phân tích di truyền gen sửa chữa bắt cặp sai msh2 từ bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Bảng 1: Thống kê các bệnh ung thư liên quan đến HNPCC Bảng 2: Tiêu chuẩn Amsterdam I và Amsterdam II trong chẩn đoán lâm sàng HNPCC Bảng 3: Các gen MMR liên quan đến ung thư đại trực trà

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Mai

PHÂN TÍCH DI TRUYỀN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MSH2

TỪ BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Mai

PHÂN TÍCH DI TRUYỀN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MSH2

TỪ BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ HỒNG VÂN

Trang

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

Bảng ký hiệu các chữ viết tắt

Lời nói đầu 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Những nét khái quát về ung thư, bệnh ung thư và gen ung thư 3

1.1.1 Ung thư và bệnh ung thư 3

1.1.2 Gen ung thư (oncogene) 4

1.2 Những hiểu biết về ung thư đại trực tràng 5

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu ung thư đại trực tràng 5

1.2.2 Sơ lược về bệnh ung thư đai trực tràng 6

1.2.3 Cơ sở phân tử của ung thư đại trực tràng di truyền 12

1.3 Hệ thống gen MMR và đột biến gen MSH2 với hội chứng ung thư đại trực tràng 17

1.3.1 Hệ thống gen MMR 17

đại trực tràng 24

1.4.1 Kỹ thuật phân tích các trình tự lặp lại đơn giản SSR 25

1.4.2 Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn RFLP 25

1.4.3 Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn SSCP 26

1.4.4 Kỹ thuật phân tích sợi đôi dị hợp HET 27

1.4.5 Kỹ thuật điện di gel gradient biến tính DGGE 28

1.4.6 Các phương pháp giải trình tự ADN 28

1.5 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 29

1.5.1 Mục tiêu nghiên cứu 29

1.5.2 Nội dung nghiên cứu 29

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Vật liệu, địa điểm, hoá chất và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu30 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 30

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 30

2.1.3 Hóa chất và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 30

2.2 Phương pháp nghiên cứu 31

2.2.1 Thu thập và bảo quản mẫu 31

2.2.2 Tách ADN tổng số 31

2.2.5 Kỹ thuật SSCP trong phân tích đột biến gây ung thư đại trực

tràng 34

2.2.6 Giải trình tự ADN 37

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số 39

3.2 Kết quả nhân bản 09 exon gen MSH2 40

3.2.1 Kết quả nhân bản exon 2 40

3.2.2 Kết quả nhân bản exon 3 41

3.2.3 Kết quả nhân bản exon 6 42

3.2.4 Kết quả nhân bản exon 7 43

3.2.5 Kết quả nhân bản exon 8 44

3.2.6 Kết quả nhân bản exon 12 45

3.2.7 Kết quả nhân bản exon 13 46

3.2.8 Kết quả nhân bản exon 14 47

3.2.9 Kết quả nhân bản exon 15 48

3.3 Kết quả phân tích đột biến trên 09 exon gen MSH2 50

3.3.1 Kết quả phân tích đột biến exon 2 51

3.3.2 Kết quả phân tích đột biến exon 3 53

3.3.5 Kết quả phân tích đột biến exon 8 57

3.3.6 Kết quả phân tích đột biến exon 12 59

3.3.7 Kết quả phân tích đột biến exon 13 60

3.3.8 Kết quả phân tích đột biến exon 14 61

3.3.9 Kết quả phân tích đột biến exon 15 62

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

Kết luận 66

Kiến nghị 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

Tài liệu tiếng Việt 68

Tài liệu tiếng Anh 68

Các trang Web 72

Bảng 1: Thống kê các bệnh ung thư liên quan đến HNPCC

Bảng 2: Tiêu chuẩn Amsterdam I và Amsterdam II trong chẩn đoán lâm sàng

HNPCC

Bảng 3: Các gen MMR liên quan đến ung thư đại trực tràng

Bảng 4: Tỷ lệ các đột biến thường gặp trong hai gen MLH1 và MSH2

Bảng 5: Nguy cơ mắc một số bệnh ung thư ở người có đột biến gen liên quan

đến HNPCC so với các cá thể bình thường

Bảng 6: Trình tự các cặp mồi dùng để nhân bản 09 exon quan tâm

Bảng 7: Thành phần và chu trình nhiệt cho một phản ứng PCR

Bảng 8: Tỷ lệ các thành phần của PAGE 12% trong kỹ thuật SSCP

Bảng 9: Quy trình nhuộm bạc và thành phần các dung dịch nhuộm

Bảng 10: Kết quả tối ưu điều kiện nhiệt độ gắn mồi trong nhân bản các exon

nghiên cứu

Hình 1: Sơ đồ cấu tạo ruột kết và sự hình thành polyp bên trong

Hình 9: Kỹ thuật SSCP trong phân tích đột biến gen MSH2

Hình 10: Kết quả tách chiết ADN tổng số

Hình 11: Kết quả nhân bản exon 2

Hình 12: Điều kiện thử nghiệm (a) và kết quả nhân bản (b) exon 3

Hình 13: Kết quả nhân bản exon 6

Hình 14: Kết quả nhân bản exon 7

Hình 15: Kết quả nhân bản exon 8

Hình 16: Điều kiện thử nghiệm (a) và kết quả nhân bản (b) exon 12

Hình 17: Kết quả nhân bản exon 13

Hình 18: Điều kiện thử nghiệm (a) và kết quả nhân bản (b) exon 14

Hình 19: Điều kiện thử nghiệm (a) và kết quả nhân bản (b) exon 15

Hình 33: Mô hình sợi đơn sai khác của mẫu 19 exon 15

Hình 34: Kết quả giải trình tự mẫu 19 exon 15 gen MSH2

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

ADN Deoxiribonucleic Acid Axit deoxiribonucleic

ARN Ribonucleic Acid Axit ribonucleic

CRC Colorectal Cancer Ung thư đại trực tràng

DGGE Denaturing Gradient Gel

Polyp tuyến theo dòng họ

HET Heteroduplex Analysis Phân tích sợi kép dị hợp

IHC Immunohistochemistry Hóa mô miễn dịch

LOH Loss of Heterozygosity Mất tính dị hợp tử

MMR Mismatch Repair Sửa chữa bắt cặp sai

MSI Microsatellite Instability Bất ổn vi vệ tinh

NCBI National Center for

Điện di trên gel polyacrylamide

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

SSCP Single Strand Conformation

Polymorphisms

Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn

SSR Simple Sequence Repeats Trình tự lặp lại đơn giản

RFLP Restriction Fragment Length

Polymorphism

Đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn

RT-PCR Reverse

Transcription-Polymerase Chain Reaction

Kỹ thuật PCR phiên mã ngược

TAE Tris-Acetic acid-EDTA Đệm điện di TAE

LỜI NÓI ĐẦU

Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm trên thế giới có khoảng 10,1 triệu trường hợp mới mắc ung thư Cũng theo tổ chức này cho biết, mỗi năm có khoảng 6,7 triệu người chết do ung thư Tỷ lệ chết do ung thư chiếm tới 12% trong tổng số các nguyên nhân gây tử vong ở người Các loại ung thư hàng đầu được tổng kết ở nam giới là ung thư phổi, dạ dày, đại trực tràng, tiền liệt tuyến, gan; ở nữ giới

là ung thư vú, đại trực tràng, cổ tử cung, dạ dày và phổi [30]

Trong hơn một thập niên trở lại đây, tỷ lệ mắc ung thư có xu hướng gia tăng

ở hầu hết các quốc gia trên thế giới Qua các kết quả thống kê cho biết, hiện toàn cầu có khoảng 25 triệu người đang sống chung với bệnh ung thư Con số này ước tính lên tới 30 triệu người vào năm 2020 nếu như chúng ta không tìm ra liệu pháp can thiệp và chữa trị kịp thời

Riêng ở Việt Nam, mỗi năm có trên 150.000 người mắc ung thư Trong đó, khoảng 100.000 người chết vì căn bệnh quái ác này Riêng số ca tử vong do ung thư đại trực tràng ước tính khoảng 55.000 trường hợp Đây được xem là những con số đáng báo động và là thách thức lớn lao đối với Y học nước nhà

Hiện nay, trên thế giới ung thư đại trực tràng chiếm khoảng 11,5% tổng số các trường hợp ung thư và chiếm tới 15,2% tổng số trường hợp tử vong có nguyên nhân từ ung thư Loại ung thư này được nhận định là liên quan đến chế độ ăn uống

và lối sống, thường gặp ở các nước phát triển và có xu hướng tăng nhanh ở các nước đang phát triển Căn bệnh này thường xuất hiện ở những người có độ tuổi trên

50 và có xu hướng dần “trẻ hóa” trong hơn một thập niên trở lại đây Đặc biệt, những người có tiền sử viêm đại trực tràng hoặc trong gia đình, dòng họ có người bị ung thư đại trực tràng thì nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng xảy ra cao hơn Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, một bộ phận ung thư đại trực tràng có xu hướng chung di truyền theo dòng họ liên quan đến các gen gây đột biến (mutator gene) [4]

Trong ung thư đại trực tràng, hội chứng HNPCC – ung thư ruột kết không polyp di truyền còn gọi là hội chứng Lynch chiếm khoảng 15% Hội chứng này cũng được xem là một bệnh di truyền tương đối phổ biến và gần đây được biết đến như một căn bệnh riêng biệt [30] Bên cạnh đó, HNPCC là hội chứng có khuynh hướng ung thư không chỉ ở đại trực tràng mà còn liên quan đến các bệnh ung thư ở các cơ quan khác nhau như dạ dày, ruột non, não, tụy, buồng trứng, cổ tử cung và

da

HNPCC là hội chứng có tính chất di truyền, vì nó có liên quan mật thiết đến

sự sai hỏng một trong các gen thuộc hệ thống gen sửa chữa bắt cặp sai MMR Hệ

thống này gồm 6 gen chính là MLH1, MSH2, MSH3, MSH6, PMS2, PMS6 Trong

đó, MLH1 và MSH2 được cho là hai gen có liên kết chặt đến sự hình thành HNPCC Bởi vì, nếu MLH1 tham gia vào quá trình sửa chữa sự sai hỏng thì MSH2

lại đóng vai trò nhận diện các lỗi sai hỏng trong tái bản ADN Khoảng 40% các trường hợp mắc hội chứng Lynch với một đột biến được xác định có liên quan đến

đột biến gen MSH2 Hàng trăm đột biến gen này có khả năng dẫn đến ung thư đại

trực tràng cũng như các loại ung thư khác liên quan đến HNPCC [22]

Mặc dù ung thư đại trực tràng, trong đó có ung thư đại trực tràng mang khuynh hướng di truyền là một trong những dạng ung thư có tỷ lệ mắc phải ở Việt Nam khá cao nhưng những nghiên cứu về gen liên quan đến căn bệnh này chưa

nhiều, đặc biệt là những nghiên cứu về gen MSH2 Chính vì thế, chúng tôi tiến

hành “Phân tích di truyền gen sửa chữa bắt cặp sai MSH2 từ bệnh nhân ung

thƣ đại trực tràng” nhằm đưa ra những kết quả nghiên cứu bước đầu về gen

MSH2 ở các bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam, nghiên cứu mới về các

gen MMR khác nhằm phục vụ có hiệu quả trong việc chẩn đoán cũng như phát hiện sớm bệnh ung thư đại trực tràng đang có xu hướng ngày một gia tăng tại Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 NHỮNG NÉT KHÁI QUÁT VỀ UNG THƢ, BỆNH UNG THƢ VÀ GEN UNG THƢ

1.1.1 Ung thƣ và bệnh ung thƣ

Ung thư là sự phân chia một cách bất thường của một nhóm tế bào tạo thành những khối u Các khối u này là tập hợp các tế bào có quan hệ di truyền với nhau, chúng có khả năng phân chia không kiểm soát Chính vì thế, thuật ngữ “ung thư” theo nghĩa hẹp được dùng để chỉ những khối u có khả năng xâm lấn các tổ chức mô xung quanh gồm các tế bào bình thường [4]

Để phân biệt giữa khối u lành và khối u ác tính ta dựa vào khả năng xâm lấn của các tế bào bất thường đối với các tế bào xung quanh nó Nếu là khối u lành, nó chỉ hình thành nên những tổ chức tế bào có khả năng sinh sản bất thường, khi tiếp xúc với mạch máu hay mạch bạch huyết cũng không có khả năng di chuyển tới một

vị trí, một mô hay bất kì một cơ quan nào khác [4] Ngược lại, nếu là khối u ác tính

sẽ có thể di chuyển (di căn) tới bất cứ vị trí nào và tiếp tục tăng sinh mạnh ngay tại

vị trí mà chúng chuyển tới Các u di căn có khả năng gây ra những rối loạn cục bộ chức năng của các mô, thậm chí cả các mô liên đới và có thể dẫn đến tử vong

Các khối u thường phát sinh từ một tế bào ban đầu bị biến đổi di truyền nhất định khiến chúng có khả năng tăng sinh mạnh, được gọi là quá trình phát sinh ung thư hay sự phát sinh ung thư Các khối u thường bắt nguồn từ những u nhỏ lành tính sau đó chuyển sang trạng thái ác tính và di căn Các khối u này có xu hướng tích lũy các biến đổi di truyền và tạo nên các đặc tính mới Sự tích lũy các gen ung thư ở các

tế bào khối u chính là nguồn gốc phát sinh ung thư [4]

Bệnh ung thư được dùng để chỉ một nhóm bệnh đa dạng nào đó ở người Và trong số đó, một vài bệnh chỉ đơn thuần gây nên những biến đổi nhỏ về sinh lí, còn phần lớn là gây ra những rối loạn sinh lí nghiêm trọng Các bệnh ung thư phổ biến ở

người trưởng thành là các bệnh như ung thư biểu mô (caxinôm), ung thư mô liên kết (sacôm), ung thư bạch huyết và bạch cầu còn gọi là các khối u dạng lỏng [4]

Các bệnh ung thư đều phát sinh do sự biến đổi các gen tạo nên các alen đột biến Trong thực tế, sự phát sinh các bệnh ung thư lại liên quan đến nhiều nhân tố Nhờ những tiến bộ về khoa học kĩ thuật với các công cụ nghiên cứu và phân tích di truyền hiện đại đã dần làm sáng tỏ cơ chế phát sinh ung thư Đặc biệt, những nghiên cứu trong khoảng 20 năm trở lại đây đã mang lại những kiến thức thiết thực và nhất quán Những nghiên cứu này đã hình thành nên các nguyên lý di truyền học ung thư Tuy nhiên, mãi tới đầu thế kỉ XIX ung thư mới thật sự được ghi nhận [4]

1.1.2 Gen ung thƣ (oncogene)

Gen ung thư là một dạng đột biến làm tăng nguy cơ ung thư hoặc làm thúc đẩy quá trình phát sinh ung thư Ngoài ra, gen ung thư cũng có thể được coi như các dạng alen đặc biệt do các gen bình thường xuất hiện các đột biến [4] Còn gen gây ung thư được coi là một dạng đặc biệt của gen ung thư Nếu gen ung thư sinh ra bởi đột biến, thì gen gây ung thư chỉ làm thay đổi chứ không làm mất chức năng sản phẩm của protein mà gen đó tạo ra

Trong quá trình tăng trưởng, các khối u tích lũy dần các gen ung thư Sự tích lũy này chủ yếu theo ba con đường sau:

1 Sự tích lũy truyền qua các tế bào dòng sinh dục

2 Sự tích lũy do đột biến tự phát trong tế bào sôma

3 Sự tích lũy đột biến do lây nhiễm virut

Trong đó, gen ung thư dòng sinh dục chiếm tỉ lệ nhỏ (từ 0,1 – 10%) nhưng lại rất đáng kể trong các trường hợp gây ung thư ở người [4] Còn gen ung thư dòng

tế bào sôma đươc gọi là các đột biến sôma Đột biến sôma dùng để chỉ quá trình phát sinh đột biến cũng như sản phẩm do quá trình đột biến đó tạo ra

Cả hai loại đột biến dòng sinh dục và đột biến sôma đều có thể làm biến đổi một gen bình thường tạo nên dạng alen đột biến Nhưng không phải tất cả mọi đột biến gen đều dẫn đến phát sinh ung thư

Riêng dạng tích lũy gen ung thư trong cơ thể do nhiễm virut thì ít phổ biến hơn và thường giới hạn trong một số bệnh nhất định (ví dụ virut viêm gan B, C gây ung thư gan, virut HPV gây ung thư cổ tử cung ) Ở dạng phát sinh ung thư này, virut đóng vai trò quan trọng Nó không chỉ là nhân tố truyền gen ung thư mà còn trực tiếp làm biến đổi môi trường mà ở đó các gen ung thư có thể được nhân lên nhanh chóng và được phát tán rộng rãi

1.2 NHỮNG HIỂU BIẾT VỀ UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu ung thƣ đại trực tràng

Ung thư đại trực tràng là bệnh lý khá phổ biến trong các bệnh ung thư có liên quan đến hệ tiêu hóa Trong đó, ung thư đại trực tràng không polyp di truyền được xem là hội chứng thường gặp nhất khi nhắc đến ung thư đại trực tràng Vào cuối thế

kỉ XIX (năm 1895), ung thư đại trực tràng được phát hiện bởi Aldred Warthin Theo quan sát của ông trên một gia đình làm thợ may, có rất nhiều người bị chết bởi ung thư đại trực tràng hoặc ung thư nội mạc tử cung [34] Tuy nhiên, ông chỉ dừng lại ở việc quan sát mà chưa đi sâu vào nghiên cứu những ghi chép của mình nên đặc tính

di truyền của hội chứng này chỉ được biết đến sau những công bố của bác sĩ Henry Lynch

Theo kết quả của ông cho biết, ở các thế hệ đầu, ung thư dạ dày chiếm ưu thế Càng về sau, ung thư đại tràng xuất hiện càng nhiều hơn Sự thay đổi này phản ánh những biến đổi của môi trường có liên quan đến từng giai đoạn phát triển của bệnh ung thư cũng như loại ung thư, đồng thời khẳng định, sự biến đổi môi trường

là một trong những nhân tố quan trọng dẫn đến ung thư đại tràng [4]

Hội chứng Lynch được chia thành hội chứng Lynch I và hội chứng Lynch II

để phân biệt các gia đình chỉ có ung thư đại tràng với các gia đình có cả ung thư đại tràng lẫn các loại ung thư khác Ngày nay, người ta cho rằng, các gia đình có các bệnh ung thư liên quan tới ung thư ruột kết đều được coi là HNPCC [17]

Đến năm 1993, một sai hỏng mới và hiếm gặp trong hệ thống gen MMR của một bệnh nhân mắc ung thư ruột kết được phát hiện đã cung cấp một đầu mối quan trọng trong quá trình nghiên cứu ung thư đại trực tràng di truyền Nghiên cứu được tiến hành trên những đột biến mất đoạn và đột biến khuếch đại gen nhằm chỉ ra các gen ung thư và gen áp chế khối u mới Kết quả, đã tìm thấy các biến đổi sôma về độ dài các trình tự lặp lại được biết đến như các vi vệ tinh [19], [36] Một nghiên cứu khác cũng tìm thấy những biến đổi liên quan đến sự hình thành khối u ở đoạn đầu ruột kết Gần đây nhất, người ta đang nỗ lực lập bản đồ cho các vùng bị mất tính dị hợp tử LOH và cũng đã phát hiện được các đột biến ở trình tự vi vệ tinh Nhờ đó người ta đã khám phá ra bản chất di truyền của ung thư đại trực tràng và khẳng định, hội chứng này do một số gen xảy ra các đột biến khác nhau, được di truyền qua các thế hệ và biểu hiện rõ rệt ở một số dòng họ Ngoài ra, tính hỗn tạp của các gen gây ung thư ở các bệnh nhân ung thư ruột kết di truyền cũng được biết đến như

là một tác nhân gây khó khăn trong chẩn đoán và phát hiện bệnh [20]

1.2.2 Sơ lƣợc về bệnh ung thƣ đại trực tràng

Ung thư đại trực tràng là một loại ung thư biểu mô, chiếm 11,5% tổng số các

ca ung thư và chiếm tới 15,2% tổng số các trường hợp tử vong vì ung thư Loại ung thư này thường liên quan đến chế độ ăn uống và lối sống, gặp nhiều ở các nước phát triển, đặc biệt là các nước phương Tây và đang có xu hướng gia tăng ở các nước đang phát triển [4]

Riêng ở Việt Nam, ung thư đại trực tràng là một trong ba loại ung thư phổ biến hay gặp đối với hệ tiêu hóa Do đó, ngày càng có nhiều dự án tập trung những nghiên cứu nhằm tìm ra nguyên nhân chủ yếu dẫn đến tình trạng này Theo thống kê

của Hội Ung thư Thành phố Hồ Chí Minh, ung thư đại trực tràng nằm trong số 5 bệnh ung thư có số người mắc cao nhất Một khảo sát mới nhất về tình trạng ung thư tại Thành phố Hồ Chí Minh cho thấy, ung thư đại trực tràng xếp thứ 4 ở nam giới (sau ung thư gan, phổi, dạ dày) và xếp thứ 3 ở nữ giới (sau ung thư cổ tử cung

và ung thư vú)

Hiện nay, y học

chưa biết chính xác nguyên

nhân gây ung thư đại trực

tràng Tuy nhiên, có những

yếu tố dẫn đến nguy cơ

chắc chắn làm dễ mắc

bệnh hơn tuổi tác Vì trên

9% bệnh nhân ung thư đại

trực tràng là trên 50 tuổi,

có tiền sử bị polyp, viêm

loét đại tràng và bệnh Crohn (một loại bệnh do hồi tràng – đoạn cuối ruột non bị tổn thương) trong gia đình có người mắc ung thư đại tràng hay đường ruột

Ung thư đại trực tràng là hội chứng khá phổ biến và được phân chia thành 3 loại chính, gồm: hội chứng u tuyến polyp theo dòng họ (FAP) (Hình 1), hội chứng HNPCC và các bệnh ung thư khác có liên quan đến hệ tiêu hóa Trong đó, hội chứng u tuyến polyp theo dòng họ đặc trưng bởi bệnh nhân mang hội chứng này hình thành rất nhiều polyp trong ruột già từ khi còn khá trẻ Các khối u có thể quan sát được chiếm tỷ lệ rất nhỏ, số ít trong đó có khả năng hình thành u ác tính Hội chứng HNPCC đặc trưng bởi không xuất hiện các polyp mà thay vào đó là sự xuất hiện u tuyến Chính những u tuyến này có nguy cơ tiến triển thành ung thư cao hơn nhiều [4]

80% người mắc ung thư ruột già dạng HNPCC có nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng Tuổi trung bình của người mắc bệnh ung thư ruột già đơn phát là 61,

trong khi các bệnh nhân HNPCC đều phát triển ung thư ở độ tuổi trung bình là 42, tức là sớm hơn 20 năm Đối với phụ nữ, có khoảng 20 – 60% bệnh nhân HNPCC

có nguy cơ mắc ung thư nội mạc tử cung Tuổi trung bình cho chẩn đoán ung thư nội mạc tử cung là 46 – 62 Trong số những phụ nữ mắc HNPCC phát triển thành ung thư ruột kết và ung thư nội mạc tử cung, khoảng 50% xuất hiện ung thư nội mạc tử cung từ trước đó [17] Có thể xem xét tỷ lệ mắc các bệnh ung thư khác có liên quan đến HNPCC trong Bảng 1 dưới đây

Bảng 1: Thống kê các bệnh ung thư liên quan đến HNPCC [17]

Ung thƣ liên quan đến

HNPCC

Tỷ lệ mắc HNPCC

Nguy cơ mắc bệnh

Tuổi phát bệnh

Căn cứ vào bảng số liệu trên có thể thấy, tỷ lệ người bị HNPCC dẫn tới mắc ung thư đại trực tràng là rất cao (khoảng 80%) Khi đó, chẩn đoán các mẫu mô trực tràng được phân lập để phân tích ADN là rất quan trọng và cần thiết Nhờ tính phổ biến và dễ tiếp cận, các khối u đại trực tràng là mô hình lí tưởng để nghiên cứu các gen đóng góp vào quá trình phát sinh ung thư Hơn nữa, độ tuổi mắc ung thư đại

40 – 42 Trong một nhóm các bệnh nhân HNPCC cũng như các bệnh nhân ung thư đại trực tràng không đủ tiêu chuẩn HNPCC thì các cá thể mang đột biến dòng mầm

ở một trong các gen MMR sẽ được xác định là mắc hội chứng Lynch Để biết được một bệnh nhân có phải mắc hội chứng HNPCC không, người ta đã thiết lập các tiêu chuẩn để xác định các cá thể có nguy cơ cao với loại hội chứng này Ngoài những chỉ dẫn của Bethesda cải tiến là dựa vào thông tin lâm sàng, lịch sử gia đình hoặc

mô bệnh học hay các tiêu chuẩn Amsterdam I và II, người ta còn tiến hành các xét nghiệm di truyền các đột biến MMR Tuy nhiên, các xét nghiệm này thường rất phức tạp, mất nhiều thời gian và chi phí tốn kém Chính vì thế, người ta đã đưa ra khuyến cáo rằng các bệnh nhân có nguy cơ cao với hội chứng Lynch nên thực hiện phương pháp tiền sàng lọc với phân tích MSI và hóa mô miễn dịch IHC Khi đó, các cá thể có khối u sẽ thể hiện mức độ bất ổn vi vệ tinh cao hoặc mất sự biểu hiện của các protein MMR bằng IHC sau đó tiến hành xét nghiệm đột biến dòng mầm Nếu tuân thủ đúng việc sử dụng hướng tiếp cận từng bước này thì hầu hết các trường hợp mắc hội chứng Lynch đều được phát hiện và cho độ tin cậy rất cao [29]

1.2.2.1 Nguyên nhân ung thư đại trực tràng

Có nhiều nguyên nhân dẫn đến ung thư đại trực tràng Tuy nhiên, y học chưa xác định rõ đâu là nguyên nhân chủ yếu Người ta chỉ biết rằng, có một số nguyên nhân khách quan khác ngoài yếu tố về tuổi tác hay yếu tố gia đình có tiền sử mắc các bệnh về đại trực tràng liên quan đến HNPCC, đó là cách thức ăn uống cũng như lối sống của chúng ta Ăn quá nhiều chất béo, thịt, mỡ, thức ăn chứa nhiều Cholesterol sẽ làm tăng nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng Hay ăn ít hoặc không

ăn các chất xơ như rau xanh, trái cây cũng là nguyên nhân dẫn tới sự hình thành bệnh Ngoài ra, những người thừa cân, béo phì cũng rất dễ mắc loại bệnh này Chính vì thế, để phòng tránh ung thư đại trực tràng, ngoài chế độ ăn uống hợp lý, tăng cường các hoạt động thể dục, thể thao thì từ 50 tuổi trở đi, mỗi người nên tới bác sĩ thăm khám định kỳ ít nhất 1 lần trong năm để kịp thời phát hiện những biến đổi tiềm ẩn giúp phòng tránh ung thư đại trực tràng

1.2.2.2 Triệu chứng biểu hiện ung thư đại trực tràng

Ung thư đại trực tràng là căn bệnh có những triệu chứng ban đầu không rõ rệt, nó có thể khởi phát ở bất cứ vị trí nào của đại trực tràng, từ phía trong ra phía ngoài qua các lớp khác nhau của thành ruột Ung thư ở mỗi vị trí sẽ có những biểu hiện triệu chứng khác nhau và thông thường là có máu trong phân khi người bệnh đi đại tiện Đại đa số trường hợp, bệnh phát triển âm thầm qua nhiều năm Sự phát triển của nó tương đối chậm chạp nên người bệnh hoàn toàn không có một triệu chứng nào cho đến khi ung thư phát triển đến giai đoạn cuối và lan tràn khắp nơi

Có tới 95% các trường hợp ung thư đại tràng là loại ung thư tế bào tuyến được bắt nguồn từ các tế bào thuộc lớp niêm mạc đại tràng

Ở giai đoạn sớm, triệu chứng bệnh thường không rõ rệt, nhiều khi người bệnh chỉ đau bụng nhẹ, cũng có khi bị trướng hay đầy bụng, đau tức vùng bụng trước hoặc sau khi ăn Tuy nhiên, triệu chứng được xem là có giá trị chẩn đoán bệnh

đó là đại tiện ra máu, nhất là ở những người ở độ tuổi khoảng 45 – 55 hay xảy ra các rối loạn tiêu hóa như có ngày bị táo bón, có ngày lại đi lỏng kiểu tiêu chảy 85% bệnh nhân nhập viện trong tình trạng bị ung thư giai đoạn giữa hoặc đã chuyển sang giai đoạn di căn

Do tính chất nguy hiểm và tính phổ biến của bệnh nên những người trong độ tuổi từ 45 – 55 cần đi kiểm tra, xét nghiệm định kỳ như thử phân, nội soi ruột già Ngoài ra, khi có những triệu chứng rối loạn đường tiêu hóa như ăn không tiêu, táo bón, đầy bụng hoặc tiêu chảy thì cần khẩn trương đi khám ngay Khoảng 58% bệnh nhân bị ung thư được phát hiện khi bệnh đã bước sang giai đoạn II và chuẩn bị sang giai đoạn di căn Trên 85% số bệnh nhân mắc ung thư đại trực tràng bị di căn và tử vong do phát hiện bệnh chậm Vì vậy, cần hết sức quan tâm đến những thay đổi của

hệ tiêu hóa, đặc biệt với những người trong gia đình có tiền sử về ung thư đại tràng hay các bệnh ung thư liên quan thì việc thăm khám định kỳ là một việc làm rất cần

thiết

1.2.2.3 Chẩn đoán lâm sàng bệnh ung thư đại trực tràng

Ung thư đại trực tràng dạng HNPCC thường hình thành ung thư từ khi còn khá trẻ, trung bình vào độ tuổi 40, có những trường hợp sớm hơn Với các bệnh nhân mang đột biến dòng mầm ở hội chứng này không những có nguy cơ cao phát sinh bệnh ung thư mà còn làm tăng nguy cơ mắc một số bệnh ung thư khác như ung thư nội mạc tử cung, dạ dày, buồng trứng, ruột non, gan, mật, đường tiết niệu trên, não và da

Việc chẩn đoán ung thư đại trực tràng di truyền có thể dựa trên cơ sở các tiêu chuẩn lâm sàng Amsterdam hoặc các xét nghiệm di truyền phân tử các đột biến dòng mầm trong hệ thống gen nhận biết và sửa chữa bazơ bắt cặp sai Năm 1990, tập đoàn hợp tác quốc tế về HNPCC đã thành lập các tiêu chí nhằm chẩn đoán lâm sàng cho các gia đình mắc ung thư ruột già (gọi là tiêu chuẩn Amsterdam I) [31] Tuy nhiên, các tiêu chí này về sau bị coi là quá hạn chế cho chẩn đoán lâm sàng các bệnh ung thư khác có liên quan đến HNPCC và được sửa đổi thành tiêu chuẩn Amsterdam II [32] được thể hiện qua Bảng 2

Bảng 2: Tiêu chuẩn Amsterdam I và II trong chẩn đoán lâm sàng HNPCC

Tiêu chuẩn Amsterdam I Tiêu chuẩn Amsterdam II

- Có tối thiểu ba người trong phả hệ

mắc ung thư đại tràng

- Một người là trực hệ của một

trong hai người còn lại

- Ít nhất có một người bị ung thư

đại tràng ở độ tuổi dưới 50

- Có tối thiểu ba người trong phả hệ mắc các bệnh ung thư liên quan đến HNPCC

- Một người là trực hệ của một trong hai người còn lại

- Ít nhất có một người bị các bệnh ung thư liên quan đến HNPCC ở độ tuổi dưới 50

Độ chính xác của một chẩn đoán dựa trên tiêu chuẩn lâm sàng phụ thuộc vào tính chính xác của những số liệu báo cáo về lịch sử các gia đình nghiên cứu

1.2.3 Cơ sở phân tử của ung thƣ đại trực tràng di truyền

Ung thư đại trực tràng là một trong những bệnh được xác định là di truyền ngoài những nguyên nhân lối sống và tuổi tác Do hội chứng này liên quan đến đột biến xảy ra tại một trong các gen thuộc hệ thống nhận biết và sửa chữa các bazơ bắt cặp sai MMR Hiện nay, tính bất ổn vi vệ tinh MSI và cơ chế MMR được coi là cơ

sở phân tử giải thích sự hình thành ung thư đại trực tràng di truyền

1.2.3.1 Tính bất ổn vi vệ tinh

Vi vệ tinh là các trình tự ADN ngắn (khoảng 1 – 4 nucleotide) lặp lại từ 10 –

100 lần, chúng phân bố rộng khắp hệ gen Chính khả năng đột biến cao của các trình tự vi vệ tinh là nguyên nhân khiến chúng trở nên có tính đa hình cao

Nghiên cứu về cơ sở phân tử của ung thư đại trực tràng người ta đã tìm thấy những biến đổi sôma về độ dài của các yếu tố lặp lại cao mà chúng ta gọi là các vi

vệ tinh Khi những trình tự vi vệ tinh này bị biến đổi, chúng có thể liên quan đến các khối u ở đoạn đầu đại trực tràng Quan sát này đã cung cấp một sự kết nối giữa các bất thường vi vệ tinh với sự hình thành ung thư đại trực tràng Ngoài ra, trong khi lập bản đồ di truyền, người ta cũng phát hiện ra các vùng bị mất tính dị hợp tử LOH Từ đó họ cũng đã phát hiện được các đột biến ở trình tự vi vệ tinh Cùng với nhiều nghiên cứu khác, sự bất ổn ở các trình tự vi vệ tinh được tìm thấy ở hầu hết các bệnh nhân mắc ung thư đại trực tràng dạng HNPCC Tuy nhiên, trong các khối

u phát hiện ở các bệnh nhân mắc HNPCC chỉ khoảng 15% chứa các bất ổn vi vệ tinh Mặc dù các bất ổn vi vệ tinh không có tác dụng lâm sàng, nhưng đó là dấu hiệu

cụ thể cho thấy hệ thống sửa chữa bắt cặp sai nhờ mạch ADN được methyl hóa bị lỗi [4]

Vi vệ tinh là các trình tự ADN lặp lại phân bố rộng khắp hệ gen nên sự lặp lại cao của các vi vệ tinh làm cho chúng thường bị đột biến do hiện tượng bắt cặp nhầm bởi sự ngắt quãng sợi ADN (slippage) trong quá trình sao chép Các đoạn lặp

1 nucleotide như An hoặc Gn và các đoạn lặp 2 nucleotide như (CA/GT)n thường bị ảnh hưởng bởi sự ngắt quãng nhất Chính sự ngắt quãng này gây nên sự bắt cặp sai hoặc giảm bớt số lượng bazơ trong trình tự lặp lại Phần lớn các bazơ bắt cặp sai được sửa chữa bởi các cơ chế đọc sửa vốn có của phức hợp ADN-polymerazse sao chép Ở các tế bào bình thường, hầu hết các bazơ bắt cặp sai thoát khỏi quá trình đọc sửa của phức hợp ADN-polymerase sao chép đều bị phân giải bởi MMR Các trình tự vi vệ tinh ở các tế bào sai hỏng về MMR dễ bị ảnh hưởng và có xu hướng

mở rộng hoặc thu ngắn trình tự vi vệ tinh từ thế hệ này sang thế hệ khác

Tính bất ổn vi vệ tinh phản ánh tần số đột biến tăng, ảnh hưởng lên toàn bộ

hệ gen Sự phát hiện MSI liên quan đến các sai hỏng MMR đã cung cấp một mấu chốt quan trọng trong việc xác định các gen gây ung thư ruột già dạng HNPCC MSI được đánh giá như là mô hình đột biến giống với mô hình được phát hiện ở nấm men và vi khuẩn mang các đột biến MMR [4]

Mặc dù tính bất ổn vi vệ tinh không có tác dụng trong chẩn đoán lâm sàng ung thư ruột kết nhưng việc phát hiện ra MSI đã cung cấp một đầu mối khá quan trọng trong việc xác định các gen liên quan đến ung thư đại trực tràng, đặc biệt là

các gen liên quan chặt đến hội chứng này như MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 [27],

[32]

1.2.3.2 Cơ chế sửa chữa ADN bắt cặp sai

Trong quá trình sao chép ADN, khi xảy ra các sai hỏng, các bazơ bắt cặp sai ngay lập tức được sửa chữa bằng phức hợp ADN-polymerase sao chép có chức năng đọc sửa Kết quả, lỗi của quá trình sao chép ADN theo thống kê chỉ là 10-12đến 10-9 Mức độ chính xác đáng kinh ngạc này cho thấy chỉ dưới 1% tế bào sẽ mang bazơ bắt cặp sai trong một pha S hoàn chỉnh Bên cạnh cơ chế sửa lỗi hoàn

chỉnh của ADN-polymerase, các bazơ bắt cặp sai trên mạch mới tổng hợp được xử

lý nhờ hệ thống MMR do mạch ADN mới chưa được methyl hóa Rất hiếm trường

hợp các bazơ bắt cặp sai tránh được sự phát hiện của MMR trong quá trình sao chép ADN [3]

E coli, giai đoạn đầu của MMR

liên quan đến 3 gen là mutS, mutL

và mutH mã hóa cho 3 protein

tương ứng là mutS, mutL và

mutH Đầu tiên mutS ở dạng

dimer sẽ nhận biết và liên kết vào

bazơ bắt cặp sai Sau đó hệ thống

sửa chữa nhận ra bazơ nào đúng,

bazơ nào sai tương ứng với mạch

nào làm khuôn và mạch nào được

tổng hợp mới để tiến hành sửa

chữa những sai hỏng đó [3]

Ở E coli, hai mạch này được phân biệt bởi sự methyl hóa nucleotide A (gắn

gốc CH3) ở trình tự [GAmTC] (Hình 2) Trong quá trình sao chép, cả hai nucleotide

A trên cả hai mạch của phân tử ADN khuôn đều được sao chép Nhưng khi sự sao chép vừa kết thúc thì chỉ có nucleotide A trên mạch khuôn được methyl hóa còn nucleotide A trên mạch được tổng hợp mới chưa được methyl hóa [4]

Lúc này mutS đã liên kết với bazơ bắt cặp sai sẽ tạo phức với mutL và mutH

MutH sẽ làm đứt mạch ADN tại vị trí trình tự [GAmTC] chưa được methyl hóa Một enzym exonuclease sẽ cắt ADN không được methyl hóa đến hết vị trí nucleotide bắt cặp sai Sau đó enzym polymerase III và ligase sẽ tổng hợp bù đoạn ADN mới và gắn đoạn ADN mới vừa tổng hợp vào khoảng trống bị loại bỏ do sai hỏng [3]

Ngoài quá trình methyl hóa xảy ra đối với nucleotide A ở trình tự [GAmTC], quá trình methyl hóa còn xảy ra đối với nucleotide C ở trình tự CCm(A/T)GG Quá

trình methyl hóa được thực hiện nhờ enzym ADN-methyl transferase

Cơ chế MMR cũng được tìm thấy ở Eukaryot Dạng tương đồng với mutS vi khuẩn của Eukaryot được gọi là dạng tương đồng mutS hay MSH được tìm thấy ở

nấm men (γMSH) và ở các tế bào người (hMSH) [15] Sự kết hợp một số dạng

protein MSH tạo ra các phức hợp có chức năng giống với protein mutS ở vi khuẩn

Ngoài ra, cơ chế MMR ở Eukaryot cũng hoạt động tương tự như ở vi khuẩn E coli

Tuy nhiên các cơ chế nhận biết mạch khuôn và mạch mới tổng hợp chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn Ở người các gen có liên quan đến hoạt động MMR gồm có các

gen MLH1, MLH3, MSH2, MSH3, MSH6, PMS1, PMS2 [9] Trong đó phức hợp chứa gen MSH2 có chức năng tương đương với mutS ở E coli, phức hợp chứa gen

MLH1 có chức năng tương đương với mutL ở E coli Các đột biến xảy ra trong các

gen này làm tăng cao nguy cơ mắc các bệnh di truyền trong đó có ung thư đại trực tràng di truyền [12] MMR là một quá trình sinh học có tính bảo thủ về mặt tiến hóa Các tế bào người chứa ít nhất năm trình tự tương đồng mutS và bốn trình tự tương đồng mutL Bốn trong số các gen này đóng vai trò quan trọng trong hệ thống MMR và gây ung thư đại trực tràng di truyền khi chúng bị đột biến Toàn bộ cơ chế MMR ở người được mô tả trong Hình 3

Trong khi các giai đoạn đầu tiên của cơ chế MMR ở vi khuẩn liên quan đến hoạt tính của mutS và mutL ở dạng homodimer thì hai protein này ở người lại hình thành các heterodimer theo nhiều tổ hợp khác nhau [33] Ở dạng tương đồng mutS,

MSH2 đóng vai trò cơ bản trong quá trình nhận biết và bám vào các bazơ bắt cặp

sai Phức hợp MSH3 và MSH6 lại đóng vai trò sửa đổi tính đặc hiệu của sự nhận biết [23] Riêng phức hợp heterodimer giữa MLH1 với PMS2 tham gia vào quá trình

nhận biết sự bắt cặp sai và tiến hành các bước tiếp theo của MMR Quá trình này bao gồm việc cắt vùng ADN bị sai hỏng, tổng hợp vùng ADN mới tương ứng với vùng bị sai hỏng bị cắt bỏ và nối trở lại

Trong cơ chế MMR ở người, heterodimer MSH2 – MSH6 được gọi là phức

hợp mutSα nhận đơn bazơ bắt cặp sai chiếm từ 80% đến 90% các bắt cặp sai trong

tế bào [14] Trong đó, MSH6 là tiểu đơn vị nhận biết những sai hỏng đơn bazơ Heterodimer MSH2 – MSH3 được gọi là phức hợp mutSβ, có nhiệm vụ nhận biết

cấu trúc khác biệt như vòng thắt diel do sự lặp lại các bazơ sai hỏng Đặc biệt, luôn

có sự tương tác lẫn nhau trong ái lực nhận biết của mutSα và mutSβ [15], [21]

Ngoài ra, ở người có ba dạng tương đồng mutL chính là heterodimer MLH1 – PMS2 (mutLα), heterodimer MLH1 – PMS1 (mutLβ) và heterodimer MLH1 –

MLH3 (mutLγ) [13] Sau khi dạng tương đồng mutS nhận biết các sai hỏng, quá

trình sửa chữa tiếp theo được thực hiện bởi dạng tương đồng mutL Đối với các sai hỏng dạng bắt cặp sai đơn nucleotide, dạng tương đồng mutLα sẽ di chuyển tới vị trí cần sửa chữa và thực hiện chức năng xác định mạch ADN nào là mạch chứa bazơ sai hỏng, mạch nào là mạch mang mã gốc Sau đó phức hợp này truyền thông tin tới các enzym sửa chữa ở phía sau bao gồm các enzym có vai trò cắt bỏ một vùng ADN, tái tổng hợp phần bị tổn thương và nối nó với mạch được sửa chữa Còn đối với các sai hỏng hình thành cấu trúc đặc biệt như vòng thắt diel sẽ được dạng tương đồng mutLβ tham gia vào quá trình nhận biết và sửa chữa Riêng đối với dạng tương đồng mutLγ, vai trò sửa lỗi sai hỏng trong sao chép ADN ở người vẫn chưa được làm sáng tỏ [15], [21]

1.3 HỆ THỐNG GEN MMR VÀ ĐỘT BIẾN GEN MSH2 VỚI HỘI CHỨNG

UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.3.1 Hệ thống gen MMR

Tất cả các hệ thống sửa chữa ADN (bao gồm cả hệ thống MMR) để hoạt động có hiệu quả cần có sự phối hợp hoạt tính của nhiều protein tạo nên phức hợp protein – protein và ADN – protein Những đột biến gây bất hoạt ở các tế bào mầm

của một trong các gen MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 dẫn đến sự thay đổi hoạt tính

của protein do chính các gen trên tạo ra Cũng chính sự thay đổi hoạt tính của các protein này là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến tình trạng toàn bộ hệ thống MMR của

cơ thể bị bất hoạt Khi hệ thống MMR bị bất hoạt, các lỗi sai hỏng trong quá trình tái bản ADN không được sửa chữa và tích tụ ngày càng nhiều qua các lần phân bào

của cơ thể Đây chính là nguyên nhân sâu xa của hầu hết các bệnh ung thư trong đó

có ung thư đại trực tràng

Người ta đã thống kê được một số gen chính trong hệ thống MMR có liên quan đến ung thư đại trực tràng được biết đến thông qua Bảng 3

Bảng 3: Các gen MMR liên quan đến ung thư đại trực tràng

Trong đó, gen MLH1 nằm trên vai ngắn của NST số 3 (3p21) với 19 exon có

kích thước khoảng 57,36 kb [37] Hiện nay đã phát hiện được trên 250 đột biến tại

gen này Các đột biến trên MLH1 chiếm 50% các trường hợp đột biến ở HNPCC và

gây ra hội chứng HNPCC điển hình Phân tích di truyền các gen MMR ở người cho

thấy rằng trên 90% bệnh nhân mắc HNPCC là do đột biến gen ở hai gen MLH1 và

MSH2 Riêng MLH1 có tần số đạt đến 1/400 và MSH2 là 1/500 ở nhiều quần thể

[25]

Gen MSH2 nằm ở vai ngắn của NST số 2 (2p21) với 16 exon kích thước

khoảng 80,10 kb [37] Hiện nay đã phát hiện được trên 170 đột biến ở gen này Các

đột biến trên MSH2 chiếm khoảng trên 40% các trường hợp đột biến trong hệ thống

MMR và gây ra hội chứng ung thư đại trực tràng dạng HNPCC điển hình Các đột

biến MSH2 liên kết mạnh với các dạng ung thư ngoài ruột kết hơn so với các đột biến ở MLH1[35]

Gen MSH6 nằm trên vai ngắn của NST số 2 (2p15) kích thước khoảng 9,4 kb với 10 exon [37] Đột biến trong MSH6 có khoảng 7% đến 10% các gia đình có HNPCC Đột biến dòng mầm của gen MSH6 gây nên một dạng HNPCC không điển

hình, đặc trưng bởi độ tuổi được chẩn đoán ung thư và khả năng mắc ung thư nội

mạc tử cung cao hơn đột biến ở gen MLH1 và MSH2 [13]

Gen PMS2 nằm trên vai ngắn của NST số 7 (7p22) kích thước khoảng 16 kb

với 15 exon [37] Đột biến ở gen này chiếm khoảng 3% các trường hợp mắc HNPCC, hơn nữa còn liên quan đến sự hình thành hội chứng Turcot - một hội chứng mà các bệnh nhân có nguy cơ cao mắc ung thư não và ung thư trực tràng khi còn khá trẻ [4]

Tất cả các gen trên đều thuộc nhóm gen có khả năng gây đột biến khi xảy ra sai hỏng Đột biến ở những gen này đều có xu hướng dẫn đến sự tích lũy các sai sót trong sao chép ADN và làm tăng tần số đột biến trong các tế bào (đặc biệt là trong các tế bào sôma) một cách nhanh chóng Ở nấm men, đột biến về các gen thuộc

nhóm MSH có thể được làm tăng từ 100 đến 700 lần so với tốc độ đột biến ở các đoạn lặp 2 nucleotide Ở người, đột biến gen MSH2 làm tăng tần số sai hỏng trong

sao chép ADN khoảng 10 lần [3]

Bảng 4: Tỷ lệ các đột biến thường gặp trong hai gen MLH1 và MSH2 (De la

Chapelle A, 2004) [11]

Gen

Tỷ lệ đột biến thường gặp

Tỷ lệ gặp phải trong CRC

Các đột biến thay thế nucleotide

Các đột biến sắp xếp lại hoặc mất nucleotide

Không giống như các sai hỏng do các gen điều hòa gây ra hội chứng FAP, sự sai hỏng của các gen gây ra ung thư đai trực tràng không ảnh hưởng trực tiếp đến sự tăng sinh tế bào Thay vào đó, sự bất hoạt gen MMR gây nên sai hỏng trong sửa

chữa ADN, một dạng của tính bất ổn di truyền Các tế bào mang sai hỏng MMR có tần số đột biến cao hơn các tế bào bình thường và do vậy có khả năng mang các đột biến gây ung thư cao hơn Các đột biến gen ở hội chứng ung thư đại trực tràng, gây đột biến liên quan đến sửa chữa ADN, qua đó mới gây ra những sai hỏng ở các gen khác Do vậy, các bệnh nhân mắc ung thư đại trực tràng dạng HNPCC hình thành các polyp lành tính với tỷ lệ tương tự như quần thể bình thường Tuy nhiên, tỷ lệ đột biến tăng lên do MMR sai hỏng khiến cho một tỷ lệ cao các polyp lành tính này phát triển thành ung thư [4] HNPCC cho thấy một vai trò rõ rệt đối với việc mất tính ổn định di truyền trong quá trình phát sinh khối u Sự bất ổn di truyền do thiếu hụt MMR thúc đẩy tốc độ các khối u phát triển thành ung thư Điều này cũng giải thích tại sao các cá thể bị ảnh hưởng bởi HNPCC bị ung thư từ khi tuổi đời còn khá trẻ Bảng thống kê dưới đây sẽ cho ta một cái nhìn tổng quát về khả năng mắc một

số bệnh ung thư ở người có đột biến gen MMR liên quan đến hội chứng ung thư đại

trực tràng đặc biệt là dạng HNPCC

Bảng 5: Nguy cơ mắc một số bệnh ung thư ở người có đột biến gen liên quan đến

ung thư đại trực tràng dạng HNPCC so với các cá thể bình thường (Aarnio M 1999) [8]

Ung thư

Tỷ lệ mắc bệnh của cá thể bình thường

Cá thể có liên quan tới HNPCC

Ung thư đại trực tràng dạng HNPCC được nhận biết bằng việc xác định một

số lượng lớn thành viên trong gia đình bị ảnh hưởng hoặc dựa vào những sàng lọc

di truyền Tuy nhiên, xét nghiệm di truyền cho thấy rằng, các đột biến gen MMR có

độ thâm nhập khá cao trong các cá thể mang ung thư nội mạc tử cung và ung thư đại trực tràng di truyền, hầu hết trong số đó không phải là thành viên của các gia đình có HNPCC Trong số các bệnh nhân ung thư ở độ tuổi 50 hay trẻ hơn, ít nhất

có một người họ hàng bị ung thư, có khoảng 25% là mang các đột biến dòng mầm ở

một trong các gen MMR bị đột biến cao, MSH2 hoặc MLH1[26]

1.3.2 Gen MSH2 và đột biến gây ung thƣ đại trực tràng

Gen MSH2 có vị trí phân tử nằm tại vị trí 21 trên vai ngắn NST số 2 (2p21) (Hình 4) [40] Nó có kích thước khoảng 80,10 kb Gen này nằm giữa 2 gen EPCAM

và RP11-436K12 (Hình 5) [45] Toàn bộ cấu trúc gen bao gồm 16 exon với kích

thước khác nhau (Hình 6-A) và phân bố không đồng đều trên gen về khoảng cách (Hình 6-B) [38]

Đây cũng là gen quy định tổng hợp một loại protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình sửa chữa ADN Cấu trúc gen gồm 3 domain mã hóa cho 3 phần protein với chức năng các phần khác nhau Khi ADN sao chép để chuẩn bị cho tế

bào phân chia, domain bám ADN (từ exon 1 đến exon 6) của gen MSH2 sẽ quy định

tổng hợp một phần protein có chức năng bám vào vị trí bắt cặp nhầm của các đơn

nucleotide Riêng domain tương tác với gen MSH3/MSH6 (từ exon 7 đến exon 12)

mã hóa phần protein có vai trò kết hợp với một trong hai loại protein do gen MSH3

và MSH6 để tạo nên một phức hợp protein hoạt động là mutSα (MSH2 – MSH6) hoặc mutSβ (MSH2 – MSH3) Dạng protein phức hợp này sẽ xác định chính xác vị

trí xảy ra những sai hỏng trong quá trình sao chép ADN Cuối cùng, domain tương tác với dạng tương đồng mut L (từ exon 13 đến exon 16) mã hóa phần protein có

nhiệm vụ tương tác với dạng tương đồng mutL (Hình 7) Và việc sửa chữa những

lỗi sai hỏng sẽ chỉ diễn ra khi có sự tham gia của phức hợp protein MLH1 – PMS2

Vì thế, gen MSH2 được xem là thành phần của tập hợp các gen sửa chữa bắt cặp sai

MMR [40]

Khoảng 40% các trường hợp bị hội chứng Lynch với một đột biến được xác

định có liên quan đến đột biến gen MSH2 Các dạng đột biến chủ yếu gồm thay thế

nucleotide (50 – 80%), mất hoặc sắp xếp lại trình tự các nucleotide (17 – 50%) (Hình 8) Hàng trăm đột biến gen này có khả năng dẫn đến làm cho con người bị ung thư đại trực tràng và các loại ung thư khác liên quan đến HNPCC Những đột

biến này có thể gây ra việc sản xuất một loại protein bất thường hoặc làm cho gen

MSH2 bị bất hoạt và không thể thực hiện chức năng bình thường của nó Khi các

protein do gen MSH2 tổng hợp bị thiếu hụt hoặc hoạt động không hiệu quả sẽ dẫn

đến những sai hỏng tăng lên đáng kể trong quá trình phân chia tế bào mà không được sửa chữa Nếu các tế bào này tiếp tục phân chia, các lỗi được tích lũy trong ADN ngày càng nhiều sẽ làm cho các tế bào không thể hoạt động hiệu quả và có thể tạo thành khối u trong ruột kết hoặc một khối u nào đó trong cơ thể [40]

Những người bị đột biến ở gen MSH2 có khả năng làm gia tăng một số khối

u hiếm gặp trên da ngoài bệnh ung thư đại trực tràng Đây là một sự kết hợp gọi là hội chứng Muir – Torre Những khối u da hiếm gặp này bao gồm u tuyến bã nhờn

và ung thư da Nguyên nhân là do tại các tuyến da (tuyến bã nhờn) sản xuất một chất nhờn gọi là sebum Chính dạng chất nhờn này đã gây nên các khối u trên da Các khối u này có thể phát triển nhanh chóng gây ra hiện tượng gai bướu sừng khi tiếp xúc trực tiếp với ánh nắng mặt trời [40]

1.4 MỘT SỐ KỸ THUẬT DI TRUYỀN SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Trong nghiên cứu ung thư đại trực tràng, đặc biệt là trong những nghiên cứu đột biến gen MMR cần có sự hỗ trợ của các phương pháp nghiên cứu hiện đại Tuy nhiên, dù tiến hành theo phương pháp nào cũng đều dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR Chính vì thế, việc Kary Mullis phát minh ra kỹ thuật PCR (năm 1985) không những gây được tiếng vang lớn trong lĩnh vực hóa sinh học mà còn

“châm ngòi” cho sự bùng nổ của sinh học phân tử đặc biệt là trong mấy thập niên trở lại đây Việc kết hợp giữa PCR với các kỹ thuật di truyền hiện đại khiến hàng loạt tật bệnh di truyền được phát hiện cũng như phục vụ ngày càng hiệu quả cho từng mục đích nghiên cứu

Chúng tôi xin giới thiệu một số kỹ thuật di truyền thường được sử dụng trong nghiên cứu ung thư đại trực tràng cũng như nghiên cứu một số tật bệnh di truyền khác

1.4.1 Kỹ thuật phân tích các trình tự lặp lại đơn giản SSR

SSR là kỹ thuật dựa trên sự tồn tại của các vi vệ tinh (microsatellite), đó là các trình tự ADN lặp lại trong hệ gen có kích thước rất nhỏ từ 2 đến 6 nucleotide, điển hình là những trình tự chỉ gồm 2 đến 3 nucleotide Các trình tự này được lặp lại

từ 9 đến 30 lần [1] Sự lặp lại của các vi vệ tinh là ngẫu nhiên, chúng có thể lặp lại hoàn toàn, không hoàn toàn hoặc lặp lại phức tạp Bên cạnh đó, các vi vệ tinh phân

bố một cách rải rác trong hệ gen người, đặc biệt mật độ các vi vệ tinh thường có xu hướng tăng cao đối với những người mắc hội chứng ung thư đại trực tràng di truyền dạng HNPCC Ở trạng thái này, các vi vệ tinh thể hiện tính bất ổn rõ rệt Chính sự bất ổn này đã khiến SSR được xem là một trong những phương pháp quan trọng được sử dụng trong nghiên cứu HNPCC Ưu điểm của kỹ thuật SSR là chính xác và cho hiệu quả cao trong phát hiện đa hình di truyền Đây cũng là kỹ thuật tương đối đơn giản, dễ thực hiện và ít tốn kém Tuy nhiên, kỹ thuật này khó nghiên cứu các đột biến gen do các vi vệ tinh thường nằm ngoài gen Mặt khác, kỹ thuật này có khá nhiều bước tiến hành, cặp mồi sử dụng trong SSR phải được thiết kế đặc hiệu, tương ứng với vùng sườn để có thể nhân các SSR nằm rải rác trong hệ gen [1]

1.4.2 Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn RFLP

Trong nghiên cứu ung thư đại trực tràng, việc phát hiện ra những sai hỏng của hệ thống các gen MMR là một vấn đề rất quan trọng trong chẩn đoán và điều trị hội chứng này Chính vì thế, RFLP được sử dụng như một phương pháp nhằm xác định có hiệu quả những biến đổi của phân tử ADN mà cụ thể là những đột biến xảy

ra với hệ thống gen MMR Đây là phương pháp sử dụng một nhóm enzym đặc hiệu gọi là enzym giới hạn Những enzym này được tổng hợp bởi các loại vi sinh vật khác nhau Chúng có khả năng nhận biết các vị trí “đích” hay còn gọi là những vị trí

giới hạn chứa một trật tự nucleotide đặc thù trong ADN và cắt ADN tại trật tự đó Kết quả là, một phân tử ADN ban đầu có kích thước lớn sau khi được xử lí bởi enzym giới hạn sẽ bị cắt thành nhiều đoạn nhỏ có kích thước khác nhau Số lượng

và kích thước các đoạn cắt phản ánh sự phân bố của các vị trí bị cắt trong phân tử ADN Sự hiện diện của những đoạn cắt này mang tính đặc trưng cho từng tổ hợp ADN/enzym giới hạn Cũng chính sự khác nhau về kích thước bởi các đoạn được tạo ra do xử lí enzym giới hạn đối với các phân tử ADN trong nhân hoặc trong các

cơ quan tử khác nhau được gọi là tính đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn [6]

Ưu điểm của phương pháp này là cho độ chính xác cao, đánh giá được tính đa hình

di truyền của gen cần nghiên cứu đồng thời xác định được sự có mặt của các đột biến xảy ra trong hệ thống gen MMR gây ung thư đại trực tràng Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là khó khăn trong việc tìm ra enzym giới hạn đặc hiệu với vị trí cắt và cần phải biết trước trình tự đoạn gen nghiên cứu để xác định vị trí cắt của enzym giới hạn

1.4.3 Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn SSCP

Năm 1989, Orita và cộng sự đã công bố một phát hiện mới về kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn [24] Kể từ đó tới nay, kỹ thuật này được xem như một phương pháp hiệu quả trong việc phát hiện tính đa hình sợi đơn của phân tử ADN hay các đột biến có liên quan đến trình tự của phân tử ADN SSCP ra đời nhanh chóng trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu thuộc lĩnh vực y học

Kỹ thuật này cho phép phát hiện những sai khác dựa trên khả năng di chuyển khác nhau của các đoạn ADN sợi đơn có cùng kích thước nhưng khác nhau về trình tự

Vì sự chuyển động của ADN trong gel điện di phụ thuộc vào kích thước và cấu hình không gian của chúng Tuy nhiên, sự chuyển động của các sợi đơn lại bị ảnh hưởng bởi những thay đổi dù là rất nhỏ trong trình tự của chúng mà sự thay đổi này có thể chỉ gồm một nucleotide trong hàng trăm nucleotide có trong sợi đơn đó Mặt khác, phân tử ADN sợi kép sau khi bị biến tính (tách thành các sợi đơn) sẽ thể hiện tính

ổn định không bền Điều này có nghĩa là giữa các sợi đơn có thể xảy ra phản ứng

hồi tính khi gặp sợi bổ sung với nó để hình thành dạng sợi kép như ban đầu Hoặc cũng có khi trên cùng một sợi đơn cũng xảy ra hiện tượng bắt cặp giữa các trình tự

bổ sung với nhau Kết quả là, chúng bắt cặp với nhau tạo nên các cấu trúc vòng hoặc nếp gấp làm thay đổi hoàn toàn cấu hình không gian của chúng Chính sự khác biệt về cấu hình không gian và sự khác nhau về trình tự các nucleotide giữa hai sợi đơn sẽ làm chúng di chuyển với tốc độ khác nhau trên cùng một bản gel điện di mặc

dù kích thước (số lượng nucleotide) của hai sợi đơn này là như nhau Ngoài ra, SSCP sử dụng gel điện di là gel polyacrylamide cho nên cho phép phân tách được các băng có sai khác nhỏ chỉ 1 nucleotide Vì thế, những đột biến dạng thêm, mất 1 nucleotide cũng được phát hiện Ưu điểm của kỹ thuật này là ít tốn kém về tiền bạc, tiện lợi, dễ tiến hành và cho độ nhạy khá cao trong xác định các đột biến gen Đặc biệt, khi tiến hành kỹ thuật này với những điều kiện tối ưu, có tới 80 – 90% các đột biến được phát hiện Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là tốn khá nhiều thời gian và các đột biến chỉ được phát hiện tại các gen đơn locus

1.4.4 Kỹ thuật phân tích sợi đôi dị hợp HET

Đây là phương pháp phát hiện đột biến tương đối hiệu quả dựa vào sự sai khác trong độ dịch chuyển của các sợi kép dị hợp so với các sợi kép đồng hợp Trong phương pháp này, các sợi kép dị hợp được tạo ra bằng cách biến tính hỗn hợp mẫu (bao gồm ADN của người bình thường và ADN của người bị bệnh) rồi để hỗn hợp hồi tính Tiếp theo, hỗn hợp được nạp lên các giếng đã được tạo sẵn trên bản gel polyacrylamide không biến tính để điện di kiểm tra Các sợi kép dị hợp sẽ có cấu hình di chuyển khác hoàn toàn với các sợi kép đồng hợp (chúng nằm ở phía trên

và tách biệt với các sợi kép đồng hợp ở phía dưới) [42] Ưu điểm của phương pháp này là chi phí thấp và khá đơn giản về mặt kỹ thuật nhưng hiệu quả phát hiện đột biến thấp hơn SSCP (<80%)

1.4.5 Kỹ thuật điện di gel gradient biến tính DGGE

Điện di gel gradient biến tính là phương pháp được mô tả lần đầu tiên bởi Myers và cộng sự (1987) [22] Trong phương pháp này, người ta sử dụng các điều kiện biến tính như nhiệt độ, hóa chất gây biến tính không hoàn toàn phân tử ADN

Sự gia tăng các điều kiện nhiệt độ hay nồng độ hóa chất xung quanh phân tử ADN không chỉ khiến các phân tử ADN biến tính không hoàn toàn mà còn làm giảm độ

di động của chúng trên gel Kết quả là, chúng dịch chuyển đến các vị trí khác nhau trên bản gel Tùy thuộc vào kích thước của đoạn ADN điện di (thông thường từ 25 đến vài trăm nucleotide) mà chúng được biến tính ở các điều kiện khác nhau Ưu điểm của phương pháp này là chi phí thấp, tỷ lệ phát hiện đột biến khoảng 50 – 100% Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi về máy móc, trang thiết bị, các thao tác phức tạp và tốn khá nhiều thời gian

1.4.6 Các phương pháp giải trình tự ADN

Từ cuối những năm 1970, trình tự các nuleotide trên phân tử ADN được xác định một cách đơn giản và nhanh chóng nhờ sự ra đời của hai phương pháp khác nhau bao gồm phương pháp hóa học và phương pháp enzym Tuy nhiên, từ những năm cuối của thập kỷ 20 thế kỷ XX, trình tự các nucleotide được xác định trên máy đọc tự động ngày càng phổ biến Ưu điểm của phương pháp này là giảm thiểu các thao tác, tiết kiệm các hóa chất và trình tự đọc được dài hơn hẳn so với các phương pháp trước đó [2]

Các phương pháp xác định trình tự đều liên quan đến kỹ thuật điện di các đoạn ADN dạng sợi đơn trên gel polyacrylamide Đặc điểm của những đoạn ADN

là có kích thước sai khác nhau chỉ 1 nucleotide Trên các máy xác định trình tự hiện đại, gel polyacrylamide được nhồi trong các mao quản và các thông số của quá trình điện di như điện thế, nhiệt độ, thời gian cũng như lưu cất dữ liệu…được kiểm soát một cách tự động [2]

1.5 MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1.5.1 Mục tiêu nghiên cứu

Sử dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử (PCR-SSCP và giải trình tự ADN)

để phân tích một số trình tự mã hóa (exon) của gen MSH2 từ các bệnh nhân ung thư

đại trực tràng

1.5.2 Nội dung nghiên cứu

Đề tài được thực hiện với các nội dung chính bao gồm:

1 Thu thập và bảo quản các mẫu bệnh phẩm (mô ung thư) của 42 bệnh nhân người Việt Nam bị mắc ung thư đại trực tràng và dạ dày cùng 5 mẫu đối chứng

2 Tách chiết ADN tổng số từ các mẫu sinh phẩm thu được

3 Nhân bản 09 exon cần quan tâm (gồm các exon 2, 3, 6, 7, 8, 12, 13, 14, 15) bằng các cặp mồi đặc hiệu

4 Sử dụng kỹ thuật PCR – SSCP để phân tích và xác định đột biến ở các exon nghiên cứu

5 Giải trình tự một số exon gen MSH2 từ một số mẫu bệnh phẩm