỉ đóng vai trò là chất phụ gia, chất độn vào các sản phẩm nhựa Nên khi nhựa bị vỡ ra hoặc bị lão hóa, các phtalat này có thể đi ra khỏi nhựa

và ra ngoài không khí xung quanh Khi đó chúng ta sẽ hít phải các chất này và bị nhiễm vào cơ thể Hơn nữa, các sản phẩm nhựa này khi được chứa các loại thức ăn

có nhiều dầu mỡ, chất béo… các phtalat này cũng bị thôi nhiễm ra ngoài thức ăn và

đi vào cơ thể qua đường ăn uống Chưa tính đến các phtalat này còn được sử dụng thay một số chất trong tự nhiên vì hóa chất công nghiệp sản xuất nhiều lại có chi phí thấp hơn Vì chúng không tan trong nước nên chúng được sử dụng để làm chất tạo đục trong các sản phẩm chứa nước như thạch sữa chua, sữa, các loại nước ngọt… nên khi ăn uống những thực phẩm đó chúng ta đã bị nhiễm các chất phtalat Các phtalat cũng còn được dùng trong sản xuất các loại mỹ phẩm, chủ yếu là kem bôi

da, gel xịt tóc… nên khi sử dụng chúng sẽ được hấp thụ qua da và đi vào cơ thể Một phần nhỏ nữa các phtalat đi vào cơ thể con người còn do các sản phẩm sơn tường, sơn gỗ sàn nhà cũng có chứa những chất này và chúng bị thôi nhiễm ra ngoài không khí Nhìn chung, các chất này có ở xung quanh môi trường sống của chúng ta rất nhiều và khó có thể kiểm soát được

1.1.4.2 Độc tính

Chưa có nhiều thử nghiệm về tác hại của các phtalat đối với cơ thể con người Tuy nhiên đối với những nghiên cứu trên động vật (cụ thể là chuột ở cả hai giới tính) đã cho ta thấy những kết quả đáng sợ về độc tính của các phtalat này Theo nghiên cứu [27], tác giả V Zitko đã nêu ra độc tính của các phtalat này trên những con chuột được tiêm vào một lượng phtalat nhất định Tất cả các phtalat kiểm tra đều có những tác hại về hệ sinh sản và một điều đáng lưu ý ở một số thai nhi bị biến đổi ở hầu hết các động vật được tiêm Đặc biệt DMP và dimethoxyletyl phtalat đã có những tác động rất linh hoạt Khối lượng phân tử các phtalat càng thấp thì càng độc hơn so với những phtalat có gốc rượu từ C6-C9 Các phtalat khi được tiêm vào tĩnh mạch chuột, cơ thể chuột tích tụ các phtalat lại trong phổi, gan và lá lách với những lượng khác nhau các phtalat và dần dần làm mất chức năng của các

bộ phận đó Phtalat còn gây xáo trộn nội tiết và các trung tâm hormonally hoạt động bởi vì khả năng can thiệp vào hệ thống nội tiết trong cơ thể của các phtalat Tiếp xúc với phtalat lâu dài sẽ dẫn đến tỷ lệ mắc các bệnh bất thường như hở hàm ếch, các dị tật xương tăng và tăng số thai chết trong các nghiên cứu trên động vật thí nghiệm Hệ thống nhạy cảm nhất của cơ thể khi tiếp xúc với các phtalat này là hệ sinh sản chưa phát triển hoàn toàn của nam giới, khi bị nhiễm các phtalat ở một

mức độ, cơ thể bị gia tăng tỷ lệ tinh hoàn không xuống, tinh hoàn giảm trọng lượng hoặc giảm khoảng cách giữa hậu môn và cơ sở dương vật [26] Đối với nữ giới, khi các phtalat tiếp xúc lâu dài với cơ thể sẽ gây ra xáo trộn nội tiết, gây tăng tiết hormon nữ tính, làm cho trẻ nữ bị dậy thì sớm hơn và dễ gây ra hiện tượng dị thường thai trong quá trình mang thai nếu tiếp xúc quá nhiều với các phtalat

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng được phương pháp phân tích định lượng đồng thời các phtalat trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng cột tách pha ngược (RP-HPLC), detector PDA và ứng dụng phân tích một số mẫu đại diện

1.3 Các phương pháp xác định phtalat

1.3.1 Các phương pháp HPLC xác định phtalat

Các phtalat là những este của axit phtalic với hai hoặc một rượu nào đó, do

đó tính chất cũng như cấu tạo của chúng có tính tương đồng cao Phương pháp phân tích các hợp chất này phải đủ mạnh để không bị ảnh hưởng lẫn nhau của các phtalat khi xác định đồng thời Và sắc ký đáp ứng tốt được điều đó Vì là các este nên có thể sử dụng cả sắc ký khí và sắc ký lỏng để phân tích Tuy nhiên khi dùng sắc ký khí phải được ghép nối với detector khối phổ mới cho hiệu quả cao, còn các detector khác đều kém nhậy (như FID, ECD) Sắc ký lỏng thì có thuận lợi hơn là có thể sử dụng detector UV cũng có thể định lượng cũng như định tính được các phtalat Tuy cũng có nhiều ưu nhược điểm khác nhau, khi dùng HPLC-UV thì khi phân tích mẫu thực, kết quả phải được kiểm chứng lại bằng một phương pháp mạnh hơn như ghép nối với MS Bởi vì dạng phổ hấp thụ của các phtalat rất giống với nhiều chất khác có một vòng benzen, bước sóng hấp thụ cũng không đặc trưng nên khả năng định tính thấp Tuy nhiên trên một số đối tượng nhất định, nền mẫu kém phức tạp hơn thì HPLC-UV lại ưu việt hơn nhờ giá thành rẻ hơn và khá chính xác, phương pháp xử lý mẫu đơn giản

Một số tác giả cũng đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector UV để xác định các phtalat trong nhiều đối tượng khác nhau Tạp chí ứng dụng của Knauer [15] cũng đã đưa ra quy trình tách 08 phtalat là benzylbenzoat, benzylbutyl phtalat, dibutyl phtalat, dihexyl phtalat, bis(2-etylhexyl) phtalat, din-octyl phtalat, di-iso-nonyl phtalat, di-iso-decyl phtalat trên hệ HPLC pha đảo, cột Eurospher II 100-3 C18 H, 250×3,0 mm ID Hệ dung môi là ACN-Nước với gradient với hai kênh A gồm H2O/ACN là 15:85 (thể tích/thể tích), kênh B là ACN Gradient từ 0-3 phút từ 0% kênh B, từ 3,0-6,5 phút tăng từ 0% B đến 100% B, phút thứ 6,5 đến 19,5 phút chạy 100% kênh B Tốc độ dòng 0,6 ml/phút, nhiệt độ cột

300C, detector UV đặt ở bước sóng 225 nm Kết quả cho thứ tự của các chất ra khỏi cột là BB-BBP-DBP-DHP-DEHP-DNOP-DINP-DIDP Tổng thời gian chạy một mẫu là 22 phút

Nhóm các tác giả Ting Wu, Chao Wang, Xing Wang, Haiqing Xiao, Qiang

Ma, Qing Zhang [23] cũng đã tách 12 phtalat trên hai hệ UPLC và HPLC, để so sánh hiệu quả tách của hai hệ máy trên Các phtalat được tách: DMGP, DPP, DIBP, DMP, DEP, DBP, BBP, DCHP, DEHP, DNOP, DAP, DHP Dung môi sử dụng là metanol, các dung dịch chuẩn các phtalat cũng được pha trong dung môi này, detector sử dụng là PDA đặt ở bước sóng 225 nm Với hệ ultra-performance-liquid-chromatography là một hệ có hiệu quả tách cao, cỡ hạt nhỏ, cột ngắn, áp suất cao, đường kính nhỏ Cột sử dụng là cột phenyl 50 mm × 2,1 mm × 1,7 µm, nhiệt độ cột

450C, sử dụng hai dung môi kênh A là MeOH, kênh B là Nước Kênh A tăng trong 1,5 phút từ 50-78%, được giữ trong một phút, sau đó tăng đều lên 100% trong vòng

1 phút, giữ trong vòng 1 phút ở tỷ lệ 100% kênh A trước khi đưa về trạng thái ban đầu và được giữ cân bằng ở điều kiện đó 2 phút Tổng thời gian chạy một mẫu là khoảng 7 phút, tốc độ pha động 0,4 ml/phút Còn đối với hệ HPLC của Agilent

1100, ghép nối với hệ bơm, bộ phận tự động bơm mẫu và lò cột Nhiệt độ cột đặt ở

250C, cột phenyl 250 mm × 4,6 mm × 5 µm Pha động cũng gồm hai kênh MeOH (kênh A) và nước (kênh B) Chế độ gradient kênh A tăng trong 5 phút từ 70-85%, sau đó tăng đều trong 4 phút tới 100%, giữ trong 4 phút trước khi trở về điều kiện

đầu sau đó giữ cân bằng 4 phút Tổng thời gian 18 phút một mẫu Tốc độ dòng 1,0 ml/phút Kết quả cho thấy đường nền khi chạy trên thiết bị UPLC rất ổn định, thẳng đều, không bị trôi hay bị dâng nền Còn đối với thiết bị HPLC, nền bị dâng đều theo lượng MeOH, tuy rằng hiệu quả tách đều tốt, độ phân giải giữa các pic đạt được tốt nhưng rõ ràng khi phân tích mẫu thực hệ UPLC sẽ cho kết quả phân tích chính xác hơn, thời gian phân tích nhanh hơn

Một phương pháp sắc ký lỏng thân thiện với môi trường cũng đã được sử dụng để tách và định lượng các phtalat trong mẫu sơn móng tay D De Orsi và các cộng sự [9] đã tách 07 phtalat: DMP, DEP, DIBP, BBP, DBP, DEHP trên hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector UV đặt ở bước sóng 254 nm Cột Zorbax Eclipse XDB C18 (Agilent) 150 mm × 4,6 mm × 3,5 µm Chế độ gradient bắt đầu với tỷ lệ 50:50

% thể tích etanol/nước, tăng dần đến 95% etanol trong 30 phút Thành phần này được giữ đến cuối cùng sau khi giữ cân bằng 10 phút, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, van bơm 10 µl, nhiệt độ cột 350C Phương pháp này được gọi là thân thiện với môi trường bởi vì nó sử dụng dung môi etanol trong quá trình tách, dung môi không độc hại với con người cũng như với môi trường như các dung môi thường dùng khác trong HPLC như: ACN hay MeOH Các phtalat cũng được tách ra khỏi nhau, tổng thời gian lưu một mẫu chạy là 40 phút Phtalat được chiết ra khỏi nền mẫu bằng hỗn hợp 90/10 % thể tích Etanol/nước Phân tích mẫu thực có sử dụng chất nội chuẩn DPP, nồng độ 50 ppm

Thêm một nghiên cứu nữa về phương pháp tách và định lượng các phtalat, theo tài liệu [13], tác giả Hyun Jung Koo và cộng sự đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp HPLC-UV để xác định 04 phtalat (DEP, DBP, BBP, DEHP) trong các mẫu mỹ phẩm Sử dụng hệ máy HPLC của Hitachi (model L-700, Tokyo), bộ phận bơm mẫu tự động, cột Supecol LC-18 5µm (250mm×4,6mm), nhiệt độ cột

200C±20C Pha động tỷ lệ 88:12 (88% ACN và 12% dung dịch đệm trietylamine 0,08% pH 2,8 được điều chỉnh pH bằng axit photphoric 1mol/L) Tốc độ dòng 0,7 mL/phút, tổng thời gian chạy là 50 phút Đường chuẩn dựng từ 10-400ppm, sử dụng chất nội chuẩn DnHP Kết quả thu được, phát hiện 19/21 mẫu sơn móng tay và

11/42 mẫu nước hoa chứa DBP, 24/42 mẫu nước hoa chứa DEP với hàm lượng khá cao Trong nghiên cứu này còn chỉ ra mức con người nhiễm phải các phtalat khi sử dụng mỹ phẩm hàng ngày Ước tính dựa trên lượng các phtalat phát hiện được trên các đối tượng mẫu

Ngoài sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector UV còn có một số phương pháp khác để định lượng cũng như định tính các phtalat Các phương pháp này được trình bày ở phần 1.2.2

1.3.2 Các phương pháp khác xác định các phtalat

Ngoài phương pháp HPLC, một phương pháp phổ biến để xác định các phtalat là GC-MS Có thể sử dụng sắc kí khí ghép nối với các detector khác để xác định các phtalat như detector bắt điện tử (ECD), hay ion hóa ngọn lửa (FID)

Theo tiêu chuẩn CPSC-CH-C1001-09.3[21] của tổ chức CPSC Mỹ (United States Consumer Product Safety Commissions), các phtalat được xác định trên đối tượng là đồ chơi trẻ em, sử dụng hệ thiết bị GC-MS Các phtalat được chiết ra khỏi đối tượng bằng dung môi THF và n-hexan Khoảng 50 mg mẫu được cân chính xác, sau đó thêm 5ml THF, tiếp đó thêm 10ml n-hexan (tổng thể tích dung môi là 15 ml) Phần dung dịch lọc, lấy 0,1 ml sau đó thêm vào 80µl dung dịch chất nội chuẩn benzyl benzoat 250µg/ml, sau đó cho đến thể tích 20ml bằng n-hexan Đường chuẩn

06 phtalat (DBP, BBP, DEHP, DNOP, DIDP, DINP) được dựng từ 0,5 – 10 µg/ml với mẫu trắng là cyclohexan Với điều kiện chạy GC-MS trên cột DB-5MS 30m×0,25mm ID×0,25µm, tốc độ dòng ban đầu 1ml/phút, dòng chảy liên tục, khí mang He, van tiêm mẫu 1µl ở nhiệt độ 2900C, áp suất 35 psi, từ 2-5 phút giữ ở

500C, sau đó tăng 300C/phút tới 2800C, sau đó tăng 150C/phút tới 3100

C, giữ trong

4 phút Thu được thời gian lưu của các chất BB (m/z=105), DBP (m/z=223) từ 9,5 phút, BBP (m/z=206) và DEHP (m/z=279) từ 9,5-10,8 phút và của DNOP (m/z=279), DINP (m/z=293) và DIDP (m/z=307) ra sau phút 10,8 Có phân tích mẫu chuẩn CRM để xác nhận giá trị của phương pháp

5-Tác giả Hao-Yu-Shen và các cộng sự [12] đã sử dụng cả hai phương pháp là sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, detector DAD và phương pháp sắc ký khí khối phổ để xác định đồng thời 07 phtalat và 04 paraben trong 15 loại mẫu mỹ phẩm như: gel dưỡng tóc, kem dưỡng da, sữa dưỡng thể 07 phtalat (DEHP, DOP, DEP, DPP, DBP, BBP) và 04 paraben (Metyl paraben, Etyl paraben, Propyl paraben và butyl paraben) được xác định bằng HPLC-DAD và GC-MS sau khi đã được làm sạch với cột chiết pha rắn C18, độ thu hồi 85-108%, RSD 4,2-8.8% Điều kiện tối

ưu khi sử dụng GC-MS: pic cơ bản (m/z=149) để định lượng các phtalat, còn m/z =

121 để định lượng các paraben Thiết bị Agilent 6890N, bơm mẫu tự động ghép với detector MS, cột HP-5MS 30m×0,25 ID×0,25µm, cột mao quản 5% diphenyl, 95% dimetylpolysiloxane, khí mang He Chạy với gradient nhiệt: 1000

C giữ trong 0,5 phút tăng từ từ 50C mỗi phút cho đến 2200C, tăng tiếp 100C một tới 2750C, giữ 5 phút Tốc độ khí mang ở 1,0 ml/min Tiêm mẫu ở 2500C Còn đối với hệ HPLC của Agilent 1100 HPLC gồm bơm, bộ phận bơm mẫu tự động, bộ trộn, lò cột, tất cả được ghép nối với detector DAD, cột C8 (150mm×4,6 mm×3µm), nhiệt độ cột giữ

ở 300

C Chế độ gradient: 0-13 phút giữ ở tỷ lệ 50:50 (MeOH:H2O), 15 phút tỷ lệ tăng đến 70:30, phút thứ 22 là 85:15, phút thứ 30 tăng đến 100 % MeOH, tốc độ dòng đặt 1,0ml/phút, bước sóng đặt tại 230 nm Khoảng tuyến tính của các chất phân tích nằm từ 0,54-100mg/l Mẫu thực được xử lí bằng cách cân chính xác khoảng 1,0 gam mẫu mỹ phẩm cho vào ống thủy tinh, cho thêm 10 ml MeOH, rung siêu âm 30 phút Chuyển dung dịch trong sang một ống sạch, làm khô bằng hơi nitơ

ở nhiệt độ phòng Dung dịch mẫu được đưa qua cột chiết pha rắn C18 và được tối

ưu hóa với các dung môi chiết khác nhau như diclometan, aceton, hexan, MeOH, etyl acetat, các điều kiện khác như đồng nhất mẫu, lắc, rung đều được tối ưu Kết quả đã phân tích được hàm lượng của 07 phtalat và 04 paraben có trong 15 mẫu mỹ phẩm

Ngoài GC ghép nối với detector MS ra thì người ta còn sử dụng các loại detector khác nhau để phân tích các phtalat như FID, ECD Tiến sĩ Sapna Johnson

và các cộng sự [20] đã nghiên cứu xác định 08 phtalat (DMP, DEP, DBP, BBP,

DEHP, DINP, DNOP, DiDP) trong đối tượng đồ chơi trẻ em sử dụng detector ECD Mẫu được cân với khối lượng 5g được chiết Soxhlet trong 100ml dung dịch diclometan 16 giờ và ở 600C 90ml dịch chiết được làm giàu ở 300C, và 1µl được bơm vào cột tách Tất cả các mẫu phân tích đều được làm lặp lại 3 lần Cột được sử dụng là DB-5MS 30 m x 25 mm ID x 0.25 µm, tốc độ ban đầu 1ml/phút, khí mang

He, van bơm 1µl ở nhiệt độ 2900C, áp suất 35 psi, 0,5 phút, 2-5 phút giữ ở 500C, tăng 300C/phút tới 2800C, sau tăng 150C/phút tới 3100C giữ trong 4 phút Tổng thời gian 50 phút Detector ECD, nhiệt độ bổ trợ 3000C, khí Nitơ 20ml/phút Kết quả thu được cho thấy 4 loại phtalat phổ biến là DEHP, BBP, DBP và DINP có mặt trong tất cả 24 mẫu thí nghiệm với hàm lượng từ <0,1%-16,22% Sau khi mẫu được xác định bằng GC-ECD thì được kiểm tra để khẳng định lại bằng GC-MS

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng các loại detector mạnh hơn detector UV cũng được sử dụng để phân tích các phtalat Theo nghiên cứu của Bart Tienpont [5], các mẫu môi trường như đất, trầm tích , các mẫu thực phẩm và mẫu nền sinh học cũng đã được đem ra phân tích hàm lượng các phtalat trên hệ máy HPLC-MS với các chế độ ion hóa khác nhau Các phtalat được phân tích chủ yếu là dạng mono-este của axit phtalic như mono-2-etylhexyl phtalat , cơ chế phân mảnh ESI hoặc APCI Hệ thiết bị Agilent 1100 LC, kết hợp với cột 25cm

× 4,6 mm ID × 5 µm, hệ dung môi gồm 2 kênh Kênh A 0,5% đệm amoni axetat trong nước, kênh B là metanol, chạy đẳng dòng tỷ lệ 50%/50% B về thể tích, tốc độ dòng 0,5 ml/phút, van bơm mẫu 50 µL Thế phân cực 70 V, nhiệt độ 3250

C, tốc độ khí 5L/phút khí N2, các mảnh ion M+1 = 277 (DEHP), 281 (MEHP), 291 (MiNP),

305 (MiDP) Mẫu được chiết các phtalat ra khỏi nền bằng chiết Lỏng – Lỏng và làm giàu bằng chiết pha rắn

1.3.3 Phương pháp chiết tách các phtalat ra khỏi nền mẫu thực phẩm

Trước khi mẫu được đưa vào hệ HPLC để phân tích cho ra hàm lượng phtalat có trong mẫu thì nó phải được đồng nhất, chuyển từ các trạng thái khác nhau

về dạng lỏng, các phtalat được tan trong dung môi acetonitril hoặc metanol Khi đưa vào đầu cột tách có khả năng hấp thu và rửa giải qua cột

Theo tài liệu [22], mẫu phải được đồng nhất trước khi đem xử lý hoặc chiết Với mẫu lỏng có thể dùng biện pháp lắc, trộn lẫn, hay khuấy Đối với mẫu rắn thường sử dụng máy trộn để làm đều hoặc có thể cho thêm dung môi hữu cơ phân cực hoặc nước cất để làm đều Các phtalat được chiết ra từ mẫu không chất béo dạng lỏng với dung môi hữu cơ không phân cực và có thể đo mà không cần bất kỳ

sự làm sạch nào Áp dụng với trường hợp đối với nước, các loại nước giải khát và

đồ uống có cồn Hầu hết các phòng thí nghiệm đều sử dụng chiết Lỏng-Lỏng để phân tách các phtalat ra khỏi nền mẫu Dung môi có thể dùng clorofom, n-hexan, n-heptan, hoặc isooctan Cũng có thể sử dụng chiết pha rắn để tách lấy các phtalat phân tích Đối với các loại thực phẩm không béo dạng rắn thường được chiết với ACN hoặc hỗn hợp ACN-Nước Trường hợp thực phẩm giàu chất béo dạng rắn thì các phtalat được chiết ra khỏi nền cùng với chất béo có thể sử dụng diclometan, hỗn hợp diclometan với cyclohexan, n-hexan, và hỗn hợp n-hexan với aceton, hoặc có thể dùng ACN để tăng độ chọn lọc của các phtalat từ thực phẩm, dựa trên khả năng tan kém của các chất béo vào trong ACN Kỹ thuật chiết phổ biến nhất chỉ bằng cách lắc mẫu với hỗn hợp chiết Tuy nhiên dùng biện pháp rung siêu âm và lò vi sóng là 2 biện pháp đã cho hiệu quả tốt nhất

Dựa trên điều kiện phòng thí nghiệm và các tài liệu tham khảo đã có, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao pha đảo của Shimadzu, ghép nối với detector PDA, cột Cadenza CD-C18 250mm × 4,6mm × 3µm, hệ điều khiển SCL 10A, lò cột CTO-10AS, bộ trộn dung môi, bơm cao áp LC-10Advp, đèn SPD-M10A (đèn D2 và W) Vòng nạp mẫu 50µl Các điều kiện chạy máy và xử lý mẫu đều được khảo sát và tối ưu hóa trước khi phân tích mẫu

CHƯƠNG II:

THỰC NGHIỆM

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Thực phẩm chứa phtalat có thể do hai nguyên nhân, do thôi nhiễm từ vỏ bao

bì được làm bằng các loại nhựa hoặc do chúng được thêm vào trong quá trình sản xuất Khả năng các phtalat bị thôi nhiễm từ bao bì thường cho lượng phtalat nhỏ, và

có thể phát hiện các phtalat khác ngoài DEHP và DINP, trong khi đó lượng phtalat

có mặt trong thực phẩm do sự thêm vào thì thường có 2 phtalat trên với lượng khá lớn (cỡ vài %) Thôi nhiễm phtalat từ bao bì thực phẩm có thể nhiều hoặc ít tùy thuộc loại thức ăn được chứa hoặc cách bảo quản, chế biến thức ăn trong bao bì đó

Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn một số mẫu phân tích chứa nhiều chất béo, bảo quản trong hộp nhựa hoặc bọc bằng giấy bạc Mẫu đại diện là Bơ Tường An của Công ty Cổ phần Dầu Thực Vật Tường An, được đựng trong hộp nhựa, khối lượng tịnh cỡ 80g và mẫu Phomai Con Bò Cười, được bọc trong giấy bạc, hộp 8 miếng của Công ty TNHH Bel Việt Nam Mẫu được xử lý và dùng để định tính, định lượng 08 phtalat đã khảo sát

2.2 Các loại phtalat thường có trong thực phẩm

Phtalat được dùng phổ biến nhất trong tất cả các lĩnh vực là DEHP Trong thực phẩm nó được sử dụng thay thế cho dầu cọ vì hóa chất công nghiệp rẻ tiền hơn dầu cọ tự nhiên Hơn nữa vì nó chiếm thành phần khá lớn trong một số loại nhựa dẻo nên khả năng nó bị thôi nhiễm vào thực phẩm cũng lớn hơn các phtalat khác

Dựa trên đặc tính của các phtalat và sự nhiễm của các phtalat vào các loại thực phẩm nên chúng tôi lựa chọn 2 loại mẫu thực, đó là dạng thực phẩm chứa nhiều chất béo như mẫu bơ và mẫu Phomai Con bò cười Thông tin về các loại mẫu được chọn đưa trong bảng 1.2

Bảng 2.1: Thông tin về mẫu phân tích được chọn

1 Mẫu bơ thực vật (hộp Công ty Cổ phần Dầu Thực vật NSX:16/11/12

Bảng 2.2: Nồng độ các dung dịch chuẩn este phtalat

STT Tên viết tắt Khối lƣợng cân (g) Nồng độ (ppm) Cách pha

2.3.2 Hóa chất sử dụng

 Các dung môi cho sắc ký lỏng hiệu năng cao: MeOH, ACN (Merck – Đức)

 N-hexan

 Trietylamin Merck – Đức

 Axit photphoric Merck – Đức

- Cột pha đảo Cadenza CD-C18 250mm × 4,6mm × 3µm

- Cân phân tích Scientech SA 210, độ chính xác 0,0001 g

- Máy ly tâm, tốc độ 4000 vòng/phút

- Máy đo pH Metrohm 961 với điện cực thủy tinh và điện cực calomen bão hòa và các dung dịch pH chuẩn để hiệu chỉnh điểm chuẩn của máy đo pH (Merck)

2.4 Phương pháp phân tích

2.4.1 Phương pháp xử lý mẫu

Theo tính chất đã biết của các phtalat, chúng tan tốt hơn trong các dung môi hữu cơ như n-hexan, acetonitril, metanol Mẫu thực được chọn là mẫu có nhiều

lượng chất béo như mẫu bơ thực vật và mẫu phô mai Con bò cười Do tính chất của dung môi acetonitril hòa tan chọn lọc các phtalat trong môi trường chất béo, vì vậy chúng tôi đã sử dụng dung môi acetonitril để xử lý mẫu[7]

Với 2 dạng mẫu rắn này chúng tôi đưa ra phương pháp xử lý mẫu:

Mẫu được cân khối lượng khoảng 0,2 g chính xác tới 0,0001g trên cân phân tích, chuyển mẫu vào ống thủy tinh 10ml Thêm 5 ml dung môi acetonitril, lắc trên máy lắc 30 phút, sau đó rung siêu âm 30 phút ở nhiệt độ 400C để giúp cho chất béo trong đó bị chảy ra, các phtalat tan dễ dàng hơn Cuối cùng quay ly tâm 30 phút để lắng cạn và thu dịch trong sang 1 ống khác Dung dịch này sau khi lọc qua màng lọc 0,45µm được bơm vào cột để định lượng các phtalat có trong mẫu Mẫu thêm chuẩn cũng được thực hiện với một quá trình trên để xác định hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu

2.4.2 Phương pháp phân tích

Phép phân tích các phtalat được thực hiện trên hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của Shimadzu, kết nối với hệ bơm gồm 4 kênh, bộ điều khiển, lò cột, bộ trộn dung môi và detector photo-diode-array (PDA) đặt ở bước sóng 225 nm Các điều kiện chạy máy được tóm tắt như sau:

- Nhiệt độ cột 250C

- Van bơm mẫu 50 µL

- Hệ dung môi gồm 2 kênh Kênh A: pha nước chứa 0,04% trietylamin được chỉnh pH tới 2,8 bằng dung dịch axit photphoric Kênh B là ACN

- Chế độ gradient tốc độ dòng: thời điểm ban đầu tốc độ là 0,8 ml/phút, giữ ở tốc độ này trong vòng 12,5 phút sau đó tăng dần lên 1,0 ml/phút ở phút thứ

14 Giữ 2 phút, sau đó tăng lên 1,2 ml/phút trong vòng 2,5 phút Giữ tốc độ này đến khi các chất được rửa giải hết ra khỏi cột Tổng thời gian chạy là 25 phút Tỷ lệ giữa 2 kênh A:B là 5:95 (% về thể tích) được giữ suốt quá trình chạy mẫu

2.5 Nghiên cứu điều kiện tối ưu và đánh giá phương pháp phân tích

2.5.1 Phương pháp nghiên cứu điều kiện tối ưu

Các điều kiện tối ưu trên hệ máy sử dụng cũng như quá trình xử lý mẫu đã được khảo sát

Thứ nhất là khảo sát để chọn hệ dung môi pha động Chúng tôi đã khảo sát 3

hệ dung môi MeOH-Nước, ACN-nước và ACN-pha nước chứa trietylamin 0,04%,

pH 2,8 chỉnh pH bằng axit photphoric 1 mol/L

Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp chúng tôi đi khảo sát thành phần của pha động Tỷ lệ giữa 2 pha ACN và pha nước cũng được khảo sát ở 2 tỷ lệ 88% ACN : 12 % pha nước và 95% ACN:5% pha nước (% về thể tích)

Khảo sát thành phần % của trietylamin trong pha nước Nồng độ của trietylamin cũng được khảo sát ở 3 mức: 0,01%; 0,04%; và 0,08%

Giá trị pH pha động cũng được khảo sát, ở 3 giá trị pH: 3,31; 2,82 và 2,20 Chế độ chạy đẳng dòng và gradient đã được khảo sát Chế độ đẳng dòng khảo sát ở 2 tỷ lệ pha động 88:12 (% thể tích của ACN : pha nước) và 95:5 (% thể tích của ACN:pha nước) 6 chương trình gradient cũng được khảo sát để chọn được một chế độ chạy phù hợp nhất, hiệu quả tách tốt nhất Với tốc độ dòng thay đổi theo thời gian từ 0,6 ml/phút tới 1,2 ml/phút từ thời điểm ban đầu đến khi kết thúc quá trình chạy khoảng 60 phút

2.5.2 Đánh giá phương pháp phân tích

Phương pháp phân tích thể hiện tính đúng đắn trước tiên phải thể hiện độ lặp lại Trong nghiên cứu chúng tôi đã khảo sát độ lặp lại của hệ thiết bị HPLC sau khi chọn các điều kiện tối ưu Đánh giá độ lặp của hệ thiết bị dựa trên độ lặp diện tích

và thời gian lưu của các cấu tử trong dung dịch khảo sát Một mẫu có nồng độ xác định nằm trong giới hạn tuyến tính của đường chuẩn các phtalat đã chọn Mẫu được bơm vào hệ 3 lần sau đó lấy diện tích pic và thời gian lưu trung bình của các lần và tính được giá trị % RSD Giá trị này đánh giá độ lặp cần khảo sát

Sau khi có đầy đủ các điều kiện tối ưu, tiến hành dựng đường chuẩn 08 phtalat đã khảo sát và thu được 08 phương trình đường chuẩn Đánh giá sai số hệ

thống qua các hệ số trong phương trình hồi quy sử dụng các chuẩn Student và Fisher để đánh giá và kết luận Thu được một phương trình đường chuẩn mới, sau

đó mới tiến hành phân tích mẫu thực tế

Khi phân tích mẫu thực thì độ lặp lại quá trình xử lý mẫu cũng được khảo sát

và đánh giá Cùng một mẫu được cân khối lượng gần giống nhau, xử lý cùng một điều kiện Mỗi mẫu sau xử lý được bơm 3 lần để thu được hàm lượng trung bình Các giá trị trung bình đó được sử dụng để đánh giá độ lặp của phương pháp xử lý mẫu Giá trị % RSD cũng được dùng làm giá trị đánh giá độ lặp của phương pháp

Ngoài độ lặp thì độ đúng là một yếu tố để đánh giá phương pháp phân tích Sau khi thu được kết quả thực tế khi phân tích các este phtalat trên đối tượng đã chọn với hệ máy đã được tối ưu, mẫu được đem phân tích lại trên hệ máy mạnh hơn GC-MS theo tiêu chuẩn CPSC-CH-C1001-09.3 [21] của tổ chức CPSC Mỹ (United States Consumer Product Safety Commissions) Các điều kiện khảo sát theo tiêu chuẩn đã được kiểm tra lại và phương pháp đã được đánh giá kết quả thu được có

độ tin cậy cao So sánh kết quả thu được sau khi phân tích trên hai hệ máy, và cho

ra giá trị độ đúng của phương pháp

2.5.3 Phương pháp đối chiếu

Mẫu thực sau khi được phân tích trên hệ HPLC, detector PDA thu được các giá trị hàm lượng của các phtalat, sau đó các kết quả này được so sánh với kết quả thu được khi phân tích trên hệ GC-MS theo tiêu chuẩn CPSC-CH-C1001-09.3 Hệ thiết bị sắc ký khí khối phổ (GC/MS) của hãng Thermo với mã hiệu DSQ II với bộ bơm mẫu tự động, cổng bơm chia dòng/không chia dòng, lò GC có thể lập trình, và

có khả năng kiểm soát ion chọn lọc, cột tách DB-5MS, 30m, 0,25 mm ID, 1,0 µm, các điều kiện cho quá trình chạy GC được thể hiện trong bảng 2.3

Bảng 2.3: Điều kiện chạy GC – MS phân tích phtalat

Điều kiện cho GC

Tốc độ (oC/phút) Nhiệt độ

Thời gian duy trì nhiệt (phút)

Điều kiện cho MS

Trì hoãn dung môi: 6 phút

Phương pháp xử lý mẫu như sau: mẫu được cân với khối lượng chính xác khoảng 0,2gam mẫu vào ống thủy tinh, sau đó thêm 5mL n-hexan vào đó, lắc đều, rung siêu âm 30 phút Ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút, thu dịch lọc sang một ống sạch khác Trước khi bơm vào cột dung dịch được chảy qua màng lọc 0,45 µm

Kết quả thu được, được so sánh với kết quả thu được khi phân tích trên hệ HPLC Sử dụng chuẩn Student để đánh giá sự khác nhau có ý nghĩa giữa hai kết quả thu được

CHƯƠNG III:

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc ký

3.1.1 Van bơm mẫu

Trên thực tế một trong những khó khăn của phép tách sắc ký là: sự doãng chân pic dẫn đến hiện tượng chồng pic, trong đó thể tích bơm mẫu vào cột cũng là một nguyên nhân gây ra hiện tượng này; nếu vòng mẫu quá dài, lượng mẫu bơm vào cột quá lớn sẽ dẫn đến hiện tượng doãng pic càng lớn, các pic càng chèn lên nhau trong khi tách Đó là do lượng mẫu quá lớn sẽ dẫn đến hiện tượng một phần mẫu vào cột tách trước, một phần ra sau dẫn đến trong quá trình tách trên cột sẽ có một phần chất phân tích ra trước và một phần ra sau gây ra hiện tượng doãng chân pic Nếu thể tích bơm mẫu là quá nhỏ thì sai số cũng sẽ rất lớn, ví dụ nếu sai số của van bơm mẫu là 0,05l, khi bơm thể tích mẫu là 1l thì sai số sẽ là 5%, còn nếu thể tích mẫu bơm là 50l thì sai số là 0,1%

Ngày nay, van bơm mẫu 6 chiều rất phổ biến, do đó, chúng tôi lựa chọn loại van này và thể tích mẫu bơm là 50L

3.1.2 Cột tách

Cột tách có vai trò rất quan trọng trong một phép tách sắc ký, nó quyết định hiệu quả tách của quá trình Để chọn được một pha tĩnh hay một cột tách phù hợp nhất ta phải dựa trên những đặc điểm như: độ phân cực của chất phân tích, chất phân tích được pha trong môi trường như thế nào, có pH ra sao thì mới quyết định chọn pha tĩnh phù hợp Chất phân tích được chọn là các este phtalat, không tan trong nước, được pha trong MeOH, ACN ,chất phân tích kém phân cực nên phải sử dụng pha tĩnh có bản chất kém phân cực giống như chất phân tích Vì vậy, cột pha đảo RP-HPLC là lựa chọn tối ưu nhất Trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi

đã sử dụng cột tách Cadenza CD-C 18 (250 mm × 4,6 mm × 3 μm) để tách các phtalat và định lượng chúng Nhiệt độ cột 250C

3.1.3 Detector

Detector là một bộ phận có vai trò theo dõi, phát hiện các chất tan trong pha động từ cột sắc ký chảy ra một cách liên tục, nó là một bộ phận thu nhận và phát hiện các chất hay hợp chất dựa theo một tính chất nào đó của chất phân tích Trên thực tế, hầu hết các chất nghiên cứu đều hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại UV – VIS, vì vậy detector UV – VIS thường được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu Hiện nay mảng diot–photo–array phát triển, chúng có vai trò như một deetector

UV – VIS, nhưng chúng có khả năng theo dõi chất ở nhiều bước sóng khác nhau ở cùng một thời điểm, và độ nhạy của nó cao hơn detector UV-VIS Tuy nhiên, dựa vào điều kiện phòng thí nghiệm và mục tiêu của nghiên cứu, chúng tôi quyết định chọn detector PDA để phát hiện các chất phân tích

3.1.4 Bước sóng hấp thụ cực đại của các este phtalat

Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn nghiên cứu định lượng 08 phtalat Chúng có cấu tạo rất giống nhau Chỉ khác nhau 2 nhóm R và R’ được thay bằng các gốc rượu khác nhau, vì vậy bước sóng hấp thụ quang của các phtalat này đều giống nhau, ở 225 nm Dải phổ hấp thụ của các phtalat này được quét trên detector PDA từ 190 nm đến 300 nm, bước sóng 225 nm là đỉnh hấp thụ cực đại của các phtalat Hình 3.1 cho thấy dạng phổ UV của các phtalat

0 250

500

mAU 3.91/ 1.00

3.1.5 Khảo sát và chọn thành phần pha động phù hợp

Thành phần pha động ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả tách chất Pha động có

thể ảnh hưởng tới những vấn đề sau của sự tách sắc ký của các chất:

Pha động trong sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng tách có độ phân cực nhỏ

và trung bình thường chủ yếu là nước, có trộn với một số dung môi hữu cơ để thu được dung dịch có độ phân cực từ thấp tới cao, phù hợp với quá trình tách

Các chất phân tích là các chất kém phân cực, pha tĩnh được chọn cũng là cột pha ngược, kém phân cực, vậy pha động dùng để tách phải có độ phân cực vừa phải thì các chất mới có thể tách các phtalat

Chúng tôi đã nghiên cứu, thử nghiệm các hệ dung môi sau:

 Hệ dung môi 1: MeOH-H2O

 Hệ dung môi 2: ACN-H2O

 Hệ dung môi 3: ACN-dung dịch đệm trietylamin 0,04% được chỉnh pH 2,8 bằng dung dịch H3PO4 1M

3.1.5.1 Dung môi pha động là MeOH-H 2 O

Đối với hệ dung môi này có rất nhiều chất bị trùng pic, gần như bị chập hoàn toàn và đường nền xấu Chúng tôi đã thử một số chế độ gradient thành phần pha động để thay đổi khả năng tách, tuy nhiên sự tách vẫn chưa được cải thiện Định tính các phtalat bằng cách bơm 1 chất, sau đó thêm vào dung dịch 1 chất khác nữa

để xác định thời gian lưu của chất được thêm dưạ trên thời gian lưu đã biết của chất trước Cứ như vậy khi thêm hết 08 phtalat và xác định được thời gian lưu của 08

phtalat khi sử dụng hệ dung môi này Căn cứ theo tài liệu [15] ta có chỉ số độ phân cực của nước là 10,2 đơn vị, còn của MeOH là 5,1 đơn vị, từ đó ta tính được độ phân cực của hệ dung môi đã chọn ứng với từng thời điểm trong quá trình chạy Công thức tính độ phân cực như sau:

% 100

Bảng 3.1: Gradient định tính các phtalat với hệ MeOH-nước

Thời gian ( phút) % MeOH Độ phân cực (PI)

Thời gian lưu của các cấu tử ứng với chế độ gradient ở trên thể hiện trong bảng 3.2

Bảng 3.2: Thời gian lưu của các cấu tử:

Các phtalat Thời gian lưu (phút) Nhận xét

DNOP 19,4

Với thời gian lưu và thứ tự ra khỏi cột của các phtalat kể trên, chúng tôi thử nghiệm thêm một vài chế độ gradient khác, xem xét cải thiện khả năng tách Các gradient đã thử nghiệm với hệ dung môi MeOH-Nước được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3: Các gradient thử nghiệm với pha động MeOH-Nước

% MeOH

3.1.5.2 Dung môi pha động là ACN-H 2 O

Với hệ dung môi này, chúng tôi cũng xác định thời gian lưu của từng cấu tử, bằng cách bơm từng cấu tử vào hệ để xác định thời gian lưu ứng với từng chất

Thứ tự ra khỏi cột của 08 phtalat khảo sát là:

Bảng 3.4: Chế độ chạy với pha động ACN- nước

Gradient 1

PI (đ.vị)

Gradient 2

PI (đ.vị)

Gradient 3

PI (đ.vị)

T

(phút)

% ACN

T (phút)

% ACN

T (phút)

% ACN 0,01 65 7,34 0,01 65 7,34 0,01 65 7,34

Bảng 3.5: Độ phân giải, thời gian lưu ứng với các gradient

Độ phân giải R Gradient 1 Gradient 2 Gradient 3

BBP 0,140 12,88 0,220 14,61 0,123 14,44 DBP 1,428 13,53 1,528 15,35 1,482 15,26 DPP 0.963 15,40 0,260 18,32 0,690 17,66 DCHP 1,581 16,08 1,608 19,27 1,553 18,33 DHP 3,531 17,83 5,008 22,34 1,162 20,33

Hình 3.2: Sắc ký đồ thể hiện 3 gradient đã khảo sát

Nhận thấy khi sử dụng dung môi ACN-nước, đường nền rất xấu, pic của DBP, DNOP, BBP có xu hướng bị kéo đuôi pic, khả năng tách kém Tác giả Hyun Jung Koo [17] đã thêm trietylamin vào trong pha động và điều chỉnh pH pha động bằng dung dịch axit photphoric 1 mol/l tới pH 2,8 Các amin thường được thêm vào dung dịch pha động trong các trường hợp pic bị kéo đuôi Nguyên nhân của hiện tượng này là do trên bề mặt cột vẫn còn nhiều nhóm silanol –OH chưa bị silan hóa Khi có mặt các tạp chất kim loại, nhất là các kim loại nặng, chúng sẽ liên kết và tạo những phức phối trí trên bề mặt cột, làm hoạt hóa các nhóm silanol trên bề mặt cột

Do đó khi có chất phân tích đi qua cột, các nhóm hoạt hóa này làm cho các chất không được rửa giải một cách dễ dàng và gây ra hiện tượng kéo đuôi pic[9] Vì vậy, chúng tôi cũng thêm một lượng trietylamin vào pha động, điều chỉnh pH của pha động tới giá trị 2,8 bằng axit photphoric 1M Nồng độ của trietylamin và pH pha động cũng được khảo sát

3.1.5.3 Dung môi pha động là ACN-trietylamin