nghiên cứu thành phần hóa học cây vam diospyros dictyonema. heirn (ebenaceae

Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm ancol sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào; - Clorof

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

1.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance

3.1.1 Thiết bị, dụng cụ 27

3.2 Chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất 27

3.2.1 Thu mẫu thực vật và xử lý mẫu 27 3.2.2 Phân lập các hợp chất ……….28

3.3 Hằng số vật lý và các dữ kiê ̣n phổ của các hợp chất 33

3.3.1 Hợp chất 1: 5,11-Epoxy-3,9-megastigmanediol 33 3.3.2 Hợp chất 2: 5-Megastigmene-3,9-diol 3-O--D-glucopyranoside 33 3.3.3 Hợp chất 3: Kaempferol 3-O-α -L-(2′′,3′′-di-E-p-coumaroyl)rhamnopyranoside (2'',3''-Di-O-p-coumaroylafzelin Platanoside) 34 3.3.4 Hợp chất 4: Afzelin (3-O-α-L-rhamnopyranosyl kaempferol) 35 3.3.5 Hợp chất 5: Diodictyonema A 35 3.3.6 Hợp chất 6: Quercetin 3-O-(2″-O- -D-glucopyranosyl)-α-L-rhamnopyranoside 36 3.3.7 Hợp chất 7: Kaempferol 3-O-(2″-O- -D-glucopyranosyl)-α-L-rhamnopyranoside 36 CHƯƠNG 4 THẢO LUẬN KẾT QUẢ 37

4.1 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 37

4.2 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2 45

4.3 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 3 51

4.4 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 4 56

4.5 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 5 59

4.6 Xác định cấu trú c hóa ho ̣c của hơ ̣p chất 6 66

4.7 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 7 70

4.8 Các hợp chất đã phân lập và xác định cấu trúc từ lá Vam 74

KẾT LUẬN………75

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 77

DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 2.1.a Ảnh quả và lá cây Vam 24

Hình 2.1.b Ảnh hoa cây Vam 24

Hình 4.1.a Phổ 1H-NMR củ a 1 38

Hình 4.1.b Phổ 13C-NMR của 1……… 39

Hình 4.1.c Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của 1 39

Hình 4.1.d Phổ 1 H-1H COSY của 1 41

Hình 4.1.e Cấu trúc hóa ho ̣c của 1 42

Hình 4.1.f Các tương tác HMBC và 1H-1H COSY chủ yếu của 1 42

Hình 4.1.g Phổ HSQC của 1 43

Hình 4.1.h Phổ HMBC của 1 44

Hình 4.2.a Cấu trúc hóa ho ̣c của 2 45

Hình 4.2.b Phổ 1H-NMR củ a 2 46

Hình 4.2.c Phổ 13 C-NMR củ a 2 46

Hình 4.2.d Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của 2 48

Hình 4.2.e Phổ HSQC của 2 49

Hình 4.2.f Phổ HMBC của 2 50

Hình 4.2.g Mô ̣t số tương tác HMBC chủ yếu của 2 51

Hình 4.3.a Phổ 1 H-NMR củ a 3 52

Hình 4.3.b Phổ 13C-NMR và DEPT của 3 52

Hình 4.3.c Cấu trúc hóa ho ̣c của 3 55

Hình 4.3.d Phổ khối lươ ̣ng của 3 55

Hình 4.4.a Cấu trúc hóa ho ̣c của 4 56

Hình 4.4.b Phổ 1H-NMR củ a 4 57

Hình 4.4.c Phổ 13C-NMR và DEPT của 4 58

Hình 4.4.d Phổ khối lươ ̣ng của 4 58

Hình 4.5.a Phổ 1H-NMR củ a 5 61

Hình 4.5.b Phổ 13 C-NMR và DEPT của 5 61

Hình 4.5.c Cấu trúc hóa ho ̣c của 5……… 63

Hình 4.5.d Mô ̣t số tương tác HMBC chính của 5 63

Hình 4.5.e Phổ khối lươ ̣ng của 5 63

Hình 4.5.f Phổ HSQC của 5 64

Hình 4.5.g Phổ HMBC của 5 65

Hình 4.6.a Phổ 1H-NMR củ a 6 66

Hình 4.6.b Phổ 13C-NMR và DEPT của 6 67

Hình 4.6.c Phổ khối lươ ̣ng của 6 69

Hình 4.6.d Cấu trúc hóa ho ̣c của 6 69

Hình 4.7.a Cấu trúc hóa ho ̣c của 7 71

Hình 4.7.b Phổ 1H-NMR củ a 7 71

Hình 4.7.c Phổ 13C-NMR củ a 7 72

Hình 4.7.d Phổ khối lươ ̣ng của 7 72

DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ BẢNG Bảng 1.1.2 Các hợp chất đã phân lập được từ chi Diospyros……… 6

Sơ đồ 3.2.2: Sơ đồ chiết phân đoạn dịch chiết metanol của cây Vam……… 29

Sơ đồ 3.2.2.a Sơ đồ phân lập các chất từ cặn chiết cloroform……….31

Sơ đồ 3.2.2.b Sơ đồ phân lập các chất từ cặn chiết Ethyl acetat……… 32

Bảng 4.1 Dữ kiện phổ NMR của hợp chất 1 40

Bảng 4.2 Dữ kiện phổ NMR của hợp chất 2 và các chất tham khảo 47

Bảng 4.3 Dữ kiê ̣n phổ NMR của 3 và chất tham khảo 53

Bảng 4.4 Dữ kiê ̣n phổ của 4 59

Bảng 4.5 Dữ kiê ̣n phổ của 5 và chất tham khảo 62

Bảng 4.6 Dữ kiê ̣n phổ NMR của 6 68

Bảng 4.7 Dữ kiê ̣n phổ NMR của 7……………… 73

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Resonance Spectroscopy

Phổ cô ̣ng hưởng từ ha ̣t nhân cacbon 13

by Polarisation Transfer

Phổ DEPT

DMSO Dimethylsulfoxide Dimethylsulfoxid

and Applied Chemistry

Hiê ̣p hô ̣i Hóa học lý thuyết và ứng dụng Quốc tế

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Thi ̣ (Diospyros), họ Thi ̣ (Ebenaceae)

1.1.1 Vài nét về thực vật chi Thị

Chi Thị (tên khoa học: Diospyros) là một chi (bao gồm cả những loài trước đây có tên chi là Maba) gồm có khoảng 450-500 loài Các cây thuộc chi này đều là

cây thân gỗ Phần lớn chúng có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới, chỉ một số ít loài sinh sống ở khu vực ôn đới Chi này bao gồm một số loài có giá trị thương mại quan

trọng, hoặc là để lấy quả ăn (bao gồm các loài Hồng, Thị, Cậy như D kaki và D

virginiana) hoặc là để lấy gỗ Có hai nhóm gỗ có giá trị thương mại là gỗ Mun trơn:

loại gỗ Mun đen thuần túy (đáng chú ý là D ebenum, D mun) và gỗ Mun sọc (Mun vàng hay Mun Macassar - D celebica)

Cánh vẩy (Lepidoptera) phá hại như Gymnoscelis rufifasciata, Eupseudosoma

aberrans và Hypercompe indecisa

Dưới đây là mô ̣t một số loài tiêu biểu của chi Diospyros

 D acris

 D armata

 D australis

 D blancoi (đồng nghĩa: Cavanillea philippensis, D discolor, D

philippensis): Thị Đài Loan, Thị lông Có nguồn gốc từ Philipin Quả màu đỏ

tươi khi chín

 D canaliculata (đồng nghĩa D cauliflora, D xanthochlamys)

 D castanea (đồng nghĩa: Maba castanea): Thị dẻ

 D celebica: Mun vàng, Mun Macassar

 D chloroxylon

 D crassiflora: Mun châu Phi, Mun Benin, Thị châu Phi

 D decandra: Thị

 D digyna (đồng nghĩa: D ebeneaster, D nigra, D obtusifolia): Thị đen Có

nguồn gốc ở Mexico, quả có vỏ màu xanh và cùi thịt trắng khi còn xanh và chuyển thành đen khi chín

 D ebenaster

 D ebenum (đồng nghĩa: D hebecarpa, D glaberrima): ô mộc, Mun Ceylon,

Thị Ceylon, Mun Mauritius, Mun thị Loài cây của vùng nhiệt đới châu Á với gỗ lõi có màu sẫm được dùng trong đồ gỗ mỹ nghệ

 D erientha

 D fasciculosa

 D fischeri (đồng nghĩa: Royena fischeri)

 D insularis

 D kaki: Hồng, Thị Nhật Bản, Thị Trung Quốc

 D kurzii: Cẩm thị, Cẩm Andaman

 D lanceifolia

 D lotus Cậy (Táo đen, Mận chà là) Có nguồn gốc ở Tây Nam Á và đông

nam châu Âu Được người Hy Lạp cổ đại biết đến như là "quả của Thượng

Đế", tức dios pyros, từ đây mà có tên khoa học của chi này Quả nhỏ có mùi

vị giống như cả Mận và Chà là

 D mabacea: Mun quả đỏ, miền bắc New South Wales - loài đang nguy cấp

cao độ

 D macassar: Mun Macassar, Mun Ấn Độ

 D macrocalyx (đồng nghĩa: D loureiroana, Royena macrocalyx)

 D major: có nhiều ở bờ biển phía đông Australia

 D malabarica (đồng nghĩa: D embryopteris, D peregrina): Cườm thị, Thị

đầu heo, Thị Ấn Độ, Mun núi

 D malabarica thứ malabarica: Thị dại Ấn Độ

 D malabarica thứ siamensis: Thị dại Thái Lan, Mun dại Thái Lan

 D maritima: Cẩm thị, vàng nghệ

 D marmorata: Mun Andaman,

 D melanoxylon: Mun Đông Ấn Lá của loài này được thu hái để làm thuốc lá bidi của người Ấn Độ

 D mespiliformis: Mun châu Phi

 D mollis: Mặc nưa

 D multiflora

 D.mun: Mun

 D nitida: Thị đen

 D oleifera: Thị dầu

 D pentamera: Mun sim, Thị xám - bờ biển phía đông Australia

 D rubra: Thị rừng

 D rumphii (đồng nghĩa: D utilis): Mun đen, Mun Macassar

 D saletti: Mun sọc

 D samoensis

 D sandwicensis: Loài cây đặc hữu của Hawaii, tại đây gọi là lama

 D siamang: (đồng nghĩa D elliptifolia)

 D siamensic: Cẩm thị, Thị Thái Lan

 D sinensis: Thị núi, Thị Trung Quốc

 D texana: Thị Texas Cây bụi nhiều cành hay cây thân gỗ nhỏ có nguồn gốc

ở miền trung và tây Texas cũng như tây nam Oklahoma, tại đây chúng sống trên các sườn núi đá khô cằn Quả nhỏ hơn quả của cây Thị châu Phi, được nhiều loài chim và thú ăn Nó đã từng được người Mỹ bản địa dùng làm thuốc nhuộm để thuộc da

 D tomentosa: Mun Nepal

 D tonkinensis: Mun sọc

 D trichophylla (đồng nghĩa: D pruriens)

 D venosa (đồng nghĩa: D hermaphroditica): Săn đen

 D villosa (đồng nghĩa: Royena villosa)

 D virginiana: Thị châu Mỹ, Thị Mỹ, Mun trắng Có nguồn gốc ở miền đông

Bắc Mỹ

1.1.2 Vài nét về thành phần hóa học chi Thị

Thành phần hóa học của chi Thị rất phong phú và đa dang bao gồm nhiều lớp chất có cấu trúc khá lý thú Các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát hiện được 187

phần hóa học của cây D dictyonema Chính vì vậy , viê ̣c nghiên cứu thành phần hóa học của cây D dictyonema có ý nghĩa khoa học cao

Bảng 1.1.2 Các hợp chất đã phân lập được từ chi Diospyros

Ký

hiê ̣u Tên hơ ̣p chất CTPT Phân lâ ̣p từ loài

Diospyros morrisiana;

D austroafricana ;D lycioides

3-Bromo-5-hydroxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone

C11H7BrO3 Diospyros maritima

12 Celabaquinone C23H18O6 Diospyros celebica

3-Chloro-5-hydroxy-2-methyl-1,4-naphthoquinon

C11H7ClO3 Diospyros maritima

chlorodiospyrin-

-D-glucopyranoside)-diospyrol

C44H54O22 Diospyros mollis

68

24-Ethyl-3-methoxylanost-9(11)-en-25-ol

C33H58O2 Diospyros discolor

naphthoquinone

8-Methoxy-6-methyl-1,2-naphthoquinone

C12H10O3 Diospyros celebica

100 6,6'-Diethoxyisodiospyrin C26H22O8 Diospyros maritima

101 6,7'-Diethoxyisodiospyrin C26H22O8 Diospyros maritima

102 6',7-Diethoxyisodiospyrin C26H22O8 Diospyros maritima

103 7',7'-Diethoxyisodiospyrin C26H22O8 Diospyros maritima

104 6-Ethoxyisodiospyrin C24H18O7 Diospyros maritima

105 6-Ethoxyhydroxyisodiospyrin C24H18O8 Diospyros maritima

106 7-Ethoxyhydroxyisodiospyrin C24H18O8 Diospyros maritima

107 6'-Ethoxyisodiospyrin C24H18O7 Diospyros maritima

108 7'-Ethoxyisodiospyrin C24H18O7 Diospyros maritima

109 Isoxylospyrin C33H18O9 Diospyros whyteana,

118 28-Acetyl-3-coumaroylbetulin C41H58O5 Diospyros maritima

124 3-Feruloylbetulin C40H58O5 Diospyros maritima

125 20(29)-Lupene-3-O-(4-hydroxy-3- C56H88O6 Diospyros maritima

methoxy-E-cinnamoyl),

28-O-hexadecanoyl

126 3-Coumaroylbetulinaldehyde C39H54O4 Diospyros maritima

127 Dioslupecin A C39H56O2 Diospyros maritima

128 3-(Z)-Coumaroyllupeol C39H56O3 Diospyros maritima

129 Macassaric acid C13H14O5 Diospyros maritima

130 Diethyl malate C8H14O5 Diospyros maritima

139 3-Methyl-1,8-naphthalenediol C11H10O2 Diospyros mollis

140 8-Methoxy-3-methyl-1-naphthol C12H12O2 Diospyros melanoxylon

148 Mutatoxanthin C40H56O3 Diospyros kaki

150 -Amyrin C30H50O Diospyros morrisiana,

151 Oleanolic acid

153 9-Oxo-13-octadecenoic acid C18H32O3 Diospyros melanoxylon

154 Palmarumycin JC2 C20H4O5 Diospyros ehretioides

161 2''-O-Galloylisoquercitrin C28H24O16 Diospyros kaki

162 Rotundiquinone C22H14O6 Diospyros rotundifolia

163 Shinanolone (dạng R) C11H12O3 Diospyros japonica;

Diospyros kaki

164 Shinanolone (dạng S) C11H12O3 Diospyros japonica;

Diospyros kaki

165 Sawamilletin C31H52O3 Diospyros ferrea

166 Tetrahydrodiospyrin C22H18O6 Diospyros montana

171 Garcimangosone D C19H20O9 Diospyros kaki

179 Diospyric acid C C29H40O6 Diospyros decandra

180 Diospyric acid B C29H44O6 Diospyros decandra

181 Diospyrosooleanolide C39H54O6 Diospyros angustifolia

182 Kakisaponin A C36H58O10 Diospyros kaki

183 Marsformosanone C30H46O Diospyros peregrina

Marsdenia formosana

Diospyros galpinii

186 Xylospyrin C33H18O9 Diospyros chloroxylon

187 Yerrinquinone C14H14O7 Diospyros montana

1.2 Vài nét về các phương pháp chiết mẫu thực vật

1.2.1 Chọn dung môi chiết

Dung môi chiết mẫu được lựa trọn trên khả năng trộn lẫn và độ phân cực (xem hình dưới) Đồng thời dung môi này phải đáp ứng khả năng không gây độc, gây cháy và giá thành phù hợp

Những dung môi thường được sử dụng trong quá trình chiết:

- Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hidrocacbon thế clo Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm ancol sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào;

- Cloroform có khả năng phân cực thấp hơn, có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào;

- Người ta thường ít khi sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây, mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol;

1.2.2 Quá trình chiết

Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

Cã kh¶ n¨ng trén lÉn Kh«ng cã kh¶ n¨ng trén lÉn

- Chiết ngâm;

- Quá trình chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet;

- Chiết sắc với dung môi nước;

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước;

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để tạo tốc độ chảy cho quá trình tách rửa dung môi Dung môi có thể nóng hoặc lạnh Trước kia, máy chiết ngâm đòi hỏi là phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thuỷ tinh

1.3 Vài nét chung về phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký (chromatography) là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng để phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng

Sắc ký bao gồm có pha tĩnh và pha động Trên thế giới hiện nay phổ biến là sử dụng pha tĩnh là chất rắn (bao gồm các loại chất hấp phụ, như silica gel, YMC,

khí (sắc ký khí) Pha động được dùng trong sắc ký lỏng là các dung môi hữu cơ, trên nguyên tắc là chất phân cực hơn sẽ tan tốt trong dung môi phân cực hơn, và ngược lại chất ít phân cực sẽ tan tốt hơn trong dung môi kém phân cực hơn

Nguyên tắc căn bản được sử dụng trong phương pháp này là dựa vào sự khác nhau về ái lực giữa các chất cần tách với chất hấp phụ Độ phân cực của dung môi tăng dần từ ete dầu hoả đến nước

1.3.1 Sắc ký cột

Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh bao gồm các loại silica gel (độ hạt khác nhau) pha thường cũng như pha đảo (YMC, ODS, Dianion, v.v…) Chất hấp phụ được nhồi vào cột (có thể cột thuỷ tinh hay cột bằng kim loại inox, nhưng phổ biến nhất là cột thuỷ tinh) Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa ký thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ

Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn và do đó khả năng tách càng cao, và ngược lại Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có độ hạt càng nhỏ thì tốc

độ dòng chảy càng giảm Trong một số trường hợp, khi lực trọng trường không đủ lớn thì gây nên hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao (HPLC)

Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng và thể hiện khả năng tách của cột Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể Trong sắc ký, tỷ lệ giữa quãng đường đi của

được từng chất ra khỏi hỗn hợp chất Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách Nếu tách thô thì tỷ lệ này thấp (dao động

từ 1/5 đến 1/10), còn nếu tách tinh thì yêu cầu tỷ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số

trong khoảng 1/20 đến 1/30

Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng Tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến là người ta phải tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn rồi đưa lên cột Nếu tách tinh, thì người ta hay đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với một lượng tối thiểu Việc nhồi cột (bằng chất hấp phụ) cũng hết sức quan trọng Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột

+ Một là nhồi cột khô Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để cho chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy qua cột đến khi cột trong suốt

+ Hai là nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được lắc đều trong dung môi chạy cột trước, sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết

Việc chuẩn bị cột hết sức quan trọng và ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả tách Yêu cầu là cột không được có bọt khí bên trong (điều này gây nên hiện tượng chảy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột không được nứt, gẫy

Tốc độ dòng chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách Nếu tốc

độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách Tuy nhiên nếu tốc độ dòng chảy thấp quá sẽ làm kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc

1.3.2 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh Ngoài việc sử dụng SKLM để định hướng cho sắc

ký cột, người ta còn dùng SKLM để điều chế thu chất trực tiếp Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng silica gel dầy hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản, và sau khi chạy sắc ký, người ta có thể cạo riêng silica gel có mang từng chất, rồi giải hấp bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch axit sunfuric 10%

1.4 Vài nét chung về các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ

Cấu trúc hoá học của các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào các phương pháp phổ kết hợp Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng hợp chất mà người ta sử dụng những phương pháp phổ cụ thể nào Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất người ta còn phải dựa vào các phương pháp

bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, kết hợp với các phương pháp sắc ký so sánh…

1.4.1 Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kính thích của tia hồng ngoại Mỗi kiểu liên kết

sẽ đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau

1.4.2 Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy)

+ Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy) dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá với năng lượng khác nhau, phổ biến là 70 eV

+ Phổ ESI (Electrospray Ionization Mass Spectroscopy) gọi là phổ phun mù điện tử Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các píc đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ

+ Phổ FAB (Fast Atom Bombardment Mass Spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ cũng dễ thu được ở dạng pic ion phân tử

+ Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy), cho phép xác định píc ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao Kết quả phổ khối lượng phân giải cao cùng với kết quả phân tích nguyên tố sẽ cho phép khẳng định chính xác công thức cộng của hợp chất hữu cơ

1.4.3.Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)

H-NMR

định trong thang ppm từ 0 ppm đến 14 ppm tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử Mỗi loại proton cộng hưởng

ở một trường khác nhau và vì vậy chúng được biểu diễn bằng một độ dịch chuyển hoá học khác nhau Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hoá học cũng như

tương tác spin coupling mà người ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất

hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau Thang đo cho

proton (từ 0 ppm đến 240 ppm)

+ Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer)

Phổ này cho ta những tín hiệu phổ phân loại các loại cacbon khác nhau Trên

+ Phổ 2D-NMR

Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:

+ Phổ HMQC: (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence)

Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ

tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ

Spectroscopy)

cacbon liền kề nhau Chính nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau

+ Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)

Đây là phổ biểu diễn các tương tác xa của H và C trong phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc

+ Phổ NOESY (Nucler Overhauser Effect Spectroscopy)

Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không

kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian Dựa vào kết quả phổ này, có thể xác định được cấu trúc không gian của phân tử

Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử Bằng việc đưa vào một xung đúng bằng

từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về mặt không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu phổ với cường độ mạnh hơn

Ngoài ra, ngày nay người ta còn sử dụng nhiều kỹ thuật phổ hai chiều rất hiện đại khác ví dụ như kỹ thuật xoá tương tác trên các phổ nhất định (decoupling), ví dụ như trên phổ proton, xoá tương tác của một proton nào đó xác định có thể xác định được vị trí của các proton bên cạnh v.v…

Ngoài các phương pháp phổ nêu trên, trên thế giới, người ta còn sử dụng phương pháp tia X ( X-RAY, nhiễu xạ tia Rơngen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử Tuy nhiên phạm vi sử dụng của phổ này rất hạn chế, bởi vì yêu cầu tiên quyết là cần phải có đơn tinh thể Đây là một điều kiện không phải luôn có thể được thỏa mãn đối với các hợp chất hữu cơ

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mẫu thực vật

ở vùng châu thổ sông Hồng Cây cao từ 5-8 m, lá mọc so le, quả có màu xanh, khi chín chuyển sang màu vàng và có mùi thơm đặc trưng , quả có đường kính khoảng

Mẫu lá cây V am (Diospyros dictyonema Hiern.) được thu hái ta ̣i Xuân

Trường, Nam Đi ̣nh vào tháng 10/2010 Mẫu tiêu bản được TS Ninh Khắc Bản, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác đi ̣nh tên khoa ho ̣c Mẫu lưu giữ tại Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hình 2.1.a Ảnh quả và lá cây Vam Hình 2.1.b Ảnh hoa cây Vam

2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất

2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60

phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu

2.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60G

10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp

2.2.3 Sắc ký cột (CC)

đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) Silica gel

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

2.3.1 Điểm nóng chảy (Mp)

Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa sinh biển

2.3.2 Phổ khối lượng (ESI-MS)

Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electrospray Ionization Mass Spectra) được

đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3.4 Độ quay cực riêng [] D

Độ quay cực được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện Hoá sinh biển – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

CHƯƠNG 3

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Thiết bi ̣, dụng cụ thí nghiệm và hóa chất

3.1.1 Thiết bi ̣ dụng cụ

Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng bao gồm:

- Bình chiết 20 lít

- Micropipet

- Máy cô quay chân không

- Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254 nm và 368 nm

- Tủ sấy chân không

- Máy sấy, bếp điện

- Bình sắc ký lớp mỏng loại phân tích và điều chế

- Cột sắc ký pha thường các loại đường kính

- Cột sắc ký pha ngược trung áp

- Máy phun dung dịch thuốc thử

3.1.2 Hoá chất

- Silica gel 60 (0,04-0,063 mm) Merck

- Các loại dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, ethyl acetat, cloroform, hexan, aceton là loại hoá chất tinh khiết của Merck

3.2 Chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất

3.2.1 Thu mẫu thực vật và xử lý mẫu

- Lá cây Vam sau khi được thu thập tiến hành phơi khô;

- Lá sau khi được phơi khô tiến hành cắt nhỏ và xay thành bột mịn;

- Chuẩn bị bình chiết (20 L), đây là thiết bị thủy tinh với một cái khoá ở dưới đáy để tạo tốc độ chảy cho quá trình tách rửa dung môi Dung môi có thể nóng hoặc lạnh Cho vào bình một lớp vải mịn để tránh bột làm tắc rút dịch chiết;

- Bột mịn lá Vam được cho vào bình chiết (20 L)

- Tiến hành chiết mẫu bằng phương pháp chiết ngâm

- Dung môi sử dụng chiết là dung môi MeOH, ngâm chiết trong methanol (3 lần, 2 ngày/lần)

- Dung môi sử dụng chiết các phân đoạn là dung môi n-hexan, cloroform và ethyl acetat

3.2.2.Phân lập các hợp chất

Dịch chiết methanol được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 120

g dịch cô Dịch cô này được phân bố vào nước rồi chiết lần lượt với n-hexan,

cloroform, ethyl acetat và butanol Sơ đồ phân lập như sau:

Sơ đồ 3.2.2 Chiết phân đoạn dịch chiết methanol của cây Vam

Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết n-hexan (10,0 g), cloroform (22,0 g), etyl acetat (25,0 g) và n-butanol (45,0 g)

Tiến hành phân lập chất bằng sắc ký cột:

- Lựa chọn cột tách phù hợp với lượng dịch đưa lên cột, thông thường tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng và thể hiện khả năng tách của cột Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể

Bổ sung n-BuOH

Cặn n-Hexan (10 g)

Bổ sung EtOAc

Bộ lá khô ( 2 kg )

lớp nước

Lớp nước

- Sử dụng sắc ký lớp mỏng để xác định giá trị Rf, với mỗi một chất sẽ có một

khỏi hỗn hợp chất Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách Nếu tách thô thì tỷ lệ này thấp (dao động từ 1/5 đến 1/10), còn nếu tách tinh thì yêu cầu tỷ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức là tuỳ

1/20 đến 1/30

- Từ phân đoạn cloroform tiến hành đưa chất lên cột: Tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn rồi đưa lên cột Trong bước đầu phân lập này việc tiến hành nhồi cột được thực hiện theo cách nhồi cột khô Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để cho chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó cho chất đã tẩm silica gel lên trên và dùng dung môi với độ phân cực tăng dần chạy cột để chạy qua cột để tiến hành phân đoạn Sơ đồ phân đoạn như sau:

Sử dụng sắc ký lớp mỏng trong tìm kiếm hoạt chất:

- Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60

phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu

- Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G

10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp

Cặn chiết CHCl3

Đã tiến hành khảo sát các hệ dung môi như sau cho sắc ký lớp mỏng:

- MeOH: nước

- n-hexan: aceton tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng với các tỷ lệ dung môi khác nhau để tìm

Sơ đồ 3.2.2.a Sơ đồ phân lập các chất từ cặn chiết cloroform

là silica gel và hệ dung môi rửa giải là cloroform/methanol tăng dần độ phân cực theo tỉ lệ cloroform/methanol từ 100/1 đến 100/100 (theo thể tích) thu được 5 phân

- sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel;

FC5 (3,5 g)

FC2 (5,0 g)

FC3 (4,5 g)

đoạn kí hiệu là FC1-FC5 Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn tương ứng là FC1 (1,5 g), FC2 (5,0 g), FC3 (4,5 g), FC4 (5,5 g) và FC5 (3,5 g)

Phân đoạn FC3 (4,5 g) được phân lập trên sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel và hệ dung môi rửa giải là cloroform/ethyl acetat (4/1, v/v), thu được hợp

chất 1 (15 mg) Phân đoạn FC4 (5,5 g) được phân lập trên sắc ký cột với chất hấp

phụ là silica gel và hệ dung môi rửa giải là cloroform/aceton (5/1, v/v) thu được hơ ̣p

chất 2 (10 mg) Phân đoạn FC5 (3,5 g) được phân lập trên sắc ký cột với chất hấp

phụ là silica gel và hệ dung môi rửa giải là n-hexan/ethyl axetat (4/1, v/v), thu được

hơ ̣p chất 5 (10 mg)

Sơ đồ 3.2.2.b Sơ đồ phân lập các chất từ cặn chiết Ethyl acetat

6

(11 mg)

7

(15 mg)

FE1

(2,0

g)

FE4 (6,0 g)

FE5 (3,5 g)

FE2 (3,0 g)

FE3 (5,0 g)

- sắc ký cột với chất hấp phụ là

silica gel pha thường;

- cloroform/metanol (30/1,v/v)

Cặn EtOAc (25 g)

3

(7 mg)

4

( 9 mg)

Từ 25 g că ̣n ethyl axetat, tiến hành phân lâ ̣p bằng sắc ký cô ̣t với chấ t hấp phu ̣ là silica gel pha th ường với hệ dung môi cloroform /methanol 30/1 (v/v), thu đươ ̣c 5 phân đoa ̣n nhỏ ký hiê ̣u là FE1-FE5 Sau khi cất loa ̣i dung môi dưới áp suất giảm thu đươ ̣c các cặn tương ứng là FE1 (2,0 g), FE2 (3,0 g), FE3 (5,0 g), FE4 (6,0 g) và FE5 (3,5 g)

Từ phân đoa ̣n FE 3 (5,0 g) tiến hành phân lâ ̣p bằng sắc ký cô ̣t pha ngược với chất hấp phu ̣ là YMC và sử du ̣ng dung môi rửa giải là met hanol/nước10/1 (v/v), thu

đươ ̣c hai hợp chất là 3 (7 mg) và 4 (9 mg)

Từ phân đoa ̣n FE 4 (6,0 g) tiến hành phân lâ ̣p bằng sắc ký cô ̣t pha ngược với chất hấp phu ̣ là YMC và sử du ̣ng dung môi rửa giải là met hanol/nước10/2 (v/v), thu

đươ ̣c hai hợp chất là 6 (11 mg) và 7 (15 mg)

3.3.1 Hợp chất 1: 5,11-Epoxy-3,9-megastigmanediol

3.3.2 Hợp chất 2: 5-Megastigmene-3,9-diol 3-O--D-glucopyranoside

Chất bột vô định hình màu trắng,  25

D

1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD)  (ppm): 1,86 (br d, J = 12,0 Hz, Ha-2), 1,52 (m,

2,14 (dt, J = 12,5, 5,0 Hz, Ha-7), 2,05 (d, J = 12,5 Hz, Hb-7), 1,49 (m, H-8), 3,72

(m, H-9), 1,19 (d, J = 6,5 Hz,H-10), 1,06 (s, H-11), 1,09 (s, H-12), 1,66 (s, H-13), 4,44 (d, J = 7,5Hz, H-1'), 3,17 (dd, J = 7,5, 8,5 Hz, H-2'), 3,39 (t, J = 8,5Hz, H-3'),

3.3.3 Hơ ̣p chất 3: Kaempferol 3-O-α

-L-(2′′,3′′-di-E-p-coumaroyl)rhamnopyranoside; (2'',3''-Di-O-p-coumaroylafzelin Platanoside)

Hz, ) và 6,38 (d, J = 16,0 Hz): H-8″′, H-8″′′]

13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD)  (ppm): Aglycon: 159,05 (C-2), 135,48 (C-3),

179,31 (C-4), 163,15 (C-5), 99,92 (C-6), 165,78 (C-7), 94,84 (C-8), 158,49 (C-9), 105,95 (C-10), 122,46 (C-1′), 131,86 (C-2′, C-6′), 116,76 (C-3′, C-5′), 161,17 (C-

4′), Rhamnopyranosyl: 100,31 (C-1″), 72,20 (C-2″), 73,08 (C-3″), 71,07 (C-4″), 70,95 (C-5″), 17,74 (C-6″), 2 x Cumaroyl: 127,15, 127,06 (C-1″′, C-1″′′), 131,36,

131,16 (C-2″′, C-6″′, C-2″′′, C-6″′′), 116,86, 116,80 (C-3″′, C-5″′, C-3″′′, C-5″′′), 161,61, 161,39 (C-4″′, C-4″′′), 147,67, 146,98 (C-7″′, C-7″′′), 114,96, 114,41 (C-8″′, C-8″′′), 168,51, 167,77 (C-9″″, C-9″′′)

3.3.4 Hơ ̣p chất 4: Afzelin (3-O-α-L-rhamnopyranosyl kaempferol)

3.3.5 Hơ ̣p chất 5: Diodictyonema A

Chất dạng dầu sệt không màu