nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, đa hình di truyền và tính kháng với hóa chất diệt côn trùng của nhóm loài anopheles leucosphyrus ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng Ngọc NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, ĐA HÌNH DI TRUYỀN VÀ TÍNH KHÁNG VỚI HÓA CHẤT DIỆT CÔN TRÙNG CỦA NHÓ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Hồng Ngọc

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC,

ĐA HÌNH DI TRUYỀN VÀ TÍNH KHÁNG VỚI HÓA CHẤT DIỆT CÔN TRÙNG

CỦA NHÓM LOÀI ANOPHELES LEUCOSPHYRUS Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Hồng Ngọc

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC,

ĐA HÌNH DI TRUYỀN VÀ TÍNH KHÁNG VỚI HÓA CHẤT DIỆT CÔN TRÙNG

CỦA NHÓM LOÀI ANOPHELES LEUCOSPHYRUS Ở VIỆT NAM

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trịnh Đình Đạt, PGS.TS Hồ Đình Trung, những người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này

Tôi chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học trường Đại học Khoa học

Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tạo mọi điều kiện giúp cho tôi nghiên cứu và hoàn thành luận án Xin chân thành cảm tạ các thầy cô, anh chị trong

bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, phòng Đào tạo sau đại học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và tạo điều kiện giúp đỡ tôi bảo vệ luận án

Tôi gửi lời cảm ơn tới các cô chú, bạn bè đồng nghiệp trong khoa Sinh học Phân tử, Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương, những người

đã tận tình giúp đỡ, động viên tôi hoàn thành luận án Tôi cũng xin gửi lòng biết ơn sâu sắc tới dự án hợp tác Song phương Việt – Bỉ, Quỹ toàn cầu phòng chống sốt rét Việt Nam và trường đại học Nagasaki Nhật Bản đã hỗ trợ tôi các phương tiện, công cụ, máy móc, hoá chất để hoàn thành các thí nghiệm trong luận án Cảm ơn bạn bè thân thiết luôn là nguồn cổ vũ động viên tôi phấn đấu

Với tất cả lòng biết ơn sâu nặng, tôi xin dành cho gia đình, bố mẹ những người đã dắt dìu, cổ vũ động viên yêu thương và cảm thông sâu sắc

Nguyễn Thị Hồng Ngọc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi Các số liệu, kết quả trong luận án này là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình hoặc tài liệu nào

Tác giả

Nguyễn Thị Hồng Ngọc

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

LỜI CẢM ƠN iii

LỜI CAM ĐOAN iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG x

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ xi

MỞ ĐẦU 1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 TỔNG QUAN VỀ NHÓM LOÀI ANOPHELES LEUCOSPHYRUS TRÊN THẾ GIỚI 5

1.2 TỔNG QUAN NHÓM LOÀI ANOPHELES LEUCOSPHYRUS Ở VIỆT NAM 10

1.3 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỀN Ở MUỖI SỐT RÉT 12

1.3.1 Đa hình enzyme và ứng dụng để nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi 13

1.3.2 Các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi 16

1.4 TỔNG QUAN SỰ KHÁNG HÓA CHẤT DIỆT CÔN TRÙNG Ở VECTOR TRUYỀN BỆNH 22

1.4.1.Cơ sở di truyền của tính kháng hóa chất diệt côn trùng 22

1.4.2 Các cơ chế kháng hóa chất diệt côn trùng 23

1.4.3 Tình trạng đáp ứng với hóa chất diệt của một số loài Anopheles tại Việt Nam 33

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 35

2.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 35

2.2.1 Thời gian nghiên cứu 35

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 36

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 36

2.3.2 Mẫu nghiên cứu 36

2.3.3 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu vật tại thực địa 37

2.3.4 Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 38

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 53

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53

3.1.1 Phân bố, đặc điểm sinh học và vai trò truyền bệnh của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam 53

3.1.2 Đa hình di truyền isozyme của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam 69

3.1.3 Đa hình di truyền của nhóm loài Anopheles leucosphyrus dựa vào các chỉ thị phân tử 76

3.1.4 Kết quả tạo chủng muỗi An dirus kháng với permethrin chủng phòng thí nghiệm 82

3.1.5 Kết quả thử nghiệm sinh học đối với hai quần thể muỗi thu thập tại thực địa 84

3.1.6 Kết quả xác định gen kháng ngã gục muỗi An dirus bằng PCR-RFLP 86

3.1.7 Kết quả xác định sự biểu hiện quá mức của gen P450 88

3.2.BÀN LUẬN 89

3.2.1 Phân bố của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam 89

3.2.2 Đặc điểm sinh học, vai trò truyền bệnh của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam 92

3.2.3 Tính đa hình của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam 94

3.2.4 Tính kháng hóa chất của An dirus 97

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 102

KẾT LUẬN 102

KIẾN NGHỊ 103

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 104

TÀI LIỆU THAM KHẢO 105

PHỤ LỤC 120

Phụ lục 1: Đạo đức nghiên cứu 120

Phụ lục 2: Đọc kết quả điện di và đặt tên cho các locus, các elen kiểm soát phổ hoạt tính các enzyme 121

Phụ lục 3: Các bước tiến hành kỹ thuật ELISA 126

Phụ lục 4: Bảng nồng độ thử nghiệm trong tạo chủng muỗi kháng với permethrin từ muỗi An dirus chủng nuôi phòng thí nghiệm 128

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ABTS: 2,2' – azino – bis (3-ethylbenzothiazoline-6sylphonic acid) ADN: Acid Deoxyribonucleic

ALDOX: aldehyde oxidase

An : Anopheles

ATP: Adenosine triphosphate

bp: Base pair (cặp bazơ )

COI: Cytochrome C oxidase I gene

COII: Cytochrome C oxidase II gene

DN: Genetic distance (Khoảng cách di truyền )

D3: Dopamine receptor gene

DDT: Diclo- diphenyl- triclo- ethane

dATP: deoxyadenosine triphosphate

dCTP: deoxycytidine triphosphate

dGTP: deoxyguanosine triphosphate

dNTP: deoxynucleoside triphosphate

dTTP: deoxythymidine triphosphate

(E.C): Enzyme code (Mã số enzyme )

EC: European commission (Cộng đồng Châu Âu )

EDTA: Ethylenediamine tetraacetic acid

ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay

(Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ liên kết enzyme )

et al: và những người khác

EtBr: Ethidium bromide

FUM: Fumerate hydratase

HAD: D-2- Hydroxy- Acid dehydrogenase

GABA: Gama aminobutyric acid

GPI: Glucosephosphate isomerase

GPDH: Glycerophosphate dehydrogenase

GOT: Glutamate oxaloacetate transminase

GST: Glutathion S transferase

HAD: D-2- Hydroxy- Acid dehydrogenase

IGS: Intergenic spacer (Vùng đệm nội gen)

ITS: Internal transcripbed spacer (Vùng đệm nội phiên mã) IDH: Isocitrate dehydrogenase

IN: Genetic Identity (Hệ số tương đồng di truyền )

mAB: Monoclonal antibody (Kháng thể đơn dòng )

MP: Maximum parsimony (Hà tiện tối đa)

MDH: Malate dehydrogenase

MPI: Manose phosphate isomerase

NAD: 1-Naphthaleneacetamide

NBT: Nitroso Blue Tetrazolium

NJ: Neighbor joining

ND5: NADH dehydrogenase 5 gene

ND6: NADH dehydrogenase 6 gene

nAchR: Nicotine acetylcholine receptor

ODH: Octanol dehydrogenase

PCR: Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp ) PGM: Phosphate glucomutase

6 PGD: 6 Phosphogluconate dehydrogenase

qRT-PCR: Quantitative reverse transcriptase - PCR

RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA

(Đa hình các đoạn nhân bản ngẫu nhiên) RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

(Đa hình các đoạn phân cắt giới hạn) Rf: Tốc độ chuyển dịch tương đối của cấu tử điện di

rARN: Acid ribonucleic Ribosome

SSCP: Single Strand Conformational polymorphism

(Đa hình cấu tạo sợi đơn) SDS: Sodium dodecyl sulfate

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự mồi để xác định KST trong muỗi 41

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR lần 1 nhân bản đoạn gen chung của giống Plasmodium 42

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR đa mồi phát hiện 4 loài KST SR 43

Bảng 2.4 Trình tự mồi nhân bản đoạn COI và ND6 44

Bảng 2.5 Trình tự mồi nhân bản đoạn CYP6P4, CYP6P9 và RSP7 50

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng qRT-PCR 52

Bảng 3.1 Các điểm điều tra có muỗi thuộc nhóm loài Anopheles leucosphyrus 54

Bảng 3.2 Tần số alen của các quần thể nghiên cứu 71

Bảng 3.3 Khoảng cách di truyền và hệ số tương đồng di truyền giữa các quần thể nghiên cứu 75

Bảng 3.4 Giá trị LC50 của permethrin sử dụng trong phòng thí nghiệm để lựa chọn chủng An dirus kháng (Tháng 6/2009- 6/2011) 83

Bảng 3.5 Kết quả thử nghiệm sinh học của muỗi An dirus thu thập tại xã Eachrang, Sơn Thành, Phú Yên (Tháng 10/ 2010) 85

Bảng 3.6 Kết quả thử nghiệm sinh học của muỗi An dirus thu thập tại Đảo lớn Côn Đảo, Bà Rịa Vũng Tàu (Tháng 10/2009 và 11/2011) 85

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Phân bố của 7 thành viên thuộc phức hợp Dirus (An cracens ở

Sumatra không có trong hình) (theo Manguin và cs., 2008)[71] 6

Hình 1.2 Bản đồ phân bố các thành viên nhóm loài Anopheles leucosphyrus (theo Valerie Obsomer, 2007)[80] 7

Hình 1.3 Cơ chế khử độc của DDT 26

Hình 1.4 Cơ chế kháng do thay đổi vị trí đích ở mức độ phân tử (theo Brogdon WG., 1998) [42] 27

Hình 1.5 Cơ chế tác động gây chết muỗi của 4 nhóm hóa chất (WHO, 2006) [110] 28

Hình 1.6 Cấu trúc của GABA 31

Hình 3.1 Địa điểm thu thập mẫu muỗi trong nhóm loài Anopheles leucosphyrus 55

Hình 3.2 Sinh cảnh của muỗi thuộc nhóm loài Anopheles leucosphyrus 56

Hình 3.3 Hình ảnh ổ bọ gậy muỗi thu thập tại Bắc Kạn 58

Hình 3.4 Sơ đồ mô tả hình thái cánh điển hình An dirus (theo Sallum, 2005) 59

Hình 3.5 Hình thái cánh của An dirus Phú Yên 59

Hình 3.6 Hình thái cánh của muỗi thu thập tại Bắc Kạn 60

Hình 3.7 Một số đặc điểm của bọ gậy Anopheles dirus 60

Hình 3.8 Sơ đồ mô tả hình thái bọ gậy Anopheles dirus (theo Sallum, 2005) 61

Hình 3.9 Một số đặc điểm của bọ gậy thu thập tại Bắc Kạn 62

Hình 3.10 Sơ đồ mô tả hình thái điển hình bọ gậy Anopheles takasagoensis (theo Sallum, 2005) 63

Hình 3.11 Một số đặc điểm của quăng Anopheles dirus 64

Hình 3.12 Sơ đồ mô tả hình thái quăng Anopheles dirus (theo Sallum, 2005) 65

Hình 3.13 Một số đặc điểm của quăng thu thập tại Bắc Kạn 66

Hình 3.14 Sơ đồ mô tả hình thái điển hình quăng Anopheles takasagoensis (theo Sallum, 2005) 67

Hình 3.15 Kết quả thử nghiệm ELISA phát hiện KST trong muỗi thu thập

tại Phú Yên và Quảng Trị 68

Hình 3.16 Kết quả xác định ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật PCR 69

Hình 3.17 Hình ảnh điện di của hệ isozyme IDH của các quần thể An dirus 70

Hình 3.18 Hình ảnh điện di của hệ isozyme 6-PGD (A), αPGD (B), GPI (C)

của các quần thể An dirus 72

Hình 3.19 Hình ảnh điện di của hệ isozyme GOT của các quần thể An

dirus 74

Hình 3.20 Hình ảnh điện di hệ isozyme PGM của các quần thể An dirus 74

Hình 3.21 Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các quần thể An

dirus nghiên cứu dựa trên số liệu điện di isozyme 76

Hình 3.22 Hình ảnh sản phẩm PCR khuếch đại gen COI của các quần thể

nghiên cứu 77

Hình 3.23 Hình ảnh sản phẩm PCR khuếch đại gen ND6 của các quần thể

nghiên cứu 77

Hình 3.24 Cây chủng loại phát sinh theo phương pháp NJ của nhóm loài

Anopheles leucosphyrus theo trình tự gen COI và ND6 79

Hình 3.25 Cây chủng loại phát sinh theo phương pháp MP của nhóm loài

Anopheles leucosphyrus theo trình tự gen COI và ND6 81

Hình 3.26 Biểu đồ biểu thị giá trị LC50 của permethrin với An dirus qua

các thế hệ 84

Hình 3.27 Sản phẩm PCR sử dụng đôi mồi Agd1 và Agd2. 86

Hình 3.28 Sản phẩm được hình thành do sử lý bằng enzyme giới hạn Fsp1 87

Hình 3.29 Sản phẩm PCR khuếch đại locus gen CYP6P9a 88

Hình 3.30 Đồ thị so sánh mức độ biểu hiện gen CYP6P9a và CYP6P9b của

hai dòng muỗi kháng và nhạy 89

1

MỞ ĐẦU

Bệnh sốt rét là một bệnh truyền nhiễm do ký sinh trùng trong máu

Plasmodium spp gây ra và thường gặp ở các nước nhiệt đới Bệnh lây lan chủ yếu từ người này sang người khác qua trung gian là muỗi Anopheles Bệnh sốt

rét có thể gây tử vong cho con người

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), sau nhiều năm tiến hành chiến lược “tiêu diệt sốt rét” (từ năm 1955- 1991), trên thế giới vẫn còn trên 2 tỷ người/100 quốc gia sống trong vùng sốt rét lưu hành Ở Việt Nam, tình hình sốt rét những năm gần đây có cải thiện nhưng nguy cơ sốt rét quay trở lại vẫn còn là điều lo ngại của ngành Y tế và các cấp chính quyền Việc giám sát vector truyền bệnh có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong chiến lược phòng chống và tiêu diệt bệnh sốt rét Tuy nhiên, công việc này còn gặp nhiều khó khăn do các vector truyền bệnh rất đa dạng về tập tính, sinh lý, sinh thái, di truyền cũng như khả năng kháng hóa chất diệt côn trùng Do đó việc xác định chính xác và nắm rõ bản chất sinh học của các vector là hết sức cần thiết

Nhóm loài Anopheles leucosphyrus thuộc series Neomyzomya, giống Anopheles (Cellia) Nhiều loài trong nhóm loài này đóng vai trò là vector chính truyền bệnh sốt rét cho người tại vùng Đông Nam Á: Anopheles balabacensis, Anopheles latens, Anopheles leucosphyrus [94], Anopheles baimaii, Anopheles dirus Ở Việt Nam, Toumanoff (1936) đã phát hiện thấy muỗi thuộc nhóm loài Anopheles leucosphyrus và đặt tên là An.leucosphyrus,

về sau loài muỗi này được chuyển tên thành An balabacensis[19] Những nghiên cứu sau này cho rằng ở Việt Nam có An dirus và An takasagoensis

thuộc nhóm loài này [16] Ngoài 2 loài trên, theo Peyton còn có dạng Côn Sơn và một mẫu muỗi cái ở Quảng Ninh chưa được phân loại đến loài [84] Tuy nhiên, những nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử của Manguin và cs

2

(2002) lại kết luận rằng ở Việt Nam chỉ có một loài là An dirus A (An dirus s.s)? Nhƣ vậy thành phần loài của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt

Nam là chƣa rõ ràng Các nghiên cứu tại Việt Nam chủ yếu tập trung vào loài

An dirus Hàng loạt công trình nghiên cứu từ năm 1962 đến nay đã khẳng định An dirus là loài muỗi hoang dại truyền sốt rét nguy hiểm, tuổi thọ dài,

có vùng phân bố trùng với vùng phân bố của ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc

P falciparum, gây ra các vụ dịch dai dẳng từ Thanh Hóa trở vào Nam, đặc

biệt vào mùa mƣa là mùa truyền bệnh sốt rét mạnh nhất của khu vực miền Trung - Tây nguyên

Để góp phần đánh giá thành phần loài, đặc điểm di truyền và đề xuất những ý kiến đóng góp vào việc lựa chọn những biện pháp phòng chống thích hợp với vector truyền sốt rét nguy hiểm này, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, đa hình di truyền và tính kháng với

hóa chất diệt côn trùng của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam”

Với Mục tiêu nhƣ sau:

1 Xác định đƣợc đặc điểm sinh học và sự đa hình di truyền của các thành viên trong nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam

2 Xác định tính kháng hóa chất diệt côn trùng của loài An dirus ở Việt

Nam

3

Nội dung nghiên cứu của luận án:

1 Điều tra đặc điểm sinh học, thu thập mẫu vật tại thực địa

2 Phân tích isozyme và ADN để đánh giá tính đa hình di truyền của các thành viên trong nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam

3 Phân tích tính kháng của các quần thể An dirus ngoài thực địa và

chủng kháng phòng thí nghiệm

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:

 Ý nghĩa khoa học: Luận án ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử vào nghiên cứu đa hình di truyền và vai trò truyền bệnh của nhóm loài Anopheles leucosphyrus cho kết quả chính xác, sâu sắc và toàn diện hơn so với các nghiên cứu trước Kết quả nghiên cứu đã xác định được

số loài, số dạng của nhóm loài này ở Việt Nam

 Ý nghĩa thực tiễn: Xác định đúng được thành phần loài, tỷ lệ nhiễm KST sốt rét, tính đa hình di truyền của một nhóm loài truyền bệnh sốt rét chính như nhóm loài Anopheles leucosphyrus tại Việt Nam rất quan trọng Điều này giúp cho các nhà dịch tễ học đánh giá đúng tình hình vector truyền bệnh tại điểm nghiên cứu từ đó đề xuất những chính sách, chiến lược phòng chống bệnh hiệu quả và làm giảm gánh nặng sốt rét cho xã hội

4

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1 Lần đầu tiên phối hợp nhiều kiểu dấu hiệu từ hình thái đến điện di enzyme và phân tích phân tử ADN để nghiên cứu một nhóm loài đồng hình có vai trò truyền sốt rét ở Việt Nam và đã xác định đƣợc mối quan

hệ di truyền giữa các thành viên trong nhóm loài Anopheles leucosphyrus

2 Kết quả nghiên cứu cho thấy sự tồn tại của một dạng mới có cấu trúc di truyền khác biệt so với các loài muỗi khác trong nhóm loài Anopheles leucosphyrus Dạng muỗi này ở miền Bắc Việt Nam (tỉnh Bắc Kạn ) và

tạm gọi là dạng Anopheles Bắc Kạn

5

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ NHÓM LOÀI ANOPHELES LEUCOSPHYRUS TRÊN THẾ GIỚI

Nhóm loài Anopheles leucosphyrus thuộc series Neomyzomya, giống Anopheles (Cellia) Hơn một thế kỷ qua, đặc biệt là trong 5 thập niên trở lại

đây, nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh đây là một nhóm loài bao gồm 14 loài đã được định tên, 2 dạng địa lý và 6 loài mới được mô tả [80] Phân bố địa lý của nhóm loài Anopheles leucosphyrus trải dài từ Tây Nam Ấn

Độ đến phía Nam Trung Quốc, Đài Loan, lục địa Đông Nam Á, Indonesia và Philippine Nhóm loài này được Peyton (1989) [84] chia làm 3 phân nhóm: Phân nhóm Leucosphyrus, phân nhóm Hackeri và phân nhóm Riparis, trong

đó các loài trong phân nhóm Leucosphyrus được nghiên cứu nhiều nhất Phân

nhóm Leucosphyrus gồm các phức hợp Dirus, phức hợp Leucosphyrus, An baisasi Colless và dạng địa lý Côn Sơn Phức hợp loài Dirus gồm 7 loài thành viên là An dirus (= An dirus A) phân bố rộng rãi ở vùng Đông Á- có mặt ở

Myanmar, Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam và đảo Hải Nam (Trung

Quốc) An cracens (= An dirus B) có ở miền nam (bán đảo) Thái Lan, bán đảo Malaysia và Sumatra (Indonesia) An scanloni (= An dirus C) có mặt ở

một vùng tương đối hẹp dọc theo biên giới Nam Myanmar, phía Tây và Nam

Thái Lan, có liên kết mật thiết với môi trường đá vôi An baimaii (= An dirus

D) có mặt từ các vùng Tây Nam Trung Quốc (tỉnh Vân Nam), Tây Thái Lan, Myanmar, Bangladesh đến đông bắc Ấn Độ và đảo Andaman (Ấn Độ) [92]

An elegans (= An dirus E) giới hạn ở vùng rừng có nhiều đồi núi (hilly forests) của Tây Nam Ấn Độ An nemophilous (= An dirus F) phân bố rải rác

dọc theo bán đảo Thái-Malay, vùng biên giới Thái Lan với Myanmar và

Campuchia Cuối cùng là An takasagoensis chỉ có ở Đài Loan Sự phân bố

6

của các thành viên trong phức hợp Dirus nói riêng và trong nhóm loài Anopheles leucosphyrus đƣợc chỉ rõ trên hình 1.1 và 1.2

Hình 1.1 Phân bố của 7 thành viên thuộc phức hợp Dirus (An cracens ở Sumatra

không có trong hình) (theo Manguin và cs., 2008)[71]

7

Hình 1.2 Bản đồ phân bố các thành viên nhóm loài Anopheles leucosphyrus (theo

Valerie Obsomer, 2007)[80]

8

Một số loài trong nhóm loài Anopheles leucosphyrus đã được xác định

có vai trò truyền bệnh sốt rét chủ yếu hoặc thứ yếu ở người như An dirus, An baimaii, An sracens, An scanloni, An leucosphyrus, An latens

Trong nhóm loài Anopheles leucosphyrus, phức hợp Dirus được nghiên cứu kỹ và toàn diện nhất Phức hợp Dirus bao gồm các loài vector sốt rét rừng

chính, chủ yếu là An dirus và An baimaii, là 2 loài lan truyền cả P falciparum và P vivax Các nghiên cứu cho thấy rằng đây là các loài thích

gần người, chủ yếu tiêu máu ngoài nhà (exophagic) và có khả năng truyền sốt

rét cao [37] An cracens là loài thích gần người, loài này cũng có thể có vai trò trong lan truyền sốt rét, cũng giống như An scanloni và An elegan Các

phương pháp xác định bằng hình thái và phân tử hiện có cho phép các nhà nghiên cứu khảo sát về mức độ truyền bệnh qua đó xác định loài nào có thể

liên quan đến vai trò lan truyền sốt rét Hai loài khác trong phức hợp là An nemopilous và An takasagoensis không có vai trò lan truyền sốt rét do tập

tính thích súc vật của chúng (Zoophilic) [37,84]

Các loài trong phức hợp Dirus là các loài muỗi rừng (rừng đồi thấp, rừng sâu, rừng trồng), nhưng thỉnh thoảng thu thập được ở vùng bìa rừng Bọ gậy của các loài muỗi này chủ yếu sống ở vũng nước nhỏ, thường là tạm thời, chủ yếu là nước đọng, sạch có bóng râm, vũng nước mưa, dấu chân động vật, suối thậm chí trong giếng ở các vùng núi đồi có rừng sơ cấp, thứ cấp hoặc rừng có lá rụng, rừng tre, và các đồn điền trồng cao su, cây ăn quả [37]

Các thành viên trong phức hợp loài Dirus khác nhau về đặc điểm hình thái, phân bố, tập tính sinh học, vai trò truyền bệnh đặc biệt sự sai khác đặc điểm di truyền tế bào (số lượng và vị trí vùng dị nhiễm sắc ở bộ nhiễm sắc thể nguyên phân và nhiễm sắc thể khổng lồ) [33,34,35,36,38], khác nhau về đặc điểm điện di enzyme [62] Gần đây, kỹ thuật PCR sử dụng các mồi đặc hiệu

9

đã được áp dụng tại Thái Lan để phân biệt 3 loài An dirus, An cracens Sallum & Peyton, An scanloni Sallum & Peyton và loài An baimaii Sallum

& Peyton thuộc phức hợp loài Dirus [67] Tương tự như vậy, Xu và cs 1998

đã sử dụng kỹ thuật PCR dựa trên sự khác biệt về trình tự đoạn ITS2 của

ADN ribosome để nghiên cứu quần thể An dirus A và An dirus D của Trung Quốc [115] Walton và cs (1999) chỉ ra rằng trình tự ITS2 của loài An dirus

D ở Trung Quốc theo nghiên cứu của Xu (1998) là khác với mẫu ở Thái Lan

và đó có thể là một loài chưa được công nhận trong phức hợp loài Dirus [104]

Walton và cs (2000, 2001) cũng đã đưa ra những bằng chứng di truyền

chứng minh An dirus và An scracens là loài chị em, có quan hệ gần hơn so với giữa An dirus và An scanloni [103,104] Năm 2002, Manguin và cs đã dùng kỹ thuật PCR đa mồi để phân biệt An dirus, An cracens, An scanloni

và An baimaii ở Đông Nam Á [72] Nghiên cứu xem xét lại nhóm loài

Anopheles leucosphyrus của Sallum và cs (2005) cho thấy các đặc điểm hình thái xuất hiện ở các giai đoạn trong chu kỳ sống của muỗi có thể dùng để phân biệt các loài [92] Tuy nhiên tác giả cũng nhấn mạnh “do sự biến thiên thay đổi phức tạp về hình thái của chúng, nên việc tách biệt nhiều loài trong nhóm này (nhóm Anopheles leucosphyrus) bằng các đặc điểm hình thái sẽ luôn luôn là một sự thách thức”

Tóm lại, lịch sử tiến hóa cũng như mối quan hệ di truyền và chủng loại phát sinh của các loài trong phức hợp loài Dirus nói riêng và nhóm loài Anopheles leucosphyrus nói chung vẫn chưa có những kết luận chính xác và cần phải có những nghiên cứu sâu hơn

cứu sau này cho rằng có sự tồn tại của loài thứ hai trong nhóm loài này ở Việt

Nam là An takasagoensis phân bố miền Bắc [16]? Ngoài hai loài trên, mẫu

vật thu thập tại miền Nam còn có thêm dạng Côn Sơn (Peyton, 1989) [84] và

ở miền Bắc còn có một mẫu muỗi cái ở Quảng Ninh thu thập năm 1970 chưa được định loại đến loài

Hầu hết các nghiên cứu tại Việt Nam mới chỉ tập trung vào loài An dirus, vì là một vector truyền bệnh sốt rét chủ yếu ở miền Trung Tây Nguyên

Nghiên cứu đặc điểm sinh học loài muỗi quan trọng này đã được tiến hành từ năm 1993, đặc biệt tại Khánh Phú 9,10,11 Nghiên cứu ngoài tự nhiên cho

thấy: bọ gậy An dirus có mật độ cao vào các tháng cuối mùa khô khi có trận

mưa nhỏ, rải rác (tháng 7,8,9) và những tháng mùa mưa (tháng 10, 11, 12) sau đó mật độ giảm dần và xuống thấp vào các thàng mùa khô (từ tháng 1 đến tháng 6) Ổ bọ gậy ở trong rừng, cách khu dân cư chừng 100- 500m, là những vũng nước đọng, trên những hốc đá hay trong các suối cạn vào mùa khô Nước hầu như không lưu thông, đáy có cát, sỏi hay đất sỏi có lá cây mục Ổ

bọ gậy có đường kính từ 20 - 60 cm, độ sâu mức nước 10 - 40 cm, độ pH từ 6 đến 7, nhiệt độ không khí 26,7˚C- 31˚C (trung bình 28,2˚C), ẩm độ từ 71 -

11

86% (trung bình 80,5%), phía trên là các bụi cây, được che bằng tán cây lớn, ánh sáng không chiếu trực tiếp vào được Đặc biệt là trong các ổ nhân tạo (vại sành) thường gặp bọ gậy loài muỗi này trong tất cả các tháng của năm

Mùa phát triển của An dirus ngoài tự nhiên: An dirus phát triển chủ

yếu trong mùa mưa, đỉnh cao vào các tháng 10, 11 hàng năm ở Khánh Hoà, Phú Yên Vào các tháng mùa khô (từ tháng 2- 6) mật độ muỗi giảm rất thấp

29,31 Tuy nhiên loài muỗi này có mặt hầu như quanh năm tại khu vực dân

cư ở Vân Canh, Bình Định 30,32 còn ở Sê - Đăng, Quảng Nam lại có đỉnh vào tháng 6,7 24,25

Tính ưa thích vật chủ: An dirus đốt người cả trong nhà và ngoài nhà

song mật độ đốt người ngoài nhà bao giờ cũng cao hơn trong nhà (người ngồi ngoài nhà cách thôn bản 200-300m, gần rừng hơn) đặc biệt nhà rẫy sát rừng mùa khô có mật độ muỗi đốt người đạt tới 1,3 con/người/ đêm cao hơn mồi người trong nhà trong làng khoảng 0,4 con/người/đêm [31

Muỗi An dirus vào nhà đốt người suốt đêm từ 18 giờ tối đến 6 giờ sáng, đỉnh cao vào 22 giờ đến 23 giờ Tính chung trong đêm số lượng An dirus vào nhà đốt người tập trung từ chập tối đến nửa đêm Số lượng muỗi hút

máu nhiều hơn vào những đêm trăng sáng 31 Tại Khánh Phú, Khánh Hoà thu thập muỗi bằng phương pháp soi trong nhà ban ngày chỉ bắt được muỗi trong màn hoặc trong bẫy muỗi Trong đó 97% muỗi vừa hút máu vào đêm hôm trước (Sella II), chỉ có 3% muỗi đói Điều này khẳng định đây là loài muỗi hoang dại có tập tính trú đậu tiêu máu ngoài nhà 31 Ở các địa

phương từ Nghệ An tới Quảng Trị, An dirus có mặt ở 30 điểm điều tra Tuy

vậy không nơi nào trong số các điểm này bắt được muỗi trú đậu trong nhà mặc dù tiến hành bắt muỗi ngay khi trời vừa sáng Ở Vân Canh, Bình Định đã tiến hành thu thập muỗi trong nhà liên tục 12 tháng trước khi sử dụng DDT

12

nhưng chỉ bắt được 11 muỗi cái bụng còn máu tươi bị kẹt lại do trời mưa to trước khi sáng 23,32

Vai trò truyền bệnh của An dirus: mổ soi tuyến nước bọt thấy tỷ lệ

nhiễm thoa trùng của loài muỗi này rất cao 3,98% Bằng kỹ thuật ELISA thì xác định được tỷ lệ này là 8,53%

Bên cạnh đó đã có một số nghiên cứu về enzyme, về di truyền tế bào cũng đã được tiến hành trên đối tượng này [10,11,12], tuy nhiên việc nghiên cứu chưa đồng bộ Những phân tích về ADN của Manguin và cs (2002) [72]

đã đi đến kết luận toàn bộ muỗi An dirus ở Việt Nam (kể cả một mẫu mang những đặc điểm hình thái giống An dirus và An takasagoensis ở cả giai đoạn

bọ gậy và muỗi trưởng thành do TS Nguyễn Đức Mạnh cung cấp) đều là An dirus A

1.3 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỀN Ở MUỖI SỐT RÉT

Theo tổ chức y tế thế giới, muỗi được coi là vector truyền bệnh trong mười bệnh sốt nhiệt đới chính, trong đó có bệnh sốt rét được coi là bệnh nguy hiểm hàng đầu Bệnh sốt rét mang tính toàn cầu, có 107 nước và vùng lãnh thổ chịu ảnh hưởng của bệnh này

Ở Việt Nam, sốt rét là bệnh nghiêm trọng và phổ biến Đặc biệt các vùng lưu hành bệnh bao gồm vùng rừng núi phía Bắc, ven dọc Trường Sơn, cao nguyên miền Trung, khu vực Đông Nam, Tây Nam và miền duyên hải

Một số loài thuộc giống muỗi Anopheles được xem là vector truyền

bệnh sốt rét Theo những nghiên cứu gần đây thì hầu hết các loài muỗi truyền sốt rét trước đây được định loại đều là các phức hợp loài hoặc nhóm loài đồng hình, trong đó có nhiều loài được xác định là vector truyền bệnh sốt rét quan trọng Các loài trong các nhóm loài này có vai trò truyền bệnh khác nhau, tính

13

kháng hóa chất diệt côn trùng cũng khác nhau, do đó việc phân loại chính xác

và mối quan hệ di truyền giữa các loài trong một nhóm loài hoặc phức hợp loài đóng vai trò hết sức quan trọng trong chiến lƣợc phòng chống bệnh sốt rét

Đa hình di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã Đây là sự đa dạng về thành phần kiểu gen của các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau Tính

đa dạng về gen có thể di truyền đƣợc trong một quần thể hoặc giữa các quần thể

Đa hình di truyền biểu hiện sự biến đổi của vật chất di truyền, biến đổi

về các cặp bazơ nitơ và sự tổ hợp trình tự của các cặp bazơ nitơ trong phân tử ADN

Tính đa hình di truyền có thể đƣợc xác định ở nhiều mức độ tổ chức bao gồm từ số lƣợng, cấu trúc của ADN trong mỗi tế bào cũng nhƣ số lƣợng, cấu trúc của nhiễm sắc thể, protein hay hình thái của mỗi loài trong các điều kiện

14

thể bị thay thế khi xảy ra đột biến ở một vài bazơ nitơ trong các codon của gen cấu trúc Thậm chí trong các gen cấu trúc có thể xảy ra hiện tượng lặp đoạn, mất đoạn, chuyển đoạn của các nucleotide Vì vậy, khi sử dụng phương pháp điện di trên gel tinh bột thuỷ phân, gel agarose hay gel polyacrylamide cùng với nhuộm hoá tổ chức ta có thể thấy được các biến dạng khác nhau của phân tử enzyme

Việc sử dụng dẫn liệu đa hình di truyền của enzyme đã mang lại những thuận lợi cho các phân tích di truyền học: do đại đa số các isozyme có đặc điểm di truyền theo kiểu đồng trội Hơn nữa trong nghiên cứu di truyền học quần thể thì số liệu về độ dị hợp của quần thể nghiên cứu là cực kỳ quan trọng Số liệu này cho phép đánh giá được động thái di truyền của quần thể tại thời điểm nghiên cứu Số liệu về độ dị hợp của quần thể cho phép đánh giá khả năng thích nghi của một quần thể Số liệu này còn cho phép so sánh động thái di truyền của các quần thể khác nhau

Ở muỗi, hiện tượng đa hình di truyền isozyme lần đầu tiên được Bianchi (1969) đề cập khi so sánh điện di photphatase kiềm của các thành

viên phức hợp loài An maculipennis Những số liệu về điện di hệ enzyme ở

muỗi chỉ ra rằng cũng giống như các quần thể sống khác, các quần thể muỗi biểu hiện sự tồn tại đa alen rất cao Ở một số quần thể muỗi, sự đa hình thể hiện là một enzyme có thể bao gồm sự biểu hiện từ 5-7 alen [41,44,46]

Những dấu hiệu về sự đa hình di truyền đã được phát hiện ở hầu hết các

loài Anopheles Những số liệu này đã chỉ ra sự khác nhau và những biến đổi

phức tạp của các loài đồng hình Chỉ với 6 locus ( Est-1, Est-2, Est-3, Est-5, Odh, Xdh) trong số 30 enzyme được phân tích chỉ ra có sự khác nhau về các

alen điện di có thể dùng để phân biệt Anopheles gambiae và Anopheles arabiensis (trong phức hợp Anopheles gambiae) với khoảng cách di truyền là

15

0.15 [48] Khoảng cách di truyền và hệ số tương đồng di truyền của các loài đồng hình thuộc cùng một nhóm loài cũng như các nhóm loài là rất khác nhau

Năm 1992, Green A.C đã tiến hành nghiên cứu 8 hệ enzyme của An dirus và nhận thấy hầu hết chúng đều đa hình [62]

Khoảng cách di truyền giữa các loài Anopheles rangeli, loài Anopheles nuneztovari và loài Anopheles dunhami ở rừng Amazon - Brazil được tính

toán sử dụng kết quả điện di isozyme 3 loài này thuộc cùng phân nhóm Oswaldoi, phân giống Nyssorhynchus 13 enzyme với tổng số 22 locus của

các loài trên đã được nghiên cứu và đưa đến những kết luận: Anopheles nuneztovari và Anopheles rangeli khác nhau ở các locus Gpi1, Hk1, Me1 đặc

biệt rõ rệt ở locus Mdh 5 locus (Mdh, Gpi1, Hk1, Gpd và Me) dùng phân biệt

hai loài An rangeli và An dunhami trong khi đó chỉ có 1 locus Gpd mới phân biệt được An nuneztovari và An dunhami Khoảng cách di truyền cao nhất giữa An rangeli và An dunhami (0,28) và thấp nhất giữa An nuneztovari và

An dunhami (0.072) Khoảng cách di truyền giữa Anopheles nuneztovari và Anopheles rangeli là 0,237 Các tác giả đưa ra nhận định rằng An dunhami và

An nuneztovari là loài chị em có mối quan hệ gần gũi và có thể được tách ra

từ một nhánh tổ tiên chung [95]

Ở Việt Nam, việc phân tích đa hình isozyme ở muỗi cũng đã được tiến hành từ giữa những năm 80 Một trong những nhóm loài truyền bệnh sốt rét chính ở Đông Nam Á cũng như ở Việt Nam được nghiên cứu khá rõ là nhóm

loài An minimus Những nghiên cứu về An minimus ở Việt Nam chỉ ra rằng

isozyme Octanol dehydrogenase (ODH) ở loài muỗi này biểu hiện tính đa

hình ở các quần thể khác nhau Các quần thể muỗi An minimus C phân bố

chủ yếu ở những sinh cảnh thích hợp đó là sinh cảnh rừng rậm, rừng nguyên

16

sinh được đặc trưng bởi 2 alen Odh134

và Odh146 Các quần thể An minimus A

phân bố rộng rãi ở vùng rừng núi trong toàn quốc, chúng mở rộng vùng phân

bố tới vùng bán sơn địa có 2 alen đặc trưng là Odh100

và Odh114 Hai dạng muỗi này có tập tính và thời gian sinh sản đặc trưng khác nhau [5,6,7]

Năm 2000, các cán bộ của Viện SR- KST- CT TƯ đã phân tích 4 hệ isozyme, đó là: Glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD), Phosphogluco-mutase (PGM), Isocitrate dehydrogenase (IDH) của phức hợp loài An maculatus ở Việt Nam Các tác giả nhận thấy có sự đa hình di truyền rõ rệt và thể hiện là các thành viên khác nhau trong phức hợp loài Do vậy có thể sử dụng hệ isozyme này để nhận biết các thành viên trong phức hợp loài [14]

1.3.2 Các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi

Cho đến nay, có nhiều phương pháp được sử dụng cho nghiên cứu tiến hoá và phân loại muỗi sốt rét Anopheles dựa trên đặc điểm tập tính, sinh thái học, hình thái học, hoá sinh, di truyền tế bào [49] và gần đây là các kỹ thuật sinh học phân tử như phân tích ADN bằng PCR (AFLP, RFLP ) Việc phát minh ra kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đã tạo ra một phương tiện mới cho nghiên cứu di truyền sinh học phân tử hệ gen và các kỹ thuật sau đó tạo điều kiện thuận lợi cho những nghiên cứu di truyền của từng cá thể cũng như ở mức độ quần thể [39] Các chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu vector sốt rét xuất hiện trong vòng 10 năm trở lại đây rất đa dạng, phong phú trong đó có cả chỉ thị mới và các “chỉ thị kinh điển” (ADN ti thể và cDNA) Một trong những ưu điểm lớn nhất của việc sử dụng một số lượng lớn các chỉ thị di truyền khác nhau là người nghiên cứu có thể lựa chọn, kết hợp các chỉ thị hay các kỹ thuật để trả lời nhiều câu hỏi có liên quan đến sự lan truyền sốt rét Những chỉ thị phân tử này cũng cung cấp công cụ hữu hiệu cho nhiều nghiên cứu ứng dụng khác bao gồm: phân loại phân tử, hệ thống tiến hóa, di

Kỹ thuật PCR có một ưu thế nổi bật so với các kỹ thuật trước đây là nó

có thể phân biệt được các loài dựa vào những đoạn trình tự ADN đặc trưng

mà ở đó các loài muỗi chỉ có những khác biệt rất nhỏ ở một vài cặp bazơ nitơ

Số lượng các đoạn ADN lặp lại khác nhau trong hệ gen của muỗi là một mục tiêu tốt để sử dụng trong phân loại Những đoạn ADN lặp lại này rất phổ biến

ở hệ gen ty thể, lạp thể, những hệ gen nhân có sự lặp lại như trong histon, gen 5S ARN, và ARN của ribosome (rRNA) ADN ribosome (rDNA) mã hoá rRNA cũng là một trong những chỉ thị tốt Cả rRNA và các gen gốc mã hoá

nó đều có tính bảo thủ rất cao (bền vững, đặc trưng), do đó rRNA được sử dụng như là một công cụ quan trọng trong nghiên cứu hệ thống học nhất là nghiên cứu phân loại Có những vùng của rRNA có những biến đổi thậm chí

là giữa các loài có quan hệ gần gũi với nhau Những vùng có nhiều biến đổi thường tập trung ở các khoảng trình tự trống (không mã hoá), đây là nguồn cung cấp các công cụ hữu hiệu nhất cho cả việc phân loại các loài và xác định mối quan hệ họ hàng giữa các loài gần gũi nhau

Những đoạn trình tự lặp lại cách nhau bởi các vùng đệm nội gen (intergenic spacers-IGS) và nối tiếp nhau thành một dãy dài Một đơn vị sao chép cơ bản bao gồm vùng mã hoá các tiểu đơn vị rRNA (ở côn trùng là 3 tiểu đơn vị 18S; 5,8S và 28S) và một vài vùng phụ (vùng sao chép bên ngoài-external transcribed spacer: ETS và 2 vùng sao chép bên trong-internal transcribed spacer: ITS1 và ITS2) là những vùng chưa biết rõ chức năng

18

Các loài riêng biệt khác nhau ở trình tự ADN ribosome có thể dễ dàng phát hiện nhờ kỹ thuật PCR bằng thiết kế ra các mồi có thể gắn vào và nhân lên một sản phẩm đặc trưng từ ADN khuôn Cách đơn giản nhất là tạo ra các cặp mồi đặc hiệu để phân biệt các loài [47, 100]

Một thí nghiệm thiết kế mồi bám vào đoạn trình tự ở đầu 5‟ của đoạn

IGS đã được tiến hành để phân biệt các loài trong phức hợp Anopheles gambiae Kỹ thuật PCR sử dụng 5 mồi khác nhau: một mồi chung gắn vào

đoạn trình tự ở đầu 5‟ của đoạn IGS có thể phát hiện ra tất cả các loài trong phức hợp và 4 mồi đặc hiệu, mỗi một mồi đặc trưng cho một loài trong phức

hợp (một mồi có thể phát hiện được 2 loài là Anopheles merus và Anopheles melas, là những loài không trùng vùng phân bố) Quá trình kéo dài của mồi

xảy ra ở đầu các mồi đặc hiệu và tạo ra những đoạn ADN có chiều dài đặc trưng cho từng loài [96]

Kỹ thuật này đã được thử nghiệm với các mẫu được thu từ thực địa và nó phù hợp hoàn toàn (100%) với các kỹ thuật khác được dùng như Southern blot [99], phân tích di truyền tế bào [59] và phân tích điện di isozyme [83] Mức độ biến đổi của vùng IGS càng cao thì tính đặc hiệu để phân loại các loài càng tốt Tuy nhiên, độ dài của đoạn IGS làm cho vùng này rất khó được nhân bản bằng kỹ thuật PCR Do đó hiện nay người ta sử dụng phổ biến mồi được thiết kế để nhân đoạn ADN ngắn hơn và nói chung ít đa hình hơn đó là trình

tự ITS Vùng ITS2 thường được sử dụng trong kỹ thuật PCR để phân biệt các

19

biến đổi trong loài của vùng ITS2 thấp hơn những biến đổi giữa các loài, điều này cho phép phát triển kỹ thuật PCR chẩn đoán loài dựa vào vùng này, ví dụ như chỉ có một biến đổi được quan sát thấy trong 9 dòng ITS2 khác nhau

được thu thập từ 4 quần thể địa lý của An freeborni [86] Mức độ biến đổi

trong loài thấp như vậy cũng được quan sát thấy ở trình tự ITS2 của các loài

trong phức hợp An quandrimaculatus Trong phức hợp loài An gambiae, mức độ biến đổi trong loài của vùng ITS2 biến đổi từ 0,07% ở An arabiensis đến 0,43% ở An gambiae trong khi đó biến đổi giữa các loài dao động từ 0,4

đến 1,6% Mặt khác, Frizt và cs (1994) đã nhận thấy độ dài đoạn ITS2 biến đổi tới 2% ở vùng có các cặp nucleotide lặp lại ở các quần thể địa lý khác

nhau của An.nuneztovari vùng Nam Mỹ Những quần thể này có biểu hiện

đặc điểm của những loài đồng hình hơn là những quần thể địa lý [60]

Một dạng ADN được sử dụng nhiều trong nghiên cứu muỗi sốt rét là ADN ở hệ gen ty thể Hệ gen ty thể thường xuyên được sử dụng để nghiên cứu chủng loại phát sinh và di truyền quần thể Trình tự và cấu trúc hệ gen ty

thể của An gambiae đã được công bố hơn một thập kỷ trước Những thông tin

này nhanh chóng được sử dụng trong những nghiên cứu trên thực địa cũng như trong phòng thí nghiệm dựa vào cả những đoạn có mã hoá (như tiểu phần NADH dehydrogenase (ND5) và tiểu phần I, II của cytochrome oxidase (COI

và COII)) và không mã hoá (như tiểu phần 12S và16S ARN) thường là những gen đích cho các nghiên cứu này

Rất nhiều các nghiên cứu đã sử dụng ADN ty thể để xây dựng các cây

chủng loại phát sinh của An gambiae s.l để trả lời các câu hỏi về cấu trúc di

truyền của các thành viên trong phức hợp loài này Những nghiên cứu về lịch

sử tiến hoá phức tạp của nhóm loài này vẫn còn đang tiếp tục Những kết luận

khi nghiên cứu hệ gen ty thể thu được từ An gambiae s.l đôi khi cho kết quả

20

khác với những số liệu thu được từ việc nghiên cứu các chỉ thị di truyền khác của phức hợp loài này (như microsatellite và rADN) [75]

ADN ty thể cũng được sử dụng để phát hiện những biến đổi lớn ở muỗi

giống Anopheles và các phức hợp loài Anopheles Foley và cs, (1998) [58] đã

sử dụng gen COII để xây dựng cây chủng loại phát sinh của muỗi Anopheles

ở Úc De Merida (1999) [51] cũng sử dụng ADN ty thể (ND5) với kỹ thuật phân tích đa hình cấu trúc sợi đơn (SSCP) để nghiên cứu cấu trúc quần thể

của An albimanus Fairley (2000) [55] sử dụng một đoạn gen COI để tìm hiểu cấu trúc di truyền và trao đổi dòng gen giữa các quần thể Anopheles punctipennis ở Vermont Nghiên cứu này tìm thấy có sự khác biệt đáng tin

cậy về sự đa hình di truyền trong một quần thể cũng như cấu trúc di truyền giữa các quần thể với nhau Điều này có thể giải thích ít nhất là một phần sự thay đổi bất thường về kích cỡ của các quần thể và các giới hạn của việc trao đổi dòng gen Ngoài ra bằng cách nghiên cứu nhiều đoạn khác nhau trên hệ gen ty thể, ta có thể sử dụng toàn bộ hệ gen này để nghiên cứu về quần thể

Conn (1999) sử dụng kỹ thuật RFLP để phân tích ADN ty thể của Anopheles darlingi để chứng minh rằng các quần thể này bị cách ly theo khoảng cách địa

lý và những sự cách ly này cho phép chúng ta quan sát được sự thay đổi kiểu hình trong loài [50] Trong những ví dụ này, ADN ty thể được chứng minh là rất hữu ích cho việc nghiên cứu về phát sinh chủng loại và cấu trúc quần thể ở một vùng địa lý rộng lớn nhưng điều này không đúng cho tất cả các loài

Anopheles (ví dụ An gambiae s.l như đã nêu ở trên) ADN ty thể cũng không thể sử dụng để phân biệt các loài đồng hình trong phức hợp An maculipennis

Trình tự của ADN mã hoá các thông tin cần thiết cho cơ thể sống có thể tồn tại và tái sinh Việc xác định trình tự vì thế rất hữu ích với các nghiên cứu

cơ bản cũng như nghiên cứu ứng dụng

21

Giải trình tự gen tìm ra trình tự sắp xếp của các nucleotide trên đoạn gen được quan tâm nhằm phát hiện sự đột biến gen, thiết kế các mồi đặc hiệu hoặc tách dòng vector tạo ra các protein tái tổ hợp có giá trị cao như vắc xin, thuốc chữa bệnh, các sinh phẩm phục vụ chẩn đoán bệnh hoặc nghiên cứu khoa học Tất cả các nghiên cứu về kỹ thuật PCR phân loại hay nghiên cứu đa hình

ở muỗi bước đầu đều được dựa trên số liệu của kỹ thuật giải trình tự Các đoạn gen thường được quan tâm nghiên cứu giải trình tự nhiều ở muỗi để phục vụ cho việc thiết kế các mồi đặc hiệu thường là ITS1, ITS2 là những gen trên ribosome và COI và COII cũng như D3 là những đoạn gen trên ty thể Việc xác định được các gen có liên quan đến miễn dịch của muỗi với các

ký sinh trùng gây bệnh là vô cùng quan trọng Do đó việc giải trình tự toàn bộ

hệ gen của các muỗi truyền bệnh là yêu cầu thiết yếu Đầu năm 1998, Genoscop cùng với Khoa Sinh học phân tử, Sinh hoá Côn trùng thuộc Viện

Pasteur Pháp đã đề xuất chương trình giải mã hệ gen muỗi Anopheles Nó

được chính thức bắt đầu vào năm 2001 với mục tiêu chính là giải mã toàn bộ

hệ gen An gambiae vector truyền bệnh sốt rét chính ở Châu Phi Đến tháng 3

năm 2002 đã có 14000 gen đã được xác định và đến nay việc giải mã hệ gen của loài muỗi này đã gần hoàn thiện

Cùng với sự phát triển các kỹ thuật mới trong công nghệ sinh học để phân loại các loài đồng hình, các chương trình, phần mềm tin học cũng đóng góp một vai trò quan trọng trong nghiên cứu phân loại Nhờ có các chương trình này, việc phân loại trở nên nhanh chóng, chính xác và dễ dàng hơn Tóm lại, để phân loại được các loài đồng hình chúng ta không nên sử dụng một kỹ thuật riêng biệt nào, cần kết hợp càng nhiều kỹ thuật càng tốt Khi phân tích mẫu vật bằng nhiều kỹ thuật ta sẽ thu được một khối lượng thông tin lớn, kết quả phân tích sẽ đáng tin cậy hơn

được phát hiện ở loài muỗi Culex tritaeniorhynchus và Ae solicitan năm

1947 Từ đó đến nay đã có hơn 100 loài muỗi được xác định là kháng một hay nhiều loại hóa chất diệt côn trùng, trong đó có trên 50 loài thuộc phân họ

muỗi sốt rét (Anophelinae)

Kháng hóa chất là sự chọn lọc đặc điểm có tính kế thừa của một quần thể côn trùng gây ra thất bại một sản phẩm hóa chất mong đợi khi sử dụng theo qui định Sự kháng hoá chất diệt côn trùng theo định nghĩa của Tổ chức

Y tế Thế giới (WHO) là: “Sự phát triển khả năng sống sót của một số cá thể sau khi tiếp xúc với nồng độ nào đó của một hoá chất mà với nồng độ đó đa

số các cá thể trong một quần thể bình thường của loài đó sẽ bị chết” [56].Khả năng phát triển kháng phụ thuộc vào các yếu tố sinh học, sinh thái học của côn trùng, mức độ trao đổi dòng gen giữa các quần thể, độ bền của hoá chất

và cường độ sử dụng hoá chất bao gồm liều lượng và thời gian [65]

1.4.1.Cơ sở di truyền của tính kháng hóa chất diệt côn trùng

Hiện tượng kháng hóa chất không phải là một quá trình thích nghi sinh

lý của các cá thể trong quần thể Hiện tượng này bắt nguồn từ sự sai khác tự

23

nhiên có bản chất di truyền về mức độ mẫn cảm đối với các chất độc giữa các

cá thể trong quần thể Sự khác biệt này có sẵn trong các quần thể tự nhiên ngay từ khi chưa tiếp xúc với các loại hóa chất Khi một quần thể côn trùng chịu áp lực của một loại hóa chất thì sẽ xảy ra một quá trình chọn lọc, những

cá thể mang gen kháng hóa chất (còn gọi là gen tiền thích ứng) sẽ tồn tại Quá trình chọn lọc này bao hàm sự thay đổi về tần số của các alen Các gen kháng

có thể có sẵn trong quần thể hoặc sinh ra do đột biến Những cá thể trong quần thể mang gen kháng sống sót mặc dù tiếp xúc với hoá chất và truyền những gen kháng cho thế hệ sau Khi chưa tiếp xúc với hóa chất, những gen kháng biểu hiện với tần số rất thấp, nếu được tiếp xúc thường xuyên sẽ có biến đổi trong các thế hệ tiếp theo: tần số, tỷ lệ di truyền kháng thuốc tăng dần, ban đầu là dị hợp tử, thế hệ sau là đồng hợp tử

Việc sử dụng lặp lại một hoá chất sẽ loại bỏ các cá thể nhạy và tỷ lệ các

cá thể kháng sẽ tăng và cuối cùng số cá thể kháng sẽ trội lên trong quần thể Nếu trong một quần thể tỷ lệ các cá thể mang gen kháng là 1/10.000, nếu tiếp xúc liên tục với hóa chất thì qua 15 thế hệ liên tục thì tỷ lệ kiểu di truyền kháng thuốc sẽ tăng lên 1/30 và sau 7 thế hệ nữa (22 thế hệ) tỷ lệ kiểu di truyền kháng thuốc trong quần thể này tăng tới 1/1 [110]

1.4.2 Các cơ chế kháng hóa chất diệt côn trùng

Các hóa chất có thể xâm nhập vào cơ thể muỗi bằng nhiều cách và ảnh hưởng đến sự sống sót của chúng ở mức độ khác nhau Dựa vào khả năng hóa chất bị phân giải trực tiếp hay không khi tác động lên cơ thể muỗi để chia ra các loại cơ chế:

- Giảm thẩm thấu của hóa chất diệt

- Thay đổi trong quá trình trao đổi chất

- Kháng do biến đổi vị trí đích

24

- Kháng tập tính

1.4.2.1 Kháng giảm thẩm thấu hóa chất diệt

Kháng giảm thẩm thấu hóa chất diệt là cơ chế mà trong đó hóa chất diệt không bị phân hủy trực tiếp, song tính kháng hình thành là do giảm khả năng thấm Nhiều loại hoá chất diệt côn trùng thâm nhập vào cơ thể côn trùng qua lớp biểu bì Những thay đổi ở lớp biểu bì của côn trùng làm giảm tốc độ thẩm thấu của hoá chất diệt côn trùng gây nên sự kháng đối với một số hoá chất diệt Đơn thuần tính thấm giảm chỉ gây ra sự kháng ở mức độ thấp [81]

Cơ chế này hiếm khi được đề cập tới, nó thường được coi là thứ yếu thậm chí không được nhắc tới ở muỗi Tuy nhiên, nếu phối hợp với các cơ chế kháng khác, nó có thể tạo nên sự kháng cao Cơ chế này hầu hết được phát hiện qua các nghiên cứu tính thấm sử dụng hoá chất diệt đánh dấu

1.4.2.2 Kháng do cơ chế trao đổi chất (metabolic mechanism)

Đây là một trong những cơ chế kháng quan trọng Một nhóm nhỏ các enzyme hoặc họ các enzyme có liên quan trong tính kháng trao đổi chất Không có một enzyme nào là enzyme duy nhất liên quan đến tính kháng hoá chất diệt của côn trùng Sự kháng là kết quả của sự thay đổi về mặt cấu trúc enzyme làm tăng khả năng giải độc của nó hoặc sự tăng số lượng enzyme nhằm tăng cường sự đào thải độc tố của hoá chất diệt côn trùng Các phân tử hóa chất sau khi thâm nhập vào cơ thể, dưới tác dụng của các enzyme trong

cơ thể muỗi sẽ phân hủy chúng theo nhiều con đường khác nhau như: oxy hóa, thủy phân, hydro hóa, khử clo, ankyl hóa trở thành chất không độc Các hệ thống enzyme: esterase, glutathione - S - transferase và cytochrome

450, monooxygenase nhìn chung được coi là các hệ thống giải độc chủ yếu của các hóa chất diệt côn trùng ở côn trùng [98] tương ứng với các nhóm hóa chất chlo hữu cơ, phốt pho hữu cơ, carbamat và pyrethroid

25

Esterase

Các esterase là những enzyme xúc tác thủy phân của các ester nhờ có nước (ester + H2O → acid → alchohol) Esterase thường liên quan đến cơ chế chuyển hóa trong nhóm phốt pho hữu cơ, carbamat, nhưng ít có tác dụng đối với nhóm pyrethroid Sự kháng có thể tăng lên ở những quần thể côn trùng thông qua quá trình chọn lọc làm tăng số bản sao của gen carboxylesterase (khuếch đại gen) Cơ chế kháng này đã được nghiên cứu rộng rãi ở các muỗi

(diazinon, parathion) ở Lucilia sericata và Musca domestica Một đột biến

khác trong vị trí hoạt động E3 là nguyên nhân kháng dimethyl

organophosphate (malation) ở Musca domestica, Lucillia cuprina và ong ký sinh Anisopteromalus calandrae Ở những côn trùng này xuất hiện một đột biến tryptophan thành leucine ở M domestica và L cuprina và thành glycine

ở A calandrae [43]

Glutathione - S - ransferase

Các enzyme glutathione - S - transferase (GST EC 2.5.1.1) liên kết với glutathione vào hóa chất diệt côn trùng hoặc các sản phẩm chuyển hóa độc chất đầu tiên của nó (RX + glutathione → R-S-glutathione) [54] Lớp enzyme này rất quan trọng trong sự kháng đối với các chất diệt có nguồn gốc phốt pho hữu cơ và pyrethroid Các GST cũng xúc tác quá trình thủy phân Chlorin của DDT thành chất không độc DDE (1,1-dichloro-2,2-bis-(p-chlorophenyl)

26

ethane) (Hình 1.3) Các chỉ số tăng lên của quá trình thủy phân Chlorin của

DDT phù hợp với sự kháng DDT có ở nhiều loài côn trùng như Aedes aegypti, An gambiae và An dirus [61,87,88]

Hình 1.3 Cơ chế khử độc của DDT

Cytochrome 450 - monooxygenase độc lập

Các cytochrome 450 - monooxygenase độc lập (EC 1.14.14.1) đầu tiên tìm thấy ở mạng lưới nội chất và ti thể Để oxy hóa hóa chất diệt hệ thống P450 tạo ra flavoprotein P450 reductase để xúc tác việc chuyển điện tử từ NADPH (RH + O2 + NADPH +H+ → ROH +H2O + NADP+) Monooxygenases liên quan đến sự chuyển hóa của nhóm pyrethroid, hoạt hóa hoặc khử oxy trong nhóm phốt pho hữu cơ, nhưng ít có tác dụng đối với nhóm carbamat Monooxygenase là một phức họ các enzyme đóng vai trò

trong chuyển hóa chất sinh học lạ (xenobiotics) và trong chuyển hóa nội sinh (endogenous metabolism) Các monooxygenases P450 đóng vai trò quan

trọng trong việc thích nghi với hóa chất của côn trùng Sự gia tăng của enzyme này có liên hệ chặt chẽ với sự kháng hóa chất nhóm pyrethroid của

An stephensi, An subpictus, An gambiae và C quinquefasciatus Sự kháng

được tạo ra hoặc do mức độ biểu hiện tăng lên hoặc do một đột biến ở gen cấu trúc Sự kháng là kết quả của một đột biến ở gen quy định enzyme làm thay

27

đổi cấu trúc enzyme do đó tăng khả năng giải độc của nó hoặc tăng số lƣợng enzyme dẫn đến tăng sự đào thải độc tố hoá chất diệt côn trùng ra khỏi cơ thể chúng

1.4.2.3 Kháng do biến đổi vị trí đích (Target-Site Resistance)

Sự kháng này gây ra bởi sự biến đổi vị trí đích tác động của hoá chất diệt côn trùng Sự biến đổi đó đã đƣợc quan sát thấy ở các enzyme và cơ quan cảm nhận thần kinh, đó là điểm đích của một số lớp hoá chất diệt côn trùng

Có 3 hình thức kháng hoá chất diệt côn trùng bằng cách thay đổi vị trí đích nhạy cảm (Hình 1.4) [40, 42]

Hình 1.4 Cơ chế kháng do thay đổi vị trí đích ở mức độ phân tử

(theo Brogdon WG., 1998) [42]

A Đột biến ở một axit amin ở vùng màng cầu nối IIS6 của gen kênh vận chuyển

Na+ gây kháng DDT ở An gambiae

B Nhân tố điều hòa (phía trên trình tự mã hóa) hay còn gọi là “Barbie Box” cho phép cảm ứng các gen kháng mã hóa esterase và oxidase phân hủy hóa chất diệt côn trùng

C Đơn vị siêu sao chép A2-B2 Esterase Các gen Esterase kháng này nằm ở đầu 3‟ tới đầu 5‟ trong cùng một đơn vị khuyếch đại

Hình 1.5 Cơ chế tác động gây chết muỗi của 4 nhóm hóa chất

(WHO, 2006) [112]

Vị trí đích của các nhóm Phốt pho hữu cơ và Carbamate là enzyme

Acetylcholinesterase và vị trí đích của nhóm hóa chất Pyrethroid và

DDT là cổng điện thế của kênh vận chuyển ion natri (AChE: Enzyme

Acetylcholinesterase, ACh: Chất dẫn truyền thần kinh Acetylcholine,

ChAT: Enzyme vận chuyển Acetylcholine, vg-Na+ chanel: Kênh vận

chuyển ion natri, MACE: Enzyme Acetylcholine đã bị thay đổi, Kdr:

Kháng hạ gục)