nghiên cứu các phương pháp phân lập zerumbon có chất lượng cao từ thân rễ cây gừng gió ( zingiber zerumbert sm ) và chuyển hóa zerumbon thành các hợp chất có hoạt tính sinh học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- LÊ THỊ THÙY NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP ZERUMBON CÓ CHẤT LƯỢNG CAO TỪ THÂN RỄ CÂY GỪNG GIÓ ZINGIBER ZERUMBERT SM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

LÊ THỊ THÙY

NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP ZERUMBON CÓ CHẤT

LƯỢNG CAO TỪ THÂN RỄ CÂY GỪNG GIÓ

(ZINGIBER ZERUMBERT SM) VÀ CHUYỂN HÓA ZERUMBON THÀNH CÁC

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Khái quát về chi Gừng (Zingiber) 4

1.1.1 Đặc điểm thực vật của các cây chi Gừng: 4

1.1.2 Sinh thái, sinh trưởng và phát triển 4

1.2 Khái quát về cây Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) 6

1.2.1 Đặc điểm thực vật 7

1.2.2 Nguồn gốc và phân bố của cây Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) 8

1.2.3 Thành phần hóa học của Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) 9

1.2.3.1 Các tecpenoit và tinh dầu của Gừng gió 9

1.2.3.2 Các curcuminoit 16

1.2.3.3 Các flavonoit 17

1.3 Công dụng và các hoạt chất sinh học của Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) 20

1.3.1 Gừng gió trong y học các dân tộc Phương Đông 20

1.3.2 Các hoạt chất sinh học của Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) 20

1.3.3 Zerumbone và hoạt tính sinh học 22

1.3.3.1 Zerumbone và hoạt tính sinh học 22

1.3.3.2 Cơ chế oxi hóa khử [12] 24

1.3.3.3 Cơ chế thúc đẩy quá trình tự chết (apoptosis mechanism) 25

1.3.4 Phân lập và chuyển hóa Zerumbone 27

1.3.4.1 Phân lập Zerumbone 27

CHƯƠNG 2 33

ĐỀ TÀI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 33

2.1 Đề tài, mục tiêu, nội dung 33

2.1.1 Đề tài 33

2.1.2 Mục tiêu của đề tài 33

2.1.3 Nhiệm vụ của đề tài 33

2.2.1 Thiết bị nghiên cứu 34

2.2.2 Các hóa chất 34

2.3 Thực nghiệm 35

2.3.1 Nghiên cứu các phương pháp phân lập zerumbone từ thân rễ cây gừng gió 35

2.3.1.1 Nguyên liệu và phương pháp xử lý 35

2.3.1.2 Điều chế cặn chiết không phân cực 35

2.3.1.3 Phân lập Zerumbone có chất lượng cao từ cặn chiết không phân cực bằng sắc ký cột 35

2.3.1.4 Phân lập Zerumbone chất lượng cao từ cặn chiết không phân cực bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng điều chế (SKLMĐC) 36

2.3.1.5 Điều chế zerumbone có chất lượng cao từ cặn chiết phần không phân cực bằng phương pháp kết tinh phân đoạn 38

2.3.2 Điều chế các dẫn xuất của Zerumbone 39

2.3.2.1 Điều chế amino zerumbone ( ZerNH2) 39

2.3.2.2 Điều chế 3- isopropylaminozerumbone 39

2.4 Khảo sát hoạt tính chống ung thư của các dẫn xuất của Zerumbone 39

CHƯƠNG 3 41

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Điều chế Zerumbone chất lượng cao ( 99%) 41

3.1.1 Nguyên liệu cho điều chế zerumbone 41

3.1.2 Điều chế phần không phân cực (dầu Zerumbone) và zerumbone tinh khiết 41

3.2 Tổng hợp một số dẫn xuất của zerumbone và khảo sát hoạt tính chống ung thư của chúng 46

3.2.1 Tổng hợp 3- amino và 10- amino Zerumbone 46

3.2.2 Tổng hợp 3- isopropylamino zerumbone 51

3.3 Khảo sát hoạt tính chống ung thư của 3-isopropylaminozerumbone 54

KẾT LUẬN 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

LỜI MỞ ĐẦU

Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) là cây thuốc dân tộc nổi tiếng từ lâu đời

không chỉ ở nước ta mà còn ở rất nhiều nước Đông Nam Á như Indonexia, Thái Lan, Miến Điện…

Gừng gió là cây mọc hoang dại phổ biến ở nước ta từ Bắc tới Nam, đặc biệt

là ở các tỉnh miền núi nước ta

Hợp chất có hoạt tính sinh học chính của gừng gió là Zerumbone- nó là chất

có hoạt tính phòng ngừa và chống ung thư mạnh trên 10 loại ung thư khác nhau, đặc biệt là ung thư gan và ung thư vú Vì vậy, gần 20 năm trở lại đây, Zerumbone nhận được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới, đặc biệt là các nhà khoa học Nhật Bản và Mỹ Ngoài ra những nghiên cứu gần đây của các nhà khoa học đã chứng minh rằng dẫn xuất của zerumbone cũng có hoạt tính phòng ngừa và chống ung thư mạnh Chính vì vậy mà chúng tôi đặc biệt quan tâm tới việc điều chế zerumbone có chất lượng cao từ cây gừng gió để chuyển hóa zerumbone thành các chất khác nhau nhằm tạo ra được những hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ cho ngành y dược Đấy cũng chính là lí do mà chúng tôi

chọn đề tài:“ Nghiên cứu các phương pháp phân lập zerumbone có chất lượng cao

từ thân rễ cây gừng gió( Zingiber zerumbet Sm) và chuyển hóa zerumbone thành các hợp chất có hoạt tính sinh học.”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Khái quát về chi Gừng (Zingiber)

Họ Gừng (Zingiberaceae) có nhiều chi và nhiều loài khác nhau Hầu hết các

loại cây thuộc họ Gừng phân bố chủ yếu ở các nước Đông Nam Á, Trung Quốc,

Ấn Độ và Nhật Bản… Theo các tác giả Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến đã tổng kết, họ Gừng có 45 chi gồm hơn 1300 loài, phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Riêng ở Việt Nam, họ Gừng có 8 chi gồm 25 loài khác nhau phân bố rải rác từ Bắc tới Nam [4,5]

Chi Gừng (Zingiber) gồm khoảng 100 loài, phân bố chủ yếu ở các khu vực

nhiệt đới Châu Á và Châu Úc Trung tâm phong phú nhất của chi Gừng là ở các nước Đông Nam Á

1.1.1 Đặc điểm thực vật của các cây chi Gừng:

- Các cây thuộc chi Gừng là loại thân thảo, sống nhiều năm, cao khoảng từ 0,5-3,5 m Thân rễ mập, phân nhánh nhiều, tạo thành củ nằm ngang trên mặt đất Thịt củ nạc, thơm và có vị cay

- Lá mọc so le theo hai phía đối xứng trên thân; phiến lá hình mác, thuôn đến bầu dục dài hoặc hình đường chỉ; cuống lá rất ngắn hoặc hầu như không có; bẹ lá nguyên hoặc xẻ hai thuỳ; có mùi thơm nhẹ

- Cụm hoa bông, thường mọc từ thân rễ, đôi khi ở ngọn “thân giả” Các hoa mọc sít nhau và mỗi hoa được bao bởi một lá bắc sắp xếp như dạng vẩy cá từ dưới lên trên; lúc đầu thường có màu xanh, sau chuyển dần sang màu vàng, đỏ nhạt, vàng sáng hoặc đỏ Cánh hoa hình ống mảnh, màu trắng, vàng hoặc hồng; bao phấn thường có dạng hình ống bao lấy vòi nhụy, bầu ba ô nhẵn hoặc có lông dày Quả nang 3 ô, hạt nhiều, hình trứng hay hình xoan, màu nâu đỏ, màu đen, trắng

hay vàng [7]

1.1.2 Sinh thái, sinh trưởng và phát triển

Các loài trong chi Gừng (Zingiber) thường thích nghi với điều kiện ẩm, được

che bóng và nhiệt độ không quá cao (khoảng 27-300 0C về

ban đêm) Chúng sinh trưởng dưới tán rừng thứ sinh, rừng cây bụi, rừng tre, rừng tếch, ở khe núi, thung lũng hoặc ven bìa rừng… Chúng ưa đất tốt, màu mỡ và sinh trưởng tốt ở những khu vực có độ cao dưới 1500m so với mặt nước biển Một số loài có thể mọc trên đất có lẫn sỏi đá, trên bãi đất trống hoặc trong rừng tới độ cao 3000m so với mặt nước biển

Thân, rễ các loại cây thuộc chi Gừng phát triển rất nhanh Từ một chồi giống ban đầu, chúng có thể phân nhánh, đâm chồi, tăng sinh khối và phát triển thành một bụi lớn chỉ trong một vài năm

Ở nước ta, chi Gừng cũng khá phong phú Chúng sinh trưởng chủ yếu trong vùng núi ở hầu hết các tỉnh từ Bắc vào Nam Theo Phạm Hoàng Hộ [7], chi Gừng

ở Việt Nam có 11 loài như sau:

Bảng 1.1 Các loài Gừng có ở Việt Nam

1 Zingiber officinale Roscoe Gừng Phân bố rộng

2 Zingiber acuminatum Valeton Gừng nhọn Tây Nguyên,

Trung Bộ

3 Zingiber conchichinensis Gagn Gừng Nam Bộ Bà Rịa- Vũng

Tàu

4 Zingiber eberhardtii Gagn Gừng Eberhardt Lâm Đồng

5 Zingiber gramineum Bl Gừng lúa, Ngải trặc Biên Hòa

6 Zingiber monophyllum Gagn Gừng một lá Ninh Bình

7 Zingiber pellitum Gagn Gừng bọc da Bà Rịa

8 Zingiber purpureum Roscoe Gừng tía Phân bố rộng

10 Zingiber rufopilosum Gagn Gừng lông hung Hà Nội

11 Zingiber zerumbet (L.) J.E Sm Gừng gió Phân bố rộng

Trong 11 loài Gừng thường thấy ở nước ta, có 3 loài được nhân dân ta dùng nhiều:

 Gừng (Zingiber purpureum Roscoe): còn gọi là Khương, Sinh khương (Gừng tươi), Can khương (Gừng khô), được trồng khắp cả ba miền Bắc, Trung, Nam để làm mứt, gia vị, thuốc chữa bệnh đường ruột

Cây cao 0,5-1m Củ màu vàng, thơm, cay Phát hoa ở đất, hình bầu dục trên một cọng dài 5-10cm Lá hoa xanh sau ngả sang đỏ Hoa vàng, cánh môi to 2cm,

có sọc đỏ Noãn sào không long

 Gừng tía (Zingiber montanum (Koanig) Dietrich): còn được dân gian gọi

là Gừng dại, Gừng đỏ… Ở nước ta Gừng tía mọc tự nhiên tại Cúc Phương (Ninh Bình), Ba Vì (Hà Nội) và các tỉnh phía Nam Gừng tía được dùng làm gia vị thay thế Gừng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và dùng làm thuốc chữa bệnh Cây cao đến 2m Củ màu vàng cam, vị nóng, đắng, thơm Phát hoa ở gốc, xoan hay bầu dục Lá hoa màu đỏ

 Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm ): xem mục 1.2

Công dụng của các loài cây thuộc chi Gừng

Hầu hết các loài cây thuộc chi Gừng (Zingiber) đều có chứa tinh dầu, được

coi là nguồn nguyên liệu có giá trị để làm gia vị và làm thuốc

Thân rễ được làm gia vị trong chế biến thực phẩm, là nguyên liệu chế biến rượu bia, mứt Gừng…

Trong dân gian, Gừng là vị thuốc giúp kích thích tiêu hóa, dùng trong những trường hợp kém ăn, ăn uống không tiêu, chữa đau dạ dày, cảm mạo, phong hàn, làm thuốc ra mồ hôi, chữa ho mất tiếng, mụn nhọt, đau đầu, đau nhức xương… Gừng còn được dân gian dùng để chữa ho cho gia súc như trâu, bò, voi, ngựa

bị đau mắt đỏ, ăn không nuốt được…

1.2 Khái quát về cây Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm)

Cây Gừng gió có tên khoa học là Zingiber zerumbet (L) J E Sm (hay Zingiber zerumbet Sm) thuộc chi Gừng (Zingiber), họ Gừng (Zingiberaceae)

Ngoài ra, cây còn có một số tên đồng nghĩa sau: Amoum zerumbet L (1753); Zingiber amaricans Blume (1872); Z aromaticum Valeton (1918); Z littorale

Valeton (1918) [9] Ở mỗi nước, cây Gừng gió được gọi với nhiều tên riêng như: Riềng dại, Ngải mặt trời, Ngải xanh (Việt Nam), Khuhet phtu, Prateal vongatit (Campuchia), Gingembre fou (Pháp) và Phong Khương (Trung Quốc) [4, 5, 7, 8, 9]

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Gừng gió (Zingiber zerumbet.Sm) được xếp vào loại cây trồng quý hiếm

cần được bảo tồn theo qui định số 80/2005/QĐ-BNN ký ngày 05/12/2005 của Bộ

NN & PTNT Nó thuộc danh mục 1, danh mục các nguồn gien trao đổi quốc tế trong trường hợp đặc biệt

Gừng gió thuộc dạng cây thảo, cao khoảng 1,2-1,7 m Thân rễ (hay còn gọi

là củ) phân nhánh, vỏ ngoài màu vàng nhạt, thịt củ màu vàng sáng, có mùi thơm nhẹ Ống bẹ lá sắp xếp sít nhau tạo thành thân giả, gần như không cuống; phiến lá hình mác thuôn, kích thước 25-40 x 4-8 cm, thon ở gốc, chóp lá hình nhọn, mặt trên xanh lục đậm, mặt dưới xanh nhạt và có lông rải rác Cụm hoa bông, hình trụ hay trứng, kích thước 6-14 x 4-5 cm, chóp tù, mọc từ thân rễ, trên cán dài 10-30

cm, thẳng, có nhiều vẩy xếp lợp lên nhau bao quanh Cụm hoa có nhiều lá bắc xếp lớp lên nhau, lá bắc gần giống hình trứng, kích thước 3-4 x 2,5 cm Khi còn non có màu xanh, già chuyển sang màu đỏ Hoa mọc ở mỗi kẽ lá bắc; đài hình ống, dài 2,5 cm, ngắn hơn lá bắc, màu trắng, tràng hoa hình ống, dài từ 5-5,5 cm với các thùy hình mác dài, màu vàng chanh; có 3 thùy, thùy phía lưng lớn hơn, kích thước 2,5 x 2 cm; các thùy bên nhỏ, kích thước 1,6 x 0,7 cm; môi dài 5 cm, mép có răng tròn, màu trắng hoặc vàng, bao phấn màu vàng nhạt; bầu 3 ô Quả nang hình trụ hay bầu dục, dài 1,5 cm, khi chín có màu đỏ; hạt ít, màu đen, áo hạt có màu trắng [9]

Tại Đông Nam Á dựa vào đặc điểm cụm hoa, năm 1996 Thailade đã mô tả

và sắp xếp những dạng khác nhau của loài Gừng gió (Z zerumbet) vào các thứ

(var): Var amaricans (Blume) Thailade; Var aromaticum (Valeton) Thailade; var zerumbet; var littorale (Valeton) Thailade [9]

Do sự đa dạng về hình thái nên những nghiên cứu về thành phần hóa học trong tinh dầu Gừng gió phân bố ở các vùng, các nước khác nhau thay đổi trong giới hạn khá rộng Và năng suất thu hái “củ” ở các thứ Gừng gió cũng khác nhau,

năng suất “củ” tươi của var zerumbet trong khoảng từ 20-32 tấn/ha/năm, còn của

các thứ khác thấp hơn [9]

Hình 1.1 Cây Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm)

1.2.2 Nguồn gốc và phân bố của cây Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm)

Nhiều tác giả cho rằng Gừng gió có nguồn gốc từ Ấn Độ, được người dân ở đây trồng và phổ biến rộng rãi sang nhiều nước Châu Á như: Việt Nam, Trung Quốc, Ấn Độ, Malaixia, Lào, Campuchia, Thái Lan Gừng gió là loài cây có nguồn gen đa dạng, sinh trưởng nhanh, khả năng chống chịu khỏe nên có thể tự nhiên hóa mạnh [8, 9]

Ở Việt Nam, cây mọc rải rác ở các tỉnh trung du, vùng núi thấp và đôi khi có

ở đồng bằng Cây ưa chịu ẩm, chịu bóng và thường mọc ở ven rừng, dưới tán cây,

rừng kín Ở vùng trung du và đồng bằng, cây mọc lẫn trong các lùm bụi dưới chân đồi hoặc các làng bản [4]

1.2.3 Thành phần hóa học của Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm)

1.2.3.1 Các tecpenoit và tinh dầu của Gừng gió

Gừng gió là nguyên liệu trong sản xuất công nghiệp chế biến thực phẩm, hương liệu nên thành phần hóa học tinh dầu của Gừng gió được nghiên cứu kĩ tại một số nước như Nhật Bản, Trung Quốc, Philippin …

Ở nước ta, Nguyễn Xuân Dũng cùng cộng sự [21] đã nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu củ, thân, lá và hoa Gừng gió vùng Bình Trị Thiên-Việt Nam

i.Thành phần hóa học của tinh dầu củ Gừng gió

Tinh dầu cây Gừng gió chủ yếu tập trung ở bộ phận củ, tinh dầu củ Gừng gió

Hàm lượng (%)

3 Humulene-oxit I 3,8 19 (E)-nerolidol 0,1

6 Caryophyllen oxit 1,5 22 Terpinen-4-ol 0,1

ii Thành phần hóa học của tinh dầu thân và lá Gừng gió

Tinh dầu thân, lá và hoa Gừng gió đều có màu vàng xanh nhạt, phảng phất mùi thơm của tinh dầu hoa bưởi [6]

Các thông tin đã có cho thấy có khoảng 40 hợp chất tìm thấy trong thân (chiếm hơn 84% tinh dầu), và lá Gừng gió (chiếm hơn 82% tinh dầu) Năm 1995, Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu thân

và lá Gừng gió vùng Bình Trị Thiên, kết quả được chỉ ra trong bảng 1.4 [21]:

Bảng 1.4 Thành phần hóa học của tinh dầu thân, lá Gừng gió vùng Bình Trị Thiên-Việt nam

iii Thành phần hóa học của tinh dầu hoa Gừng gió [6, 21]

Hơn 44 hợp chất đƣợc tìm thấy trong tinh dầu hoa Gừng gió vùng Bình Trị Thiên (chiếm khoảng 85 % tinh dầu) và đƣợc chỉ ra trong bảng 1.5:

Bảng 1.5 Thành phần hóa học của tinh dầu hoa Gừng gió vùng Bình Trị Thiên -Việt Nam

Hàm lƣợng (%)

Hàm lƣợng (%)

9 1,8-cineol 0,7 31 α-sesquiphelandren 0,2

11 (E)- α-ocimen 1,3 33 Caryophylen oxit 2,2

13 2-metyl-6-metylen

Kết quả phân tích định lƣợng và nhận dạng các thành phần hóa học của tinh

dầu củ, thân, lá và hoa của cây Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) cho thấy thành

phần chủ yếu của các loại tinh dầu này là các sesquitecpen và dẫn xuất chứa oxi của chúng đƣợc xây dựng trên hai khung cacbon cơ sở là humulan (I) và caryophyllan (II) Trong tinh dầu củ, chúng chiếm đến 83,6%, tinh dầu của thân và

lá có thêm dẫn xuất oxi của khung farnezan (III) chiếm một lƣợng khá lớn: trong thân là 16,8% và trong lá là 22,3%

Để có thể rút ra những kết luận lí thú về mối liên hệ hóa học giữa củ, thân, lá

và hoa của Gừng gió, chúng tôi so sánh các thành phần chính của tinh dầu các bộ phận này trong bảng 1.6

Bảng 1.6: Các thành phần chính của tinh dầu các bộ phận củ, thân, lá và hoa của cây Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm)

Nếu coi - Humulene là sản phẩm đồng phân hóa của - Caryophyllen và Zerumbone là sản phẩm oxi hóa của -Humulene thì ta có sơ đồ sau:

Quá trình này sẽ diễn ra từ hoa đến củ, vì vậy hàm lượng -Caryophyllen ở hoa cao nhất và ở củ sẽ thấp nhất, ngược lại Zerumbone ở củ sẽ cao nhất còn ở hoa

là thấp nhất

Cho đến nay người ta đã phân lập và xác định cấu trúc phân tử được 10 Sesquitecpen từ củ Gừng gió

(1) Zerumbone , (2) Humulene, (3) Humulene 9,10-epoxide, (4) 4,4,7,11-tetramethylcycloundeca-2,6-dienone, (5) Humulene 1,2-epoxide, (6) 6- methoxy-2E,9E-humuladien-8-one, (7) Zerumbone oxide, (8) Humulene 2,3;6,7- diepoxide, (9) Caryophyllone peoxit,

(2E,6E)-Mới nhất, vào năm 2010, M Golam KADER và cộng sự lần đầu tiên phân lập được Zederone từ củ Gừng gió và nghiên cứu hoạt tính chống các Staphylococus kháng thuốc của nó [26]

1.2.3.2 Các curcuminoit

Curcuminoit là các sắc tố màu vàng tươi cho đến vàng thẫm Nó rất phổ biến

trong các cây thuộc họ Gừng, đặc biệt là chi Nghệ (Curcumin) Do đó, việc các

nhà nghiên cứu Matthes.H.W.D, Luu.B và Ourisson.G (năm 1980) đã phân lập từ cặn chiết ete của củ Gừng gió Trung Quốc được 3 curcuminoit là: diferuloylmetan

(1), feruloyl-p-coumaroylmetan (2) và di-p-coumaroylmetan (3) [24] là không có

gì khó hiểu

1.2.3.3 Các flavonoit

Năm 1980, cùng với việc phân lập đƣợc các curcuminoit, các nhà nghiên cứu Matthes.H.W.D, Luu.B và Ourisson.G cũng phân lập đƣợc từ củ Gừng gió Trung

Quốc một flavonol glycozit 3",4"-O-diaxetylafzelin (4) [24]

Tiếp đó năm 1991, một nhóm các nhà nghiên cứu Nhật Bản Masuda.T, Jitoe.A, Kato.S và Nakatani.N đã công bố phân lập đƣợc 4 flavonol glycozit từ cặn chiết axeton của củ Gừng gió Nhật Bản, lần lƣợt là: 2-O-axetyl-α-L-

rhamnopyranozit (5); 3-O- rhamnopyranozit (6); 4-O- rhamnopyranozit (7), 3-O- α-L-rhamnopyranozit (8) [25]

p-acetylafzelin, (7) 2”,4”-O-dip-acetylafzelin, (8)

Kaempferol-3-O-(2,4-O-diacetyl L-rhamnopyranoside) và 3”,4”-O-diacetylafzelin

Vào năm 2007 nhóm các nhà nghiên cứu của Nhật là Bangladesh [36] cũng

công bố phân lập 8 flavonoids trong củ Gừng gió là: (9)

kaempferol-3-O-methylether, (10) kaempferol-3-O-(3,4-O-diacetyl-α-rhamnopyranoside), (11)

kaempferol-3-O-(2,3-O-diacetyl-α-rhamnopyranoside), (12)

kaempferol-3-O-(2,4-O-diacetyl-αrhamnopyranoside, (13)

kaempferol-3-O-(4-O-acetyl-α-L-rhamnopyranoside), (14) kaempferol-3-O-(3-O-acetyl-α-kaempferol-3-O-(4-O-acetyl-α-L-rhamnopyranoside), (15)

kaempferol-3-O-(2-O-acetyl-α-rhamnopyranoside), (16) rhamnopyranoside

Sự trình bày trên cho thấy hợp chất flavonoit có trong củ Gừng gió rất phong

phú, cho đến nay đã có 16 chất được tìm thấy Hầu hết chúng đều là dẫn xuất của

Kaempferol Có một số ít là dẫn xuất của C6 – C3

1.3 Công dụng và các hoạt chất sinh học của Gừng gió (Zingiber zerumbert

Sm)

1.3.1 Gừng gió trong y học các dân tộc Phương Đông

Gừng gió có vị đắng, cay, tính ấm, có tác dụng tán phong hàn, tán huyết ứ,

kích thích, bổ và lọc máu, được sử dụng làm thuốc trong y học dân tộc ở nhiều

nước Châu Á [4, 8]

Trong y học dân gian của Việt Nam, nhân dân thường dùng củ Gừng gió làm

thuốc kích thích, bồi dưỡng sức khỏe, tẩy độc và chữa viêm đau khớp

Tại Inđônêxia, củ Gừng gió được sử dụng làm thuốc kích thích đối với lớp

màng niêm mạc dạ dày, ruột; làm thuốc chữa các bệnh đau dạ dày, tiêu chảy, kiết

lị, sỏi mật … hoặc đắp ngoài để chữa các vết thương

Ở Lào, Campuchia, người ta coi củ Gừng gió là dược thảo có tác dụng tăng

cường thể lực, được dùng làm thuốc bổ dưỡng, kích thích và làm thuốc lọc máu

[9]

Ở Malaixia, củ Gừng gió được dùng làm thuốc chữa đau dạ dày, chữa chân

tay bị co quắp, chữa bệnh ngoài da và dùng cho phụ nữ sau khi sinh nở để phòng

bệnh sản phụ và tránh bị nhiễm trùng [9]

Ở Brunei Darussalam, người dân dùng nước sắc từ củ Gừng gió để pha nước

tắm cho trẻ sơ sinh; dùng lá Gừng gió hơ nóng để chữa viêm đau khớp và giảm

đau nhức do mụn nhọt Còn người dân Philippin lại thường dùng củ Gừng gió

phơi khô, tán nhỏ thành bột làm thuốc chữa bệnh tiêu chảy, dùng củ Gừng gió sắc

làm thuốc uống chữa ho và đặc biệt là điều trị bệnh viêm thấp khớp [9]

1.3.2 Các hoạt chất sinh học của Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm)

Trong y học các dân tộc Phương Đông, Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm)

được bào chế và dùng chủ yếu là củ dưới dạng khô (thái thành lát) hay tươi để

chữa trị rất nhiều bệnh theo kinh nghiệm dân gian, đời này truyền sang đời sau (nhƣ đã nêu ở phần 1.3.1) Ngày nay, y dƣợc học hiện đại nghiên cứu tác dụng chữa bệnh của Gừng gió qua việc tìm kiếm các chất tinh khiết có tác dụng thực sự

với tác nhân gây bệnh in vitro và in vivo qua các phép thử sinh học (bioassay test)

cụ thể Theo cách này, để tìm kiếm những chất xúc tiến các hoạt tính chống ung thƣ của các cây thuốc dân tộc thuộc chi Gừng ở Malaixia, Vimala.S và các cộng

sự [43] đã chiết từ củ của 7 loại Gừng bằng các dung môi khác nhau, sau đó thử hoạt tính ức chế gây ung thƣ của các phần chiết đối với TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-axetat) tạo ra bởi hoạt động của virut Epstein-Barr trên tế bào Raji Kết quả đƣợc chỉ ra nhƣ sau:

Bảng 1.7 Phần trăm ức chế TPA (làm giảm hoạt tính của virut Barr) của các cặn chiết

100%: ức chế hoàn toàn; 99-1%: phần trăm bị ức chế; ct: gây độc tế bào

Bảng này cho thấy Gừng gió là một trong ba loại Gừng được thử có hoạt tính chống ung thư mạnh nhất

1.3.3 Zerumbone và hoạt tính sinh học

1.3.3.1 Zerumbone và hoạt tính sinh học

Như phần trên đã trình bày, hàm lượng Zerumbone trong củ Gừng gió rất cao, đặc biệt trong tinh dầu (73,2%) [21] Nó là thành phần chính quyết định giá trị của tinh dầu Gừng gió cũng như cặn chiết của Gừng gió Do đó nghiên cứu hoạt chất sinh học trong Gừng gió trước hết là nghiên cứu hoạt tính sinh học của Zerumbone

Hoạt tính chống ung thư là hoạt tính nổi bật của Zerumbone Điều này được Takahashi.S đề cập đến năm 2002 [36] và về sau có nhiều nghiên cứu khẳng định điều này Đặc biệt năm 2005, Huang.G.C và cộng sự nghiên cứu tác dụng ức chế

khối u của Zerumbone trên tế bào P-388D1 in vitro, in vivo ở chuột và khẳng định

ở nồng độ 5 mg/kg (thể trọng chuột) thì kéo dài sự sống của chuột một cách rõ rệt [22] Zerumbone cũng ức chế sự phát triển tế bào thư máu trắng dòng HL 60 ở người, ở các nồng độ 22,29; 9,12 và 2,27 μg/ml trong 6, 12 và 18 giờ tùy theo phương thức điều trị [29] Năm 2005, PGS TS Văn Ngọc Hướng trong nghiên cứu về các hoạt chất chống ung thư và HIV từ cây cỏ Việt Nam đã khảo sát hoạt

tính chống các dòng ung thư người Hep-2, RD, KB in vitro; kết quả cho thấy

Zerumbone ức chế mạnh nhất đối với sự phát triển của dòng ung thư biểu mô KB, sau đó là dòng ung thư tim RD và cuối cùng là ung thư gan Hep-2 (bảng 1.8) [11]

Bảng 1.8 Cường độ gây độc tế bào ung thư của Zerumbone in vitro

 Ung thư máu (Leukemia) [23]

So sánh hoạt tính chống ung thư đại tràng in vivo của Zerumbone với Curcumin I, người ta thấy hoạt tính của Zerumbone mạnh hơn Curcumin I rất nhiều, IC50 của Zerumbone là 2,7 g/ ml trong khi đó IC50 của Curcumin I là 9,4 g/

ml [39]

So sánh hoạt tính chống ung thư của Zerumbone với hoạt tính chống ung thư của Cis-platin đối với ung thư tử cung người Hela, Abdul A.B H và cộng sự nhận thấy IC50 của Zerumbone là 2,5 g/ml và IC50 của Cis-platin là 1,6 g/ml Kết quả này cho thấy viễn cảnh tốt đẹp của Zerumbone trong việc phát triển thuốc hóa học thiên nhiên mới cho điều trị ung thư tử cung [13]

Khảo sát chi tiết hoạt động gây độc tế bào ung thư gan của Zerumbone và Cis-platin, Sharifash Sakinah S.A và cộng sự khẳng định rằng Zerumbone gây độc

chọn lọc tế bào ung thư, chống sự phát triển đột biến, còn Cis-platin không có tính

chất chọn lọc, nó độc với cả tế bào ung thư (cancerous cells) lẫn tế bào thường (non-cancerous cells) Các số liệu của họ cũng khẳng định Cis-platin gây độc tế bào ung thư gan Hep G2 (IC50 = 7,08±0,073 g/ml) yếu hơn nhiều so với độ độc của Zerumbone đối với Hep G2 IC50 = 3,15±0,026 g/ml) Điều này cho thấy Zerumbone cũng rất có triển vọng trong việc nghiên cứu thuốc điều trị ung thư gan [38]

Sự trình bày trên cho thấy hoạt tính chống ung thư và chống viêm là hoạt tính sinh học chính của Zerumbone Ngày nay, nghiên cứu hoạt tính chống ung thư của các loại thuốc chủ yếu đi sâu vào cơ chế tác dụng của thuốc với hy vọng tìm ra thuốc mới Với Zerumbone cho đến nay, có 03 cơ chế được nêu lên, đó là:

 Cơ chế sinh học phân tử [41]

Cơ sở khoa học của cơ chế này đã được nhà khoa học Mỹ Takada nêu ra năm

2005 Cơ chế này dựa vào yếu tố nhân (NF-kB) (Nuclear factor kappa B) trong quá trình phát triển sinh học Cho đến nay, người ta đã khẳng định mọi tế bào có NF-kB và I-kB (inhibit-kappa B) ở trạng thái bình thường NF-kB và I-kB liên kết đồng hóa trị với nhau Nhưng vì một lý do nào đó như tác động độc hại của hóa chất, suy thoái môi trường hay sự xâm nhập của các vi khuẩn… làm cho I-kB bị phá hủy nên NF-kB được giải phóng và trở nên hoạt động bất thường

Chính sự hoạt động bất thường của NF-kB là nguyên nhân gây ra rất nhiều bệnh tật cho con người, đặc biệt là bệnh ung thư, viêm nhiễm, thần kinh, Alzheimer… Theo Takada và cộng sự, Zerumbone đóng vai trò như một I-kB, nó liên kết với NF-kB hoạt hóa nhờ nhóm chức sinh học của mình, gây ức chế sự hoạt động bất thường của NF-kB nên ngăn chặn được các bệnh do NF-kB hoạt hóa gây ra như bệnh ung thư

1.3.3.2 Cơ chế oxi hóa khử [12]

Cơ chế này được Hoffman A và cộng sự nêu lên năm 2002 Trong chu trình phát triển của tế bào luôn tồn tại cặp Glutathione (GSH) và Glutathyl sunphua (GS- SG) Cặp oxi hóa khử này có điện thế oxi hóa khử E = log(GS-SG)/(GSH)2

Tốc độ phát triển tế bào khác nhau thì nồng độ các tác nhân của cặp điện thế này thay đổi Do đó, điện thế E thay đổi Trong quá trình điều trị ung thư bằng Zerumbone, do có sự cộng hợp ái nhân của GSH vào nhóm cacbonyl - không no của Zerumbone tạo ra sản phẩm cộng hợp Michael làm cho nồng độ GSH thay đổi

và dẫn đến thay đổi điện thế E Như thế theo dõi điện thế E của tế bào ung thư (khối u) trong quá trình điều trị bằng Zerumbone không chỉ cho biết tác dụng của Zerumbone đến sự phát triển của tế bào ung thư mà còn cho phép xác định được liều điều trị (dose treatment) của Zerumbone cho đến lúc E của tế bào ung thư (khối u) bằng E của tế bào bình thường

1.3.3.3 Cơ chế thúc đẩy quá trình tự chết (apoptosis mechanism)

Tháng 12 năm 2009, trong bằng phát minh của mình về nghiên cứu điều trị tế bào ung thư Hela bằng Zerumbone, Abdul A.B.H đã khẳng định cơ chế này [13, 14] Apoptosis là cách để tế bào tách ra khỏi mô già như là một phần trong cơ chế duy trì quá trình phát triển bình thường Apoptosis cũng là cách hối thúc các tế bào già tự nguyện chết, không phải bắt buộc chết (cái chết này cũng là chết sinh lý chủ động, nó khác với chết bệnh lý thụ động (necrosis) Nó được gọi là cái chết sạch sẽ của sinh học bởi tất cả các xác chết đều được chủ động dọn dẹp nhờ thực bào phân giải nên không có bất kỳ dấu tích nào để lại [10] Nếu quá trình Apoptosis bị tổn thương hay bị khóa không thực hiện được thì các tế bào già, tế bào hư không bị chết mà vẫn phát triển phân chia vô tội vạ Khi đó sự cân bằng sinh học bị phá vỡ

và gây lên bệnh tật, nhất là bệnh ung thư

Như thế, nếu như xúc tiến quá trình Apoptosis của các tế bào ung thư chính

là lập lại sự cân bằng sinh tử làm cho tế bào phát triển bình thường Điều này đã được Abdul khẳng định in vitro khi nghiên cứu tác dụng của Zerumbone lên tế bào ung thư người Hela [14]

Ngoài nghiên cứu hoạt tính chống ung thư, người ta cũng rất quan tâm nghiên cứu hoạt tính phòng ngừa ung thư và nhóm chức sinh học của phân tử Zerumbone Đây là một hướng nghiên cứu mới phát triển đầu thế kỷ này Để khảo sát hoạt tính phòng ngừa ung thư Murakami.A và cộng sự đã khảo sát hoạt tính ức

chế của Zerumbone đối với tác nhân gây ung thư TPA axetat) do hoạt động của virut Epstein-Barr tạo ra Kết quả cho thấy Zerumbone là một tác nhân ức chế mạnh tác nhân gây ung thư TPA (IC50 = 0,14 μM) [28] Theo kết quả nghiên cứu năm 2006 của PGS.TS Văn Ngọc Hướng cho thấy Zerumbone

(12-O-tetradecanoylphorbol-13-không những chống ung thư báng Sarcoma 180 in vivo mà còn phòng ngừa tái

phát ung thư này ở giai đoạn hậu phẫu Và đây cũng là lần đầu tiên phát hiện hoạt tính phòng ngừa tái phát ung thư của Zerumbone [11]

Để khẳng định nhóm chức có có hoạt tính phòng ngừa ung thư trong phân tử Zerumbone ta tiến hành so sánh cường độ ức chế tác nhân gây ung thư của Zerumbone với cường độ ức chế của các dẫn xuất của nó như sau:

IC50 = 0,14 μM IC50 = 0,95 μM IC50 >100 μM Kết quả này cho thấy nếu khử hóa nhóm cacbonyl của Zerumbone thành nhóm ancol hay khử sâu hơn thành nhóm metylen thì hoạt tính chống ung thư của Zerumbone giảm đi một cách rõ rệt từ 0,14 μM đến 0,95 μM và trên 100 μM Như vậy có thể bước đầu nói rằng nhóm xeton vòng α, β không no quyết định hoạt tính chống ung thư của Zerumbone Các nghiên cứu tiếp theo về vai trò của Zerumbone trong việc loại trừ các gốc tự do sinh ra trong quá trình tiền viêm nhiễm và sự phát triển đột biến kép của tế bào ung thư, Murakami.A và cộng sự đã khẳng định thêm vai trò quyết định của nhóm cacbonyl α, β không no trong hoạt tính chống viêm và chống ung thư của Zerumbone [29]

Các nghiên cứu sâu hơn vai trò của nhóm cacbonyl α, β không no trong phân

tử Zerumbone của Nakamura và cộng sự cho thấy Zerumbone là một tác nhân hóa học phòng ngừa (chemopreventive agent), chống lại các bệnh ung thư ruột già và

ung thư da nhờ nhóm cacbonyl α, β không no của nó đã kích thích các enzym giải độc phase II của tế bào biểu mô nuôi cấy trên chuột Còn Humulene và zerumbol không có các nhóm này nên không thể hiện một tác dụng nào Các tác giả này còn cho rằng đặc tính ái điện tử của nhóm cacbonyl α, β không no làm cho khả năng phản ứng ái nhân của các protein sunfuryl tốt hơn ở vị trí nhóm cacbonyl này, nhất

là các tiol có phân tử lượng thấp Đó là thực chất vai trò quan trọng của nhóm cacbonyl α, β không no trong kích thích enzym giải độc phase II [30]

1.3.4 Phân lập và chuyển hóa Zerumbone

1.3.4.1 Phân lập Zerumbone

Như trên đã trình bày, Zerumbone là một chất có nhiều hoạt tính sinh học quý giá Hơn nữa, nguyên liệu của nó cực kỳ phong phú nên người ta rất quan tâm phân lập Zerumbone để nghiên cứu làm dược liệu

Zerumbone có trong nhiều loài thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) như Gừng tía (Zingiber purpureum Roscoe), nghệ đen (Curcuma Zerumbone zerdoaria)… nhưng hàm lượng Zerumbone trong củ Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) là cao

nhất[5] Vì vậy, người ta nghiên cứu phân lập Zerumbone chủ yếu từ củ Gừng gió Cho đến nay, có 2 phương pháp phân lập Zerumbone từ củ Gừng gió

i Phương pháp chiết:

Theo phương pháp này, người ta chiết bột khô hay tươi nghiền từ củ Gừng gió bằng các dung môi khác nhau như MeOH, EtOH, dietyl ete… sau đó xử lý và chiết các chất không phân cực bằng n-hexan, loại n-hexan rồi cho sản phẩm qua cột silica gel để phân lập Zerumbone [14] Theo cách này Abdul và cộng sự trong bằng phát minh của mình công bố tháng 12 năm 2009 đã phân lập Zerumbone từ

củ Gừng gió đạt hiệu suất 0,062% tính theo trọng lượng tươi

ii Phân lập Zerumbone từ tinh dầu

Theo cách này, người ta điều chế tinh dầu Gừng gió bằng phương pháp cất hơi nước trong một thiết bị đặc biệt, sau đó làm lạnh tinh dầu để thu được Zerumbone kết tinh, lọc tinh thể Zerumbone thô rồi tinh chế qua cột Silica gel thu Zerumbone tinh khiết

Cũng theo phương pháp này, Văn Ngọc Hướng và cộng sự đã phân lập thành công Zerumbone từ củ Gừng gió vùng Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc, Việt Nam đạt hiệu suất cao [11]

iii Xác định cấu trúc phân tử của Zerumbone

Zerumbone là dẫn xuất của sesquitecpen có khung cacbon cơ sở là Humulan nên còn có tên là 2,6,9-Humulatrien 8-one Nó được Dev S phân lập đầu tiên vào năm 1960 [20] từ củ Gừng gió Zingiber zerumbet Sm và một số loại Gừng

(Zingiber) khác Nó kết tinh hình kim, nóng chảy 66-67oC, nhiệt độ sôi

165-167oC/10mmHg, có công thức phân tử là C15H22O, phân tử lượng 218,33

Cấu trúc tinh thể của Zerumbone được Sal S.R xác định năm 1981 [34] Công thức cấu tạo phân tử Zerumbone được Dai J.R.et al xác định năm 1997 [19] Kết quả xác định cấu trúc phân tử Zerumbone cho thấy nó có tên hóa học là (2E,6E,10E)-2,6,9,9-tetramethylcycloundeca-2,6,10-trien-1-one Hóa lập thể của Zerumbone cũng được N.P Damodaran và Sukh Dew xác định năm 1965 [31]

1.3.4.2 Các chuyển hóa Zerumbone

Zerumbone là một Sesquitecpen xeton đơn vòng có 03 liên kết đôi và nhóm xeton , không no Cấu trúc phân tử của Zerumbone tạo cho nó có nhiều khả năng chuyển hóa lý thú Đó là chuyển hóa liên kết đôi độc lập, chuyển hóa các liên kết đôi liên hợp với nhóm cacbonyl, chuyển hóa nhóm cacbonyl, và chuyển hóa mở vòng… Hơn nữa, nguồn nguyên liệu Zerumbone phong phú, chiếm 55-85% tinh

dầu củ Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm)

Zerumbone là một chất có hoạt tính chống ung thư mạnh, chống viêm và HIV, do đó chuyển hóa Zerumbone còn nhằm tạo ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học tốt hơn zerumbone và tìm ra nhóm chức sinh học của phân tử zerumbone cũng là một hướng chuyển hóa làm cho các nhà khoa học thế giới rất quan tâm, đặc biệt là các nhà khoa học Nhật Bản

b1 Chuyển hóa liên kết đôi liên hợp với nhóm cacbonyl

Năm 1999, Kitayma T và cộng sự đã thực hiện phản ứng cộng hợp 1, 2 ở các liên đôi C6 và C9 với HCN, kết quả là vòng Zerumbone bị xoắn lại và tạo ra các đồng phân DIA có cấu hình thú vị, khi thực hiện cộng hợp 1 mol Brom vào liên kết đôi C6 tạo ra một hỗn hợp 2 đồng phân DIA 5A và 5B Xử lý 5A với KCN cho ta hỗn hợp Cyclopropanecacboxylic acid 6A và 6B Lập thể cũng như sự chọn lọc của các phản ứng này đều đã được khảo sát [37]

Các tác giả này cũng là những người đầu tiên nghiên cứu hóa học Zerumbone Họ thực hiện phản ứng cộng hợp vào liên kết đôi liên hợp với nhóm cacbonyl và tạo ra liên kết vòng mới [37]

Phản ứng cộng hợp NH3 và dẫn xuất của nó vào liên kết đôi liên hợp với nhóm cacbonyl trong phân tử Zerumbone không những là phản ứng cộng hợp hay

về lý thuyết mà sản phẩm tạo ra cũng có hoạt tính sinh học lý thú [40]

b2 Chuyển hóa liên kết đôi độc lập (C 6 =C 7 )

Đặc trưng nổi bật của liên kết đôi là dễ bị oxy hóa Phản ứng quan trọng là epoxi hóa Sản phẩm này là nguyên liệu cho chuyển hóa tiếp theo [37] thành những chất chống ung thư mật [42]

b3 Khử hóa nhóm cacbonyl

Tùy theo tác nhân khử mà nhóm cacbonyl của Zerumbone có thể khử về nhóm cacbinol hay nhóm metylen Nhưng như trên đã trình bày, Humulene không phải là chất có hoạt tính sinh học lý thú nên người ta thường khử hóa nhóm cacbonyl của Zerumbone về nhóm cacbinol, sau đó chuyển hóa tiếp Theo cách