nghiên cứu điều kiện phân tích thuốc kháng sinh họ p - lactam trong các mẫu sinh học và dược phẩm

Tách và xác định đồng thời kháng sinh β - Lactam bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng detector huỳnh quang trong mẫu sinh học và dược phẩm là một hướng nghiên cứu mới,

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 Tổng quan 2

1.1 Giới thiệu chung về chất kháng sinh 2

1.1.1 Lịch sử ra đời 2

1.1.2 Phân loại 2

1.1.3 Đánh giá tác dụng 2

1.2 Kháng sinh β – Lactam 3

1.2.1 Định nghĩa 3

1.2.2 Cấu trúc và phân loại 3

1.2.3 Tính chất vật lý và hóa học 7

1.2.4 Tác dụng 7

1.2.5 Điều chế 8

1.2.6 Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay 9

1.3 Các phương pháp định lượng β – Lactam 11

1.3.1 Các phương pháp quang học 11

1.3.2 Các phương pháp điện hóa 12

1.3.3 Các phương pháp điện di mao quản 12

1.3.4 Sắc kí bản mỏng 13

1.3.5 Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) 14

Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 17

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 17

2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 17

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu – Phương pháp RP- HPLC 18

2.2.1 Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC 18

2.2.2 Sắc ký hấp phụ pha ngược RP-HPLC 20

2.2.3 Detector huỳnh quang 22

2.2.4 Một số đại lượng đặc trưng của HPLC 23

2.2.5 Phân tích định lượng bằng HPLC 25

2.3 Kỹ thuật dẫn xuất hóa các β- Lactam với thuốc thử NBD-F 26

2.4 Dụng cụ và hóa chất 28

2.4.1 Máy móc và dụng cụ 28

2.4.2 Hóa chất 28

Chương 3: Kết quả và thảo luận 30

3.1 Khảo sát các điều kiện tạo dẫn xuất giữa β- Lactam và thuốc thử NBD-F 30

3.1.1 Khảo sát nhiệt độ phản ứng dẫn xuất hóa 30

3.1.2 Khảo sát thời gian phản ứng dẫn xuất hóa 33

3.2 Khảo sát các điều kiện chạy sắc ký 36

3.2.1 Chọn thể tích vòng mẫu (sample loop) 36

3.2.2 Chọn bước sóng của detector 37

3.3 Chọn pha tĩnh 37

3.4 Chọn pha động 38

3.4.1 pH dung dịch đệm 38

3.4.2 Tỉ lệ thành phần pha động 40

3.4.3 Nồng độ đệm acetat của pha động 44

3.4.4 Tốc độ pha động 47

3.5 Đánh giá phương pháp phân tích 50

3.5.1.Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 50

3.5.2.Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 54

3.5.3 Độ đú ng của phép đo 55

3.5.4 Độ lặp lại của phép đo 57

3.6 Phân tích mẫu thực 58

3.6.2 Phân tích mẫu sinh học 63

3.7 Kết quả một số phương pháp khác xác định kháng sinh cùng loại 68

3.8 Hướng phát triển của đề tài 70

KẾT LUẬN 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

PHỤ LỤC 79

DANH MỤC BẢNG

4 Bảng 3.1 Sự phụ thuộc của Spíc vào nhiệt độ phản ứng 32

5 Bảng 3.2 Sự phụ thuộc của Spíc vào thời gian phản ứng 35

6 Bảng 3.3 Sự phụ thuộc của thời gian lưu của các chất vào pH

8 Bảng 3.5 Sự phụ thuộc của thời gian lưu vào tỉ lệ giữa dung môi

9 Bảng 3.6 Sự phụ thuộc của thời gian lưu vào tỉ lệ giữa ACN và

10 Bảng 3.7 Sự phụ thuộc của k’ vào tỉ lệ giữa ACN và MeOH 43

11 Bảng 3.8 Thời gian lưu của chất phụ thuộc vào nồng độ đệm 44

12 Bảng 3.9 Diện tích píc chất phân tích tại nồng độ đệm khác nhau 45

13 Bảng 3.10 Thời gian lưu của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc

14 Bảng 3.11 Diện tích pic của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc

15 Bảng 3.12 Sự phụ thuộc của Spic vào nồng độ chất phân tích 51

16 Bảng 3.13 Các giá trị Ftính, Fbảng và phương trình đường chuẩn của

17 Bảng 3.14 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các chất

19 Bảng 3.16 Độ đú ng của phép đo tại nồng độ các chất 0,40ppm 56

20 Bảng 3.17 Độ đú ng của phép đo tại nồng độ các chất 0,80ppm 57

21 Bảng 3.18 Khảo sát độ lặp lại của phép đo theo diện tích pic 58

23 Bảng 3.20 Kết quả độ thu hồi xác định β-Lactam theo phương pháp

24 Bảng 3.21 Kết quả tính nồng độ Cx và sự sai khác hàm lượng so

MỞ ĐẦU

Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con người ngày càng được quan tâm, đặc biệt là các sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏe con người

Trong y học hiện đại, các β - Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh con người, thú y từ khi chúng được giới thiệu vào thị trường vào năm

1938 và là loại kháng sinh được dùng nhiều nhất hiện nay Nhờ các thuốc kháng sinh mà y học có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy hiểm như dịch hạch, tả, thương hàn, và điều trị hiệu quả nhiều bệnh gây ra bởi vi khuẩn Nhưng, nếu liều lượng và cách dùng kháng sinh không đúng sẽ dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa trị càng khó khăn Ngoài ra, còn gây lãng phí cho người bệnh

vì có những bệnh do vi rút không chữa được bằng kháng sinh nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đoán các bệnh và ảnh hưởng tới sức khỏe người bệnh Đối với những người cao tuổi , lươ ̣ng dư kháng sinh trong nư ớc tiểu nhiều, còn gây ra các bệnh về thận Đồng thời, lươ ̣ng dư này thải ra môi trường sẽ gây lên những hâ ̣u quả vô cùng nghiêm tro ̣ng Vì vậy, kiểm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng

Có rất nhiều phương pháp tách khác nhau Trong đó, phương pháp tách sắc

ký là phương pháp tách chọn lọc có độ nhạy cao, lượng mẫu bơm ít, thời gian phân tích ngắn

Tách và xác định đồng thời kháng sinh β - Lactam bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng detector huỳnh quang trong mẫu sinh học và dược phẩm là một hướng nghiên cứu mới, với những ưu điểm của nó ngày càng được áp dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm và phân tích mẫu dịch vụ Trên cơ

sở đó, chúng tôi chọn đề tài là: “Nghiên cứu điều kiện phân tích thuốc kháng

sinh họ β - Lactam trong các mẫu sinh học và dƣợc phẩm ”

biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin

Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA)

Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên [1]

1.1.2 Cấu trúc và phân loại

O

COR

COOM

2 3 4 1

5 6

7

Hình 1.1 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin

Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là: (2S,5R,6R 3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid

Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S, 5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác nhau Với M là gốc cation thường là: K, Na, H

Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau [1]

Bảng 1.1 Phân loại và cấu trúc một số penicillin

6-[(5-methyl-3-phenyl-1,2-oxazole-4-carbonyl)amino]

Là các Penicillin bán tổng hợp Phổ hẹp như nhóm I Kháng

penicilliiase, không tác động vào vòng β – Lactam được

CH- phenylacetyl]amino)

6-([(2R)-2-amino-2-Phổ rộng, tác dụng cả khuẩn gram (+) và (-) Không kháng β-

lactamase và penicilliiase

6-{[(2R)-2-amino-2-(4-* Các cephalosporin

Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R Khác nhau bởi các gốc R

N H

O

CO R1

N

S

R3 R2

COOM

1 2 3 4 5

6 7

8

Hình 1.2 Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin

Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R)

1.1.3 Tính chất vật lý và hoá học

Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong

nước, dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi hữu cơ phân cực vừa phải Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa đồng thời nhóm –COOH và –NH2

Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp thụ)

Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa= 2,5-2,8 tùy vào cấu trúc phân tử Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân

là vi khuẩn bị tiêu diệt

Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của màng tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ rộng [13]

Kháng thuốc:

Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là enzim có tác dụng mở vòng β-lactam, theo phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng Tất cả các cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi

là kháng methicillin) [13]

Độc tính:

Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc phản vệ [13]

Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và bà mẹ trong thời kỳ cho con bú Chống chỉ định dị ứng với thành phần của thuốc

Là phương pháp chủ yếu nuôi cấy chủng nấm Penicillium nonatum hoặc

Penicillium chrysogennum trong môi trường và điều kiện thích hợp Chiết xuất dạng

kết tinh và muối natri hoặc kali Để cho hiệu suất cao thường gây đột biến bằng mù tạt, tia X hoặc tia UV, rồi chọn lọc lấy chủng nấm tốt theo ý muốn, đồng thời thêm vào môi trường nuôi cấy các tiền chất thích hợp để định hướng cho quá trình sinh tổng hợp Ví dụ khi sản xuất penicillin G, tiền chất thêm vào là acid phenylacetic Tuy nhiên không phải tiền chất nào cũng định hướng được quá trình lên men Trong môi trường nuôi cấy có tạo ra các acid amin → peptid → polypeptide Penicillin tạo thành từ một tripeptid, sau đó acyl hoá bởi men

Tổng hợp hoá học:

Chưa được ứng dụng rộng rãi

1.1.6 Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay

Ta biết rằng, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ chế khác nhau đối với các vi trùng khác nhau Kháng sinh chỉ có tác dụng với các bệnh

do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus) Để điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp Vì thiếu hiểu biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế giới, nhất là ở các nước đang phát triển, người ta đã dùng kháng sinh quá nhiều, cả khi không cần thiết, không đúng chỉ định và không đúng cách Từ đó, làm cho các vi khuẩn dần dần kháng thuốc, việc chữa trị bệnh ngày càng khó khăn và sự ô nhiễm môi trường

do kháng sinh gây ra càng trầm trọng hơn [42]

Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết.Theo R Gonzales [4,46], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp trên trong khi 60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không cần

và không điều trị được bằng kháng sinh Dùng cephalosporins bừa bãi khiến enterococus trở nên đề kháng và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus kháng vancomycin Theo báo cáo của A.W McCormick [15] năm 2003, tỉ lệ pneumococus kháng penicillin tăng nhanh ở Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004,

41% pneumococcus sẽ đề kháng penicillin Tỉ lệ vi trùng lao kháng thuốc tăng cao khiến phải dùng 4 thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao

Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một địa phương nào vì với phương tiện giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến khắp nơi trên thế giới trong vòng 24 giờ Theo D.P Raymond [26], mỗi năm ở Hoa kỳ có 2 triệu người bị nhiễm trùng vì lây lan trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi trùng kháng thuốc, gây tử vong cho 70 ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5 đến 10 tỉ đô-la

Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J Chalker [9], năm

1997 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh, 71% bệnh nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian dưới 5 ngày)

Theo [9], qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít trẻ em Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử vong Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan Phó giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60% tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng hoàn toàn Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9% Đối với vi khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là 42%

Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng kháng sinh từ nhiều chục năm nay Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các nhà chuyên môn đã thành lập “Liên Hiệp vì sự Sử Dụng Kháng Sinh Hợp Lý” (Alliance for the Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm chống lại sự lan tràn của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang phát triển

Năm 2001, Tổ chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế Hoạch Toàn Cầu để Kiểm

các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng cường khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác, đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngừa sự lưu hành của các thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đang phát triển là thuốc giả mạo, không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có hoạt chất

Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽ bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiệu của kháng sinh, hạn chế được chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng

1.2 Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam

1.2.1 Phương pháp quang học

Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-lactam, đặc biệt trong dược phẩm

Các β-lactam hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp phụ, chúng cũng tạo phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo Trong nhiều trường hợp, các β-lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích

Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các β-lactam với độ nhạy khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các β-lactam

A Fernández-González và cộng sự [17] dùng Cu2+ thủy phân và tạo phức với AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện thu được 4.10-7

M (0,16 mg/l) Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy cho hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống, huyết thanh…

Theo [30], F Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống

bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử Phương pháp cải tiến sự thủy phân của kháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl2, KCl 2M Kết quả tạo ra

phức màu vàng được đo tại bước sóng 335 nm Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l và giới hạn phát hiện của AMO là 0,73 mg/l, AMP 0,76 mg/l

Wei Liu và cộng sự [49], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ luminol- K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân tích một số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP) trong sữa đa ̣t giới ha ̣n phát hiê ̣n thấp : PEN là 0,5 mg/l, cefradine 0,04 mg/l, cefadroxil là 0,08 mg/l; 0,1 mg/l CEP Kết quả được kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS, nồng độ CEP trong mẫu là 0,1 mg/l

Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích, việc xác định sẽ kém chính xác Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này

1.2.2 Phương pháp điện hóa

Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam nhưng không phổ biến nhiều Theo [26], Daniela P Santos và cộng sự sử dụng sensor điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0,92 μM (0,39 mg/l) trong môi trường đệm axetat 0,1M, pH= 5,2

1.2.3 Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)

Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau

L Nozal, L Arce1,A.R´ıos, M Valcárcel [37] sử dụng phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm điện

di gồm 40 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8,5 Tiến hành phân tích tại thế điện di

10 kV, nhiệt độ 200C, thời gian bơm mẫu 10s Phương pháp cho phép tách 6 kháng sinh gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân tích

mg/l, độ lệch chuẩn tương đối cho thời gian lưu từ 0,25 đến 0,86%, diện tích pic 1,3 đến 4,15%; độ thu hồi trên 96%

Biyang Deng và cộng sự [19] đã sử dụng phương pháp điện di với detector điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp 0,31 μg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95,77%, độ lệch chuẩn tương đối không lớn hơn 2,2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/ mẫu

Attila Gaspar và cộng sự [16] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh

họ cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis – CZE) Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6,8 Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện

14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon, cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim, ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0,42 – 1,62 mg/l Trong đó CEP và CEF có giới hạn phát hiện tương ứng 1,62 và 0,89 mg/l; khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l Mục đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họ Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25, +4 và -180C) Kết quả cho thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ phòng sau khi pha loãng

M.I.Bailon-Perez và cộng sự [38] sử dụng phương pháp CZE và detector UV – DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH =8 và 20% (v/v) ethanol, dùng kĩ thuật chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng thời AMP, AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền mẫu nước (nước sông, nước thải…) Giới hạn phát hiện tương ứng 0,8; 0,8; 0,25; 0,30; 0,30; 0,9; 0,08 μg/l cùng độ thu hồi đạt 94 – 99 % với độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 10%

1.2.4 Sắc ký bản mỏng ( TLC)

Phương pháp này đơn giản và không yêu cầu thiết bị đặc biệt dùng để kiểm tra đánh giá sơ bộ các chất phân tích có tính ưu việt, tiến hành nhiều mẫu cùng một lúc song song rất tiện lợi Khi TLC được trang bị phần phát hiện là một máy đo

quang có thể phân tích định tính và định lượng Tuy nhiên phương pháp này chỉ dùng để định tính

1.2.5 Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC)

Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất

là lĩnh vực hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu, hoá học hợp chất thiên nhiên, phân tích môi trường,… đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các chất

Một số các kết quả nghiên cứu về kháng sinh -lactam bằng phương pháp HPLC

Theo [50], Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân tích penicillin V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa Điều kiện chạy sắc ký: cột Inertsil ODS2 (4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN – (C2H5)3N 0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong sữa 2-10 μg/kg, trong thịt 25-100 μg/kg

J.M Cha và cộng sự [32] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích lactam trong nước sông và nước thải Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C18 (2,1 mm×50 mm, 2,5 μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C = Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phút A/B/C=50:40:10, 20 phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0,25 ml/phút; nhiệt độ cột

β-450C; thời gian 20 phút Áp dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin

có giới hạn phát hiện của phương pháp là 8 – 10 ng/l với nước bề mặt, 13 – 18 ng/l với nước thải trước xử lý, 8 – 15 ng/l với nước thải sau xử lý

Một detector quan trọng trong phương pháp HPLC là detector huỳnh quang, với ưu điểm tăng độ nhạy, độ chọn lọc cao Như trong [19] C.Y.W Yang và cộng sự dùng cột Spherisorb ODS2 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) phân tích AMO trong sữa bò (pha động: ACN/đệm photphat 10mM pH 5,6 – 24/76; detector huỳnh quang: 346

nm – 422 nm) đạt giới hạn phát hiện lần lượt 0,5 μg/kg và 0,3 μg/kg Tuy vậy, do các β-lactam ít tạo phức phát huỳnh quang và cơ chế phát quang dựa trên phản ứng

quang hóa [17, 25] nên chỉ áp dụng với số ít chất hoặc phân tích riêng từng chất chứ không áp dụng phân tích đồng thời nhiều kháng sinh cùng lúc được

Trong [33, 34], Boison J.O và cộng sự sử dụng cột Spherisorb ODS2 (250mm*4,6mm, 5μm); pha động : ACN –Na2S2O3 15,7mM trong đệm photphat 0,1M pH 6,5; tốc độ pha động 1ml/phút, detector UV 325nm, phân tích đồng thời AMO, AMP, PEN, CLO trong sữa và thịt bò đạt giới hạn phát hiện 2-5g/kg

Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ dẫn… để phân tích các β-lactam

Trong [24], D.Hurtaud và cộng sự sử dụng etylaxetat để chiết tách CLO, OXA, dicloxacillin từ thịt bò đạt hiệu suất thu hồi tương ứng 88%, 94%, 91% Còn trong [46], WJ Blanchflower và cộng sự dung diclometan và hexan để tách penicillin V, PEN, oxacillin, CLO, dicloxacillin trong thận, thịt và sữa, hiệu suất đạt 89-117%

Khi tách và làm giàu các β - Lactam trong mẫu phân tích bằng kỹ thuật SPE thì thường dùng theo hai phương pháp chiết pha đảo (thường là C18) và trao đổi ion dựa trên đặc tính kém phân cực và chứa đồng thời nhóm axit, amin hữu cơ

K Takeba và cộng sự sử dụng cột chiết pha rắn pha đảo C18 và dung môi rửa giải là MeOH để tách PEN, AMP, CLO, dicloxacillin, nafcillin từ sữa đạt hiệu suất thu hồi 83-89%

Còn trong [32] sử dụng cột Oasis HLB (60mg, 3ml) để tách và làm giàu AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin trong mẫu nước môi trường đạt hiệu suất thu hồi 77,1 - 95,9%

Trong [28] sử dụng cột Osis MAX (500mg, 6ml, trao đổi anion) để tách AMO, AMP, PEN, penicillin V, oxacillin CLO, nafcillin và dicloxacillintrong nước thải cho hiệu suất thu hồi 76-100%

Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương pháp đều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu

và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ Do đó việc kết hợp phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao và kỹ thuật chiết pha rắn là phương pháp nghiên cứu đạt độ tối ưu cao trong việc phân tích β – Lactam do có độ nhạy, độ chính xác và độ lặp lại cao

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

Hiện nay, các chỉ tiêu về chất lượng, dư lượng các chất độc hại là một vấn đề cấp thiết đang được quan tâm Trong đó, chỉ tiêu về dư lượng kháng sinh trong mẫu thuốc và mẫu sinh học là một mảng đề tài rất thực tế và quan trọng Như chúng tôi

đã đề cập trong bản luận văn này, vấn đề lạm dụng không đúng hàm lượng kháng sinh đem lại rất nhiều tác hại và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người

Trong đề tài này, chất phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu là ampicillin (AMP), cephalexin (CEP), cefaclor (CEF) là các kháng sinh β - Lactam được sử dụng phổ biến hiện nay

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Tập trung vào nghiên cứu các vấn đề sau:

1 Tối ưu hóa các điều kiện để điều chế dẫn xuất giữa các chất phân tích và thuốc thử 7-Fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F)

- Chọn nhiệt độ của phản ứng dẫn xuất hóa

- Chọn thời gian của phản ứng dẫn xuất hóa

2 Tối ưu hóa điều kiện tách bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo sử dụng detector huỳnh quang (RP-HPLC)

- Chọn bước sóng của detector

- Chọn pha tĩnh

- Tối ưu hoá pha động: pH, thành phần, tốc độ và các điều kiện khác,…

3 Điều kiện định lượng

- Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- Độ đúng và độ lặp lại của phép đo

4 Phân tích mẫu thực, đánh giá khả năng áp dụng của phương pháp

- Phân tích mẫu dược phẩm (mẫu thuốc)

- Phân tích mẫu sinh học (mẫu nước tiểu và mẫu máu)

- So sánh với một số phương pháp khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu – Phương pháp RP-HPLC

2.2.1 Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC

Sắc ký lỏng là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình vừa có tính chất hoá học lại vừa có tính chất lý học Nó là những cân bằng động xảy

ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động, là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan (hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng lớp qua chất nhồi cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách Trong quá trình đó chất tan luôn luôn được phân bố lại giữa hai pha, trong khi pha động chảy liên tục qua cột tách với một tốc

độ và thành phần pha động nhất định, hay gradient Nghĩa là đối với một phân tử chất tan, thì trong quá trình sắc ký, nó luôn chuyển từ pha này sang pha kia nhiều lần từ đầu cột đến cuối cột sắc ký Mặt khác cũng vì cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử chất tan là khác nhau nên tốc độ di chuyển trung bình của mỗi chất tan là khác nhau Quá trình sắc ký có thể xảy theo 3 cơ chế sau:

- Tương tác hấp phụ

- Tương tác trao đổi ion

- Tương tác theo cơ chế rây phân tử

Tương tác với 3 cơ chế trên có 3 phương pháp tiến hành tách khác nhau:

- Sắc ký hấp phụ (chất hấp phụ pha thường NP-HPLC) và hấp phụ pha ngược RP-HPLC)

- Sắc ký trao đổi ion (EX-HPLC)

- Sắc ký rây phân tử (Gel-HPLC)

Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được tóm tắt như sau:

Hình 2.1 Sơ đồ chức năng của thiết bị HPLC

1 Bộ phận cấp dung môi (pha động) 2 Bơm cao áp

7 Bơm mẫu tự động 8 Phần điều khiển, xử lý kết quả

Trong RP-HPLC thì pha tĩnh là vật liệu kém phân cực, thông thường chất mang trong pha tĩnh là các loại silica trung tính đã được thế hoá bề mặt bằng các loại hợp chất kém phân cực như C18 , C8, Pha tĩnh này thường dùng để tách các hợp chất hữu cơ có độ phân cực khác nhau Khi tiến hành chạy sắc ký trên bề mặt pha tĩnh xảy ra các cân bằng động như sau:

Sr + Xi ↔ SrXi (Quá trình hấp phụ)

SrXi + M ↔ MXi + Sr (Quá trình giải hấp)

Trong đó: Sr là pha tĩnh

Xi là chất phân tích

SrXi chất phân tích hấp phụ trên pha tĩnh

M là pha động

MXi chất phân tích trên pha động

Ngoài bản chất của nền pha tĩnh, kích thước hạt nhồi và chiều dài cột tách cũng ảnh hưởng rất lớn đến khả năng phân tách các chất Do vậy, trong điều kiện phân tích thực tế chúng ta phải nghiên cứu, khảo sát chọn pha tĩnh có cỡ hạt, chiều dài cột tách như thế nào để đạt được độ phân giải theo yêu cầu phân tích Thông thường đối với một hỗn hợp chất phân tích nhất định, yếu tố quyết định đến hiệu quả tách ở đây

là các điều kiện về bản chất của pha tĩnh và thành phần pha động trong hệ HPLC Sắc ký hấp phụ pha ngược (RP-HPLC) là phương pháp được dùng phổ biến nhất trong quá trình tách phân tích và điều chế các hợp chất đang được quan tâm trong các đối tượng sinh học, hoá học, dược học và y học Hệ RP-HPLC có các ưu điểm nổi trội sau:

1 Có độ linh động và độ chọn lọc cao

2 Có khả năng cân bằng cột nhanh, cột có hiệu lực cao, các pic cân đối

3 Pha động là nước hay hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thân thiện với môi trường

Nói chung, hệ RP-HPLC có độ linh hoạt và độ chọn lọc cao, dung môi làm pha động có thể là dung môi hữu cơ hoà tan tốt trong nước như methanol, acetonitril, hay có thêm những dung dịch đệm pH được trộn với nhau theo tỷ lệ nhất định Trong nhiều trường hợp nước là thành phần chính của pha động

Pha động có độ phân cực gần giống với độ phân cực của chất phân tích thì thời gian lưu của chất càng ngắn Chính vì điều này mà cần phải lựa chọn pha động sao cho phù hợp Các yếu tố cần được quan tâm và lựa chọn cho mỗi hệ pha đó là:

1 Bản chất pha động

- Thành phần của chất tạo ra pha động

- Loại dung môi sử dụng

- pH của pha động

2 Tốc độ pha động:

Khi pha động đã có một thành phần phù hợp mà tốc độ rửa giải không phù hợp thì cũng chưa có kết quả tách sắc ký hoàn toàn tốt Khi tốc độ pha động tăng, thời gian lưu của chất giảm, đồng thời diện tích píc cũng giảm Do đó cần tiến hành lựa chọn tốc độ pha động cho phù hợp để vừa tách hoàn toàn các chất, vừa đỡ tốn dung môi mà vẫn đảm bảo tăng độ nhạy của phép phân tích

2.2.3 Detector huỳnh quang

Một số chất phân tích hay sản phẩm của chất phân tích với một chất khác (phản ứng có tính định lượng) có tính chất huỳnh quang thì xác định bằng detector huỳnh quang

Nguyên nhân sinh ra phổ huỳnh quang phân tử là do các điện tử hóa trị tự do của nguyên tử hay điện tử hóa trị nằm trong liên kết hóa học (, liên hợp - ) của phân tử bị thay đổi mức năng lượng, chúng nhận năng lượng và ở mức năng lượng cao, trạng thái này không bền, nó bị suy biến và sau đó phát ra bức xạ Như vậy, quá trình sinh ra phổ huỳnh quang là tổ hợp của hai quá trình hấp thụ bức xạ của phân tử và quá trình phát xạ huỳnh quang của nó Mặc dù tín hiệu huỳnh quang

là phát ra mọi hướng, nhưng chỉ có chùm tia phát xạ huỳnh quang nằm vuông góc với chùm tia sáng kích thích là chùm phát xạ huỳnh quang có cường độ lớn và có ý nghĩa Chùm phát xạ huỳnh quang này đặc trưng cho mỗi loại phân tử

Nguyên tắc của detector huỳnh quang: dựa trên nguyên nhân sinh ra phổ

huỳnh quang Chiếu một chùm tia sáng kích thích có bước sóng xác định (1) phù hợp vào cuvet chứa mẫu phân tích, để chất phân tích phát ra chùm tia phát xạ huỳnh

quang của nó (2) Sau đó nhờ hệ quang học thu, phân tách lấy tia phát xạ huỳnh quang thích hợp cần đo hướng vào nhân quang điện để đo chúng, khuyếch đại và biểu diễn chúng

Việc định lượng chất phân tích dựa trên sự phụ thuộc tuyến tính giữa cường

độ của tia phát xạ huỳnh quang của chất với nồng độ của chất đó trong mẫu

Iq= kCL Trong đó:

và độ chọn lọc cao

Hình 2.2 Sơ đồ cấu tạo của detector huỳnh quang

2.2.4 Một số đại lƣợng đặc trƣng của HPLC

- Thời gian lưu và hệ số tách k’

Khi được nạp vào cột sắc ký, các chất phân tích sẽ bị giữ lại trên cột trong một khoảng thời gian nhất định Thời gian đó tính từ lúc mẫu được nạp vào cột cho đến lúc chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở thời điểm có nồng độ cực đại Đó chính là

tRi = to + t’RiTrong đó: to là thời gian không lưu giữ của chất (thời gian chết)

t’Ri là thời gian lưu thực của chất trên cột tách

Ngoài ra người ta còn sử dụng hệ số lưu giữ k’ để đánh giá khả năng tách

t

k’ không phụ thuộc vào tốc độ dòng mà chỉ phụ thuộc vào thành phần pha động Nếu k’ lớn thì thời gian rửa giải lâu, k’ bé thì píc của chất tiến gần đến pic dung môi

do vậy các chất không tách được

- Số đĩa lý thuyết và khả năng phân giải của cột tách

Đối với một cột tách sắc ký thì đại lượng đặc trưng cho cột tách là số đĩa hiệu dụng của cột tách và khả năng phân giải của cột tách

t

Trong đó: Nef là số đĩa hiệu dụng của cột tách

tR(i) là thời gian lưu của chất cần phân tích i trên cột tách (giây)

to là thời gian không lưu giữ ( thời gian chết:giây)

Wi là độ rộng chân pic của cấu tử i (giây)

Độ phân giải của hai chất rửa giải có vị trí cạnh nhau trên sắc đồ

i i

i R i R

W W

t t

1

2

Trong đó: R(i +1, i) là độ phân giải của 2 pic cạnh nhau trong sắc đồ

t’R(i +1), t’R(i) lần lượt là thời gian lưu thực của cấu tử i +1 và i

Wi +1, Wi lần lượt là độ rộng chân píc của hai cấu tử i +1 và i

Hai đại lượng này có quan hệ chặt chẽ với nhau Nếu như số đĩa hiệu dụng càng lớn thì độ phân giải càng tốt Sự phụ thuộc này được mô tả bằng quan hệ toán học như sau:

i R

i R

t

t 

Trong điều kiện phân tích thực tế, chúng ta cần quan tâm tới độ phân giải của cột tách đối với một hỗn hợp chất phân tích cụ thể Cần phải nghiên cứu, khảo sát, chọn pha tĩnh về kích thước hạt nhồi, chiều dài cột tách như thế nào để đạt được độ phân giải theo yêu cầu đặt ra Thông thường đối với một hỗn hợp các chất phân tích nhất định thì yếu tố quyết định hiệu quả tách ở đây là các điều kiện và bản chất của pha tĩnh, thành phần pha động trong hệ HPLC

2.2.5 Phân tích định lƣợng bằng HPLC

Trong điều kiện phân tích cố định đã chọn, đại lượng đặc trưng cho một chất

là thời gian lưu tRi của chất đó trên cột tách Do đó, có thể phân tích định tính các chất trong mẫu chưa biết bằng HPLC thông qua thời gian lưu mẫu chất chuẩn đó

Để tiến hành phân tích định lượng, thông thường trong phương pháp HPLC người ta biểu diễn quan hệ nồng độ chất phụ thuộc vào chiều cao pic hoặc diện tích pic sắc

ký

H = k.Cb

S = k.CbTrong đó: H- chiều cao pic sắc ký của chất

S- diện tích pic sắc ký của chất

k- hằng số điều kiện thực nghiệm thực nghiệm

b- hằng số bản chất 0 < b ≤ 1

Ở vùng nồng độ nhỏ thì b = 1, mối quan hệ giữa H, S và C là quan hệ tuyến tính

H = k1.C = f(C)

S = k2 C = f(C ) Biểu diễn mối tương quan của diện tích pic vào nồng độ chất phân tích cho kết quả

dàng hơn đo diện tích pic Nên trong phân tích lượng nhỏ, người ta thường đo chiều cao pic Tuy nhiên khoảng tuyến tính sẽ nhỏ hơn

Trong luâ ̣n văn này, chúng tôi thiết lập quan hệ đo diện tích pic phụ thuộc vào nồng

độ chất phân tích, khảo sát khoảng tuyến tính sau đó tiến hành xác định nồng độ chất theo cả hai phương pháp đường chuẩn và thêm chuẩn

- Phương pháp đường chuẩn

Nguyên tắc của phương pháp này là: pha một dãy mẫu chuẩn của chất phân tích có nồng độ từ Co đến C5 và mẫu phân tích Cx …trong cùng một điều kiện phân tích Sau đó tiến hành chạy sắc ký để ghi sắc đồ của dãy mẫu chuẩn và mẫu phân tích Xác định chiều cao H hay diện tíc S của pic sắc ký trong tất cả các mẫu trên rồi tiến hành dựng đường chuẩn theo quan hệ H=f(C) hay S=f(C) Từ giá trị Hx hay Sxcủa mẫu phân tích, áp vào đường chuẩn chúng ta sẽ biết được nồng độ của chất trong mẫu phân tích

- Phương pháp thêm chuẩn

Nguyên tắc thực hiện cũng giống với phương pháp đường chuẩn, tuy nhiên chúng ta dùng ngay chính dung dịch mẫu phân tích làm nền để pha chế dãy mẫu chuẩn Từ đường chuẩn thực hiện phép ngoại suy tuyến tính, ta sẽ tìm được giá trị nồng độ Cx của chất phân tích trong mẫu đã được bơm vào cột tách

2.3 Kĩ thuật dẫn xuất hóa các β- Lactam với thuốc thử NBD-F

Như trên đã trình bày, detector huỳnh quang là một detector rất nhạy và có độ chọn lọc cao Chính vì lí do này, kĩ thuật HPLC với detector huỳnh quang đang ngày càng được sử dụng rộng rãi trong phân tích lượng vết, nhất là trong phân tích các mẫu sinh học Nhưng để sử dụng được kĩ thuật này, đòi hỏi chất phân tích hay sản phẩm của chất phân tích với một chất khác phải có khả năng phát huỳnh quang Trong thực tế, không có nhiều chất mà bản thân nó tự phát ra huỳnh quang Các thuốc kháng sinh - Lactam cũng là những chất không tự phát huỳnh quang Để sử dụng được kĩ thuật này, chúng ta phải dẫn xuất hóa nó với một chất khác

Theo [44], các tác nhân dẫn xuất hóa thường dùng là:

Trong bản luận văn này, chúng tôi chọn tác nhân dẫn xuất hóa (thuốc thử) là:

2.4 Dụng cụ và hoá chất

2.4.1 Máy móc và dụng cụ

Máy HPLC model LC-20AB của hãng Shimadzu bao gồm

- Bộ loại khí dung môi, Degasser–DGU-20A3

- Van trộn dung môi FCV-20AB

- Bơm dung môi 2 kênh LC-20AB

- Bộ ổn nhiệt cho cột tách CTO-20A

- Bơm mẫu tự động SIL-20A

- Detector huỳnh quang RF-10AXL

- Hệ điều khiển CBM-20Afile

- Phần mềm điều khiển và xử lý kết quả LC solution version 1.11

Máy đo pH

Catrige lọc với kích thước mao quản 0,45m ; bể siêu âm, tủ lạnh, máy điều nhiệt,

tủ sấy, máy ly tâm và các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác

Thuốc thử NBD-F được pha trong MeOH với nồng độ 1000ppm và pha loãng dần bằng MeOH đến nồng đô ̣ thấp hơn và được bảo quản trong tủ la ̣nh

2.5 Cách tiến hành phản ứng:

Điều chế dẫn xuất giư ̃a chất chuẩn β – lactam và thuốc thử NBD-F

Hút 20l dung dịch mỗi chất chuẩn nồng độ 100ppm và 60l NBD-F 100ppm Thực hiện phản ứng trong bình điều nhiệt ở một nhiệt độ và thời gian thích hợp Dung dịch thu được đem pha loãng bằng dung môi là thành phần pha động đến một nồng độ xác định, sau đó đem phân tích trên HPLC với detector huỳnh quang Đối với mẫu Blank, làm tương tự như mẫu phân tích, nhưng không cho chất phân tích

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát các điều kiện tạo dẫn xuất giữa β - Lactam và thuốc thử NBD-F 3.1.1 Khảo sát nhiệt độ phản ứng dẫn xuất hóa

Nhiệt độ dẫn xuất hóa là một yếu tố rất quan trọng Nhiệt độ thích hợp, chất phân tích phản ứng hoàn toàn với thuốc thử, làm cho kết quả của phép phân tích chính xác hơn Trong phản ứng của chất phân tích với thuốc thử NBD-F, tham khảo các tài liệu trong nước và trên thế giới, chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ từ

500C đến 800C Điều kiện chạy sắc ký là: bước sóng kích thích Ex = 470nm, bước sóng phát xạ Em = 530nm, thể tích vò ng mẫu V=20l, vận tốc pha động v= 1ml/phút Cột Supelcosil RP-C18, đệm acetat 10mM (pH=4,5), ACN/MeOH/ đệm

= 25/25/50, thu được các kết quả như sau:

5 10 15 20 25 30

35 mV

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

%

A.Press.(Status)

Detector A:Ex:470nm,Em:530nm

(b)500C

% A.Press.(Status) Detector A:Ex:470nm,Em:530nm

(c) 550C

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min 0

5 10 15 20 25 30 35 mV

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

% A.Press.(Status) Detector A:Ex:470nm,Em:530nm

% A.Press.(Status) Detector A:Ex:470nm,Em:530nm

(e) 650C

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min 0

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

% A.Press.(Status) Detector A:Ex:470nm,Em:530nm

% A.Press.(Status) Detector A:Ex:470nm,Em:530nm

(h) 750C

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min 0

10 20 30 40 50 60 70 80 mV

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Bảng 3.1 Sự phụ thuộc của S píc vào nhiệt độ phản ứng

(E x =470nm, E m =530nm, V=20l, v= 1ml/phút Cột RP-C18, đệm acetat 10mM (pH=4,5), ACN/MeOH/

đệm = 25/25/50)

Nhìn vào sắc đồ sắc ký trên, so sánh giữa mẫu Bank và mẫu phân tích, ta có: pic đầu tiên là sản phẩm phụ của phản ứng, píc thứ hai là CEP, tiếp theo là CEF và AMP

Dựa vào bảng số liệu và đồ thị trên, nhận thấy: nhiệt độ phản ứng ảnh hưởng

rất lớn tới diện tích píc Nhiệt độ càng nhỏ, Spíc càng nhỏ (nhiệt độ từ 500C đến

650C) Nhiệt độ quá lớn, Spíc giảm, đồng thời sinh ra nhiều sản phẩm phụ Tại nhiệt

độ 700

C, Spíc là lớn nhất Với những nhận xét như vậy, chúng tôi quyết định chọn nhiệt độ phản ứng tạo dẫn xuất là 700C cho những khảo sát tiếp theo

3.1.2 Khảo sát thời gian phản ứng dẫn xuất hóa

Thời gian của phản ứng dẫn xuất hóa cũng là một yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng tới hiệu suất phản ứng Thời gian thích hợp, phản ứng xảy ra hoàn toàn, kết quả của phân tích chính xác hơn Trong phản ứng này, chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian phản ứng từ 8 phút đến 15 phút Điều kiện chạy sắc ký như trên, nhiệt độ dẫn xuất hóa là 700C và thu được kết quả như sau:

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5mV

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

%

A.Press.(Status)

Detector A:Ex:470nm,Em:530nm

(c) 12 phút

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min 0

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 mV

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

%

A.Press.(Status)

Detector A:Ex:470nm,Em:530nm

(d) 15 phút

Hình 3.3 Sắc ký đồ ở các thời gian phản ứng khác nhau

(E x =470nm, E m =530nm, V=20l, v= 1ml/phút Cột RP-C18, đệm acetat 10mM (pH=4,5), ACN/MeOH/

đệm = 25/25/50)

Bảng 3.2 Sự phụ thuộc của S píc vào thời gian phản ứng

(ACN/MeOH/đệm Acetat = 25/25/50 Tốc độ 1ml/phút Nồng độ đệm 10mM, pH=4,5; E x =470nm;

E m =530nm)

Nhìn vào bảng và sắc ký đồ trên ta thấy, thời gian phản ứng càng ít, Spíc càng nhỏ, phản ứng tạo dẫn xuất không xảy ra hoàn toàn (t = 8 phút và 10 phút) Thời gian phản ứng càng lớn, Spíc giảm đồng thời xuất hiện nhiều sản phẩm phụ (t = 15 phút) Tại thời gian phản ứng là 12 phút, Spíc tạo ra là lớn nhất, không xuất hiện sản phẩm phụ Với những nhận xét đó, chúng tôi chọn thời gian phản ứng là 12 phút cho những khảo sát tiếp theo

3.2 Khảo sát các điều kiện chạy sắc ký

3.2.1 Chọn bước sóng của detector

Trong phép phân tích đồng thời, việc chọn bước sóng rất quan trọng vì nó quyết định trực tiếp đến độ nhạy của phép phân tích Vì phương pháp nghiên cứu là HPLC ghép nối detector huỳnh quang, do sử dụng detector cố định bước sóng, do

đó phải tiến hành khảo sát điều kiện để chọn ra được bước sóng kích thích (Ex) và bước sóng phát xạ (Em) tối ưu nhất cho phân tích đồng thời các chất

Do các -lactam là các hợp chất không màu, hấp thụ ánh sáng vùng tử ngoại Khi dẫn xuất hóa nó với thuốc thử NBD-F, sản phẩm của phản ứng là một chất có màu và có khả năng phát huỳnh quang Tham khảo các tài liệu trên thế giới [35,36,48], chúng tôi quyết định chọn bước sóng kích thích là Ex= 470nm, bước sóng phát xạ Em= 530nm cho các khảo sát tiếp theo

3.2.2 Chọn thể tích vòng mẫu (sample loop)

Hệ bơm mẫu cho sắc ký lỏng sử dụng nguyên lý cơ bản là mẫu ban đầu được nạp vào trong vòng chứa mẫu có thể tích nhất định bằng một xi lanh ở áp suất thường, sau đó nhờ hệ thống chuyển van mà mẫu được dòng pha động nạp trong cột tách Độ chính xác, độ đúng và lượng mẫu cần thiết nạp vào cột tách không những phụ thuộc vào thiết kế của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu vào trong cột

Dựa vào khả năng thay đổi các vòng mẫu khác nhau mà có thể thay đổi được thể tích mẫu bơm vào cột Tuy nhiên yếu tố này cũng góp phần vào việc mở rộng chân pic sắc ký (doãng pic) Nếu như vòng mẫu chứa quá dài, lượng mẫu bơm vào cột quá lớn thì hiện tượng doãng pic xảy ra càng lớn gây ra sự chen lấn pic trong quá trình tách

Lượng mẫu được xác định bằng lượng thể tích vòng chứa mẫu mà ta chọn Với thể tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn Vo thì khi bơm mẫu vào cột tách chiều cao hay diện tích của pic sẽ tăng một cách tuyến tính Đến giới hạn Vmẫu > Vo, nếu ta tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao pic sắc ký cũng không tăng được nữa