DÙNG TRYPSIN THÈM AXIT AMIN TÀCH TÉ BÀO PHÒI GÀ VÀ DANH GIÀ SU PHÀT TRIÉN CÙA TÈ BÀO DÒ

He thóng enzym này tham già vào thành phàn càu tao cùa ehinh màng va boat dóng nhu "chat chuyén chò" khóng phii thuóc vào nàng lugng [5] Màng té bào là mot màng rat mòng , khóng thè nhìn

BÒ GIAO DUO VÀ DÀO TAO

• • • DAI HOC QUÓC GU HA NÓI

TRUÒNG DAI HOC KHOA HOC TUNHIÈN

****

CAO XUAN THINH

DÙNG TRYPSIN THÈM AXIT AMIN TÀCH

CÙA TÈ BÀO DÒ

LUAN AN THAC S? KHOA HOC HOA HOC

Qiuyèn ngành: Hoà HOu co

Masd: 01-04-02

Nguòrf hiróng dàn khoa hoc: GS.TS.KH Ngò Thi Thuàn

GS.TS.KH Nguyén Vàn Man

MUC LUC

Trang

MÒ DÀU CHUONGLTÓNG QUAN

L l T é b à o 4

7.7.7 Saluge lich sùtébào hgc 4

7.7.2 Màng bào tuoitg 5

1.1.3 Siéu càu trùc cùa càc vùng lién két giua càc té bào 10

7.7.-^ Suphàn chia té bào 19

1.2 Trypsin 19

7.2.7 Càc tién chat cùa enzym 19

7.2.2 Hogt hoà trypsinogen 20

1.2.J? Dàc diém cùa trypsinogen - co che thuy phàn protein,

dnh huòiìg cùa nhiet dò va pll dai vói trypsin 23

1.2.4 Nhoni hydroxyl cùa serin 28

7.2.5 Axit amin 30

CHUONG 2 VÀT LIÈU VÀ PHUONG PHÀP

THUC NGHIÈM 2.1 Vatlieu 32

2.7.7 Trang thiét bi va dung cu can thiét 32

2.7.2 Càc mói truàng càn thiét dùng de tàch va nuói cày té bào 33

2.2 Phifimg phap thirc nghiem 37

2.2.7 Chuàn hi tritng gà co phói 37

2,2.2 Chuàn hi nuói cày té bào CEF

(Chick Embryos Fibroblast) 39

3.2 So té bào chét / mi dugc tàch tir phói gà 42

3.3 So té bào song / gam dirgc tàch tir phòl gà 43

3.4 So té bào chét / gam dirgc tàch tir phói gà 44

3.5.Ty le té bào song / tong so té bào (%) tàch tir phói gà 45

3.6 Quan sàt sir phàt trién cùa té bào qua 2 ngày nuói cày 46

3.7 Su nhàn lén cùa virut trén té bào phói gà 48

3.8 Su phàn huy va tài tao té bào 51 3.9 Tàc dung cùa trypsin va trypsin axit amin 52

KÉT LUÀN 57 TÀI LIÈU THAMKHÀO 58

MODÀU

Tir dàu thàp nién 1950 viéc nghién culi va phàt trién càc vaexin da eó dugc buóc tién bó nbày vgt nhó phuang phàp nuói cà'y té bào in vitro thành cóng

Thoat tién Goodpasture dà nuói cà'y tình dugc màng phói gà Sau dò Maitland dà cài tién nuói té bào thàn gà trong chai thuy tinli, dùng mói truàng eó huyét thanh gà va mot sÓ muói khoàng de cà''y virut vaexin

Khóng lAu ve sau, Gey da eó mot dóng góp dàng ké : óng de xuA't phuang phàp quay tròn lién tue càc óng nghiém nuói té' bào dà cày virut vaexin va bÀng ky thuAt này Gey dà thu hoach dugc lugng virut lón han gA'p bòi

Cilng trong nhiTng nàm 50, Enders, Wella va Robbins thue hién nhiéu thf nghiém cày virut trén té bào nguòi nuói in vitro, chù yéu là càc nguyén bào

xa (fibroblast) tu tÓ chirc da va ea cùa tré chét khi mói sinh Bang phuang phàp này càc tàc già dà dat dugc nhung két qua rat khà quan là dugc polyovirut typ II Langsing vói khói lugng khà lón trong té bào nuói

Thành cóng trong viéc su diing té' bào nuói in vitro de cày virut gay bénh cho nguói dà ma ra mot ky nguyén mói nghién cuu va phàt trién mot loat càc vaexin mai phòng càc bénh bai liét, dai, quai bj, thuy dàu, sai, v.v

Gòng nghé nuói té bào a mot quy mó lón ngày càng dugc cài tién va hoàn thién sé tao diéu kién thuAn Igi hon nùa cho viéc san xuà't càc vaexin va nghién ciru sinh y hoc

Bang phuang phap trypsin hoà nguòi ta dà tàch dugc càc té bào riéng ré

san eó va cung dugc su dung róng rai nhàt [9] Trypsin vói net dàc tnrng cùa chuói peptit lién quan dé'n nhóm eaeboxyl cùa càc axit amin ea ban [22] 0 diéu kién thieh hgp trypsin boat dóng rat huu hiéu trong viéc tàch mó, nhung trypsin sé phà huy té' bào né'u kéo dai thòi gian trypsin hoà [26] Tiì yéu cÀu thue té càn lugng té bào song nhiéu han, nén chùng tói tién hành nghién cuu

de tài:

''Dùng trypsin thém axit amin tàch té bào phói gà va dành già su phàt trién cùa té bào dò "

Mue tiéu cùa de tài bao góm nhung vA'n de ehinh sau:

1 )Nghién cùru ành huong cùa trypsin va trypsin co axit

amin dén sir tàch té bào phói gà

2) Dành già sir phàt trién cùa hai nhóm té' bào tàch

dugc theo càc phuang phàp trén

Chuong 1

TÓNG QUAN

1.1 Té bào

7.7.7, Saluge lich sùtébào hgc

Té bào dugc Robert Hook phàt hién lÀn dàu tién vào nàm 1665 nhò kmh

hién vi tir tao vói dò phóng dai 30X Ong dà xuàt ban euón "Kinh hién vi"

mó ta nhiéu dói tugng ma óng dà quan sàt dugc Ong mó tà càu tiiie cùa tiéu bau thue vAt à dcing càc xoang róng eó thành bao quanh va dat tén là cella [4]

Antoni Van Leuvenhock (1674) vói kmh hién vi eó dò phóng dai 270X dà

mó tà càc té bào dóng vAt va dà xàc djnli té bào khóng phài là xoang róng ma

eó cA'u trùc phùe tap

Tu quan diém té bào là "xoang róng" dà chuyén sang quan niém té bào là khói té bào chat eó chùa nhàn (R Brawn, 1831) va dugc giói han bòi màng

té bào [4] Nhiéu qua trình sinh ly quan trong cùa té bào dugc nghién cuu làm ca sa cho sir phàt trién cùa di truyén hoc , sinh ly hoc va phói sinh hoc a cuòi théky XIX va dàu théky XX [21]

Ca thè ehi song trong tiiròng hgp néu càc hgp phÀn cùa nò dugc càu tao tir le bào Mó cùa tA't cà càc ea thè déu bao góm nhung té bào gAn vói nhau bÀng nhiìng lue bàm thóng thuòng TA't cà càc mó va càc ca quan ehi là càc khói té bào bién dang khàc nhau [11], té bào sinh ra bang eàch chia dói va co cAu phàt biéu nói tié'ng : "Ngoài té bào khóng eó su song" [4]

+ Mèi ca thè song déu eó càu tao té bào va san phàm boat dóng song cùa

té bào

+ Càc té bào mói duae hình thành ti^ su phAn chia té bào cu

+ Thành phàn hoà hoc va su chuyén hoà cùa chùng rat gió'ng nhau Boat tinh ca thè toàn ven bao góm boat tinh va su tàc dóng tuang hó cùa càc dan

vi té bào dóc lAp càu tao nén nò [5]

Té bào là dan vj só'ng ea ban dugc tao thành bòi càc thành phàn quan trong lién quan màt thiét vói nhau góm 3 thành phàn ea ban: màng, té bào chA't, nhàn [4]

7.7.2 Màng bào tuoyig

Trong de tài nghién cuu này bang phuang phàp trypsin hoà chùng tói da tàch dugc iihùng té bào riéng ré tir mó (phói gà), de bié't dugc nhung tàc dung tfch cuc cung nhu khóng tieh ciré trong viéc thuy phAn protein màng té bào cùa trypsin Chùng tói quan tAm rat nhiéu dé'n cA'u tiijc cùa màng, dac biét dé'n càc phàn biét hoà cùa màng nói giua càc té bào vói nhau Màng bào tuong là màng ngàn, giói han su ngA'm thu dóng dàn dé'n két qua là màng dò chi cho phép càc chA't di qua theo gradien nóng dò, nguòi ta thày ràng niróc

va nhung chA't eó kliói lugng phAn tir nhò di qua màng ngàn do mot eàch tu

do Su vAn chuyén mot so chat nhu duòng, axit amin co su tham già cùa càc enzym Càc enzynì làm tàng toc dò thAm thà'u cùa càc chat dò qua màng He thóng enzym này tham già vào thành phàn càu tao cùa ehinh màng va boat dóng nhu "chat chuyén chò" khóng phii thuóc vào nàng lugng [5]

Màng té bào là mot màng rat mòng , khóng thè nhìn thA'y dugc duói kùih hién vi quang hoc ma dugc nhìn thA'y duói knih hién vi dién tu Màng bào tuong boc quanh té bào cùng dugc xàc nhàn nhò càc hién tugng sau:

- Càc ch^t chùa trong té' bào bi chày ra, dàc biét là khi thié'u Ca^^ khi té' bào bi tén thircfng

- Càc loai phàn tu ngà'm vào tè' bào khòng cùng tó'c dò nhir nhau

- Nhùng ion cùng nhu phàn tir mang dién tfch thàm nhàp vào té' bào chàm han nhùng phan tir khòng mang dién tich

- Nhùng phàn tir bé thàm nhap vào té' bào nhanh hon nhùng phàn tu lón

a Càu tao cùa bào tuong

Overton (1902) nhàn thà'y nhùng chc'ft hoà tan trong lipit rà't de xàm nhàp vào té' bào, dòng thòi òng ta nhftn thà'y ràng nhùng dung mòi cùa lipit va nhùng men iipaza phà huy màt té' bào Tu dò òng két luàn màng bào tuong

co chat lipit Già thuyét duoc khàng dinh sau khi nguòi ta nhàn thày nhùng hoc7t dóng men ò màt ngoài màng bào tuong Tu dò két luàn màng bào tuong dugc tao thành bòi lipit va protit Bang phuong phàp hoà hoc té' bào, nguói ta còli chùng minh su co màt mot lóp chat co tinh chat cùa polysaccarit o trén màt té' bào Phàn tfch hoà hoc, nhàn thày màng bào tuong tàch rói co lipit, protit vói so lugng tuong duong, dóng thòi co thém polisaccarit [28]

Màng bào tuong là mot màng dàm, day eàch màng té' bào bòi mot vùng sàng nhò hon dò là mot tnjóng hgp càc desmosom dà dugc biét hoà cao dò [6] Màng té' bào co thè két dfnh vói là trong Màng bào tuong co thè cà'u trùc kiéu màng, song song vói màt té' bào Càc màng này lién két vói nhau trong mot khuón co ban chat hoà hoc gàn giò'ng keratohyaline [18] Càc sgi nhò nói té bào (tonofilaments) là nhùng thành phàn quan trong nhà't cùa vùng lién két Tonofilaments co duòng kfnii 10 nm, xuyén qua càc màng bào tuong, va

nguòi ta dành già rat cao già tri cùa gangliosit eó trén màng té bào Nhfmg chat này tuong tu nhu photpholipit nò là mot ehuói ki nuóc, nhung phàn eó ciré thi dai va két thue boi axit neuramin, cài ma co mot nhóm eaeboxyl tir

do

Cuc cuòi cùa phAn tu chùra N-axetyllactosamil, glaetosamil va diròng glucose [17] Dién tieh bé màt Am tinh nguòi ta cho ràng eó lién quan dé'n nóng dò cùa doan cuòi axit neuramin Sau khi hoà tan nhe vói neuraminidase dac biét thi axit neuramin tan ra tir té bào song va tinh (-) cùa bé mat giàm Càc thành phÀn quan trong cùa gangliosit dóng vai trò trong vàn chuyén ion

va trong màng chùra neuron Ben canh viéc tao nén càc nhóm eaeboxyl ionogen trén bé mat té bào axit neuramin là thành phàn quan trong cùa mot

sé khàng nguyén bé màt (vimt va khàng nguyén toxin) Nhung diéu dò chi

ra ràng càc gangliosit là thành phàn cA'u trùc quan trong cùa màng té bào

e Su biét hoà màng bào tuong va su két dinh

Càc té bào canh nhau cùa co thè dugc ngan eàch nhau boi nhung khoàng gian bào, giàn doan tùng quàng tuy theo càc kiéu phùe hgp lién két Càc té bào dugc ràp lai vói nhau qua càc móng

Càc khoàng gian bào: Càc té bào khòng dfnh vói nhau trén suót chiéu dai cùa chùng Trong biéu mó hình lang kmh don giàn thày eó nhung kè ho giua càc té bào, dò là càc khoàng gian bào 0 dinh eó mot càu trùc ggi là khung té bào, co tàc diing ngàn khóng cho dich lién bào thoàt ra va khóng cho chat liéu bé mat biéu mó nhAp vào khoàng gian bào Khoàng gian bào eó kieh lluróc tuong dói bang dinh Càc té bào lién két dugc vói nhau là do mot chA't

"kco" co chira càc protein (fibroneetin, elastin, collagen) Su eó màt cùa Mg'^ va C a ' ' là cÀn thiét cho sir lién két giùa càc té bào [ 14]

1.1.3 Siéu càu trùc cùa càc vùng lién két giira càc té bào

Càc té' bào dugc phàn eàch vói nhau bang mot khoàng gian bào hep hoàc ròng Càc té' bào khóng dfnh vói nhau trén suót chiéu dai cùa chùng ma thà'y

co nhùng kè ho giùa càc tè' bào, dò là càc khoàng gian bào Khoàng gian bào

co kfch thuóc tucmg dÓi hàng djnh [11]

Trong gian bào co djch khe vàn chuyè'n càc chà^t nuói duòng, càc chà't tié't

va càc chat thài [15] Tai mot sÓ vùng càc màng tè' bào dinh lai vói nhau Càc vùng lién két này góm càc kiè'u lién két khàc nhau: (hình 2, 3, 4, 5a, 5b, 5c, 5d,5e )

- Càc lién két kiéu chat

- Càc lién két kiéu khe

- Càc lién két kiéu càu nói

- Càc lién két kiéu desmosom

a Càc lién két kiéu chat

Dò là càc vùng chuyén biét cùa màng, tai dò càc là ngoài lién ké't vói nhau dén nói khòng con khoàng gian bào nùa, va nhu vày khòng con su van chuyén chat giùa càc té' bào Lién két kiéu chat thuòng thà'y ó nhiéu mó, nói lién càc té' bào nói mó Kiéu lién két chat này khòng con chó cho dich luu chuyén giùa càc té' bào Vi vày viéc trao dói ó day là giùa hai té' bào, chù khòng phài là qua càc gian bào Mòi màng té'bào thuóc lién két kiéu chat déu

co chùa pròtéin dugc ggi là càc connexin [4] (càc chat nói )(hình 2)

Hình 2- Lién két kiéu chat

b Càc lién két kiéu khe

Dò là càc vùng chuyén biét tai màng cùa hai té bào làn càn, nói hai màng

\:Ì\ vói nhau Néu càt theo hình thuóc thg, lién ké't khe góm eó bay lóp :

- Càc là (hai là dàm va mot là sàng ) cùa mot trong hai té bào

- Khoàng gian bào eó chiéu day 2-3 nm

Ba là cua màng té bào lan can,

Nhu vay lién két kiéu khe góm co btfn là th^m thàu dugc

Nhung hai là ngoài sàt nhau qua nén khóng phin biét dugc Do dò làm tucmg lién két kiéu chat, vi vày khó xàc dinh dugc Phài chùng minh su co màt cùa gian bào bang Nitratlanthan Vi chat này co thè nhàp vào càc gian bào ké cà càc gian bào nhò Nén dùng chat Nitratlanthan làm chat dành dàu [10] Qua hién vi dién tu, chat này due va de phàt hién Néu ngàm mot tÓ chùc trong dung dich Nitratlanthan thi de phàt hién dugc tà^t cà càc khoàng gian bào Càc phàn tu hgp thành connexon (mot hexame) càc connexon cùa hai màng té bào làn càn dugc lién két vói nhau Connexon co duòng kinh là 6

nm va co mot kénh trung tàm 2 nm, dugc bé trf theo mang luói hình lijc giàc (hìnli 3)

Kénh giùa cùa connexon

Hình 3-Lién két kiéu khe

e Lién két kiéu cdu nói

Day va càc vùng chuyén biét cùa màng té bào, dugc nói vói nhau bang càu nói xuyén qua gian bào Khoàng gian bào eó kieh thuóc 16 ^ 20 nm giua càc màng té bào là càc càu nói, hình dàm (hình 4)

Hình 4 - Lién két kiéu càu nói

d Càc lién két kiéu desmosom

Giùa càc té bào biéu mó chùng ta hay thA'y desmosom Cài này dugc nhìn thày nhuòm màu tói trén kmh hién vi quang hoc, cài ma nguòi ta cho là cài

càu giùa càc té bào, nhùng sgi mòng euón vào desmosom txi dAy nguòi ta tin

ràng thóng qua càc càu eó thè dua tu té bào này sang té bào kia Cuòi cùng kinh hién vi dién tu da làm sàng tò càu bòi khóng eó vàn de ve su lién nhau giùa càc té bào (hình 5a)

Cài goi là phàn ''Khoà" thóng thuòng gap ò giGa càc té bào biéu mó hình

tru tnic tiép duói bé màt tu do (hình 5c)

vy^

Hình 5(c)- Lién két kiéu desmosom

Duói kinh hién vi dién tiJ nò tuong tu nhu Desmosom, màng day lén a ben canh nò co mot chft màu tèi co thè gap nhung thóng thuòng khóng co sgi

ta

Giùa càc bé màt té bào tiép xùc vói nhau co nhiéu hình thùc cài ràng Urge co thè quan sàt Mot trong vf dii mmh hoa là (hình 5d)

Desmosom là phàn day lén tal chó cùa càc màng té bào dÓi dién vói nliau,

tu nhung cài ma sgi nhò mòng tién thành hình tia di vào ben trong bào tucfng Giua càc Desmosom tliuòng xuàt hién nhung doan noi ma càu tao long léo va

ò day khoàng lién bào thuc chat da hình thànli Tai day chat long tu do co thè v9n chuyén (hình 5b)

Hình 5(b)- Lién két kiéu desmosom Desmosom co thè tliày trong mot sÓ té bào bièu mO

Hình 5(d)- Lién két kiéu desmosom Nhung Desmosom va phàn "Khoà" ben canh bé màt chay theo làn song

dà làm cho mÓi lién két chat che hcfn

Day là càc he phùc tap nhàt, biét hoà ò mùc cao nhàt, de lién két càc té bào vói nliau, dugc phàn bÓ thành càc diém déu dàn doc theo duòng bién giùa hai té bào làn càn Hình trai xoan duòng k(nh lón là 400^500 nm duòng kùili nhò 190 nm Truc lón thuòng song song vói tnjc té bào Cit theo hình thiróc thg sé thày màng cùa càc té bào làn càn khòng hgp nhàt vói nhau, va kliòng co tiép xùc truc tiép

H»C- U - •

V. V» i ' IJ • •

N

u!(,^

- Khoàng gian bào là 24 nm, co khi lón tói 50 nm (tniòng hgp desmosom

da dugc biét hoà cao dò) [26]

- Càc thành phàn ngoai té bào: "ào" khoàng gian bào cùa desmosom co chùa càc chat hoà hoc giÓng nJiU cùa "ào" 0 day "ào" trò nén dàm hon eó vai trò nhu xi màng gàn càc desmosom vói nhau [31] (hình 5e)

Demosom

Demosom

PHUC HO? CÀC DlEM NOI

GIUA HAI TE BÀO RUÒT

Hình 5(e)- Lién két kiéu desmosom

1.1.4 Su phàn chia té bào

Co hai loai té bào: té bào soma (dinh duong) va té bào sinh dite Té bào don cùng nhu té bào trong càc mó cùa ea thè da bào thuòng phAn chia theo kiéu nguyén phAn vói mot lÀn nhAn dói cùa phAn tu DNA va 4 kì phAn chia:

kì dàu, kì giùa, kì sau va kì cuòi, lui nam 1858 Virchov dà dua ra dinh de nói

tié'ng: *'té bào sinh ra tu té bào eó tiiróe" [5] Tu té bào con mói dugc sinh ra bang con duòng trao dói chA't tang truòng kJió'i lugng té bào chat va nhàn dàp ùng càc boat dòng song Té bào tàng truòng dén mot mue dò nào dò thi phAn chia ra thành càc té bào mói [16]

1.2 Trypsin

Trypsiiì là mot proteaza serin tuyén tuy vói net dac trung cùa chuói peptit lien quan dén nhóm eaeboxyl cùa càc axit amin ca bàn là arginin va lysin Trypsin tinh khiét mot minh thiròng kém hiéu qua trong viéc tàch té bào mó,

vi no ehi ra tmh chon loc ft dÓi vói càc protein gian bào Trypsin khi co su két hgp vói chymotrypsin va elastase thi eó hiéu qua trong viéc tàch mó nhiéu hon Hoat tmh cùa trypsin bi IJTC che' bòi Ca^^ va Mg^^ Vi vày, trypsin nén dugc chuAn bi vói sir vAng mat cùa càc muói này

7.2.7 Càc tién chat cùa enzym

PhÀn lón càc enzym dirgc tóng hgp thành càc phàn tu enzym eó boat tinh, nlìtrng co nhiìng enzym dugc tóng hgp qua 1 dang trung gian khóng eó boat tùih xùc tac goi là zymoenzym hay proenzym Dò là nhung tién chA't de tao (hành enzym, chù khóng phài là enzym thue su Nhung chà't này phài trai qua

I qua trình bién dói, sAp xép hai cA'u trùc phAn tu mói trò thành enzym hoat

tinh Qua trình dò bao góm su thùy phAn lién két peptit, loai bò 1 vài doan

peptit co tàc dung kìm hàm hocit dóng hoàc bao vAy che lA'p trung tAm hoat

dóng cùa enzym Do dò ma phàn tt!r khÓi cùa enzym eó boat tinh thuòng nhò hon phàn tu khÓi cùa ehinh tién chat tao ra nọ Qua trình này ggi là su boat hoà zymogen va nguòi ta cho ràng ehinh qua trình này da làm bóc lo hoàc da tao ra tàm boat dòng cùa enzym Qua trình hoat hoà eó thè là qua trình tu xùc tàc hoàc do 1 enzym khàc xùc tàc [1]

Hoat dòng cùa trypsin là hién tugng tóng hgp ra càc zymogen eó mot y nghTa sinh hoc quan trong, eó thè nói ràng, càc proteaza trong óng tiéu hoà dugc tóng hgp qua giai doan tmng gian nhu vày ehinh là mot ca che tu bào

ve cùa ca thè vi néu khòng nhu vày thi ehinh càc tuyén da tóng hgp nén càc loai enzym này sé bi tiéu hùy bòi ehnih nhung enzym do chùng tóng hgp nén [6]

Ò loài ngiròi va nhiéu locii dóng vàt eó vù, càc enzym thuy phàn protit (proteaza) trong óng tiéu hoà déu dugc tóng hgp ra duói dang tién chat cùa enzym Vi du trypsinogen cùa tuyén tuy là tién chat cùa trypsin Càc chat này déu ehi duge boat hoà thành dang enzym boat dóng sau khi da tié't vào long óng tiéu hoà Trypsinogen duge hoat hoà thành trypsin duói tàc diing cùa chuìh trypsin hoàc enterokinazạ

7.2.2 llogt hoà trypsinogen

Su phAn lAp tinh khiét trypsinogen va trypsin cùng nliu su nghién cuu dóng hoc cùa qua trinh hocit hoà trypsinogen thành trypsin dà dugc thirc hién long lai trong truòng phài cùa Northrop Trypsinogen tinh thè eó thè boat hoà bang ehmh trypsin va nhu vày vói nhùng diéu kién thieh hgp, qua trình tu xùc tàc dà dugc thue hién Trypsinogen cùng duge boat hoà bang enterokinaza, mot enzym thùy phàn protit eó trong dich tié't cùa ruót va 1 sÓ enzym tuang

tu tu nguón góc khàc nhau, vi dii nhu "kinazấ cùa penicillinum sp TÁt cà càc triròng hgp déu san xuÁt ra cùng 1 loai trypsin

Trong qua trình tu xùc tàc, co thè xày ra 2 phàn ùmg canh tranh nhau: mot phàn ung (a) tao thành trypsin eó boat tinh va 1 phàn ùmg (b) tao thành 1 protein khóng eó hoat tinh enzym, su phàn phÓi pepsinogen cho 2 phàn ùng này phu thuóc vào pH va sii eó mat cùa 1 sÓ ion Ion Ca^^ làm tàng cuòng phàn ung (a) va ngàn chàn phàn ung (b) Ké't qua là khi co màt 0,02 mol CaClj va dugc khòi dàu vói sir eó mat cùa 1 lugng nliò (vét) enterokinaza thi phàn ung sé xày ra nhu 1 qua trình tu xùc tàc thuàn nhà't Ion Ca""^ va pH thàp

sé làm tàng hiéu suA't enzym eó hoat tinh, nhung ò pH thàp thi toc dò boat hoà kém [2]

Hai phàn ung Ccinh tranh nhau trong qua trình hoat hoà trypsinogen eó thè biéu thi nhu sau:

Trypsin ^

Trypsinogen *- Trypsni + Hcxapcpiil (a)

Hoac "kina/a"

Trypsinogen irypsin ^ Protein khóng co hoat tinh enzym (b)

Kinaza cùa nàm mÓc eó su khàc biét rò lét vói càc "kinaza'' khàc ò ebÓ là

nò hoat dòng trong dung dich axit (pH thieh hgp nhà't vào khoàng 3,5) ma a

pH do trypsin khóng hoat dóng duge, do dò trong truòng hgp này su hoat hoà khòng phài là hién tugng tu xùc tàc

Trypsinogen cùa bò eó phAn tu khói vào khoàng 24.000 va trypsin cùa bò

eó phAn tu khói nhò han mot ehùt, nguòi ta cùng phàt hién thày 2 loai phAn

tu này eó su khàc biét nhau ve hA'p thu quang phó (tia tu ngoai) Mói loai phAn tu ké trén déu chi do mot ehuói polypeptit càu tao nén va eó thè phàt hién dugc nhóm a-amino tAn cùng, nhung khòng phàt hién dugc nhóm C tàn l^ang eàch su dung eaeboxylpeptitaza Diéu dò eó thè là do cA'u trùc vòng a dàu này, nhung do su càn tra khóng gian nào do nén eaeboxylpeptitaza

khóng tàc dóng dugc Nguòi ta da chung minh ràng, mot doan 6 axit amin dà tàch ra khòi trypsin trong qua trình boat hoà va nguòi ta cùng phàn làp duge

1 hexapeptit góm 6 axit amin (Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) Su loai bò hexapeptit dà làm cho phàn tir thay dói hình dang khòng gian va eó le vi thè

da tao diéu kién cho su hình thành tàm boat dòng cùa enzym [1] Trypsin dugc boat boa bòi enteropeptitaza Trypsin là mot chat khòi dàu thóng dung cùa càc zymogen tiiy tang Nò duge tóng hgp khi trypsinogen zymogen khóng boat dóng va phài duge boat hoà bòi ehinh nò Enzym hoat hoà trypsin dugc ggi là enteropeptitaza, enzym thùy phàn protein nàm trong tà tràng Nò xùc tàc cho qua trình tàch doan chuói polypeptit ò trypsinogen giua góc Lysin 6 va Isoleucin 7

Su do niò tà su bién dói trypsinogen cùa bò thành trypsin

-f- Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys - ILcu-Val-Gly^

Trén sa dò này, nguòi ta thà'y lién ké't peptit giua Lysin va Isoleucin dà bj

bé gay trong qua trình boat hoà

Ngoài ra, nguòi ta cùng nghién cuu su boat boa cùa nhiéu trypsinogen tu tuy cùa dòng vAt khàc Trong khi boat hoà trypsinogen tiiy Ign, nguòi ta thà'y oetapeptit (-Phe-Thr-Pro-Asp 4-Lys-) da duge giài phóng ra Khóng gió'ng nhu triròng hgp cùa bò, nguòi ta dà xàc dinh duge axit amin C tàn cùa trypsinogen trong tiiy ign va xàc dinh dirge chuói thu tu ò dAu này là Ala-Asp (NH^ hoac là Ileu-Ala-Glu (NH^) Trong qua trình bién dói trypsinogen thành trypsin, dAu C tàn cùng cùa chuói khóng bi bién dói [1]

1.2.3 Dàc diém cùa trypsin - Ca che thùy phàn protein, dnh huong cùa nhiet do va pH dai vói trypsin

a Dac diém, càu truc cùa trypsin

- Dàc diém

Qua trình thùy phàn protein trong ruót dóng vàt eó vù duge dién ra trong

truc tràng a pH gàn = 6 bòi càc thành phàn chùa enzym eó trong qua trình

tié't ra dich tiiy Qio dé'n khi eó su biéu hién cùa nhiéu locii protein hocit dòng trong dich tuy, tbì nguòi ta vàn tin ràng qua trình này ehi chua duy nhA't I loai proteaza, co tén là trypsin Hón hgp cùa càc enzym thùy phAn protein trong dich tiiy eó thè duge bÓ nbiém mot eàch thieh hgp han bòi tiiy tang, trypsin dirge An dinh cho mot trong càc proteaza, va chymotrypsin dugc An dinh cho mot proteaza khàc Su hién dién cùa mot proteaza khàc trong tiiy tang dugc chi ra do viéc tìm thày mot loai enzym (enzym dàn hói) ma xuàt hién tuang dói dac trung trong qua trình làm giàm su dàn hói, mae dù càc protein khàc cùng bi thùy phAn bòi enzym này Han nùa, chùng eó là rat ro ràng cho su tón tai cùa tnót "protaminaza" tuy tang [16]

- Càu trùc

Càu trùc cùa chymotrypsin, trypsin va elastaza là tuang tu nhau, ea che xùc tàc cùa chùng cho qua trình thuy phAn càc ehuÓi peptit là gàn nhu giò'ng hét nhau Ba loai proteaza serin này chi khàc nhau a 1 vài màt xich trén bé mat va net dac tiirng ve góc cùa chùng Chymotrypsin xùc tàc cho qua trình thùy phAn càc chuói peptit ve phfa C tàn cùa càc chuói ben hydrophobic lón Trypsin xùc tàc cho qua trình thùy phàn cùa càc chuói peptit ve phia C tàn cùa càc chuói ben ca bàn cùa arginili va lysin Elastaza thuòng xùc tàc cho

qua trình thùy phàn cùa càc chuói peptit trong dò 1 glycin hoàc 1 phàn cùa alanin bó sung cho phàn axyl [13] (hình 6)

ehymofryp Mnogen

Hình 6- Sa dò càu trùc phàn tir cùa Chymotrypsinogen A va Trypsinogen

b, Ca che thuy phàn protein

Trypsin eó dang tinh thè do Kunitz va Narthrop phàt hién, eó khÓi lugng phàn tu klioàng 24000 va c6 diém ding dién ò pH =10,5, nò tàn cóng dugc vào càc protein Vi dii Casem boat dòng tÓi uu ò pH = 8, màc dù mot sÓ qua trình tliuy phàn protein co thè dién ra Ò pH thàp = 6 [7] GiÓng nhu pepsin, trypsin dugc tìm thày là mot endopeptidaza ma co tàc dung tói càc lién két CO-NH trong càc co chat tÓng hgp cùa càc càu trùc don giàn Tu càc nghièn cuu này cùa Bergmann va cOng su, nguòi ta di dén két luàn ràng net dàc tnrng cùa trypsin là truc tiép tliùy phàn càc lién két peptit de tao thành dufti L-arginin hoàc L-lysùi làm cho hàm lugng nhóm cacbonyl tàng lén Do vSy,

càc ca chat tóng hgp eó thè phù hgp cho trypsin tinh thè là

benzoyl-L-arginamit hoàc benzoyl-L-lysinamit, càc chat này bj kbir amin va làn lugt tao

thành benzoyl-L-arginin va benzoyl-L-lysin Su thay thè càc duói axit amin

bang càc chà't khàc nhau tao ra hgp chat chiù dugc tàc dung cùa trypsin [29]

Trypsin tinh thè cùng thùy phàn càc protamin va càc peptitlysin tÓng hgp

dugc tao bòi càc phàn ung tiìing hgp Trypsin tinh thè eó thè co tàc dung tói

càc lién ké't este cùng nhu tói càc lién ké't amit, vói diéu kién là eó càc yéu

càu dàc biét khàc cùa enzym ma dà de càp a trén Nhu vày, trypsin thùy phàn

benzoyl-L-arginin methyl este, nhung khóng thùy phàn benzoyl-L-leuein

metyl este, trong khi dò chymotrypsin eó khà nàng thùy phàn tà't cà càc lién

khòng chi ap dung dói vói cac co chat tóng hcfp ma con cà vói càc protein, do

vay, viéc tao ra enzym nhy là chft't phàn ihig vó cijng già tri trong viéc nghién

cuu càc chuói aminoaxid trong càc mach polypeptit phuc tap [23]

7

e Anh huòiig cùa nhiet dò va pll ddi vói trypsin

- Anh buòne cùa nhiét dò

Trypsin thu dugc ixi mot tién chà't khòng boat dóng, eó tén là trypsinogen,

co trong càc té bào acinar cùa tiiy tang Tién chà't này eó duge ò dang tinlì thè

do Kuintz va Northrop, là nhung nguòi dà chi ra ràng su hình thành trypsin xày ra rat nhanh khi trypsinogen dugc hoà tan trong dung dich trung tinh.Su

bién dói tix trypsinogen sang thành trypsin là xày ra nhanh nhà't ò pH = 7 ^ 8,

va sif boat hoà duge xùc tàc bòi trypsin, do vày phàn ùmg này là phàn ùmg tu xùc tàc [7]

Cùng gióng nhu hàu hét càc phàn ùmg hoà hgc, càc phàn ùmg co enzym xùc tàc phii thuóc rat manh vào nhét dò Arbenius da trình bay 1 eàch eó he thóng ve tàc dung cùa nhiét dò dói vói toc dò phàn ùmg Ong cho ràng khóng phài mgi phàn tu trong I he thóng co thè tham già phàn ùmg, ma ehi 1 phàn

tu nào eó dù nàng lugng hoat hoà mói eó khà nàng phàn ùmg Trong càc phàn ùng enzym, nhiét dò eó tàc diing làm tàng toc dò cùa phàn ihig lén tÓc dò cuc dai, va cùng gió'ng nhu càc phàn ung hoà hoc nói chung, cbijlig nào enzym chua bi bién tinh tbì mói khi tàng nhiét dò lén 10''C, toc dò phàn ùmg sé tàng lén khoàng 2 làn Khi tàng nhiét dò lén dén khoàng 60 ^ 70^C tbì phàn lón càc enzym màt bàn boat tinh va nhiét dò dò duge goi là nhiét dò tói han [2] Mòi enzym déu eó mot nliiét dò thieh hgp nhà't cho sir boat dóng xùc tàc, ò nhiét dò dò phàn ihig enzym dat tói toc dò cao nhà't [24] Nói chung nhiét dò thieh hgp cùa enzym gàn vói nhiét dò cùa ea thè Tuy nhién cùng càn chù y ràng, nhiét dò thieh hgp cùa 1 enzym khòng eÓ dinh ma phii thuóc vào nhiéu yéu tó, thòi gian tàc dung càng dai thi nhiét dò thieh hgp cùa enzym càng thàp Ngoài ra, nóng dò enzym, nÓng dò ca chat, dang tón tai cùa enzym cùng eó thè làm thay dói tàc dung cùa nhiét dò dói vói enzym [17] Nói chung enzym ò dung dich loang, khóng eó ea chat, thuòng kém ben nhà't Ò trcang thài khó va co ca chà't tbì khà ben vói nhiét [25] Vói nhiét dò thàp thi boat dò cùa enzym giàm dị Tai nhiét dò ỐC, boat dò cùa nhiéu enzym con

lai khóng dàng ké Khi tàng nhiét dò lén tbì boat tinh cùa enzym lai tàng theo

vi enzym khóng bi bién tinh ò nhiét dò lanh Nguòi ta su diing dàc tinh này

de bào quàn enzym Enzym thuòng dugc bào quan a OX hoàc nhiéu khi ò

-20''C hoàc -30X hoac thàp han nua [2] Trong truòng hgp dùng trypsin de

tàch té bào ti^ mó hoàc té bào mot lóp, nhiét dò thieh hgp nhàt là 37''C

- Ành huong cùa pH dÓi vói trypsin

Enzym rà't nhay càm vói pH cùa mói tiiròng, do dò pH eó tàc dung rat lón tói toc dò cùa enzym MÓi enzym eó mot tri sÓ pH thieh hgp cho sir boat dóng cùa nò Ò pH dò, toc dò cùa phàn img enzym tòt nhàt, vói nhung tri sÓ lón han va nhò han tri so thieh hgp, toc dò phàn ùmg enzym giàm dàn Co rat nhiéu enzym eó pH thieh hgp a vùng trung tnih nhung cùng eó nhùng enzym hocnt dòng ò vùng rat axit nhu pepsin ( pH = 1,5 ) va eó nhùng enzym khàc boat dóng ò vùng rat kiém nhu phosphataza kiém (pH = 9 -:- 10) [1]

Trong thue hành, phài luón luón bào dàm pH thieh hgp nhà't cho su boat dóng cùa enzym càn nghién cuu MuÓn vày phài su diing càc dung dich dém

de giù vijng pH càn thiét cho enzym Dói vói mot enzym nhà't dinh, pH thieh hgp cùa nò khóng phài lue nào cùng eó' dinh, ma co thè thay dói theo tinh chat va nóng dò cùa ca chat, nhiét dò cùa phàn ung va bàn chat cùa càc loai dung dich dém Mantaza eó pH thieh hgp là 6,6 khi ea chat là Mantoza, pH

thieh hgp là 6,2 khi ca chat là Metyl glueoxit; néu nhiét dò là 4TC thi pH

thich hgp là 4,3, khi nhiét dò là 37,5"C tbì pH thieh hgp là 7,2 [8], pH thieh hgp de tàch té bào phói gà là 7,4

Anh hiròng cuà pH dói vói càc phàn ùmg enzym eó thè do nhiéu tàc diing rat khàc nhau pH eó thè ành huong dén toc dò cùa phàn ung enzym do tàc dung vào trang thài ion hoà cùa phàn tu enzym (nhà't là càc nhóm boat dóng

cùa enzym), vào trang thài ion hoà cùa co chat, vào dò ben vùmg cùa phàn tir enzym va ành huong dén sir ké't hgp giiia phàn protein va phàn phii khóng phài protein (nhóm phii hay nhóm eoenzym) cùa enzym Enzym là nhung protein vói nhung nhóm hoat dòng dàc biét, eó thè tón tai duói nhiéu trang thài ion khàc nhau va thuòng chi mot trang thài eó boat tinh xùc tàc; pH eó tàc dimg quyét dinh dÓi vói trang thài ion hoà cùa phàn tir enzym nói chung

va càc nhóm boat dòng cùa enzym nói riéng, do dò ma ành huong dén boat tinh cùa enzym Trong rat nhiéu tniòng hgp, co chat là nbiJng chat ion hoà va phàn ùmg phii thuóc vào mot trang thài ion nhà't dinh cùa co chat Càc phàn tu enzym cùng nhu nhiéu protein nói chung ehi ben vùmg trong mot vùng pH nhà't dinh, phàn lón là ò vùng trung tinh Tuy nhién cùng co nhung enzym ben vung ò vùng pH rat axit, vi du nhu |:>epsin, enzym này sé màt boat tinh nhanh chóng trong dung djch trung tinh hay pH kiém

1.2.4 Nhóm hydroxyl cùa serin

Nguòi ta dà phàt hién duge vai trò quan trgng cùa góc serin trong tàm hoat dóng cùa mot sé esteraza, proteinaza va photphoglucomutase Vai trò cùa serin dà duge xàc dinh khi dùng càc chat photpho huu co nhu diisopropylfluoio-photphat hay tetraetylpyrophotphat làm chà't ùe che càc enzym axetyleholinesterase va nhiéu hydrolase khàc Nguòi ta thà'y góc photphat cùa càc chat uè che này da két hgp vói nhóm hydroxyl cùa góc serin hoat dòng cùa cholinesterase, chymotrypsin va mot sÓ enzym khàc cùng loai, tao nén nhung dàn xuàt 0- pbotphoryl ben vung Càc lién két này ehi bi phàn giài trong nhùìig diéu kién nhà't dinh bòi nhung chat ài nhàn, vi du nhu càc dàn chat cùa hydioxylamin Sau khi lién ké't vói chat ùfc che bi phàn giài thi hocit tmh cùa enzym dugc phiie hói Sau khi thùy phàn tùng phàn nhùng enzym két hgj) vói chat ùe che eó chùa P"^^ hoàc chymotrypsin két hgp vói N-

nitrophenylaxetat C*"*, nguòi ta da tìm thà'y 0-axyl-serin dành dàu trong nhung doan peptit co chuói axit amin gàn gióng nhau

—Gly- Asp

Gly Ser

Gly Ala Vói nhùng ké't qua cùa nhiéu loai thue nghiém khàc nhau, nguòi ta di dén két luàn ràng, ehinh nhóm serin cùa esterase va proteinase da tbiJc hién ebùc nàng cùa chà't nhàn tmng gian dói vói nhóm axyl trong càc phàn ùng thùy phàn càc co chat thién nhién hoac càc phàn ùng ké't hgp vói càc chat ùe che' Nhóm hydroxyl (OH ) cùa serin tu do, giò'ng nhu nhiJng nhóm ancol bàc nhà't khàc, rà't tra ve màt hoà hgc, nhimg khi eó nhùng diéu kién gay ra su phàn cuc cùa nhóm dò thi khà nàng phàn ùng cùa nò tàng lén rat nhiéu Trong phàn tu eó nhàn thom dà làm cho màt dò dién tu ò nguyén tu oxy cùa nhóm

OH bi giàm di ró lét, do dò nguyén tu bydro cùa nò de bi phàn ly va thay thè' bang nhùng nhóm tieh dién duong [1]

ir + H^

Trong phàn tu serin, ta khòng thà'y eó nhùng lién két dói va nhùng chat thè nhàn dién tu két hgp vói nhóm hydroxyl (-OH) (nhu truòng hgp cùa phenol) de gay ra su phàn cuc nhóm dò do su chuyén chó nói phàn tu cùa càc dién tu Nhu vày, io ràng là su tàng boat tinh cùa nhóm hydroxyl cùa serin trong trung tàm boat dóng cùa enzym nguyén thùy bàn là do ành huong cùa nhtTmg nhóiiì ebùc nàng khàc gàn ké vói nhóm này, va cùng vói nhóm này tham già vào tuong tàc tinh dién (hiéu ùng càm ùng ngoài, su tao thành lién két bydro ) Diéu này dugc ehirng minh thém khi nguòi ta nhàn xét thà'y ràng, nhóm hydroxyl cùa nhùng góc serin khàc cùa phàn tu enzym hoac cùa nhiìng góc serin trong trung tàm boat dòng cùa nhùng phàn tu enzym dà mà't

hoat tinh do nhijmg nhàn tÓ làm bié'n tinh, déu rat tro ve màt hoà hoc Trong càc peptit tóng hgp phòng theo cà'u tao mot doan cùa chuói peptit co chùa serin boat dóng trong phàn tu enzym esterase (vi dii trong tetrapeptit-Gly-Asp-Ser-Gly-) thi nhóm hydroxyl cùa Ser cùng rat tro [12]

Mot sé tàc già dua ra già thuyét ràng, trong tmng tàm boat dòng cùa esterase, nhóm hydroxyl (Ser) duge boat hoà nhò tàc diing qua lai vói nhóm carboxyl tu do cùa axit aspartie hoàc axit glutamie nàm canh serin trong chuói peptit, do su tao thành lién két bydro hoàc lién ké't este Tuy nhién, trong mot sÓ enzym khàc eó chùa serin, nhu subtilisin va photphoglucomutase nguòi ta khóng thà'y eó axit amin dicaeboxylie ò canh serin

1.2.5.Axit amin

Trong tìiòi truòng nuói cà'y té bào, càc axit amin phài dugc thém vào mói triròng nuói cà'y té bào, chùng duge su dung cho viéc tóng hgp protein va axit nucleic (ADN va RNA) [26] Chùng cùng tham già vào qua trình vàn chuyén ion Bòi vi càc axit amin là luong tinh, phàn ùng nhu là axit va bazo Càc axit amin tu do eó thè dóng vai trò nhu là càc chat dém [25] Khi thié'u càc enzym, té bào trong nuói cà'y khóng thè san xuàt tà't cà càc axit amin ma té bào dói bòi Trong in vitro, IO axit amin dugc coi là càn thiét, té bào khòng thè tu tóng ligi") duge: là arginin, bistidin, isoleucin, leuein, lysin, methionin, phenylalanin, thrionin, tryptophan, valin Nhiéu té bào dac biét là càc té bào giù chire nàng vàn chuyén eó dói bòi cao ve glutamin Trong mói tiiròng nuói cà'y lo lirng va càc cóng nghé nuói cà'y dac biét khàc eó thè dói bòi thém càc axit amin khàc chàng han serin cho viéc phàt trién té bào don le [30] Vi vày càc axit amin khàc ngoài 10 axit amin khòng thè thay thè thuòng duge thém vào hàu hét càc mói triròng nuòi cày té bào [27] Vi càc té bào chi su dung càc dóng phàn L cùa càc axit amin, càc dóng phàn D co thè bi han che, nhìn

chung trong mói truòng nuói cày té bào chi chùa càc L axit amin Nhùng axit amin ma té bào khòng tir tóng hgp dugc là nhu càu tÓi càn thiét cho su phàt trién cùa té' bào Vi nò là nguón du trù tao ADN va protein trong té bào, khóng chi trong qua trình nuói cà'y ma ngay cà trong dung dich trypsin dùng tàch nhimg té bào riéng ré tu càc mó Viéc dua thém nhùng axit amin này cùng rà't càn thiét

Chirong 2 VAT LIÈU VÀ PHl/ONG PHÀP THlTC NGHIÈM 2.1 Vat lìeu

2.1.1 Trang thiét bi va dung cu can thiét

- May do pH - Trùng gà da thu thai 9 ngày tuoi

- Kéo thàng, kéo cong, panh kep, panh thàng

- Bình càu thuy tinh chia vach 250 mi

- C h a i thuy tinh 1500 mi

- Pipet 1 mi, 2 mi, 5 mi, 10 mi

- Ung dong co Vcich 50 mi, 500 mi, 1000 mi

- Phéu thuy tinh

- Luói Igc nylon mets

- May khuà'y tu, nam chàm

- Kùih hién vi soi ngirgc

- Hot vó trùng (Laminar Flow air Cabinets)

- Càn dién, mày diéu nhiét

- Buóng dém té bào

2.7.2 Càc mai truòng càn thiét dùng de tàch va nuói cày té bào,

a Mói truòiig CMF^l (Calcium Magnesium Free llanks Balancel Salt Solution)