nghiên cứu thành phần hóa học vỏ quả măng cụt xanh

Xuất pháp từ những lý do đó chúng tôi tiến hành nhiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học vỏ quả măng cụt xanh Studying the compositon of Green fruit hulls of Garcinia Mangostana

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN VĂN ĐẬU

Hà Nội – 2011

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU i

DANH MỤC HÌNH VẼ v

DANH MỤC SƠ ĐỒ vi

LỜI MỞ ĐẦU 1

CH ƢƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Vài nét về họ bứa (Clusiaceae) 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật 3

1.1.2 Một số chi trong họ bứa (Clusiaceae) 3

1.2 Cây măng cụt (Garcinia mangostana L.) 4

1.2.1 Đặc điểm thực vật 4

1.2.2 Nguồn gốc và phân bố 5

1.2.3 Hóa thực vật của cây măng cụt 6

1.2.3.1 Tinh dầu 6

1.2.3.2 Các axit phenolic được tách ra từ quả măng cụt 6

1.2.3.3 Các xanthon được tách ra từ vỏ quả măng cụt 7

1.3 Công dụng và các hoạt chất sinh học 13

1.3.1 Ứng dụng trong y học dân gian 13

1.3.2 Các hoạt tính sinh học của cây măng cụt (Garcinia mangostana L.) 14

1.3.2.1 Hoạt tính chống oxy hóa 14

1.3.2.2 Hoạt tính kháng ung thư 16

1.3.2.3 Hoạt tính chống viêm và chống dị ứng 18

1.3.2.4 Hoạt tính chống khuẩn, chống nấm và chống virut 20

1.3.2.5 Hoạt tính chống sốt rét 22

CHƯƠNG 2 NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN VĂN 23

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.2.1 Phương pháp chiết và phân tách các hợp chất trong mẫu thực vật 23

2.2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách và phân lập sắc ký 23

2.2.2.1 Sắc ký lớp mỏng 23

2.2.2.2 Sắc ký cột 24

2.2.2.3 Phương pháp kết tinh lại 25

2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc (các phương pháp phổ) 25

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 26

3.1 Thiết bị và hóa chất 26

3.2 Nguyên liệu thực vật 26

3.3 Điều chế các phần chiết từ vỏ quả măng cụt xanh 26

3.4 Phân tích cặn GMD 27

3.4.1 Phân tích cặn GMD bằng TLC 27

3.4.2 Phân tách cặn GMD bằng CC 28

3.4.3 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các chất đã phân lập được từ phần chiết điclometan ( GMD) 29

3.4.3.1 Chất D1 29

3.4.3.2 Chất D2 29

3.4.3.3 Chất D3 29

3.5 Phân tích cặn GMB 30

3.5.1 Phân tích cặn GMB bằng TLC 30

3.5.2 Phân tách cặn GMB bằng CC 30

3.5.3 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các chất đã phân lập được từ phần chiết n-BuOH……….31

3.6 Thử hoạt tính sinh học 31

3.6.1 Hoạt tính chống oxi hóa DPPH 32

3.6.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh 33

3.6.2.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 33

3.6.2.2 Các chủng vi sinh vật kiểm định 33

3.6.2.3 Môi trường nuôi cấy 34

3.6.2.4 Cách tiến hành 34

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

4.1 Điều chế các phần chiết 36

4.2 Phân tích và phân tách cặn chiết diclometan (GMD) 38

4.2.1.Phân tích cặn chiết điclometan (GMD) bằng TLC 38

4.2.2 Phân tách cặn chiết điclometan (GMD) bằng CC 39

4.3 Phân tích và phân tách cặn chiết n- BuOH 40

4.3.1 Phân tích cặn n- BuOH bằng TLC 40

4.3.2 Phân tích cặn n- BuOH bằng CC 41

4.4 Hằng số vật lý của các chất đã phân lập được từ các phần chiết 42

4.4.1 Chất D1 42

4.4.2 Chất D2 43

4.4.3.Chất D3 43

4.4.4 Chất D4 43

4.5 Xác định cấu trúc các chất phân lập 43

4.5.1 Chất D1 43

4.5.2 Chất D2 45

4.5.3 Chất D3 46

4.5.4 Chất D4 48

4.6 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh và chống oxi hóa của một số xanthone 51

4.6.1 Hoạt tính chống oxy hóa DPPH 51

4.6.2 Hoạt tính kháng sinh 52

KẾT LUẬN 54

HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 63

DANH MỤC BẢNG BIỂU

2 Bảng 4 1 Hiệu suất các phần chiết từ vỏ quả măng

DANH MỤC SƠ ĐỒ

1 Sơ đồ 4 1 Quy trình chiết các lớp chất trong vỏ quả

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học và công nghệ, mức sống của con người ngày càng được nâng cao hơn Đặc biệt, trong lĩnh vực y – dược học, từ những năm đầu của thế kỉ XIX, việc kết hợp giữa các phương pháp khoa học kỹ thuật và các loại thực vật xuất phát từ thiên nhiên đã đưa con người tiến một bước lớn trong việc phát minh ra nhiều loại thuốc, có khả năng chữa nhiều căn bệnh

được cho là nan y ở các thế kỉ trước đó

Xanthon là một trong những khám phá mang tính tích cực của con người Giới khoa học đang tiếp tục nghiên cứu sâu về các xanthon vì những lợi ích bất ngờ cho cơ thể con người và khả năng tham gia vào nhiều vấn đề sức khỏe Trong công nghệ thực phẩm thì xanthon là thành phần tốt nhất từ trước đến nay mà chúng ta có được Nó được ví như một dưỡng chất thực vật đa năng trong lĩnh vực dinh dưỡng Bên cạnh đó, xanthon còn mang lại nhiều hoạt tính sinh học, nổi bật

là hoạt tính chống oxy hóa

Theo như nhiều nguồn thông tin thu thập trên thế giới cũng như trong nước, thì măng cụt là một trong “mười siêu trái cây”, mệnh danh là „‟ nữ hoàng trái cây‟‟, được xếp vào nhóm thực phẩm chức năng, chứa một lượng lớn các loại xanthon Điều này giải thích vì sao từ hàng nghìn năm nay, các chất pha chế từ quả măng cụt được sử dụng rộng khắp trên toàn thế giới như một phương thuốc chữa bệnh hay một loại thuốc bổ, có tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng viêm, giảm đau, kháng nấm, giúp hệ tiêu hóa tốt vv Gần đây, người ta còn khám phá ra khả năng chữa bệnh tim, tác dụng bảo vệ gan, mật, hay hơn nữa là chống được các bệnh như ung thư, HIV Tuy nhiên, điều đặc biệt ở chỗ, các hoạt tính đó của trái măng cụt xuất phát chủ yếu từ vỏ quả măng cụt – phần mà chúng ta thường loại bỏ sau khi lấy phần thịt quả

Cùng với yếu tố Việt Nam là một trong những nước có nguồn măng cụt với

số lượng lớn, phong phú trên thế giới, việc tập trung nghiên cứu, tìm hiểu hóa dược của trái măng cụt là cần thiết, có lợi, tận dụng được nguồn nguyên liệu sẵn

có Xuất pháp từ những lý do đó chúng tôi tiến hành nhiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu thành phần hóa học vỏ quả măng cụt xanh (Studying the compositon of Green fruit hulls of Garcinia Mangostana L.)”

Để góp phần nghiên cứu thành phần hóa học của vỏ quả măng cụt xanh các nhiệm vụ được đặt ra:

- Xây dựng phương pháp chiết hiệu quả với vỏ quả măng cụt xanh

- Khảo sát định tính và phân tách các chất từ vỏ quả măng cụt xanh

- Xác định cấu trúc các chất phân lập được từ vỏ quả măng cụt xanh

- Thử hoạt tính chống oxi hóa và kháng sinh đối với một số chất phân lập được

CH ƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Vài nét về họ bứa (Clusiaceae)

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Họ Bứa hay họ măng cụt có danh pháp khoa học: Clusiaceae (còn gọi là

Guttiferae, được Antoine Laurent de Jussieu đưa ra năm 1789), là một họ thực vật

có hoa bao gồm khoảng 27-28 chi và 1050 loài các cây thân gỗ hay cây bụi, thông

thường có nhựa trắng như sữa và quả hay quả nang để lấy hạt[3]

Đặc điểm thực vật: cây gỗ hay cây bụi thường xanh, cành thường mọc ngang Trong thân và lá có ống tiết nhựa mủ màu vàng Lá mọc đối đơn, nguyên, không có lá kèm Gân cấp hai thường gần thẳng góc với gân chính Hoa đều, nhỏ, thường đơn tính hoặc vừa đực vừa hoa lưỡng tính trên cùng một cây Mọc đơn độc hay họp thành cụm hoa Đài 2-6 tồn tại dưới quả Tràng 2-6 cánh dễ rụng nhị nhiều, tự do hay dính lại thành bó Bộ nhụy gồm 3-5 lá, noãn tạo thành bầu trên Quả khô mở vách hay quả thịt

Họ bứa được phân bố đều trên toàn thế giới, tập trung chủ yếu ở các vùng

có khí hậu nhiệt đới, ngoại trừ 2 chi Hypericum và Triadenum phân bố ở Trung

Quốc Nhiều loài trong số đó đã mang lại nhiều lợi ích cho các quốc gia Ví dụ như làm vật liệu xây dựng, dược phẩm, thuốc nhuộm, nhựa, mỹ phẩm (lấy tinh dầu), đặc biệt có những loài là trái cây bổ dưỡng cho con người (măng cụt, táo mammey) và được coi là một loại thuốc cổ truyền

1.1.2 Một số chi trong họ bứa (Clusiaceae)

Họ Bứa có 4 chi quan trọng sau:

Thứ nhất, chi bứa (Garcinia) có nguồn gốc ở Châu Á, Australia, vùng nhiệt

đới và miền nam Châu Phi và Polynesia Chi này có khoảng 50–300 loài cây thân

gỗ hay cây bụi thường xanh, hoa khác gốc và một vài loài có thể sinh sản vô tính

Tên gọi garcinia lấy theo tên của nhà thực vật học Laurence Garcia, người đã sưu

tập các mẫu cây cỏ và sống tại Ấn Độ vào thế kỷ 18

Thứ hai, chi Calophyllum (theo tiếng Hy Lạp nghĩa là lá đẹp) có khoảng

180–200 loài Chi này có nguồn gốc từ Madagascar, Đông Phi, phía Nam và Đông Nam Á (từ hướng Đông Pakistan cho tới Việt Nam và Indonesia), những hòn đảo Thái Bình Dương và Mỹ La Tinh

Thứ ba, chi Clusia gồm có khoảng 140–150 loài, phân bố chủ yếu ở các

vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, thường là các cây bụi hay cây leo (bò), có chiều cao từ trung bình lên tới 20m, với tán lá xanh Một số loài bắt đầu cuộc sống như những thực vật biểu sinh, rồi phát triển những gốc dài mà đi xuống tới nền, dần dần làm nghẹt và giết chết cây chủ, rất giống với cây đa

Thứ tư, chi Mammea gồm khoảng 50 loài, được phân bố rải rác trên thế

giới Chúng được tìm thấy ở vùng nhiệt đới của Mỹ và Tây Ấn Độ, Châu Phi, Madagascar; Indonexia, Malaysia và Thái Bình Dương Quả chỉ có một hạt, ăn được

1.2 Cây măng cụt (Garcinia mangostana L.)

Măng cụt có tên tiếng Anh, Mỹ là mangosteen; Pháp: Mangoustanier;

Trung Quốc: Sơn trúc tử; Thái Lan: Mankhut[2- 4]

quả rất dai, xốp, màu đỏ như rượu vang chứa 5-8 hạt, quanh hạt có lớp áo hạt

trắng, ngọt ngon [4]

1.2.2 Nguồn gốc và phân bố

Măng cụt được khai hóa đầu tiên ở Thái Lan hoặc My-an-mar, cách đây ít nhất 2000 năm, và sau đó được mở rộng sang những vùng nhiệt đới khác Hiện có khoảng 10 loài khác nhau được trồng để lấy quả Cây măng cụt ưa khí hậu nóng

ấm Ở Việt Nam loài cây này được trồng phổ biến ở đồng bằng Sông Cửu Long và Đông Nam Bộ, nhiều nhất ở Lái Thiêu, Thủ-Dầu-Một Ở các nước Đông Nam Á, măng cụt được trồng nhiều tại Thái Lan, Cam-pu-chia, My-an-mar, Sri Lanka và Phi-lip-pin

Măng cụt cho trái sau 10–15 năm trồng nhưng cây có thể sống trên 50 năm Cây tốt có thể cho trái sau 7–8 năm trồng (vùng Lái Thiêu, Thủ-Dầu-Một, Việt Nam) Tại miền nam nước ta, măng cụt trổ hoa vào tháng 1 – 2 dương lịch và

bắt đầu thu trái từ tháng 5 đến tháng 8 dương lịch[4]

Hình 1.1 Hình ảnh cây măng cụt ( Garcinia Mangostana L.)

Hình 1.2 Hình ảnh quả măng cụt ( Garcinia Mangostana L.)

1.2.3 Hóa thực vật của cây măng cụt

1.2.3.2 Các axit phenolic được tách ra từ quả măng cụt

Theo các nghiên cứu trước đây, đã có khoảng 10 axit phenolic (chủ yếu là

các dẫn xuất của axit hydroxybenzoic) được xác định trong cây măng cụt thông qua

GC-MS Ngoài một số axit như vanillic, veratric, caffeic, coumaric, ferulic,

p-hydroxyphenylaxetic, benzoic, cinnamic, mandelic thì nổi trội lên là một số axit

phenolic có hàm lượng lớn hơn hẳn ở các bộ phận khác nhau của cây măng cụt như:

axit protocatechuic (vỏ quả và vỏ cây); axit p-hydroxybenzoic (áo hạt); axit

m-hydroxybenzoic (vỏ quả); 3,4–dihydroxymandelic (vỏ cây) [8, 28,37,49]

OH O

OH

OH 3,4 – dihydroxymandelic axit protocacheuic

OH

OH O

OH O

O H

axit p-hydroxybenzoic axit m-hydroxybenzoic

1.2.3.3 Các xanthon được tách ra từ vỏ quả măng cụt

Trái măng cụt đã được chỉ ra là có chứa một lượng lớn các chất chuyển hóa thứ cấp như là prenyl xanthon và oxygen xanthon[13,14, 28, 49]

Xanthon hay xanthen-9H-one là chất chuyển hóa thứ cấp được tìm thấy

trong một số họ thực vật lớn, nấm và địa y Chúng là một trong những ngành quan

trọng của hợp chất dị vòng được oxy hóa Khung cơ bản của xanthon được biết đến như 9-xanthenone hay dibenzo-γ-pyron và được sắp xếp một cách cân đối

(hình 3) Các nguyên tử cacbon được đánh số theo sự thuận tiện của tổng hợp sinh

học Các nguyên tử cacbon ở vị trí từ 1-4 được đánh số theo vòng B có nguồn gốc

từ shikimate, và cacbon từ 5-8 được đánh số theo vòng A có nguồn gốc từ axetat [15, 27]

Hình 1.3 Khung cơ bản của xanthon

Xanthon được phân thành năm nhóm: xanthon oxy hóa đơn giản, xanthon glycosid, prenyl xanthon, xanthonolignoid và xanthon miscellaneous Trong đó, các xanthon oxy hóa đơn giản lại được chia nhỏ thành 6 nhóm theo mức độ oxy

hóa[9, 15, 23, 30, 38]

Năm mươi xanthon đã được tách ra từ vỏ quả măng cụt Hợp chất đầu tiên

trong số chúng được đặt tên là mangostin (1) (sau được đổi thành α-mangostin),

được tách ra vào năm 1855 (Schmid, 1855) Chất này mang màu vàng, thu được từ

vỏ hoặc nhựa khô của cây măng cụt (Dragendorff, 1930)

Sau này, Dragendorff (1930) và Murakami (1932) đã làm sáng tỏ cấu trúc của mangostin Yates và Stout (1958) đã đưa ra công thức phân tử, phân loại và vị trí của các nhóm thế của α-mangostin Hơn thế nữa, Dragendorff (1930) cũng đã

tách được β-mangostin (2), cấu trúc của hợp chất này vẫn chưa được làm sáng tỏ

cho đến năm 1968 (Yates và Bhat, 1968) Jefferson (1970) và Govindachari và Muthukumar-aswamy (1971) cũng tách được α và β-mangostin

Một số xanthon khác được tách ra từ vỏ quả măng cụt được trình bày trong

Bảng 1.1 Các xanthon được tách từ vỏ quả măng cụt

STT Tên hợp chất Công thức cấu

Theo nhiều báo cáo, α, β và γ-mangostin, gartanin, 8-deoxy gartanin, garcinone E là những xanthon đƣợc nghiên cứu nhiều nhất do mang nhiều hoạt tính sinh học

1.3 Công dụng và các hoạt chất sinh học

1.3.1 Ứng dụng trong y học dân gian

Trái măng cụt thơm ngon cũng còn cống hiến nhiều môn thuốc Từ lâu, ở

Á châu, bên Ấn Độ, hệ thống y học ayurvedic đã kê nó vào nhiều thang thuốc cổ truyền, đặc biệt chống viêm, chữa tiêu chảy, ức chế dị ứng, làm giãn phế quản trong cuộc điều trị hen suyễn Nó cũng được xem như là thuốc chống dịch tả, bệnh lỵ, kháng vi khuẩn, kháng vi sinh vật, chống suy giảm miễn dịch Người Thái dùng nó để chữa vết thương ngoài da Người Malaysia, Philipin dùng nước sắc vỏ chữa lỵ, đau bụng, đi tiêu lỏng, bệnh vàng da Ngoài ra, người ta còn dùng

lá và vỏ cây măng cụt sắc lấy nước làm thuốc hạ nhiệt, điều trị bệnh tưa miệng ở trẻ em, nấm candida ở phụ nữ và rối loạn đường tiết niệu Rễ cây măng cụt sắc lấy nước uống giúp điều hòa kinh nguyệt Nước sắc vỏ quả cũng được dùng làm nước

rửa âm đạo trong trường hợp bị bệnh bạch đới, khí hư[3]

Tinh dầu trích từ vỏ măng cụt được dùng để chữa bệnh eczema (chàm bội nhiễm) và các rối loạn về da khác

Vỏ măng cụt đem sắc lấy nước uống còn chữa được viêm bàng quang, và dùng ngoài da để chữa bệnh lậu, ung nhọt

Theo Đông y, vỏ quả măng cụt có vị chua chát, tính bình, đi vào hai kinh phế và đại tràng, có công năng thu liễn, sáp trường, chi huyết, dùng trị tiêu chảy, ngộ độc chất ăn, khi bệnh thuyên giảm thì thôi, dùng lâu sinh táo bón Sau đây là một số bài thuốc từ quả măng cụt: chữa tiêu chảy, kiết lỵ, tiêu độc, chữa rối loạn tiêu hóa

- Lấy khoảng mười cái vỏ cho vào một nồi đất, đậy thật kín bằng một tàu

lá chuối Sau đó đun sôi cho đến khi nước có màu thật sẫm, uống mỗi ngày 3-4 chén

- Ở vùng nóng người ta còn phối hợp với các vị thuốc khác; bài 1: vỏ Măng cụt khô 60g, hạt Mùi 5g hạt thìa là 5g đem sắc với 1200ml nước Ðun sôi kỹ, còn lại 600ml chiết ra để uống, ngày hai lần, mỗi lần 120ml Nếu là người lớn, đau bụng, có thể thêm thuốc phiện; bài 2: vỏ quả măng cụt (1 quả), rau sam, rau má,

cỏ mực mỗi thứ 20 gam, cỏ sữa lá nhỏ (hoặc lớn), rễ cây mua mỗi thứ 8 g, cam thảo đất, vỏ quýt, gừng tươi mỗi vị 4 g, thêm 1 lít nước, sắc còn phân nửa, uống trong ngày

- Lấy một nắm vỏ khoảng 50g, đem cắt ra từng khoanh, cho vào nồi đất với hai bát nước, sắc như sắc thuốc, đun nhỏ lửa cho sôi từ 15-30 phút Sau đó để nước âm ấm, chiết lấy nước uống làm nhiều lần, mỗi lần độ 1 ly nhỏ Thuốc sắc ngày nào thì uống trong ngày đó, có thể thêm đường để uống và đỡ khát

- Lấy vỏ quả măng cụt thái nhỏ, phơi khô, tẩm rượu, sao thơm rồi tán thành bột mịn Khi ăn phải những thức ăn ôi thiu gây rối loạn tiêu hóa, ăn không tiêu, đi

tả, nôn mửa nên lấy ngay một thìa bột thuốc nói trên hòa với nước đun sôi, cho thêm ít muối trắng, uống ngay lúc nước còn nóng sẽ thấy đỡ

1.3.2 Các hoạt tính sinh học của cây măng cụt (Garcinia mangostana L.)

1.3.2.1 Hoạt tính chống oxy hóa [13,22,24, 26, 41]

Năm 1994, Yoshikawa và các cộng sự thực hiện phương pháp dọn gốc diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) đối với phần chiết metanol từ vỏ quả măng cụt

2,2-α và β mangostin đã chỉ ra hoạt tính chống oxy hóa thông qua sử dụng phương pháp sắt thiocyanat Năm 1995, Williams và các cộng sự đã phát hiện ra α-mangostin làm giảm quá trình oxy hóa LDL (low density lipoproteins) đối với con người, được cảm ứng bởi đồng hay gốc peroxyl Họ cũng phát hiện ra rằng α-mangostin, thứ nhất là kéo dài thời gian chậm trế của các đien liên hợp ở 234 nm

theo liều lượng, thứ hai là giảm bớt quá trình sản xuất TBARS (thiobarbituric reactive substances), và thứ ba là làm giảm khả năng tiêu thụ α-tocopherol, được cảm ứng bởi sự oxi hóa LDL Sau đấy, năm 2000, Mahabusarakam và các cộng sự cũng nhận ra rằng α-mangostin và những dẫn xuất tổng hợp từ đó ngăn cản quá trình giảm mức tiêu thụ α-tocopherol, được cảm ứng bởi sự oxy hóa LDL Những tác giả này cũng nhận ra rằng sự thay đổi cấu trúc của α-mangostin cũng làm thay đổi hoạt tính chống oxy hóa Cụ thể, sự thay thế giữa C-3 và C-6 với dẫn xuất aminoethyl làm tăng hoạt tính; bất kỳ sự thay thế nào cùng với các nhóm metyl, axetat, propanediol hay nitrile đều khử hoạt tính chống oxy hóa

Mặt khác, Leong và Shui (2002) đã so sánh toàn bộ khả năng chống oxy hóa của 27 loại trái cây có giá trị trên thị trường Singapo, bao gồm cả măng cụt, có

sử dụng phép phân tích ABTS và DPPH; và họ chỉ ra rằng các chất tách ra từ trái măng cụt có vị trí thứ 8 về hiệu quả chống oxy hóa

Năm 2006, Weecharangsan và các cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ thần kinh của bốn phần chiết thu được từ vỏ trái măng cụt (bao gồm: nước, 50 % etanol, 95 % etanol, và etyl axetat) Khả năng chống oxy hóa được đánh giá dựa vào phương pháp DPPH sử dụng 1, 10, 50 và 100 μg/mL ở mỗi phần chiết Phần chiết từ nước và etanol (50 %) chỉ ra khả năng chống oxy hóa cao (nồng độ ức chế theo thứ tự định sẵn ở 50 % (IC50) là 34,98 ± 2,24 và 30,76 ± 1,66 μg/mL) Khả năng chống oxy hóa của những phần chiết này được kiểm

nghiệm trên dòng tế bào ung thư ngoài sọ (neuroblastoma – NG108-15) thông qua

H2O2; cả 2 phần chiết đều bộc lộ tính bảo vệ thần kinh khi được sử dụng ở nồng

độ 50 μg/mL Phần chiết chứa 50 % etanol có tính bảo vệ thần kinh cao hơn phần chiết nước Gần đây hơn, năm 2007, Chomnawang và các cộng sự đã chỉ ra là cặn chiết etanol từ măng cụt sở hữu hoạt tính chống oxy hóa đáng kể, được xác định thông qua sự ức chế về thông tin của các gốc DPPH là 50 % Phần tách ra này đã thể hiện chỉ số IC50 ở 6,13 μg/mL bằng cách so sánh với các cặn etanol của

Houttuynia cordata, Eupatorium odoratum và Senna alata (theo thứ tự IC50 là 32,53, 67,55 và 112,46 μg/mL) Thêm vào đó, phần chiết từ trái măng cụt khử

được đáng kể sản phẩm ROS (reactive oxygen species) của PML (polymorphonuclear leucocytes) với 77,8 % tỉ lệ ức chế superoxide anion, theo thứ

tự là 62,6 %, 44,9 % và 35,18 % Cũng trong năm 2007, Haruenkit và các cộng sự

đã chỉ ra tính chống oxy hóa của măng cụt dựa vào phân tích DPPH và ABTS Họ

đã tìm ra chỉ tiêu của các chất tương đương trolox trên 100 g tính theo khối lượng tươi, theo các phân tích DPPH và ABTS lần lượt là 79,1 và 1268,6 μM Bên cạnh

đó, với các loài chuột được cho ăn theo khẩu phần ăn kiêng cơ bản bổ sung thêm 1% cholesterol cộng với 5% măng cụt thì sự tăng thể huyết tương và sự giảm tính chống oxy hóa được thấy rõ với việc ngăn cản mỗi cholesterol

Năm 2004, Moongkarndi và các cộng sự đã chỉ ra rằng phần chiết từ măng cụt làm giảm hiệu quả quá trình sản xuất ROS nội bào, thông qua phương pháp DCFH-DA (2,7-dichlorofluorescein diacetate) trong dòng tế bào SKBR3

Năm 2008, Chin và các cộng sự đã nghiên cứu khả năng hoạt động loại bỏ

HO. của các xanthon tách ra từ măng cụt Trong số 16 xanthon được kiểm nghiệm chỉ có duy nhất γ-mangostin có khả năng này (IC50 0,2 μg/mL) Sau đó, họ cũng kiểm tra các xanthon tương tự thông qua quá trình cảm ứng của khử quinone ( QR, phase II drug-metabolizing enzyme), thử nghiệm trên các tế bào murine hepatoma Tất cả các xanthon, ngoại trừ α-mangostin đều gây cảm ứng với hoạt động khử

QR Nồng độ làm gấp đôi giá trị hoạt động cảm ứng QR của các hợp chất trên lần lượt là: 1,3 μg/mL ( 1,2-dihydro-1,8,10-trihydroxy-2-(2-hydroxypropan-2-yl)-9-(3-methylbut-2-enyl)furo[3,2-a]xanthen-11-one), 2,2 μg/mL (6-deoxy-7-demethylmangostanin), 0,68 μg/mL (1,3,7-trihydroxy-2,8-di-(3-methylbut-2-enyl)xanthon, 0,95 μg/mL (mangostanin)

1.3.2.2 Hoạt tính kháng ung thư

Rất nhiều nghiên cứu cho thấy xanthon trong vỏ măng cụt có hoạt tính chống ung thư[13,31] Các loại dòng tế bào như: Dòng tế bào ung thư biểu mô gan,

dòng tế bào ung thư vú ở người SKBR3 và dòng tế bào bạch cầu ở người được sử dụng

Năm 2002, Ho và các cộng sự đã nhận ra rằng garcinone E gây hiệu quả độc tố tế bào rất mạnh mẽ trên dòng tế bào ung thư biểu mô gan Họ đã nghiên cứu hiệu quả độc tố tế bào của 6 xanthon được tách ra từ vỏ quả măng cụt và nhận thấy rằng garcinone E là độc tố tốt nhất Chính vì vậy, garcinone E được thử nghiệm chống lại các dòng tế bào ung thư gan HCC36, TONG, HA22T, Hep3B, HepG2 và SK-Hep-1; dòng tế bào ung thư phổi NCI-Hut 125, CH27 LC-1, H2891

và Calu-1; dòng tế bào ung thư dạ dày AZ521, NUGC-3, KATO-III và AGS Garcinone E đã tỏ rõ sự phân bố lớn về hiệu quả phụ thuộc liều lượng và thời gian độc tố tế bào chống lại các dòng tế bào ung thư khác nhau; ngoại trừ tế bào ung thư phổi CH27 LC-1, tất cả các dòng tế bào được kiểm nghiệm đều bị tiêu diệt Chỉ số về liều lượng gây chết người ở garcinone 50% (LD50) chống lại các dòng tế bào trên là khoảng từ 0,1–5,4 μM Hiệu quả chống ung thư của garcinone E theo thứ tự là như sau: SK-hep-1 > HA22T > HepG2 > Hep3B > HCC36

Năm 2003, Matsumoto và các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của 6 xanthon (α, β và γ-mangostin, mangostinone, garcinone E và 2-isoprenyl-1,7-dihydroxyl-3-methoxy xanthon) được tách ra từ vỏ quả măng cụt với khả năng ức chế sự phát triển tế bào của dòng tế bào mắc bệnh bạch cầu ở người HL60 Họ đã khảo sát hiệu quả độc tố tế bào 72h tính từ sau khi ủ bệnh với các xanthon ở 5 hay

40 μM Tất cả các xanthon đã chỉ ra hiệu quả ức chế hoàn toàn, nhưng α, β và mangostin hiệu quả hoàn toàn từ 10 μM trở đi Hợp chất có hàm lượng lớn nhất trong cặn là α-mangostin, đó cũng là chất có hoạt tính ức chế cao nhất (IC50 10 μM) Sau này, α- mangostin được phát hiện ra là có cả hiệu quả đối với các dòng

γ-tế bào mắc bệnh bạch cầu khác: K562, NB4 và U937 Những dòng γ-tế bào này thường bị α- mangostin ức chế ở 5–10 μM

Năm 2005, Matsumoto và các cộng sự đã nghiên cứu khả năng chống tăng trưởng của 4 prenyl xanthon (α, β, γ-mangostin và methoxyl-β- mangostin) trên tế bào ung thư ruột người DLD-1 Ngoại trừ methoxyl-β- mangostin, 3 xanthon còn lại ức chế mạnh mẽ sự phát triển tế bào ở 20 μM và 72h; khả năng chống ung thư của chúng phụ thuộc vào số nhóm hydroxy

Năm 2006, Suksamrarn và các cộng sự đã tách được 3 prenyl xanthon mới

từ vỏ quả măng cụt (mangostenones C, D và E), cùng với 16 xanthon được biết đến trước đó Khả năng gây độc tố tế bào của các xanthon này được kiểm nghiệm chống lại 3 dòng tế bào ung thư khác nhau: ung thư biểu bì mồm (KB), ung thư vú (BC-1), và ung thư phổi (NCI-H187) Mangostenone C đã được chứng minh hiệu quả độc tố tế bào chống lại 3 dòng tế bào này, với IC50 theo thứ tự là 2,8, 3,53, 3,72 μg/mL Tuy nhiên, α-mangostin hiệu quả nhất với tế bào BC-1 (IC50 0,92 μg/mL), tốt hơn thuốc ellipticine (IC50 1,46 μg/mL); α-mangostin cũng có hiệu quả độc tố tế bào chống lại tế bào KB (IC50 2,08 μg/mL); và gartanin cũng có thể

ức chế sự tăng trưởng của NCI-H187 (IC50 1,08 μg/mL)

Năm 2007, Nakagawa và các cộng sự đánh giá hoạt tính của α-mangostin thông qua thí nghiệm với các tế bào DLD-1 Kết quả là số lượng tế bào quan sát được bị giảm đi nhờ xử lý với mangostin 20 μM Hiệu quả càng rõ rệt hơn khi xử

lý kết hợp giữa mangostin 2,5 μM với 5-fluorouracil 2,5 μM (5-FU)

Tóm lại, các kết quả chỉ ra rằng α-mangostin và các chất tương tự có thể sẽ

là những “ ứng cử viên” trong việc chữa và điều trị ung thư

1.3.2.3 Hoạt tính chống viêm và chống dị ứng

Có những bằng chứng về khả năng chống viêm và chống dị ứng của măng cụt trên những mẫu thí nghiệm khác nhau, ví dụ như tế bào RBL-2H3 (2002) và tế bào u thần kinh đệm ở chuột (2002, 2004, 2006), động mạch chủ ở ngực loài thỏ và khí

quản ở chuột lang (1996) và vài mẫu thí nghiêm trên loài gặm nhấm (1979, 2004) [11- 13,18,20,21,33-36, 43-48]

Năm 1979, Shankaranarayan và các cộng sự đã tạo ra các dẫn xuất tổng hợp từ xanthon (3-O-methyl mangostin, 3,6-di-O-methyl mangostin, mangostin triaxetat, 1-isomangostin, mangostin-3,6-di-O-(tetra axetyl)-glucosid và mangostin-3,6-di-O-glucosid) từ α-mangostin, được sử dụng trong nghiên cứu dược lý, cũng giống như α-mangostin Khả năng hoạt động trong miệng và bụng

(50 mg/kg) của α-mangostin, 1-isomangostin và mangostin triaxetat đã thể hiện hoạt tính chống viêm trên các loài gặm nhấm, được kiểm nghiệm khi dùng chích qua màng phúc mô hay khi cho uống nơi chuột bị gây phù chân bằng carrageenan, hay bằng cách cấy cục bông gòn dưới da Các chất này không có hiệu ứng ổn định màng tế bào Trong phần tác dụng lên hệ trung ương, chúng ta thấy mangostin ức chế tổng hợp COX-2, đó cũng là một cơ chế chống viêm

Năm 2002, Nakatani và các cộng sự sử dụng dịch chiết etanol 100 %, 70

%, 40 % và nước, tìm thấy dung dịch etanol 40% ức chế phóng thích histamin qua trung gian IgE Dung dịch này cũng ức chế tổng hợp prostaglandin E-2 (PGE-2) Phản ứng phản về qua da thụ động bị ức chế đáng kể bởi dịch chiết 40% Tác dụng

chống dị ứng của dung dịch này mạnh hơn dung dịch một loại cây ngấy (Rubus

suavissimus) thường dùng ở Nhật

Gần đây, năm 2008, Chen và các cộng sự đã chứng minh rằng α và mangostin ức chế hiệu quả quá trình sản xuất NO. và độc tố tế bào đến các tế bào RAW 264,7 Số lượng sản xuất NO. ở 3 đến 25 μM được xác định liên lục, chỉ số

γ-IC50 đối với α và mangostin là 12,4 và 10,1 μM Hai hợp chất là α và mangostin cũng khử một cách hiệu quả quá trình tổng hợp PGE2 (IC50 11,08 và 4,5 μM) Hiệu quả của những xanthon này được thông qua bằng cách xác định sự cảm ứng của iNOS (nitric oxide synthase) và enzym COX

γ-Cơ quan cảm nhận IgE gây hoạt động truyền tính trạng tín hiệu trong tế bào, dẫn tới sự giải phóng chất trung gian gây bị viêm, ví dụ như histamin Đây chính là khả năng quan trọng nhất trong vài giả thiết về dị ứng Dựa trên những thông tin đó, Itoh và các cộng sự (2008) đã giải thích rằng các xanthon được tách

ra từ quả măng cụt (α, β và γ- mangostin), ngăn cản quá trình mất hạt nhỏ của bạch cầu trong hoạt động Ag gián tiếp của IgE trên tế bào bạch cầu RBL-2H3 ở chuột Các tác giả này cũng giải thích rằng cơ chế ức chế của quá trình mất hạt nhỏ nhờ xanthon là do sự ngăn cản của đường chạy SYK/PLCγs/PKC

Tất cả những dữ liệu kể trên chỉ ra rằng các xanthon được tách ra từ quả măng cụt có thể là một mục tiêu mới về các hợp chất chống viêm và chống dị ứng

1.3.2.4 Hoạt tính chống khuẩn, chống nấm và chống virut [13,18]

Năm 1983, Sundaram và các cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống vi khuẩn và chống nấm của α–mangostin và 4 dẫn xuất của nó Họ nhận thấy rằng vi

khuẩn S aureus, P aeruginosa, Salmonella typhimurium và Bacillus subtilis dễ bị tổn thương cao đối với các xanthon này; ngược lại các vi khuẩn Pro-teus sp,

Klebsiella sp và Escherichia coli chỉ bị tổn thương ở một mức độ nào đấy Về

nấm, α–mangostin và 4 dẫn xuất của nó có tác dụng ức chế mạnh mẽ với các loại

Epidermophyton floccosum, Alternaria solani, Mucor sp., Rhizupus sp và Cunninghamella echinulata, ngược lại Trichophyton mentagrophytes,

Microsporum canis, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Penicillium sp., Fusarium roseum và Curvularia lunata chỉ bị tổn thương nhẹ Nồng độ ức chế tối

thiểu (MIC, nồng độ thấp nhất của hợp chất chống vi khuẩn gây ức chế sự tăng trưởng có thể quan sát được của vi sinh vật sau giai đoạn ủ bệnh) của α–mangostin

là giữa 12,5 và 50 μg/mL đối với vi khuẩn, giữa 1 và 5 μg/mL đối với nấm Sự sắp xếp về khả năng kháng khuẩn và kháng nấm như sau: α–mangostin > isomangostin > 3-O-metyl mangostin > 3,6-di-O-metyl mangostin Mangostin triaxetat không có hoạt tính

Năm 1986, Mahabusarakam và các cộng sự đã điều tra về hoạt tính chống khuẩn của mangostin, gartanin, γ-mangostin, 1-isomangostin và 3-isomangostin

được tách từ trái măng cụt chống lại S aureus, cả chủng bình thường lẫn chủng

kháng penicillin Chỉ số MIC (μg/mL) của các hợp chất được sắp xếp theo thứ tự sau: đối với các chủng bình thường là methicillin (3,9) > α–mangostin (15,6) > γ-mangostin (31,2) > 1-isomangostin (62,5) > 3-isomangostin (125) > gartanin (250); đối với các chủng kháng penicillin là α–mangostin (1,56-12,5) > methicillin (1,56-12,5) > 1-isomangostin (125) > 3-isomangostin (250), γ-mangostin (250) và gartanin (250) Thêm vào đó, hoạt tính của mangostin, gartanin và γ-mangostin

chống lại Candida albicans, Cryptococcus neoformans, T mentagrophytes và

Microsporum gypseum cũng được kiểm nghiệm; kết quả là có hoạt tính trung bình

chống lại T mentagrophytes, Microsporum gypseum nhưng lại không thể hiện hoạt tính chống lại C albicans, C neoformans

Năm 1996, Linuma và các cộng sự đã nghiên cứu hiệu quả ức chế của vài

xanthon, được tách ra từ vỏ quả măng cụt, chống lại sự tăng trưởng của S.aureus

đề kháng methicillin (MRSA–methicillin resistant S.aureus) α–mangostin ức chế

hiệu quả rõ rệt, với chỉ số MIC từ 1,57-12,5 μg/mL

Năm 2003, Saksamrarn và các cộng sự đã nghiên cứu khả năng chống vi trùng lao của các prenyl xanthon lấy từ vỏ quả măng cụt Trong số chúng, α và β-mangostin và garcinone B thể hiện hiệu quả ức chế thuyết phục nhất chống lại vi

trùng lao Mycobacterium tuberculosis, với chỉ số MIC là 6,25 μg/mL, ngược lại,

demthylcalabaxanthon và trapezifolixanthon có chỉ số MIC là 12,5 μg/mL, mangostin, garcinone D, mangostanin, mangostenone A và tovophyllin B có chỉ

γ-số MIC là 25 μg/mL Các xanthon có khả năng chống lại vi trùng lao thấp hơn là mangostenol và mangostanol có chỉ số MIC lần lượt là 100 μg/mL và 200 μg/mL

Năm 1994, Phongpaichit và các cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của α và γ-mangostin và hỗn hợp mangostin trên 49 chủng MRSA, được lấy từ các bệnh nhân ở bệnh viện Songklanagarind; 50 chủng MRSA, 13 chủng

Enterococcus spp, được lấy từ các bệnh nhân ở bệnh viện Maha-raj Nakorn

Chiang Mai Hỗn hợp mangostin có hiệu quả thuyết phục nhất chống lại MRSA (MIC 1,48 μg/mL), α và γ-mangostin lần lượt là 3,12 và 2,26 μg/mL Đối với tất

cả các chủng Enterococcus spp, mangostin ức chế sự tăng trưởng của chúng ở 1

μg/mL

Vài sản phẩm tự nhiên được xác định nhờ vào khả năng ức chế những trạng thái khác nhau đối với chu kỳ của virut làm mất khả năng miễn dịch ở người (HIV-1) Năm 1996, Chen và các cộng sự đã chỉ ra rằng cặn chiết etanol của trái măng cụt ức chế rất hiệu quả với HIV-protease Hai xanthon được tách ra từ cặn

này là α và β-mangostin, theo thứ tự thể hiện chỉ số IC50 5,12 ± 0,41 và 4,81 ± 0,32 μM Tính chất ức chế này không cạnh tranh

Gần đây, năm 2007, Rassameemasmaung và các cộng sự đã nghiên cứu hiệu quả của một loại thuốc súc miệng từ dược thảo có chứa thành phần chiết từ

vỏ quả măng cụt, thông qua thử nghiệm trên 60 người, được chẩn đoán mắc phải bệnh viêm lợi kinh niên ở mức độ nhẹ nhàng hay vừa phải Kết quả là có tác dụng chống lại các hợp chất chứa lưu huỳnh dễ bay hơi, bệnh bựa răng và chảy máu răng Chính vì vậy, phần chiết từ vỏ quả măng cụt có thể được sử dụng như một tác nhân bổ sung trong việc điều trị hơi thở hôi thối

1.3.2.5 Hoạt tính chống sốt rét [13]

Một vài xanthon được tách ra từ măng cụt đã chỉ ra hoạt tính chống sốt rét

chống lại plasmodium falciparum trong phòng thí nghiệm β-mangostin và

α-mangostin thể hiện giá trị IC50 theo thứ tự lần lượt là 7 và 5,1 μM, trong khi đó mangiferina - một xanthon glucosid, lại thể hiện chỉ số IC50 cao hơn 50 μM (2005) Mặt khác Mahabusarakam và các cộng sự ( 2006) lại nhận ra rằng α – mangostin lại thể hiện chỉ số IC50 là 17 μM chống lại P.falciparum

CHƯƠNG 2 NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN VĂN

1- Xây dựng một quy trình chiết thích hợp để điều chế các phần chiết chứa các hợp chất hữu cơ thiên nhiên từ vỏ quả măng cụt xanh

2- Nghiên cứu quy trình phân tích và phân tách các phần chiết nhận được từ

vỏ quả măng cụt xanh

3- Phân lập các hợp chất trong các phần chiết nhận được

4- Xác định cấu trúc của các hợp chất được phân lập

5- Thử hoạt tính kháng sinh và chống oxi hóa của một số hợp chất phân lập

được

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp chiết và phân tách các hợp chất trong mẫu thực vật

Ngâm chiết mẫu thực vật đã phơi khô bằng EtOH Để tăng hiệu suất chiết tiến hành ngâm chiết nhiều lần, mỗi lần ngâm trong 3 ngày Phần chiết EtOH này sau đó được phân bố giữa H2O và các dung môi hữu cơ khác nhau nhằm làm giàu các lớp chất theo độ phân cực tăng dần

2.2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách và phân lập sắc ký

2.2.2.1 Sắc ký lớp mỏng

Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) là một phương pháp hiện đang được sử dụng rất rộng rãi trong các ngành khoa học hoá học, sinh học, hoá dược với nhiều mục đích khác nhau do các đặc tính ưu việt của nó: độ nhạy cao, lượng mẫu phân tích nhỏ (thường từ 1 đến 100x10-6

g), tốc độ phân tích nhanh, kỹ thuật phân tích dễ thực hiện Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) có thể được dùng để phân tích định tính hay định lượng hoặc kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất cũng như hỗ trợ

cho các phương pháp sắc ký cột để xác định và kiểm soát điều kiện phân tách Đối với sắc kí bản mỏng, việc lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy sắc kí cho Rf tốt

là quan trọng nhất Cụ thể với yêu cầu khảo sát hỗn hợp thì chọn dung môi sao cho các vệt tròn, sắc nét, rải đều trên toàn bản và có Rf càng xa nhau càng tốt

Rf 

Hình 2.2 Sắc ký cột

2.2.2.3 Phương pháp kết tinh lại

Phương pháp này được sử dụng để tách và làm sạch chất rắn Việc làm sạch chất rắn bằng kết tinh là dựa trên sự khác nhau về độ tan của hợp chất mục tiêu và của tạp chất trong dung môi hoặc một hệ dung môi đã chọn

2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc (các phương pháp phổ)

Các phương pháp phổ hiện nay là các phương pháp hiện đại và hữu hiệu nhất

để xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ bao gồm:

- Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS);

- Phổ khối lượng phun bụi điện tử (ESI-MS);

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) với chương trình DEPT;

chuẩn nội zero

3.2 Nguyên liệu thực vật

Mẫu nghiên cứu là vỏ quả măng cụt có nguồn gốc từ miền Nam, được thu gom vào tháng 7 năm 2010 Sau khi bỏ cuống, tách bỏ phần thịt quả, vỏ quả măng cụt được rửa sạch, đem phơi khô ở nhiệt độ thường, trong bóng râm Sau đó, mẫu khô được đem nghiền thành dạng bột nhỏ, thu được 2,0 kg bột

3.3 Điều chế các phần chiết từ vỏ quả măng cụt xanh

Phần tổng quan về thành phần hóa học của cây măng cụt nói chung cho thấy trong vỏ quả măng cụt chủ yếu có chứa các xanthon, là các hợp chất đều có

độ phân cực khá, do đó việc chiết chủ yếu được thực hiện ở các dung môi có độ phân cực trung bình trở lên như điclometan,n-butanol, etyl axetat, axeton

2,0 kg vỏ quả măng cụt được ngâm trong etanol 96 % ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày Sau đó, lọc lấy dịch chiết, bã nguyên liệu lại được ngâm tiếp với etanol Quá trình này được tiến hành tương tự như vậy 4 lần Dịch chiết sau 4 lần được gom lại, đem cất loại dung môi dưới áp suất thấp ở nhiệt độ khoảng 40 –

500C đến khi thu được khối sệt

Pha khối sệt ở trên với nước cất theo tỉ lệ 1:1 ( khoảng 0,3 l nước cất), nhằm giải phóng các chất kém phân cực ra khỏi dịch chiết rồi chiết chúng bằng các dung môi theo độ phân cực tăng dần, trước hết là điclometan , sau đó đến n- butanol

Dịch chiết điclometan và n- butanol tiếp theo được xử lí như sau: làm khô với Na2SO4, sau đó đều đem cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 40-55

0C, thu được các cặc chiết ở dạng sệt, kí hiệu lần lượt là GMD và GMB

Sơ đồ chiết và hiệu suất các phần chiết được trình bày ở chương 4: Kết quả

Phát hiện các vết chất dưới ánh sáng thường , sau đó soi bản mỏng dưới đèn tử ngoại UV (λ = 254 nm), cuối cùng phun bản mỏng với dung dịch vanilin/H2SO4, FeCl3 và hơ bản mỏng trên bếp điện để nhận biết vệt chất

Kết quả khảo sát bản mỏng cặn chiết chiết GMD xem ở chương 4: Kết quả

và thảo luận

3.4.2 Phân tách cặn GMD bằng CC

Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có đường kính 4 cm, cao 80 cm, lót đáy cột

bằng một miếng bông thủy tinh có thể cho dung dịch rửa giải đi ra

Tẩm mẫu: Hòa tan 15 gam cặn điclometan trong etyl axetat, sau đó tẩm

với 11.5 gam silicagel (cỡ hạt 40- 63 μm, Merck) bằng cách trộn đều vào nhau, khi etyl axetat bay hơi hết thu được bột mịn tơi màu vàng thẫm

Nhồi cột: Tiến hành nhồi cột theo phương pháp nhồi ướt Silicagel được

khuấy đều và ngâm trong dung môi n- Hexan cho trương nở trong Sau đó, vừa khuấy vừa đổ nhanh hỗn hợp silicagen và dung môi n- Hexan lên cột sắc kí, đồng thời mở khóa phía dưới cho dung môi chảy ra Trong quá trình nhồi cột có sử dụng quả bóp gõ nhẹ dọc theo cột loại bỏ các bọt khí và cho n- Hexan chảy qua nhiều lần để cột được nén đều

Chạy sắc kí cột: Khi dung môi trong cột xuống đến cách bề mặt silicagen

đã được nén đều khoảng 4cm thì đưa mẫu đã tẩm lên cột Sau đó đặt một miếng bông thấm lên bề mặt chất để tránh sự khuếch tán ngược của chất tẩm Tiến hành rửa giải bằng dung môi theo gradient, tăng dần độ phân cực: đầu tiên với 100 % n- Hexan, tiếp theo là hỗn hợp n- Hexan : axeton theo tỉ lệ tăng dần axeton, và cuối cùng dội cột với axeton Tốc độ rửa giải cỡ khoảng 5-6 ml/phút Dung dịch rửa giải được thu vào các ống nghiệm đã đánh số thứ tự

Khảo sát các phân đoạn rửa giải: Qua kiểm tra bằng SKLM, những ống

nghiệm có sắc ký đồ giống nhau được gom lại, thu được 7 phân đoạn, kí hiệu là

GMD I→ VII

Tiến hành rửa chất cùng với kỹ thuật kết tinh lại, chúng tôi đã thu được

chất tinh khiết ở phân đoạn GMD I, kí hiệu là D1

Tiếp tục chạy sắc kí cột (với cột nhỏ hơn) phân đoạn GMD III với hệ

dung môi n- hexan/acetone, và tiến hành rửa chất cùng với kỹ thuật kết tinh lại

chúng tôi đã thu được 2 chất tinh khiết kí hiệu là D2 và D3

Kết quả chạy sắc ký cột xem ở chương 4: Kết quả và thảo luận

3.4.3 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các chất đã phân lập được từ phần chiết điclometan ( GMD)

3.4.3.1 Chất D1

Tinh thể hình que, màu vàng tươi; nhiệt độ nóng chảy là 167-169 0C (kết tinh lại trong hệ dung môi n-hexan/axeton); Rf = 0,78 (TLC, silicagel, điclometan/axeton (20:1), v/v); dưới ánh sáng thường có màu vàng nhạt, phun với vanilin/H2SO4 đặc + t0 cho màu vàng tươi

Phổ 1 H-NMR (500 MHz, Me2CO-d6, , ppm): 12.33(1H; s; OH-1); 11.30(1H; s; OH-8); 7.31(1H; d; J= 8.8 Hz; H-6); 6.62(1H; d; J= 8,8 Hz; H-7); 5.28 và 5.24(2H; m; H-12 và H-17); 3.66(2H;d; J= 7,0 Hz; H-16); 3.45(2H; d; J= 7,0 Hz; H-11); 1.85(3H; s; H-20); 1.80(3H; s; H-14); 1.67(3H; s; H-19); 1.66(3H; s; H-15)

3.4.3.2 Chất D2

Tinh thể hình kim màu vàng, Đnc 1660

- 1670C (kết tinh trong axeton); Rf 0,66 (hệ dung môi: n-hexan- etyl axetat, 7:3, v/v); phát quang màu tím

n-hexan-dưới ánh sáng tử ngoại; cho màu vàng đậm hơn với thuốc thử vanilin/H2SO4+ T0

Phổ 1

H- NMR (500MHz, MeOD, δ, ppm): 12.32(1H; s; OH-1); 7.37(1H;

d,d; J= 1.5Hz, 8.0 Hz; H-6); 7.25(1H; t; J= 8.0 Hz; H-8); 5.3(1H; m, H- 12);5.24(1H; m; H- 17); 3.79(2H; d; J= 7.0 Hz; H- 16); 3.57(2H; d;J= 7.0 Hz; H- 11); 1.79(3H; s; H- 15); 1.65(3H; s; H- 14); 1.86(3H; s; H- 20); 1.65(3H; s; H-19)

3.4.3.3 Chất D3

Tinh thể hình kim, màu vàng óng, nhiệt độ nóng chảy là 180-181 0

C (kết tinh lại trong hệ dung môi metanol/nước); Rf = 0,67 (TLC, silicagel, n-hexan/etyl axetat (1:1), v/v); dưới ánh sáng thường có màu vàng, phun với vanili/H2SO4 đặc + t0 cho màu vàng đậm hơn

Phổ 1

H-NMR (500 MHz, MeOD, , ppm): 6,74(1H; s; H-5); 6,28 (1H; s; H-4); 5,25(2H; m; H-12 và H-17); 4,12(1H; br S; H-16); 4,11(1H; br S; H-11); 3,78(3H; s; OCH3- 7); 1,85(3H; s; H-20); 1,80(3H; s; H-15); 1,70(3H;s; H-14); 1,68 (3H; s; H-19)

sự tách tốt nhất đối với cặn

3.5.2 Phân tách cặn GMB bằng CC

Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có đường kính 4 cm, cao 80 cm, lót đáy cột bằng

một miếng bông thủy tinh có thể cho dung dịch rửa giải đi ra

Tẩm mẫu: Hòa tan 15 gam cặn n- BuOH trong MeOH, sau đó tẩm silicagel

(cỡ hạt 40-63 μm, Merck) bằng cách trộn đều vào nhau, khi MeOH bay hơi hết thu được bột mịn tơi màu vàng thẫm

Nhồi cột: Tiến hành nhồi cột theo phương pháp nhồi ướt 100 gam silicagel

được khuấy đều và ngâm trong dung môi điclometan cho trương nở trong 15 phút Sau đó, vừa khuấy vừa đổ nhanh hỗn hợp silicagen và dung môi điclometan lên

cột sắc kí, đồng thời mở khóa phía dưới cho dung môi chảy ra Trong quá trình nhồi cột có sử dụng quả bóp gõ nhẹ dọc theo cột loại bỏ các bọt khí và cho điclometan chảy qua nhiều lần để cột được nén đều

Chạy sắc kí cột: Khi dung môi trong cột xuống đến cách bề mặt silicagen đã

được nén đều khoảng 4cm thì đưa mẫu đã tẩm lên cột Sau đó đặt một miếng bông thấm lên bề mặt chất để tránh sự khuếch tán ngược của chất tẩm Tiến hành rửa giải bằng dung môi theo gradient, tăng dần độ phân cực: đầu tiên với 100 % điclometan, tiếp theo là hỗn hợp điclometan : MeOH theo tỉ lệ tăng dần MeOH,

và cuối cùng dội cột với MeOH Tốc độ rửa giải cỡ khoảng 5-6 ml/phút Dung dịch rửa giải được thu vào các ống nghiệm đã đánh số thứ tự

Khảo sát các phân đoạn rửa giải: Qua kiểm tra bằng SKLM, những ống

nghiệm có sắc ký đồ giống nhau được gom lại, thu được 4 phân đoạn, kí hiệu là

GMB I-IV

Tiến hành rửa chất cùng với kỹ thuật kết tinh lại, chúng tôi đã thu được chất

tinh khiết ở phân đoạn GMB II, kí hiệu là D4

Kết quả chạy sắc ký cột xem ở chương 4: Kết quả và thảo luận

3.5.3 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các chất đã phân lập được từ phần chiết n-BuOH

Chất D4: Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt; hiện màu vàng nhạt với thuốc

thử Vanilin/ H2SO4 đặc, t0, hiện màu nâu đen với FeCl3 ở ngay nhiệt độ phòng

Phổ 1 H- NMR(500MHz, CDCl3, δ, ppm): 13.68(1H; s; OH-1); 6.83(1H; d; j= 3.6 Hz; H-4); 6.24(1H; s; H-5); 6.72(1H; d; J= 10 Hz; H-16); 5.56(1H; d; J= 10 Hz; H-17); 5.26(1H; m; J= 6 Hz, 3.6 Hz; H-12); 4.08(2H; d; J= 6 Hz; H-11); 3.80(3H; s; H-22); 1.83(3H; s; H-15); 1.69(3H; s; H-14); 1.46(6H; s; H-20, H-21)

Phổ 13

C- NMR(500 MHz, CDCl3, ppm): 182(C-9); 159.91(C- 3); 1); 156.31(C-4a); 155.77(C-10a); 154.56(C-6,7); 142.71(C-13); 137.04(C-8); 132.13(C-2); 127.13(C-17); 123.16(C-12); 115.74(C-16); 112.25(C-8a); 104.52(C-