nghiên cứu thành phần hóa học cây khổ sâm mềm (brucea mollis wall. ex kurz

Gần đây, các cây thuộc chi Brucea đã thu hút nhiều sự quan tâm và đầu tư nghiên cứu thành phần hóa học, bởi vì hoạt tính đa dạng và phong phú của chúng.. Douglas Kinghorn, Ohio Mỹ, nghi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM ĐẠI HỌC KHTN VIỆN HÓA HỌC

BÙI MINH NHUỆ

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY KHỔ SÂM

MỀM (BRUCEA MOLLIS WALL EX KURZ)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI - 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM ĐẠI HỌC KHTN VIỆN HÓA HỌC

BÙI MINH NHUỆ

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY KHỔ SÂM

MỀM (BRUCEA MOLLIS WALL EX KURZ)

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

HÀ NỘI - 2012

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN ÁN 6

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN ÁN 7

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 7

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về chi Brucea (Sầu đâu) 3

1.1.1 Sơ lược về chi Brucea 3

1.1.2 Thành phần hóa học của chi Brucea 3

1.1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 3

1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 3

1.1.2.2.1 Lớp chất quassinoit 4

1.1.2.2.2 Lớp chất ancaloit 4

1.1.2.2.3 Lớp chất tritecpenoit và steroit 4

1.1.2.2.4 Lớp chất flavonoit 5

1.1.2.2.5 Lớp chất axít béo và loại khác 5

1.1.3 Hoạt tính sinh học 12

1.1.3.1 Hoạt tính kháng u và ung thư 12

1.1.3.2 Hoạt tính chống sốt rét 13

1.1.3.3 Hoạt tính kháng virus TMV (Tobacco Mosaic Virus) 13

1.1.3.4 Hoạt tính chống đái đường 13

1.1.3.5 Hoạt tính kháng ký sinh trùng mũi khoan 14

1.1.3.6 Hoạt tính kháng amíp 14

1.1.3.7 Các hoạt tính khác 14

1.1.4 Loài Brucea mollis (Khổ sâm mềm) 14

1.1.5 Lớp chất quassinoit 16

1.1.5.1 Giới thiệu 16

1.1.5.2 Phân lập và xác định cấu trúc 17

Trang

1.1.5.3 Sinh tổng hợp các quassinoit 17

1.1.5.4 Bán tổng hợp các quassinoit 18

1.1.5.5 Tổng hợp toàn phần các quassinoit 19

1.1.5.6 Hoạt tính sinh học 21

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 22

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu 22

2.1.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết 22

2.1.3 Các phương phương xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 22

2.1.3.1 Xác định điểm chảy và góc quay cực 22

2.1.3.2 Phổ khối lượng (ESI-MS) và phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) 23

2.1.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 23

2.1.4 Phương pháp thử hoạt tính ức chế tế bào ung thư in vitro 23

2.1.4.1 Vật liệu 23

2.1.4.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro 23

2.1.4.3 Phép thử sinh học xác định hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxic assay) 23

2.2 Xử lí mẫu thực vật và chiết tách 24

2.3 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được 28

2.3.1 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.01 (12N) 28

2.3.2 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.02 (MC218) 28

2.3.3 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.03 (3R, 12K) 28

2.3.4 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.04 (MC220) 28

2.3.5 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất BM.05 (MC221) 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Xác định tên khoa học cây Brucea mollis 30

3.2 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào các cặn chiết từ lá cây Brucea mollis 31

3.3 Cấu trúc của các hợp chất được phân lập 31

3.3.1 Cấu trúc các hợp chất phân lập từ lá cây Khổ sâm mềm 31

3.3.1.1 Hợp chất BM.02: tetratriacontan-1-ol (MC218) 32

3.3.1.2 Hợp chất BM.03: stigmast-5,22-dien-3--ol (3R, 12K) 33

3.3.1.3 Hợp chất BM.04: bombiprenone (MC220) 33

3.3.1.4 Hợp chất BM.05: α-tocopherol (MC221) 37

3.4 Hoạt tính sinh học của các hợp chất đƣợc phân lập 42

KẾT LUẬN 44

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TRONG KHUÔN KHỔ LUẬN ÁN 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN

Trang

Hình 1.1 Cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall ex Kurz) 15 Hình 1.2 Các bộ khung cơ bản của lớp chất quassinoit 16

Hình 3.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.01 32

Hình 3.2 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.02 33

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN ÁN

Trang

Bảng 1.1 Thành phần hóa học các cây thuộc chi Brucea

9

Bảng 3.1 Kết quả thử độc tính tế bào các cặn chiết từ lá cây Khổ sâm

Bảng 3.3 Số liệu phổ 13

C-NMR của hợp chất BM.05 và chất tham khảo 36 Bảng 3.4 Cấu trúc các hợp chất phân lập từ lá cây Khổ sâm mềm 40 Bảng 3.5 tổng kết các hợp chất phân lập từ lá cây Khổ sâm mềm 42 Bảng 3.6 kết quả thử hoạt tính các chất tách ra trên bốn dòng ung thƣ 43

Bảng 3.7 Kết quả sàng lọc hoạt tính độc tế bào trên hai dòng tế bào LU và

KB

44

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1

H-NMR Proton Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

13

C- NMR Carbon -13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

DEPT Distortionless Enhancement by

HR-ESI-MS High Resolution Electron

Spray Ionization Mass Spectroscopy

Phổ khối phân giải cao ion hóa bằng phun mù điện tử

Hep-G2 Human hepatocellular

carcinoma

Ung thư gan người

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế tối thiểu 50%

1

MỞ ĐẦU

Ngày nay dân số thế giới đã đạt đến con số bảy tỷ người, một con số khổng lồ Nhu cầu về khám chữa bệnh vì thế cũng tăng theo Trong khi đó tình trạng sử dụng thuốc bừa bãi không theo hướng dẫn của bác sĩ dẫn đến kháng thuốc, đặc biệt là ở những nước đang phát triển, đã vô tình tạo một áp lực lớn đối với ngành y tế thế giới

Thiên nhiên là một kho thuốc khổng lồ mà đến nay thế giới vẫn chưa khám phá hết Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm, có một hệ động thực vật

đa dạng phong phú với 10.368 loài thực vật, trong đó có tới 3.830 loài có khả năng

dùng làm thuốc (Viện dược liệu, 2001) Đây chính là tiềm năng to lớn mà chúng ta

cần phải tận dụng

Tuy nhiên tình trạng đốt phá rừng ngày càng gia tăng và không thể kiểm soát, đồng thời khí hậu thay đổi theo chiều hướng khắc nghiệt hơn đã và đang làm cho một số lượng lớn các loài suy thoái dần Nếu chúng ta không nhanh chóng nghiên cứu và bảo vệ nguồn gien này thì đó sẽ là một mất mát to lớn của loài người

Hiện nay, hầu hết các bài thuốc gia truyền đều sử dụng theo kinh nghiệm, phần lớn chưa được chứng minh theo y học hiện đại Thông thường người ta sử dụng ở dạng sắc lấy nước uống hoặc ở dạng cao, viên Đó là một hỗn hợp bao gồm nhiều thành phần khác nhau, có những thành phần có khả năng làm tăng hoặc giảm hoạt tính hoặc độc tính của thuốc Vì vậy, xu hướng chữa bệnh hiện nay là kết hợp Đông – Tây y với phương châm vừa áp dụng kinh nghiệm chữa bệnh của cha ông ta bằng thuốc Nam, vừa nghiên cứu tính năng tác dụng của cây thuốc bằng cơ sở khoa học hiện đại, từ đó tạo cơ sở cho sử dụng tốt hơn cây thuốc và bài thuốc dân tộc

Trong y học dân gian cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall ex Kurz) được

sử dụng để trị sốt rét, đau bụng, u nhọt, amíp, ghẻ lở [1] Ngoài ra, trong chương trình hợp tác giữa Việt Nam và Hàn Quốc, 2002, nhằm tìm kiếm các loài thực vật có

hoạt tính kháng lại dòng ung thư phổi người A549, các tác giả đã phát hiện ra cây B

2

mollis có hoạt tính rất mạnh, dịch chiết MeOH từ lá cây Khổ sâm mềm ức chế tới

96% tế bào ung thư phổi người A549 [14]

Nhằm mục đích đi sâu nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây này, chúng tôi đã lựa chọn đề tài:

" Nghiên cứu thành phần hóa học cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall

ex Kurz) với nội dung nghiên cứu như sau:

1 Nghiên cứu thành phần hóa học của cây

2 Xác định các hợp chất có hoạt tính kháng ung thư

3

1.1 Giới thiệu về chi Brucea (Sầu đâu)

1.1.1 Sơ lược về chi Brucea

Brucea (Sầu đâu) là một chi thuộc họ Simaroubaceae (Thanh Thất) với sáu loài chính (Brucea javanica, Brucea mollis var tonkinensis, Brucea guineensis, Brucea sumatrana, Brucea antidysenterica và Brucea amarissima) được phân bố ở

các vùng nhiệt đới phía đông bán cầu [4], [5]

Ở Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ, chi Brucea có ba loài gồm Brucea javanica, Brucea mollis và Brucea mollis var tonkinensis [5].Trong đó, có hai loài được sử dụng trong dân gian để làm thuốc là Sầu đâu cứt chuột (Brucea javanica)

và Khổ sâm mềm (Brucea mollis) trị sốt rét, đau bụng, u nhọt , thường mọc ở vùng

Lào Cai, Kom Tum, Lâm Đồng [1]

Ở Trung Quốc, hai loài Brucea mollis và Brucea javanica cũng được sử dụng

như là thuốc thảo dược truyền thống bởi vì hoạt tính chống ung thư và chống sốt rét

của chúng [6] Gần đây, các cây thuộc chi Brucea đã thu hút nhiều sự quan tâm và

đầu tư nghiên cứu thành phần hóa học, bởi vì hoạt tính đa dạng và phong phú của

chúng Các nghiên cứu hóa học về chi Brucea đã phát hiện ra nhiều hợp chất thuộc

các lớp chất chính là quassinoit, ancaloit, tritecpenoit và flavonoit

1.1.2 Thành phần hóa học của chi Brucea

1.1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở trong nước, cho đến nay chỉ có ba công bố các nghiên cứu về hai loài trong

chi Brucea là B javanica và B sumatrana Một công bố của Ngô Văn Thu, 1979, nghiên cứu về hoạt tính chống sốt rét của các dịch chiết từ cây B sumatrana [7]

Năm 1995, GS Trần Văn Sung và cộng sự đã phân lập được một glycoside mới từ

lá cây B javanica [8] Và mới đây, 2009, GS Douglas Kinghorn, Ohio Mỹ, nghiên

cứu phân tách theo định hướng thử hoạt tính sinh học các thành phần có hoạt tính

gây độc tế bào từ cây B javanica thu hái tại Việt Nam [9] Từ cây này đã tách ra

được năm tritecpenoit, hai quassinoit và một flavonolignan

1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

4

Cho đến nay, đã có năm loài trong sáu loài chính của chi Brucea được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên thế giới gồm: B javanica, B mollis var tonkinensis, B sumatrana, B antidysenterica và B amarissima

Kể từ năm 1900, đã có hơn 100 hợp chất hóa học được tách ra từ chi Brucea,

bao gồm các lớp chất: quassinoit, ancaloit, tritecpenoit, flavonoit và các axít béo 74] Trong đó lớp chất, quassinoit là lớp chất chính, chiếm hơn 50% trên tổng số các hợp chất được tách ra từ chi này

[6-Cấu trúc các hợp chất được chỉ ra ở phần sau; tên của hợp chất và nguồn gốc cây tương ứng được liệt kê ở Bảng 1.1

1.1.2.2.1 Lớp chất quassinoit

Lớp chất quassinoit là thành phần chính của chi Brucea Cho đến nay, có

khoảng 75 quassinoit 1-75, được phân lập từ chi Brucea [10-45] Các quassinoit chủ

yếu được tách từ quả và hạt của cây, một số quassinoit có hoạt tính sinh học lý thú

Bruceantinol A 12, bruceene 16, bruceine H-J 24-26, bruceoside A-G 27-33, dehydrobruceine A và B 37, 38, javanicolide A-D 41-44, javanicoside A-H 45-52, yadanzigan 57, yadanziolide B, C, và S 58-60, và yadanzioside A-O 61-75 được

phân lập từ cây B javanica Yadanzigan 57 và yadanzioside B 62, C 63, E 65, I 69

và K 71 cũng được phân lập từ B amarissima, và yadanzioside M 73 cũng được tìm thấy từ B antidysenterica Các bruceine A-G 17-23 và javanicoside I-L 53-56 được phân lập từ B amarissima Trong số chúng bruceines A-G 17-23 cũng được tìm thấy ở B javanica Chỉ có duy nhất một chất brusatol 34 là được phân lập từ cây B sumatrana Hợp chất 34 cũng được báo cáo ở cây B javanica Các quassinoit còn lại được phân lập từ B antidysenterica Bruceantarin 9, bruceantin 10, bruceantinol

11, bruceantinoside A và B 13 và 14được tách từ cây B javanica

1.1.2.2.2 Lớp chất ancaloit

Cho đến nay có 25 ancaloit 76-100 được phân lập từ chi Brucea [6], [46-53],

[58] Các hợp chất này phân bố chủ yếu ở hai cây B.mollis var tonkinensis và B javanica

1.1.2.2.3 Lớp chất tritecpenoit và steroit

5

Có tám tritecpenoit, bruceajavanin A, B 101, 102, dihydrobruceajavanin A

103, bruceajavanone A, B, C, bruceajavanone A 7-axetat và bruceajavaninone A;

một steroit, daucosterol 104, đƣợc phân lập từ cây B javanica [6], [8], [9], [58]

1.1.2.2.4 Lớp chất flavonoit

Có hai flavonoit, luteolin-7-O--D-glucoside 105 và quercetin-3-O-

-D-galactoside 106 đƣợc phân lập từ cây B mollis var tonkinensis và B javanica [58]

1.1.2.2.5 Lớp chất axít béo và loại khác

Có chín axít béo 107-115 và axít vanillic 116 đƣợc phân lập từ B sumatrana

và B javanica [46], [58]

6

H

H MeO MeO

OH

H

H MeO

H

H

H

H MeO

8

9

Bảng 1.1 Thành phần hóa học các cây thuộc chi Brucea

B javanica

[21] [22]

14 BruceantinosideB, yadanzioside P B antidysenterica

B javanica

[21] [23]

B javanica

[25] [19]

11

B javanica

[39] [42–44]

B amarissima

[42] [39]

B javanica

[39] [44]

B antidysenterica

[44] [45]

B mollis var tonkinenis [49]

85 5,11-dimethoxycanthin-6-one B mollis var tonkinenis [48]

86 11-hydroxycanthin-6-one N-oxide B mollis var tonkinenis [49]

87 1-hydroxy-11-methoxycanthin-6-one B mollis var tonkinenis

B antidysenterica

[48] [47]

88 4-(ethoxycarbonyl)quinolin-2-(1H)-one B javanica

B antidysenterica

[58] [51]

91 1-(hydroxymethyl)--carboline B mollis var tonkinenis [48]

93 9H-pyrido[3,4-]indole-1-ethanol B mollis var tonkinenis [48]

94 -carboline-1-propionic acid B mollis var tonkinenis [48]

106 Quercetin-3-O--D-galactoside B javanica [58]

Axít béo và các hợp chất khác

114 Axít 8-hydroxyhexadecanoic B javanica [41]

1.1.3 Hoạt tính sinh học

Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các loài thuộc chi

Brucea cho thấy nhiều hợp chất có phổ hoạt tính rộng và mạnh nhƣ: kháng u, ung

thƣ, sốt rét, virus

1.1.3.1 Hoạt tính kháng u và ung thƣ

Hiện nay có một số công bố về hoạt tính của các hợp chất nhƣ: bruceoside C

29 có hoạt tính gây độc tế bào mạnh kháng lại các tế bào ung thƣ KB (ung thƣ biểu

mô), A549 (ung thƣ phổi), RPMI (u ác tính), và TE-671 (u nguyên tủy bào) [30]

Bruceoside D, E, và F 30–32 gây độc tế bào chọn lọc kháng lại các dòng tế bào ung

13

thư bạch cầu, ung thư phổi, ung thư đại tràng, u ác tính, và ung thư buồng trứng với giá trị log|GI50| nằm trong khoảng -4,14 đến -5,72 [31] Các bằng chứng thực nghiệm thuốc đã cung cấp một giải thích khoa học về việc dân gian đã sử dụng cây

B javanica để điều trị một số bệnh liên quan đến ung thư Ngoài ra, bruceatin 10 và

bruceantinol 11 cũng có hoạt tính kháng ung thư bạch cầu [10], [17]

1.1.3.2 Hoạt tính chống sốt rét

Năm 1987, trong một thử nghiệm in vitro hoạt tính kháng ký sinh trùng sốt rét

các hợp chất bruceantin 10, bruceantinol 11, bruceine A-D 17-20, yadanziolide A

24, brusatol 34, và dehydrobruceine A 37, cho giá trị IC50 in vitro trong khoảng

0,0460,0008 µg/ml, điều đó chứng tỏ các chất này kháng rất mạnh chủng ký sinh

trùng Plasmodium falciparum gây bệnh sốt rét - chủng ký sinh trùng này kháng thuốc chloroquine dùng cho điều trị sốt rét Trong cuộc thử nghiệm in vivo, có bốn

quassinoit bruceine A 17, B 18, bruceine D 20, và brusatol 34, đã thể hiện hoạt tính

chống lại sự nhiễm trùng P berghei ở những con chuột sau khi uống một liều tác

dụng [19] Năm 1994, Kitagawa và cộng sự đã báo cáo rằng bruceajavanin A 101, dihydrobruceajavanin A 103 và bruceolline B 79 ức chế sự phát triển của ký sinh

trùng sốt rét nuôi cấy P falciparum K1 của một chủng kháng chloroquine [6]

1.1.3.3 Hoạt tính kháng virus TMV (Tobacco Mosaic Virus)

TMV là chủng virus gây thiệt hại rất lớn trong ngành trồng trọt Năm 2010,

một báo cáo của các tác giả người Trung Quốc cho thấy các quassinoit 18, 20, 34,

66, 67, 69, 72 tách ra từ cây B javanica ức chế rất mạnh TMV với phần trăm ức chế

lần lượt là 94,6; 84,7; 94,0; 31,1; 33,7; 81,5; 73,8% [60]

1.1.3.4 Hoạt tính chống đái đường

Mới đây, năm 2009, người ta đã tiến hành thử nghiệm tác dụng làm giảm hàm

lượng đường trong máu của hai quassinoit bruceine D 20 và E 21 lên chuột với hàm

lượng 1mg/kg Kết quả cho thấy hai hợp chất này làm giảm đến 48,82 (± 13,34%)

và 40,07 (± 11,45%) nồng độ đường trong máu của chuột [61] Tiếp tục thử nghiệm trên mô hình STZ, dạng gây ra bệnh đái đường của người cũng như ở động vật và

14

đặc biệt ở chuột, kết quả thu được cũng rất tốt, nó làm giảm đến 87,99 ( ± 2,91%)

và 73,57 (± 13,64%) hàm lượng đường trong máu của chuột [61]

1.1.3.5 Hoạt tính kháng ký sinh trùng mũi khoan

Năm 2008, Ken Katakura và các cộng sự tách được 11 quassinoit khung C-20

từ quả của cây B javanica Tác giả đã tiến hành thử hoạt tính kháng ký sinh trùng mũi khoan Trypanosoma evansi cho các quassinoit này Trong số đó các hợp chất

12, 18, 19, 20, 34 có hoạt tính kháng ký sinh trùng mũi khoan rất mạnh, với các giá

trị IC50 dao động từ 2,9-17,8 mM [62]

1.1.3.6 Hoạt tính kháng amíp

Dịch chiết MeOH và CHCl3 của cây B javanica có hoạt tính kháng amíp đáng

kể được chỉ ra bằng kỹ thuật microdilution [54] Năm 1988, Colin W Wright đã tiến hành thử hoạt tính kháng amíp của năm quassinoit tách ra từ các dịch chiết của

cây B javanica 10, 17-20 Các hợp chất này có hoạt tính kháng amíp rất mạnh với

giá trị IC50 (μg/ml) lầnlượt là 0,019; 0,097; 0,306; 0,279; 0,386 [64]

1.1.3.7 Các hoạt tính khác

Các nhà nghiên cứu đã phát hiện thấy hợp chất dehydrobruceantin 36 kháng

lao trên in vitro [55] Ngoài ra, các hợp chất bruceoside A 27, bruceine D 20,

yadanzigan 57, javanicolide B 42, yadanziolide S 60, flazine 90, axít

8-hydroxyhexadecanoic 115, và axít azelaic 116 được tách ra từ B javanica gây ra sự

khác biệt tế bào ung thư bạch cầu ở người (HL-60) và ức chế COX-1, COX-2 và

7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) là các tác nhân gây ra sự tổn thương ở vú chuột [41] Hoạt tính kháng virus và kháng viêm ở B javaniva cũng được nghiên

cứu [56], [57]

1.1.4 Loài Brucea mollis (Khổ sâm mềm)

Ở Việt Nam, họ Thanh Thất (Simaroubaceae) có tám chi, trong đó chi Brucea

có ba loài gồm Brucea javanica, Brucea mollis và Brucea mollis var tonkinensis [5] Cây Brucea mollis còn có tên là Sầu đâu rừng hay Khổ sâm mềm, thường mọc

ở vùng Lào Cai, Kom Tum, Lâm Đồng [1]

15

Hình thái thực vật của cây Brucea mollis khá giống với cây Meliosma pinnata

thuộc họ Sabiaceae Để tránh nhầm lẫn khi thu hái hai loài này, chúng tôi đưa ra một

số mô tả về đặc điểm thực vật của cây Brucea mollis (Khổ sâm mềm) như sau:

Brucea mollis Wall ex Kurz - Khổ sâm mềm

Wall ex Kurz, Bengal 42: 64

Tên đồng nghĩa: Brucea acuminata H L 1873 J Asiat Soc Li

Tên Việt Nam khác: Cứt chuột, Sầu đâu rừng

Cây bụi hoặc gỗ nhỏ, cao l-5 m Cành nhỏ màu vàng-xanh, có lông; cành to

màu đỏ-nâu với nhiều bì khổng màu trắng Lá kép lông chim lẻ, cỡ 20-45(-60) cm;

trục và cuống lá có nhiều lông vàng; lá chét 5-15; cuống lá chét dài 3-7 mm; phiến

lá hình bầu dục-mác, trứng-mác hoặc mác rộng, cỡ 5-12(-15) × 2,5-5 cm, phủ lông

nâu khi non, sau nhẵn; gốc hình nêm rộng hay hơi tròn, lệch, mép nguyên; đỉnh có

đuôi dài hay nhọn; gân bên 8-10 cặp Cụm hoa hình chùy, dài 10-25 cm, mảnh; trục

phủ lông rậm màu vàng, sau thưa hoặc nhẵn Đường kính hoa 2-3 mm Cánh hoa

hình cái thìa, có lông ngắn, dài hơn nhị Đĩa hình cầu ở hoa đực, hình cái bát nông ở

hoa cái Bầu có lông Quả hạch, hình trứng, cỡ 8-12 × 6-8 mm, nhẵn, màu nâu đỏ

khi khô, có hình mạng lưới nông [5], [63]

Hình 1.1 Cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall ex Kurz)

Sinh học và sinh thái: Mùa quả tháng 6-12 Mọc rải rác trong rừng, ở độ cao

1200-1700 m

16

Phân bố: Lào Cai (Sa Pa), Hòa Bình (Mai Châu, Pà Cò), Kon Tum (Đác Glây,

Ngọc Linh), Lâm Đồng (Đà Lạt, Lang Bian) Còn có ở Trung Quốc, Mianma, Lào, Campuchia, Ấn độ, Malaysia, Thái Lan, Philippin, Nepal

Mẫu nghiên cứu: Hòa Bình (Mai Châu, Pà Cò), 15/12/1999, Phương 2228

(HN); 24/6/2008, VK 2211 (HN)

1.1.5 Lớp chất quassinoit

1.1.5.1 Giới thiệu

Quassinoit được biết đến như là các hợp chất có vị đắng đặc trưng [65] Lớp

chất này xét về mặt hóa học là các tritecpen thoái biến và được phân loại thành năm

bộ khung cơ bản gồm có: C-18, C-19, C-20, C-22, C-25 (hình 1.2) [66], trong đó các hợp chất có khung C-20 được chú ý nghiên cứu nhiều hơn vì chúng có hoạt tính kháng ung thư bạch cầu được phát hiện ra vào đầu những năm 1970 bởi Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ Lớp chất quassinoit khung C-20 được phân thành hai loại: loại bốn vòng (tetracyclic) và loại năm vòng (pentacyclic) Dạng bốn vòng phổ biến không có nguyên tử ôxy ở vị trí C-20, còn dạng năm vòng thì có thêm một ôxy nguyên tử ở vị trí cacbon C-20 và cho phép tạo thêm một vòng nữa Tuy nhiên, các chất quassinoit có bộ khung khác, đặc biệt là các chất có bộ khung C-19 gần đây cũng được chú ý nhiều hơn [67], [68] Nhiều hợp chất quassinoit này thể hiện hoạt

tính sinh học rộng in vivo và in vitro bao gồm như: kháng u, kháng virus, kháng

HIV, kháng ung thư, chống sốt rét, kháng viêm, chống côn trùng, trị lở loét và diệt

cỏ

Hình 1.2 Các bộ khung cơ bản của lớp chất quassinoit

17

1.1.5.2 Phân lập và xác định cấu trúc

Cho đến nay, lớp chất quassinoit chỉ được tìm thấy ở trong các cây thuộc họ

Simaroubaceae như Brucea antidysenterica Mill, Brucea javanica Merr, Brucea mollis var tonkinensis, Simaba amara, Picrasma ailanthoides, Pierreodendron kerstingii và Ailanthus grandis Tất cả các loài này thuộc phân họ Simarouboidaea

của họ Simaroubaceae Hai hợp chất quassinoit đầu tiên được phân lập từ gỗ cây

Quassia amara là quassin 117 và neoquassin 118 (hình 1.3), cả hai đều thuộc nhóm

quassinoit có bộ khung C-20 [69] Hai chất này được Clark phân lập vào đầu những năm 1930 [69], và cấu trúc hóa học của chúng do Valenta xác định vào đầu những năm 1960 với sự trợ giúp của các kĩ thuật vật lý hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR [70] Một số chi của họ Simaroubaceae đã được nghiên cứu, phân lập riêng biệt các hợp chất và xác định cấu trúc rõ ràng Các hợp chất được tách ra có cấu trúc hóa học tương tự quassin - là quassinoit đầu tiên được tách ra Vì vậy, tất

cả các hợp chất này được gọi chung là lớp chất quassinoit [71] Việc nghiên cứu lớp chất quassinoit đã thu hút các nhà khoa học kể từ khi cấu trúc của quassin được xác định và hoạt tính kháng bệnh ung thư bạch cầu của các quassinoit được công bố

Hình 1.3 Quassin 117 và neoquassin 118 là hai quassinoit

đầu tiên được phân lập từ cây Quassia amara

Các nghiên cứu và ứng dụng của lớp chất quassinoit tiếp tục được mở rộng suốt những năm 1990, với việc phân lập và xác định cấu trúc của nhiều hợp chất mới Cho đến nay đã có hơn 150 quassinoit được phân lập và mô tả đầy đủ Ngoài

ra, các quassinoit chỉ được phân lập từ họ Simaroubaceae và đây là một đặc điểm về thành phần hóa học để phân biệt các loài trong họ Simaroubaceae với các loài trong các họ khác

1.1.5.3 Sinh tổng hợp các quassinoit

phản ứng của nhóm cacbonyl C-16 và nhóm 7α-OH Các quassinoit C-20 được hình

thành như vậy Ngoài ra, sự thêm vào một nguyên tử ôxy ở liên kết C-13/C-17 sẽ làm cho liên kết này bị đứt gẫy, kết quả là sự tạo thành hầu hết các quassinoit C-19

và C-20

1.1.5.4 Bán tổng hợp các quassinoit

Bán tổng hợp các sản phẩm tự nhiên thường dùng để thay thế cho các hợp chất

có hoạt tính sinh học nhưng lại có hàm lượng thấp trong tự nhiên Thành công nhất

cho việc bán tổng hợp các quassinoit là sự chuyển hóa bruceoside A 27, một hợp

chất dễ dàng thu được từ Brucea javanica Biomass [72], đến bruceantin 10 (hình

19

1.5), hợp chất rất khó để có lƣợng lớn dùng trong việc thử nghiệm lâm sàng nhằm

chứng tỏ hoạt tính kháng ung thƣ bạch cầu mạnh của nó [73] Bruceoside A 27 khi bị thủy phân sẽ cho hợp chất 119, hợp chất này sau đó có thể bị este hóa và tạo thành một hỗn hợp gồm các hợp chất 120 và 121

Việc tổng hợp toàn phần các quassinoit đƣợc thực hiện lần đầu tiên bởi nhóm

Grieco khi nhóm tiến hành tổng hợp bruceantin 10 [74] Qui trình tổng hợp bắt đầu với sự bảo vệ nhóm hydroxymethyl của một hợp chất xeton có ba vòng 122 tại vị trí C-8, tiếp theo là sự cacbomethoxy hóa để nhận đƣợc hợp chất 123 Các liên kết đôi

α, β chƣa bão hòa đƣợc lấp đầy bằng cách selenyl hóa và sự tách của axít

benzeneselenic để nhận đƣợc một hợp chất enone ba vòng 124, enone này có thể đƣợc biến đổi thành hợp chất 125 bằng cách thêm vào hai đơn vị cacbon và phân

20

cắt nhóm bảo vệ Sự brôm hóa hợp chất 125, sau đó đun nóng với collidine sẽ nhận được hợp chất 127, hợp

Hình 1.6 Tổng hợp toàn phần bruceantin

chất này có thể được chuyển hóa lượng lớn thành hợp chất xeton bốn vòng 128

Việc cộng hai nhóm OH (axial) ở vị trí trans vào vòng C qua qui trình tám bước sẽ

21

nhận được hợp chất 132 và chuẩn bị để tạo thành vòng D Sau khi bảo vệ có chọn lọc, sự ôxy hóa, sự khử và gỡ bỏ nhóm bảo vệ ta thu được hợp chất triol 134, hợp

chất này tiếp tục qua bốn giai đoạn nữa để nhận được hợp chất lacton năm vòng

135 Từ 135 ta sẽ có 138 thông qua quá trình tách, ôxy hóa và thủy phân Sự acyl

hóa 138, sau đó là sự ôxy hóa sẽ cho 140, hợp chất này sau khi gỡ bỏ bảo vệ hai nhóm OH ở vòng C sẽ cho hỗn hợp tinh thể racemic bruceantin (10) (hình 1.6)

Tuy nhiên, qui trình này trải qua rất nhiều bước, vì vậy không cho hiệu suất cao, nên nó chỉ có thể mang tính chất nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

22

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu

Cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall ex Kurz) được thu hái vào tháng

3/2009, ở Mai Châu, tỉnh Hoà Bình Tên khoa học của cây do TS Trần Thế Bách (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật) xác định Mẫu tiêu bản của cây được lưu trữ tại phòng tiêu bản thực vật HN thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, kí hiệu mẫu là VK 2211 (HN)

Mẫu thực vật sau khi thu hái về được rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng, phơi khô

và sấy ở nhiệt độ 50-60oC cho đến khô Sau đó mẫu được xay nhỏ và được ngâm chiết kiệt nhiều lần bằng MeOH ở nhiệt độ phòng

Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được chiết phân đoạn với các dung môi có độ

phân cực tăng dần như: n-hexan, cloroform hoặc diclometan, etyl axetat và MeOH

Các dung môi dùng để chiết tách và chạy sắc ký là dung môi công nghiệp được làm khan, lọc và cất lại trước khi sử dụng

2.1.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết

Các phương pháp sắc ký được sử dụng để nhận biết và phân lập các hợp chất

từ cặn chiết thô bao gồm: sắc ký bản mỏng TLC, sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường (Merck loại 40-63 m) hoặc pha đảo (ODS, YMC (30-50 μm)), sắc ký cột dianion HP-20, sephadex LH-20 Bên cạnh đó còn dùng phương pháp kết tinh để thu chất sạch

2.1.3 Các phương phương xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập ra được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp vật lý và hóa học, sử dụng các phương pháp phổ như: phổ khối lượng (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D, 2D-NMR)

2.1.3.1 Xác định điểm chảy và góc quay cực

23

Điểm nóng chảy được đo trên máy Boetius, góc quay cực đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet là 1 cm

2.1.3.2 Phổ khối lượng (ESI-MS) và phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS)

Phổ khối ion hóa bụi điện tử ESI-MS được ghi trên máy ghi Agilent 6310 Ion Trap, phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy Agilent 6510 Q-TOF LC/MS

+ Hóa chất: do Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên cung cấp và các hóa

chất cần thiết khác của các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen v.v

+ Các dòng tế bào ung thư: KB (ung thư biểu mô), LU-1 (ung thư phổi

người), Hep-G2 (ung thư gan người), MCF-7 (ung thư vú người), LNCaP (ung thư tiền liệt tuyến) và HL-60 (ung thư máu cấp tính) do GS TS J M Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp

2.1.4.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro

Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 1,5 g/L sodium bicarbonate, 4,5 g/L glucose, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra

bổ sung 10% fetal bovine serum-FBS (GIBCO)

Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2

2.1.4.3 Phép thử sinh học xác định hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxic assay)

Các tế bào ung thư được nuôi trong phiến vi lượng 96 giếng, được thử chất, nhuộm bằng SRB (sulforhodamine B) và đo hàm lượng protein tổng số ở bước sóng

515 nm bằng máy Microplate Reader (BioRad) Hoạt chất được chuẩn bị cho thí nghiệm ở các nồng độ 100 g/ml; 20 g/ml; 4 g/ml; 0,8 g/ml

2.2 Xử lí mẫu thực vật và chiết tách

Lá cây Khổ sâm mềm sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi khô, nghiền thành bột (2,6 kg), ngâm chiết trong metanol (12 lít × 3 lần) Dịch chiết metanol sau đó được quay cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 191g dịch cô Dịch cô này được hoà vào 1,5 lít hỗn hợp MeOH:nước (1/1) rồi chiết phân bố lần lượt bằng các dung môi

n-hexan, diclorometan, etyl axetat Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết n-hexan (80 g), diclometan (21 g), etyl axetat (8 g) và dịch nước Hai cặn chiết n-hexan và diclometan cho các vết giống nhau trên sắc ký bảng

mỏng TLC nên được gộp lại và tiến hành tách phân đoạn trên

Hình 2.1 Sơ đồ phân đoạn các cặn chiết từ lá cây Khổ sâm mềm

cột silica gel pha thường và hệ dung môi rửa giải lần lượt là n-hexan:axeton 100 -

40/1 - 20/1 - 10/1 - 5/1 - 2,5/1 - 1/1 - 0/100, thu được tám phân đoạn 1E (10 g), 1F (5 g), 1G (27 g), 1H (8 g), 1I (14 g), 1K (9 g), 1L (15 g), 1M (15 g) Phân đoạn 1G

25

(27 g) tiếp tục tách phân đoạn trên cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải diclometan:metanol (gradient, 1-100%), thu được 11 phân đoạn 12A (3 g), 12B (1,3 g), 12C (2,4 g), 12D (2,8 g), 12E (1 g), 12F (1,4 g), 12G (4,1g), 12H (700 mg), 12I (1 g), 12L (1,9 g), 12S (0,76 g)

Phân đoạn 12F (1,4 g) xuất hiện tinh thể, lọc rửa bằng axeton thu được chất

sạch BM.01 (22 mg) (12N) Phân đoạn 12G (4,1 g) chạy tách chất lần lượt qua hai cột sắc ký trên silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải lần lượt là diclometan

(100%) và n-hexan:axeton 20/1, thu được chất sạch BM.02 (24 mg) (MC218) Hai

phân đoạn 12I và 12L xuất hiện chất kết tinh, tiến hành lọc rửa bằng metanol thu

được chất sạch BM.03 (570 mg) (3R, 12K) Phân đoạn 12B được tiến hành sắc ký

cột trên silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải n-hexan:diclometan 2/1 thu

được ba phân đoạn 14A (500 mg), 14B (180 mg), 14C (140 mg) Gộp hai phân đoạn (14B+14C) tiến hành sắc ký cột trên silica gel pha thường với hệ dung môi rửa

giải n-hexan:etyl axetat 40/1, thu được hai chất sạch BM.04 (70 mg) (MC220) và

BM.05 (75 mg) (MC221)

26

Hình 2.2 Sơ đồ phân lập các chất từ lá cây Khổ sâm mềm

Cặn chiết n-hexan và CH2Cl2 của lá 101g

12B 12A

14A 14B 14C

D/M gradien ( 1- 100% MeOH)

BM.01 22mg

BM.03 570mg

Xuất hiện tinh thể, lọc rửa bằng axeton

Xuất hiện tinh thể, lọc rửa bằng MeOH H/D 2/1

H/E 40/1

27