nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở lúa việt nam

Trong đó, ứng dụng chỉ thị phân tử như RAPD, SSR, RFLP, AFLP được nghiên cứu và phát triển đã trở thành công cụ mạnh mẽ để phân tích đa dạng di truyền và xác định được sự khác biệt về mặ

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Thị Thu Trang

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN LIÊN QUAN

ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở LÚA VIỆT NAM

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÃ TUẤN NGHĨA

Hà Nội – Năm 2011

Trang 2

Lê Thị Thu Trang iii ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Mục lục ii

Danh mục bảng v

Danh mục hình minh họa vi

Danh mục chữ viết tắt vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Sự hình thành và đặc tính của đất mặn 4

1.2 Giới thiệu chung về đặc điểm vùng lúa nhiễm mặn ở Việt Nam 5

1.2.1 Đồng bằng sông Cửu Long 6

1.2.2 Đồng bằng Sông Hồng 6

1.3 Cơ sở di truyền tính chịu mặn ở lúa 7

1.3.1 Cơ chế chịu mặn của cây lúa 7

1.3.2 Di truyền tính chịu mặn 10

1.4 Công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn 11

1.4.1 Phương pháp truyền thống 11

1.4.2 Áp dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống lúa chịu mặn 12

1.5 Đa dạng di truyền 14

1.6 Chỉ thị trong đánh giá đa dạng di truyền 15

1.6.1 Chỉ thị hình thái 16

1.6.2 Chỉ thị hoá sinh 17

1.6.3 Chỉ thị phân tử ADN 18

1.7 Thành tựu trong nghiên cứu đa dạng di truyền lúa 28

1.7.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hình thái 28

1.7.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hoá sinh 29

1.7.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị ADN 30

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

Trang 3

Lê Thị Thu Trang iv ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN

2.1 Vật liệu 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu 38

2.2.1 Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa 38

2.2.2 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá lúa 40

2.2.3 Nhận dạng di truyền các giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR 41

2.2.4 Phân tích số liệu 43

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 Kết quả đánh giá tính chịu mặn của các giống/dòng lúa 44

3.1.1 Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm 44

3.1.2 Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa trong điều kiện nhà lưới 54

3.2 Kết quả tách chiết ADN tổng số 60

3.3 Kết quả phản ứng PCR và phân tích đa hình trên gel polyacrylamide 61

3.4 Quan hệ di truyền liên quan đến tính chịu mặn của các giống/dòng lúa 73

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78

TÀI LIỆU THAM KHẢO 80

PHỤ LỤC 93

Trang 4

Lê Thị Thu Trang v ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN

Danh sách 40 mẫu giống/dòng lúa trong nghiên cứu……

Danh sách các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu………

Tiêu chuẩn đánh giá (SES) ở giai đoạn tăng trưởng và phát triển (IRRI,1997)………

Tần số alen của 20 locut SSR………

Đa hình các locut SSR ở các giống lúa nghiên cứu…………

Trang 5

Lê Thị Thu Trang vi ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN

Danh mục hình

Hình 1.1:

Hình 1.2:

Hình 1.3:

Hình 1.4:

Hình 3.1:

Hình 3.2:

Hình 3.3:

Hình 3.4:

Hình 3.5:

Hình 3.6:

Hình 3.7:

Hình 3.8:

Hình 3.9:

Hình3.10:

Hình 3.11:

Hình 3.12:

Hình ảnh lúa ngập mặn………

Các cơ chế chịu mặn ưu thế ở lúa………

Nguyên lý phản ứng PCR………

Đa hình ADN SSR giữa hai cá thể có motif (AT)n………

Thí nghiệm thanh lọc mặn các giống/dòng lúa nghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm… …………

Đồ thị biểu diễn tỷ lệ % mức chống chịu mặn của 40 giống/dòng lúa nghiên cứu trong dung dịch Yoshida có NaCl với E=6dS/m và EC=16dS/m………

Thí nghiệm xử lý mặn các giống/dòng lúa trồng trong đất……

Biểu đồ biểu diễn % tỷ lệ sống sót của các giống/dòng lúa nghiên cứu trồng trong đất có NaCl với EC=6dS/m, EC=12dS/m………

Đồ thị biểu diễn tỷ lệ % mức chống chịu mặn của 40 giống/dòng lúa nghiên cứu trồng trong đất có NaCl với EC=6dS/m và EC=12dS/m………

Kết quả tách chiết ADN tổng số lúa………

Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR- RM339………

Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR- RM201……….………

Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR- RM202 ………

Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ Trang 5 8 19 25

44

53

54

55

60

61

62

Trang 6

Lê Thị Thu Trang vii ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN

Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR-RM214………

Biến động kích thước của các alen tại locut SSR khảo sát……

Kết quả phản ứng PCR của 40 giống/dòng lúa với 20 cặp mồi SSR………

Sơ đồ cây phân loại 40 giống/dòng lúa bằng phương pháp UPGMA………

Trang 7

Lê Thị Thu Trang viii ĐH Khoa học Tự nhiên -

Conformation Sensitive Gel Electrophoresis Cetyl trimethylammonium bromide

DNA Amplification Fringerprinting Deoxyribonucleic acid

Deoxy nucleotide triphosphates Ethylenediaminetetraacetic acid Expressed sequence tag

Ethidium bromide Inter-simple sequence repeat Molecular Assisted Selection Polymerase Chain Reaction Polymorphism Information Content Random Aplification Polymorhism DNA Restriction Fragment length Polymorphism Single Nucleotide Polymorphism

Simple sequence repeat Sequence-tagged microsatellite site marker Sequence- tagged site

Tris-Acetic acid- EDTA N,N,N’,N’- Tetraethyl methylendiamine Variable Number of Tandem Repeat

Trang 8

Lê Thị Thu Trang 1 ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN

MỞ ĐẦU

Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực chiếm vị trí quan trọng hàng đầu ở

nhiều nước trên thế giới và là cây trồng chủ đạo trong nền nông nghiệp Việt Nam [7,8] Tuy nhiên, cây lúa lại là cây trồng nhạy cảm với độ mặn Năng suất lúa tại nhiều khu vực trồng lúa đang giảm dần do mặn làm tổn hại mà trong đó nước mặn xâm thực vào nước tưới và đất trồng lúa là một trong những nguyên nhân quan trọng Ước tính diện tích đất bị nhiễm mặn trên toàn thế giới lên tới 1 tỷ ha Chỉ riêng Châu Á khoảng 21,5 triệu ha đất bị nhiễm mặn (Flower và Yeo, 1995)

Ở Việt Nam diện tích đất canh tác ngập mặn khoảng 200.000ha [1] Mặt khác do tập quán và nhu cầu mở rộng canh tác đổi mới ngành nghề như nuôi trồng thuỷ sản vô tình làm tăng thêm diện tích đất ngập mặn cũng như độ mặn tăng lên khoảng từ 0,3-0,4% thậm chí còn cao hơn cả chục lần [14] Hơn nữa, nghề trồng lúa

ở vùng nhiễm mặn đang phải đối mặn với sự tác động của biến đổi khí hậu Theo báo cáo về Chỉ số rủi ro khí hậu toàn cầu năm 2010 do tổ chức Germanwatch công

bố tại Đan Mạch thì Việt Nam là một trong 10 quốc gia bị thiệt hại nhiều nhất do biến đổi khí hậu gây ra, các quốc gia khác đó là: Bangladesh, Myama, Honduras, Nicaragoa, Haiti, Ấn Độ, Cộng hoà Đôminica, Philippines và Trung Quốc Theo kết quả nghiên cứu và dự báo của Uỷ ban liên chính phủ về biến đổi khí hậu của Liên hiệp quốc (IPPC) và Ngân hàng thế giới thì trong vòng 100 năm tới, nước biển sẽ dâng 1m, nhiệt độ sẽ tăng thêm 2 độ C Nếu nước biển dâng cao 1m thì vùng đồng bằng sông Cửu Long sẽ có 1,5- 2 triệu ha đất nông nghiệp bị ngập nước, còn ở vùng đồng bằng sông Hồng sẽ có 1668 km2 đất bị ngập, trong đó có khoảng 0,3- 0,5 triệu

ha đất chủ yếu là đất lúa bị ngập

Trước những biến đổi nghiêm trọng đó, trồng các giống lúa chống chịu tốt với mức nhiễm mặn cao sẽ là giải pháp để khắc phục các hiện tượng trên Các biện pháp như xây dựng công trình thuỷ lợi bao đê ngăn chặn hay bón các loại phân hữu

cơ vào đất (bón vôi, thạch cao để cải thiện cấu trúc đất, cày sâu cải thiện tính thoát nước tốt nhằm giảm đóng váng trên mặt đất) thường tốn kém và hiệu quả không cao

Trang 9

[31] Tuy nhiên phần lớn các giống lúa có khả năng chịu tốt thì năng suất lại thấp, tính thích nghi kém Do đó, hướng lai tạo tập trung vào chuyển gen chống chịu mặn

ở giống lúa chịu mặn tốt và một số giống lúa mang đặc tính ưu việt về năng suất, chất lượng đang được phát triển Thông thường phải mất đến 3-4 năm lai tạo để chuyển gen Ngoài ra, một khó khăn thường gặp trong lai tạo giống mới là đôi khi

có mối liên hệ khá chặt chẽ giữa tính trạng chống chịu mặn với các tính trạng xấu, không mong muốn thường được lai chuyển vào các con lai cùng một lúc Các gen điều khiển tính trạng mong muốn này ảnh hưởng xấu đến biểu hiện của con lai Do

đó lai tạo tính trạng chống chịu mặn có thể kéo dài đến 10- 15 năm để phát triển một giống lúa mới [29] Vì vậy, phương pháp lai tạo truyền thống thường khó, mất nhiều thời gian và không hiệu quả

Ngày nay, nhờ tiến bộ của công nghệ sinh học nên công tác chọn tạo giống đã trở lên hiệu quả hơn Trong đó, ứng dụng chỉ thị phân tử như RAPD, SSR, RFLP, AFLP được nghiên cứu và phát triển đã trở thành công cụ mạnh mẽ để phân tích đa dạng di truyền và xác định được sự khác biệt về mặt di truyền của quần thể giống khởi đầu, từ đó xác định các cặp lai có khoảng cách di truyền phù hợp có thể cho ưu thế lai cao nhất Việc tiếp cận ở mức độ phân tử cho phép đánh giá các giống bố mẹ một cách chính xác, không bị tác động bởi điều kiện ngoại cảnh, rút ngắn thời gian

và nâng cao hiệu quả công tác lai tạo Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở lúa Việt Nam” với mục tiêu chính là xây dựng cơ sở dữ liệu ADN và tính chịu mặn của

các giống/dòng lúa nghiên cứu nhằm góp phần quan trọng cho việc khai thác nguồn gen chịu mặn và định hướng cho chọn tạo giống lúa chịu mặn ở Vi ệt Nam

Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi đã tiến hành những nội dung nghiên cứu sau:

1 Đánh giá khả năng chịu mặn của các mẫu giống/dòng lúa nghiên cứu

2 Nhận dạng di truyền các mẫu giống/dòng lúa nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử SSR

Trang 10

3 Phân tích, đánh giá sự đa dạng di truyền của các mẫu giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR

Kết quả của đề tài góp phần tạo cơ sở khoa học để xây dựng phương pháp đánh giá đa dạng di truyền và phân loại nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở các giống/dòng lúa, hỗ trợ đắc lực cho công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn mới có năng suất cao, chất lượng tốt

Trang 11

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Sự hình thành và đặc tính của đất mặn

Hiện nay, diện tích đất nhiễm mặn chiếm 7% diện tích toàn thế giới Đất bị ảnh hưởng mặn ở đại lục thuộc Châu Âu và Bắc Mỹ rất ít có khả năng trồng trọt Ở châu Á, hơn 80% đất bị ảnh hưởng mặn có khả năng trồng trọt và đã khai thác cho sản xuất nông nghiệp Ở Châu Phi và Nam Mỹ, khoảng 30% đất bị nhiễm mặn có khả năng trồng trọt Hiện tượng nhiễm mặn là mối đe doạ lớn nhất đến việc gia tăng sản lượng lương thực của các quốc gia Châu Á [32]

Nguyên nhân phát sinh mặn do nhiều yếu tố, một là mặn ven biển hoặc vùng cửa sông do nước biển xâm thực vào mùa khô, có thể trồng trọt bình thường trong mùa mưa; hai là mặn bên trong đất do mao dẫn từ tầng dưới lên có thể do phá rừng, không có tán che phủ

Đất mặn là đất có độ dẫn điện (EC) từ 4dS/m trở lên ở 25oC, phần trăm sodium trao đổi ESP kém hơn 15, pH nhỏ hơn 8,5 [5] Trong đất chứa một lượng muối hoà tan trong nước ở vùng rễ cây, làm ảnh hưởng đến hoạt động sinh trưởng của cây trồng Mức độ thiệt hại của đất mặn tuỳ thuộc vào loài cây trồng, giống cây, thời gian sinh trưởng, các yếu tố môi trường và tính chất của đất

Đất mặn được phân thành hai loại: (1) đất mặn nhiều; (2) đất mặn ít và trung bình

(1) Đất mặn nhiều (Hyper Salic Fluvisols) chiếm 0,03% diện tích đất tự nhiên Đất được hình thành do sự bồi tụ của phù sa sông, biển hoặc hỗn hợp sông biển, nhưng do phân bố ở địa hình thấp, ven đầm phá, chịu trực tiếp của nguồn nước mặn nên đất bị mặn nhiều (hàm lượng Cl- dao động từ 0,05- 0,15%) Đất thường có màu tím hoặc nâu, hơi xám đen Thành phần cơ giới rất khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc đất bị mặn Nơi đất cát bị mặn thì có thành phần cơ giới nhẹ, nơi đất phù

sa bị mặn thì thành phần cơ giới lại rất nặng Đất có phản ứng ít chua đến trung bình, nghèo mùn, đạm tổng số nghèo đến trung bình, nghèo lân tổng số, nồng độ

Trang 12

Ca2+ và Mg2+ khá Loại đất này có độ mặn cao, có thể dùng để trồng cói hoặc nuôi trồng thủy sản, nếu giải quyết được có nước ngọt và chọn được giống lúa chịu mặn thì có thể trồng lúa 1 vụ hoặc 2 vụ [5]

(2) Đất mặn ít và trung bình (Molli Salic Fluvisols): Diện tích chiếm khoảng 1,22% diện tích đất tự nhiên, phân bố tập trung ở ven đồng bằng tiếp giáp vùng đất mặn nhiều, ven sông lớn hoặc các kênh rạch, đầm phá Loại đất này có địa hình cao hơn, được hình thành do ảnh hưởng của mạch nước ngầm mặn hoặc do ảnh hưởng của nguồn nước mặn tràn vào không thường xuyên Hình thái phẫu diện thường có màu xám hơi tím hoặc nâu tím nhạt, các lớp dưới có màu xám nâu hoặc xám xanh Thành phần cơ giới cũng rất khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc phát sinh [5]

1.2 Giới thiệu chung về đặc điểm vùng lúa nhiễm mặn ở Việt Nam

Ở Việt Nam, đất nhiễm mặn tập trung ở vùng đồng bằng Sông Hồng và đồng bằng Sông Cửu Long Tổng diện tích đất nhiễm mặn khoảng 1triệu ha, trong đó 139.610 ha đất mặn nhiều, tập trung ở vùng đồng bằng Sông Cửu Long khoảng 102.000ha, vùng Đông Nam Bộ khoảng 19.590ha, duyên hải miền Trung 11.420ha, khu IV cũ 6.600ha Đất mặn trung bình và ít có diện tích 722.580 ha, trong đó ở vùng đồng bằng Sông Hồng với diện tích 586.420ha, đồng bằng Sông Cửu Long là 53.300ha, Khu IV cũ 38.350ha, duyên hải miền Trung 35.560ha và một ít ở Đông Nam Bộ (theo Hội Khoa học Đất Việt Nam, 2002)

Hình 1.1: Hình ảnh lúa ngập mặn

Trang 13

1.2.1 Đồng bằng sông Cửu Long

Đồng bằng sông Cửu Long có nhiệt độ khí hậu trung bình hàng năm trên

27-28oC, Số giờ nắng trung bình là 6giờ/ngày Năng lượng bức xạ năm đạt 80Kcal/cm2 Lượng mưa trung bình hàng năm toàn vùng là 1.520-1.800mm, phân

75-bố không đều theo thời gian và không gian Mưa lũ tập trung vào tháng 5 đến tháng 10; lượng mưa chiếm khoảng 90% lượng mưa cả năm Do đó, thuỷ triều có ảnh hưởng rất lớn đến toàn bộ đồng bằng sông Cửu Long Nước mặn từ biển tràn vào sâu trong đất liền vào mùa khô Các vùng lúa ven biển đồng bằng sông Cửu Long đều bị nhiễm mặn Mức độ xâm nhập mặn tuỳ thuộc vào sự xâm nhập mặn của nước biển và tuỳ vào mùa trong năm, cao điểm vào khoảng tháng 3-4 là các tháng

có lượng mưa ít [1] Theo Lê Sâm (2003), đồng bằng sông Cửu Long có khoảng 1,8-2,1 triệu ha đất tự nhiên chịu ảnh hượng của mặn tập trung ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Kiên Giang, Trà Vinh, Sóc Trăng, Bến Tre, phần lớn là đất bị nhiễm mặn kết hợp với phèn, ngập nước

Bộ Nông nghiệp và PTNT (2001) chia vùng đồng bằng sông Cửu Long ra làm 6 vùng: vùng ven và giữa sông Tiền và sông Hâu, vùng Đồng Tháp Mười, vùng Tây sông Hậu, vùng Tứ giác Long Xuyên, vùng Bán đảo Cà Mau, vùng ven biển Đông Trong đó các vùng bị ảnh hưởng mặn chính là:

Vùng bán đảo Cà Mau: diện tích tự nhiên là 946.000ha Diện tích đang sử

dụng 676.000ha, gồm các loại đất: đất mặn và đất phèn chua Yếu tố chính ảnh hưởng đến sản xuất của vùng là thiếu nước ngọt và ảnh hưởng mặn

Vùng ven biển Đông: diện tích tự nhiên 1.073.000ha Diện tích đang sử dụng

844.000ha, gồm các loại đất phù sa, đất mặn và đất cát giồng Yếu tố chính ảnh hưởng đến sản xuất của vùng là không ngập lũ, thiếu nước ngọt và ảnh hưởng của mặn

1.2.2 Đồng bằng Sông Hồng

Sự nhiễm mặn tại các cửa sông thuộc các tỉnh đồng bằng Sông Hồng lên cao

và xâm nhập vào trong nội địa từ 30-40km làm cho diện tích nhiễm mặn lên tới

Trang 14

100.000ha ở một số tỉnh: Hải Phòng, Nam Định, Thái Bình, Ninh Bình, Thanh Hoá… Trong đó, diện tích đất mặn ở tỉnh Thái Bình khoảng 18.000ha tập trung chủ yếu ở các huyện Thái Thuỵ, Tiền Hải, Kiến Xương… Tỉnh Hải Phòng khoảng 20.000ha tập trung ở huyện Tiên Lãng, Vĩnh Bảo, Kiến Thuỷ… Tỉnh Thanh Hoá có khoảng 22.000ha đất nhiễm mặn ở các huyện Hậu Lộc, Hà Trung, Hoằng Hoá… Ở Nam Định có khoảng 10.000ha chủ yếu ở các huyện Nghĩa Hưng, Xuân Trường, Giao Thuỷ… Các giống lúa mùa địa phương trước đây thường được gieo trồng là : Cườm, Nhộng, Tẻ Tép, Chiêm Bầu …năng suất thấp, chỉ đạt 18-20tạ/ha Gần đây một số giống chịu mặn trung bình như: Mộc Tuyền X21, VD97… cho năng suất khá cao nhưng có dạng hình cây yếu, ít chịu phân, cao cây, lá lướt Dọc theo ven biển miền Trung đất cũng bị nhiễm mặn như Hà Tĩnh có khoảng 17.919ha, Quảng Bình có hơn 9.300ha, Ninh Thuận có gần 2300ha Các giống lúa địa phương thường được canh tác tại các vùng này là: Thuận Yến, nếp Bờ Giếng, Trắng Điệp

Như vậy, đất nhiễm mặn là một trong những yếu tố gây khó khăn chính cho nghề trồng lúa ở Việt Nam Những năm gần đây, xu hướng chuyển đổi từ trồng lúa sang nuôi tôm nước lợ nhiễm mặn ở các tỉnh ven biển đã làm cho một số vùng lúa lân cận trở nên bị nhiễm mặn, gây ảnh hưởng xấu đến sản lượng lúa

1.3 Cơ sở di truyền tính chịu mặn ở lúa

1.3.1 Cơ chế chịu mặn của cây lúa

Lúa là cây lương thực thích hợp nhất trên đất mặn, dù nó luôn được đánh giá

là nhiễm mặn trung bình với mặn Vì đất mặn luôn ở dưới điều kiện bị ngập nước, những cây trồng khác không thể sinh trưởng được ngoại trừ lúa [26] Theo Ponnamperuma (1984) cây lúa chịu mặn trong suốt giai đoạn nẩy mầm; giai đoạn sinh trưởng dinh dưỡng; giai đoạn chín nhưng lại bị nhiễm trong giai đoạn mạ non

và giai đoạn thụ phấn Tuy nhiên, một nghiên cứu khác cho rằng, tại giai đoạn trỗ, cây lúa không mẫn cảm với mặn [26] Do đó, sinh trưởng và phát triển của cây lúa phải được chia ra nhiều giai đoạn để nghiên cứu một cách đầy đủ về cơ chế chống chịu mặn của lúa

Trang 15

Trong điều kiện nhiễm mặn cao cây lúa sẽ chết, tuy nhiên trong môi trường mặn trung bình đến thấp chỉ ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, phát triển của cây Hầu hết các cây bị mặn làm tổn hại thường có những triệu chứng biểu hiện như trắng đầu lá sau đó cháy, đẻ nhánh kém, sinh trưởng còi cọc, tỉ lệ hạt lép cao, số hạt/bông ít, thay đổi thời gian trỗ, rễ sinh trưởng kém, cuốn lá và năng suất thấp Bên cạnh đó, cây lúa cũng có thay đổi sinh lý và sinh hoá dưới điều kiện mặn cao biểu hiện như vận chuyển Na+ cao đến đỉnh sinh trưởng, tích lũy natri nhiều hơn ở các lá già, hút Cl- , hút K+, P và Zn thấp, trọng lượng tươi và trọng lượng khô của đỉnh và rễ thấp…

Hình 1.2: Các cơ chế chịu mặn ưu thế ở lúa Nghiên cứu sự tác động của yếu tố mặn làm tổn hại đến lúa cho thấy do cây tích lũy quá nhiều ion Na+ và Cl-; mà ion Na+ lại có tác động phá vỡ và cản trở vai trò sinh học của tế bào chất trong cây [85] Ngược lại những cây được xem là chịu mặn (kháng mặn) thì nó có khả năng giảm hấp thu Na+ và gia tăng hấp thu

K+ để duy trì cân bằng lượng natri và kali trong cây bởi ion K+ có vai trò làm kích hoạt các enzyme và đóng, mở khí khổng tạo ra tính chống chịu mặn của cây

Trang 16

[70] Bên cạnh đó, vai trò của kẽm (Zn) trong chồi cũng có liên quan đến tính chịu mặn của cây lúa Khi hàm lượng kẽm trong chồi cao thì tính chống chịu mặn cao Điều này được giải thích là do kẽm làm gia tăng hàm lượng nitơ trong chồi, dẫn đến việc sinh trưởng nhanh hơn và năng suất lúa cao hơn trong điều kiện mặn [26] Như vậy giống lúa chịu mặn sẽ duy trì nồng độ Na+ và Cl- thấp, nồng độ của K+ và Zn2+ cao hơn và tỷ lệ Na+/K+ thấp trong mầm lúa

Kết quả nghiên cứu của Flowers và Yeo (1988) cho thấy, có mối tương quan giữa số lượng muối được đi vào rễ cây lúa với nồng độ muối trên chồi Mối quan hệ này được xác định bởi mối quan hệ giữa tốc độ sinh trưởng của chồi với sự di chuyển thực của những ion ngoài rễ Giá trị này là số lượng thực của những ion được di chuyển tới chồi trên đơn vị trọng lượng của rễ trong một đơn vị thời gian Bằng chứng là ở giống lúa Pokkali (giống chống chịu mặn), hàm lượng natri ở chồi trung bình thấp hơn của giống IR29 (giống nhiễm mặn) Bởi vì hàm lượng natri ở chồi của giống lúa Pokkali được pha loãng do sự sinh trưởng dinh dưỡng nhanh của

nó Với cơ chế này, cây hấp thu muối nhưng sẽ làm loãng muối nhờ tăng cường tốc

độ phát triển nhanh và gia tăng hàm lượng nước trong chồi

Khi cây lúa bị ảnh hưởng của mặn thì diện tích lá sẽ giảm, trọng lượng khô của chồi và của rễ sẽ giảm tương ứng với độ mặn Ở giai đoạn mạ, lá già hơn sẽ mất khả năng sống sót hơn lá non [39] Khi phân tích trên lá lúa sống trong môi trường mặn có sự chênh lệch hàm lượng muối từ lá cây này sang lá cây khác, muối luôn được tích lũy với nồng độ cao trong lá già và hiện tượng chết ở lá già là một cơ chế loại muối ra khỏi cây Như vậy, rụng lá là một hiện tượng thông thường ở cây lúa

để chống chịu mặn Mặt khác, nghiên cứu nồng độ Na+ trong các lá lúa cho thấy có

sự thay đổi rõ rệt về hàm lượng Na+ từ những lá non sang những lá già; ion Na+tích lũy cao nhất ở những lá già nhất và giảm dần trên những lá non nhất

Các cơ chế nêu trên cho thấy khi cây lúa bị nhiễm mặn nồng độ Na+ trong các mô chức năng bị giảm đi, do đó làm giảm tỷ lệ Na+/K+ trong chồi Tỷ lệ Na+/K+trong chồi được xem như là chỉ tiêu chọn lọc giống lúa chịu mặn

Trang 17

1.3.2 Di truyền tính chịu mặn

Nghiên cứu di truyền về tính kháng mặn ở lúa cho thấy rằng nó được điều khiển bởi nhiều gen và muốn chọn tạo giống lúa chịu mặn có hiệu quả, cần phải nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền nhằm xác định rõ các gen điều khiển tính chịu mặn, từ đó giúp chúng ta chủ động và khai thác hiệu quả nguồn gen trong chọn tạo giống lúa chịu mặn [25, 50]

Qua những thí nghiệm đánh giá tính chống chịu mặn ở giai đoạn mạ trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida có độ mặn tương đối cao với độ dẫn điện (EC)= 12dS/m, tính trạng chiều dài chồi, hàm lượng Na và K ở trong chồi, trọng lượng khô của chồi và rễ thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa giống kháng mặn và giống nhiễm mặn, các tính trạng này chủ yếu được điều khiển qua hoạt động của nhóm gen cộng tính và hệ số di truyền tính chống chịu của tính trạng này rất thấp [80] Ở giai đoạn trưởng thành, tính trạng chiều cao cây, năng suất của lúa trong điều kiện mặn được điều khiển bởi nhóm gen cộng tính [57]

Khi phân tích di truyền số lượng về tính trạng chống chịu mặn được thông qua hàm lượng Na+, K+; tỷ lệ Na+/K+ và điểm chống chịu mặn cho thấy nó được kiểm soát bởi 2 nhóm gen cộng tính và không cộng tính Tính trạng thể hiện khả năng hấp thu K+ được kiểm soát bởi gen đối xứng Nghiên cứu của Gregorio và Senadhira (1993) còn cho thấy, tính trạng tỷ lệ Na+/K+ thấp còn thể hiện ảnh hưởng siêu trội và được điều khiển bởi ít nhất hai nhóm gen trội Một số nghiên cứu cho thấy chiều dài bông và khối lượng 1000 hạt ít bị tác động bởi các yếu tố môi trường; trong khi đó khối lượng bông, số hạt chắc trên bông chịu tác động lớn bởi tác động của môi trường và 3 tính trạng này đóng góp phần lớn trong việc tăng năng suất lúa trong môi trường mặn [61]

Qua nhiều nghiên cứu di truyền phân tử tính kháng mặn, bản đồ QTL( Quantitative Trait Loci)/gen được xây dựng trên cơ sở chỉ thị AFLP và STS cho thấy, gen chủ lực điều khiển tính trạng chống chịu mặn định vị trên nhiễm sắc thể

số 1 Bên cạnh gen chủ lực Saltol, 3 QTL được ghi nhận có quan hệ với tính trạng

Trang 18

hấp thu K cao, 4 QTL có quan hệ với tính trạng hấp thu Na thấp và 3 QTL có quan

hệ với tính trạng tỷ số Na/K thấp Những QTL này định vị trên nhiễm sắc thể số 1,

3, 4, 10 và 12 [27, 52, 65]

1.4 Công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn

Hiện nay, công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn có thể là hợp lý và ít tốn kém cho các vùng canh tác nhiễm mặn Ngoài một số phương pháp truyền thống (chọn lọc cá thể, đột biến ) với sự pháp triển của khoa học kỹ thuật- nhất là công nghệ sinh học nhiều công nghệ mới đã được áp dụng cho hiệu quả vượt trội so với các phương pháp truyền thống

1.4.1 Phương pháp truyền thống

Chương trình lai tạo giống lúa chịu mặn ở các nước trên thế giới đều dựa trên yêu cầu thực tế của từng nơi nhưng đều hướng tới mục tiêu nâng cao tính chịu mặn, năng suất và cải thiện chất lượng Các phương pháp lai tạo giống lúa chịu mặn truyền thống như chọn lọc cá thể, lai giống, đột biến, chọn giống ưu thế lai được áp dụng khá phổ biến

Nhiều giống lúa chịu mặn đã được chọn tạo và canh tác hiệu quả trên thế giới Trong những năm 1977- 1980, Viện nghiên cứu lúa quốc tế đã tiến hành chọn được những dòng chịu mặn tốt như IR4595-4-1, IR 42, IR9894-54-3, năng suất đạt 3,6 tấn/ha cao hơn so với giống lúa cổ truyền 2 tấn/ha [70] Các giống lúa chịu mặn do Viện nghiên cứu lúa quốc tế lai tạo và hợp tác với các quốc gia trong mạng lưới đang được phát triển như PSBRC84, PSBRC88 ở Bangladesh, giống CRS27, CRS10 ở Ấn Độ [5] Năm 1993, IRRI phát triển giống lúa IR66946, một giống lúa chịu mặn khá tốt từ tổ hợp lai của Pokkali/IR29 Từ đó hướng lai tạo tập trung vào lai chuyển gen chống chịu mặn từ Pokkali và một số giống lúa mùa địa phương có tính chống chịu mặn bằng phương pháp lai hồi giao các nguồn giống lúa cao sản thích nghi với từng vùng sinh thái trồng lúa riêng biệt [45]

Ở Việt Nam, nhiều giống lúa chống chịu mặn như OM732, OM861,

Trang 19

OM1314, OM 1490, OM2031, OM1314, OM576, IR42, OM344, OM924, Trắng Điệp, Móng Chim Rơi, Móng Chim, Nếp Áo Già, Nếp Bờ Giếng, Nàng Quốc

Đỏ, Rồng Xanh, Đốc Phụng, Nhỏ Đỏ, Tám Vuốt, TD2, Thuận Yến, nếp Bờ Giếng, Trắng Điệp, X19, VD97, VD920, CM6 v.v đã được triển khai ở vùng đồng bằng sông Cửu Long và Sông Hồng [3, 5, 20]

Từ năm 2001-2005, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm đã nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn cho các vùng lúa ven biển phía Bắc và đã tạo ra giống lúa chịu mặn M6 (Bầu Hải Phòng/1548) và một số giống khác như MT6, MT163, BM9855, BM9820 và BM9830 Các giống này tỏ ra thích ứng trên các chân đất ven biển và vùng bị nhiễm phèn mặn ở phía Bắc Ngoài ra Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm cũng đã chọn lựa được 44 giống/dòng lúa chịu mặn, trong đó 15 giống/dòng lúa có khả năng chịu mặn cao và 10 giống/dòng lúa

có khả năng chịu mặn trung bình đang được sử dụng trong công tác chọn lọc giống lúa chịu mặn [8] Bên cạnh đó Viện Di truyền Nông nghiệp đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong cải tạo một số giống lúa địa phương vùng đồng bằng ven biển Bắc bộ Kết quả gây đột biến nguồn Coban (Co60) đã chọn được các giống lúa CM1 và CM5 là những giống chịu mặn tốt, cứng cây, kháng bệnh

và cho năng suất cao

Do đặc điểm di truyền và nông sinh học của cây lúa mà phương pháp lai tạo truyền thống thường tốn nhiều thời gian và công sức (3-4 năm lai tạo) Đôi khi trong quá trình lai tạo giống mới có các tính trạng không mong muốn được lai chuyển vào con lai cùng lúc, các gen điều khiển tính trạng không mong muốn này ảnh hưởng xấu đến biểu hiện của con lai Vì vậy, thời gian để phát triển một giống lúa chịu mặn mới có thể mất đến hơn 10 năm [29]

1.4.2 Áp dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống lúa chịu mặn Trong những năm gần đây, công nghệ sinh học được áp dụng mạnh mẽ trong công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn Nhằm khắc phục những điểm yếu của phương pháp truyền thống, công nghệ sinh học đã hỗ trợ hoặc thay thế một số công

Trang 20

đoạn trong quá trình lai tạo giống, phổ biến nhất là hai mảng công nghệ chỉ thị phân

tử và nuôi cấy mô tê bào

Năm 2002, Gregorio và cs tiến hành nuôi cấy tế bào soma lúa để tạo các biến dị soma chống chịu mặn đã thu được dòng biến dị soma TCCP226-2-49-B-B-3 chịu mặn cao từ giống lúa Pokalli Đặng Minh Tâm và Nguyễn Thị Lang (2003) nuôi cấy mô 10 giống, bao gồm lúa mùa địa phương và cao sản chống chịu mặn khá (cấp 3-5), trong môi trường có chứa NaCl ở mức 1,0 và 1,5% cho tỷ lệ cây tái sinh cao Ngô Đình Thức (2006) ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và nuôi cấy túi phấn trong chọn tạo giống lúa chịu mặn Kết quả tạo được 8 dòng biến dị soma từ OM576, IR64, Basmati và VD20 có khả năng chống chịu mặn ở cấp 5 khi thanh lọc

ở giai đoạn mạ với EC=12dS/m Từ nuôi cấy túi phấn từ 12 tổ hợp lai, 12 dòng cây xanh lưỡng bội có khả năng chống chịu mặn ở cấp 5 khi thanh lọc ở giai đoạn mạ với EC=12dS/m được tuyển chọn

Với mục tiêu nhằm làm chủ việc khai thác các gen qui định tính chịu mặn trong công tác chọn tạo giống lúa một cách hiệu quả, các nhà khoa học đã tiến hành phân tích xác định những QTL/gene điều khiển tính chịu mặn và chỉ thị liên kết với gene để sử dụng theo hướng chọn giống nhờ chỉ thị phân tử Trong nhiều năm qua, một số nghiên cứu của: Bonille et al (2002) và Niones (2004) đã xác lập bản đồ QTL/gen (gen Saltol) nằm trên nhiễm sắc thể số 1, đóng góp tới 65% tính chống chịu mặn của lúa Lin et al., (1998) đã phát hiện QTL qui định tính chịu mặn nằm trên nhiễm sắc thể số 5 Sử dụng chỉ thị RFLP và SSR, Singh et al., 2007 đã lập bản

đồ QTL tính chịu mặn ở lúa Mohammadi-Nejad et al (2008) đã sử dụng 33 chỉ thị SSR trên nhiễm sắc thể số 1 để xác định khoảng cách liên kết của các chỉ thị này với gen Saltol Trong số 33 chỉ thị, có 6 chỉ thị gồm: RM10745, RM1287, RM8094, RM3412, RM493 và RM140 liên kết với gen Saltol ở khoảng cách 10.8 đến 12.28Mb; gen Saltol có thể liên kết gần nhất với các chỉ thị: RM8094 và RM10745 Các giống lúa: IR70023, IR65858, IR69588, IR74105, IR71832, IR74099, Cherivirrupo và IR66946-3R-178-1-1 (FL478) có sản phẩm PCR giống như sản phẩm PCR của Pokkalikhi được nhân bản bởi Marker RM8094 và cho tính chống

Trang 21

chịu rất tốt hoặc tốt đối với mặn Tác giả cũng khuyến cáo việc sử dụng hai chỉ thị RM8094 và RM10745 trong xác định kiểu gen của cây lúa chống chịu mặn có mang gen Saltol trong các chương trình lai tạo lúa chịu mặn

Ở Việt Nam, ứng dụng marker phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn cũng được phát triển Năm 2000, Vương Đình Tuấn và cs đã xác định được 3 chỉ thị RFLP đó là: R1928, R674 và G257 liên kết với các QTL điều khiển tính chịu mặn trên các nhiễm sắc thể số 1, 6 và 11 BùiChí Bửu và cs (2000) sử dụng 30 chỉ thị SSR để lập bản đồ gen cho tính chống chịu mặn của quần thể F3 gồm 257 cá thể phân ly, phát triển từ tổ hợp lai IR28/Đốc Phụng và đã xác định được chỉ thị RM223 liên kết với gen chịu mặn với khoảng cách là 6.3cM trên nhiễm sắc thể số 8 RM223 nhân bản đoạn DNA kích thước 120bp, liên kết với gen chống chịu mặn, từ giống Đốc Phụng và sản phẩm PCR có kích thước 160bp từ giống nhiễm IR28 Hai chỉ thị OSR1 và RM315 liên kết với QTL chịu mặn ở lúa, định vị trên nhiễm sắc thể

số 1 [63]

1.5 Đa dạng di truyền

Đa dạng sinh học là vấn đề rất được quan tâm hiện nay Giữ gìn và bảo tồn đa dạng sinh học là mục tiêu sống còn trong việc duy trì cân bằng sinh thái, đảm bảo môi sinh của các sinh vật trên trái đất, trong đó có con người Khái niệm đa dạng sinh học được hiểu theo nhiều cấp, đó có thể là sự đa dạng của các quần xã sinh vật trong hệ sinh thái, là sự đa dạng giữa các loài trong quần xã hay

sự đa dạng ở cấp độ di truyền giữa các cá thể trong cùng một loài Mặc dù là cấp

độ thấp nhất, nhưng đa dạng di truyền lại có vai trò vô cùng quan trọng trong tiến hoá và thích nghi của các sinh vật, mọi biến động ở cấp độ đa dạng di truyền đều có tác động đến những cấp độ cao hơn và cuối cùng là ảnh hưởng đến đa dạng sinh học [76]

Đa dạng di truyền là sự thể hiện phong phú ở nguồn gen và kiểu gen trong mỗi loài Mỗi loài có một bản đồ nhiễm sắc thể và số lượng nhiễm sắc thể khác nhau, cho nên hiếm có các cá thể của cùng một loài hoặc cùng một giống có trật

Trang 22

tự các gen trong hệ gen giống hệt nhau Trong quá trình tiến hoá, các nhiễm sắc thể luôn biến đổi từ nhiễm sắc thể tâm cân đến nhiễm sắc thể tâm lệch và hơn nữa là sự có mặt của thể kèm Mỗi một sự biến đổi bên trong của cơ thể đều được thể hiện ra bên ngoài để tạo ra các dạng khác biệt nhau [19]

Những nghiên cứu trước về mức độ đa dạng di truyền chủ yếu dựa trên các đặc điểm hình thái Với các phương pháp phân tích mới, người ta đã thấy rằng biến dị di truyền bên trong loài được cấu trúc có thứ bậc giữa các nhóm có đặc hiệu bên trong như dưới loài, thứ và quần thể Xét về thực chất, mức độ đa dạng di truyền phụ thuộc vào số lượng và sự khác biệt của các gen bên trong loài Nếu biến dị xảy ra giữa các alen bên trong locut và tế bào thì được gọi là dị hợp tử và biến đổi như vậy ở các tế bào đa bội có thể lớn hơn các tế bào lưỡng bội Mức độ khác biệt giữa các locut trong tế bào lớn hay nhỏ phụ thuộc vào việc các gen có được lặp lại trong hệ gen hay không

Nghiên cứu đa dạng di truyền có vai trò và ý nghĩa rất quan trọng trong chọn giống Từ những kết quả đánh giá đa dạng di truyền, các nhà khoa học có thể chọn lọc và bảo tồn các nguồn gen quý nhằm duy trì đa dạng sinh học hoặc

hỗ trợ cho quá trình lai tạo giống thông qua chọn lựa các cặp bố mẹ trong các phép lai nhằm thu được ưu thế lai cao nhất Đó là nhân tố giúp cho sinh vật duy trì được nòi giống, kháng với các loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi trong điều kiện ngoại cảnh [10]

1.6 Chỉ thị trong đánh giá đa dạng di truyền

Chỉ thị di truyền là một thuộc tính hay một đặc điểm có thể đo đếm được và

có khả năng di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Chỉ thị di truyền nhất thiết thiết phải đảm bảo hai tiêu chuẩn: (i) phải khác biệt giữa bố và mẹ, (ii) phải được truyền lại chính xác cho thế hệ sau [68]

Các nhà di truyền và chọn giống luôn quan tâm đến chỉ thị di truyền vì tính

ưu việt của nó trong việc nghiên cứu sự kế thừa dấu hiệu di truyền và những biến đổi của chúng trong quần thể, đặc biệt là tính trạng nông sinh học có lợi cho con

Trang 23

người Chỉ thị di truyền cho phép phát hiện sự sai khác về mặt thông tin di truyền giữa hai hay nhiều cá thể Sự sai khác này có thể được phát hiện với nhiều phương pháp tiếp cận khác nhau, thông qua dữ liệu kiểu hình (chỉ thị hình thái), thành phần protein và hoạt chất (chỉ thị hoá sinh) hay sự khác biệt (đa hình) trong ADN (chỉ thị ADN) Mỗi loại chỉ thị đều có những ưu, nhược điểm cũng như khả năng đánh giá mức độ đa dạng di truyền khác nhau Trong đó, chỉ thị hình thái được sử dụng sớm nhất và là cơ sở ban đầu trong đánh giá phân loại sinh vật, còn chỉ thị hoá sinh và đặc biệt là chỉ thị ADN hiện nay được sử dụng rộng rãi nhất không chỉ đánh giá đa dạng di truyền mà còn là công cụ hữu hiệu trong chương trình chọn giống

1.6.1 Chỉ thị hình thái

Chỉ thị hình thái là loại chỉ thị có thể nhìn thấy, đo đếm được và dễ dàng nhận biết được ở dạng trội lặn Thông thường, chỉ thị hình thái biểu hiện dưới một tính trạng được kiểm soát bởi một locut đơn lẻ thường xuyên điều khiển các đặc điểm hình thái như các gen qui định màu sắc, hình dạng, kích thước, đặc điểm các

bộ phận (hạt, vỏ, …) Với ưu điểm dễ dàng tiếp cận và nghiên cứu, không đòi hỏi thiết bị đặc biệt cũng như quy trình thực hiện phức tạp, chỉ thị hình thái được áp dụng khá rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật Trong đánh giá và chọn tạo giống truyền thống, chỉ thị hình thái được áp dụng phổ biến và hiệu quả ở một số loại cây trồng như lúa, đậu tương, ngô, khoai [9, 22, 25, 86]

Mặc dù chỉ thị hình thái thường được sử dụng là một chỉ thị trội hoặc đồng trội, nhưng trong nhiều trường hợp các đặc điểm hình thái lại chịu ảnh hưởng của quá trình tương tác gen, nhân tố gen nhẩy, điều kiện ngoại cảnh và chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể Do đó, kết quả thường có

sự sai lệch giữa các lần đánh giá hoặc trong điều kiện đánh giá khác nhau Hơn nữa,

số lượng chỉ thị hình thái không nhiều cho mỗi loài sinh vật nên khả năng ứng dụng của chúng trong nghiên cứu di truyền và chọn giống bị hạn chế rất nhiều Bên cạnh

đó, việc đánh giá kiểu hình mang tính chất thống kê nên cần thực hiện trên số lượng lớn đối tượng để đảm bảo độ chính xác Chính vì vậy sẽ cần diện tích đất đai lớn

Trang 24

cũng như nhiều nhân lực và thời gian để gieo trồng và đánh giá đối tượng Ngoài ra,

do đặc điểm dựa trên kiểu hình để đánh giá kiểu gen nên chỉ thị hình thái không thể

là thước đo chính xác để đánh giá tính đa dạng di truyền giữa các cá thể, nhất là khi không phải toàn bộ các gen đều thể hiện ra kiểu hình có thể đo đếm được

1.6.2 Chỉ thị hoá sinh

Protein và các hoạt chất trao đổi khác là sản phẩm của quá trình biểu hiện gen ở sinh vật Nghiên cứu sự khác biệt trong thành phần của các sản phẩm này có thể giúp xác định những khác biệt về mặt di truyền giữa các cá thể và loài khác nhau Điện di protein trên gel là phương pháp hữu hiệu có thể giúp phân biệt, nhận diện giữa các loài và phân loại sinh vật Các protein, sản phẩm trao đổi chất…được

sử dụng như những chỉ tiêu đánh giá, phân biệt các sinh vật được gọi là chỉ thị hoá sinh Chỉ thị hoá sinh được sử dụng phổ biến nhất là các isozyme (các enzyme có trình tự amino acid khác nhau nhưng cùng xúc tác cho một phản ứng hoá học) Isozyme được trích ly, tinh sạch và điện di trên gel Các thành phần trong gel biến tính (thường là SDS) phá vỡ các cấu trúc bậc cao của chuỗi amino acid và khi đó dưới tác động của điện trường, các isozyme biến tính sẽ phân tích trên gel dựa trên khối lượng và độ tích điện Từ sự đa hình giữa các băng điện di thu được sẽ giúp nhận diện từng cá thể và đánh giá được sự đa dạng trong quần thể nghiên cứu

So với chỉ thị hình thái thì chỉ thị hoá sinh đáng tin cậy hơn bởi mỗi protein là sản phẩm của một gen, do đó sự đa hình các protein cũng phản ánh gián tiếp sự đa hình trong kiểu gen của sinh vật Tuy nhiên, đối với các cá thể có quan hệ di truyền gần gũi (đặc biệt là giữa các giống cây trồng) thì các sản phẩm biểu hiện gen (protein, enzyme…) không cho sự đa hình rõ ràng Cho nên loại chỉ thị này cũng chưa phản ánh thật chính xác bản chất di truyền của mỗi tính trạng Do đó khả năng ứng dụng của chỉ thị hoá sinh còn hạn chế rất nhiều Bởi vậy trong hầu hết những nghiên cứu đa dạng di truyền ngày này, chỉ thị ADN được sử dụng phổ biến hơn cả

Trang 25

1.6.3 Chỉ thị phân tử ADN

Đầu những năm 80 của thế kỷ 20, kỹ thuật RFLP ra đời và được biết đến

là loại chỉ thị mới- chỉ thị ADN thế hệ đầu tiên - với những ưu điểm vượt trội so với những chỉ thị hình thái và chỉ thị hoá sinh đang được sử dụng trong đánh giá

đa dạng di truyền lúc đó Tuy nhiên mốc đánh dấu quan trọng nhất của công nghệ chỉ thị phân tử nói riêng và sinh học phân tử nói chung chính là phát minh phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chains Reaction- PCR) của Karl Mullis (1983) Với khả năng tạo ra vô số bản sao của một đoạn ADN chỉ từ một vài phân tử ADN ban đầu, đây là phát minh mang tính bước ngoặt, làm thay đổi hoàn toàn cách thức tiếp cận - nghiên cứu sinh học phân tử và là cơ sở nền tảng

ra đời cho thế hệ chỉ thị phân tử tiếp theo

PCR (Polymerase Chains Reaction) là phản ứng nhân gen in-vitro, dựa trên

hoạt tính của loại enzym ADN polymerase chịu nhiệt

Phản ứng PCR chuẩn có ba giai đoạn nhiệt độ được kiểm soát bởi máy gia nhiệt Thành phần phản ứng bao gồm:

Trang 26

SNP … [40] Các chỉ thị này đã được ứng dụng và mang lại kết quả đáng tin cậy trong nghiên cứu đa dạng di truyền cũng như trong lĩnh vực công nghệ sinh học nông nghiệp khác

Trang 27

ADN sẽ bị cắt thành nhiều đoạn nhỏ có kích thước khác nhau Sự khác nhau về kích thước của các phân đoạn ADN được tạo nên bởi enzym giới hạn gọi là RFLP

Về nguyên lý, chỉ thị RFLP dựa trên sự phân cắt ADN hệ gen bằng các enzym giới hạn và sản phẩm cắt giới hạn có thể phát hiện bởi quá trình lai Southern với các mẫu dò đánh dấu phóng xạ (đoạn trình tự ADN đặc hiệu được thiết kế có thể bắt cặp bổ sung và qua đó phát hiện được trình tự ADN mục tiêu) sau khi điện

di trên gel agarose [76] RFLP là chỉ thị đồng trội do có thể phát hiện được các alen khác nhau trong cùng một locut trong hệ gen nhân, hệ gen ti thể hay hệ gen lục lạp bằng một mẫu dò đặc hiệu [83]

RFLP là công cụ chủ yếu trong nghiên cứu đa dạng di truyền trong và giữa các loài động thực vật trong những năm 80 thế kỷ 20 [40, 76] Rất nhiều nghiên cứu trên thực vật đã được thực hiện bằng chỉ thị RFLP Tuy nhiên, do các thao tác thực hiện phức tạo, đòi hỏi kỹ thuật viên có tay nghề cao, mất nhiều thời gian, công sức trong khi tiến hành thí nghiệm Do vậy, khi các chỉ thị thị phân tử khác được tìm ra thì RFLP đã không còn được sử dụng phổ biến

1.6.3.2 Chỉ thị ADN ngẫu nhiên

Năm 1990, William và Welsh trong nghiên cứu độc lập đã phát triển chỉ thị ngẫu nhiên RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) dựa trên kỹ thuật PCR Thực chất RAPD là phản ứng PCR nhân các đoạn ADN bằng những mồi không đặc hiệu Đoạn mồi dài khoảng 9-12 nucleotit và có trình tự ngẫu nhiên, đòi hỏi có trình tự G+C cao khoảng 60-70% để tăng độ bền cho đoạn bắt cặp giữa mồi và khuôn đảm bảo cho quá trình tổng hợp thuận lợi Trong kỹ thuật RAPD, đoạn mồi ngẫu nhiên bắt cặp với ADN khuôn tại vị trí bổ sung và tổng hợp các đoạn ADN sản phẩm có kích thước khác nhau [83]

Kỹ thuật RAPD- PCR dễ thực hiện, chi phí rẻ hơn rất nhiều so với RFLP

và chỉ yêu cầu một lượng nhỏ ADN khuôn cho phản ứng PCR Tuy nhiên, do đặc điểm ngẫu nhiên của mồi RAPD nên kết quả phân tích không ổn định, thường có sai khác giữa những lần nghiên cứu cho dù chỉ thay đổi một thông số thí nghiệm

Trang 28

Bên cạnh đó, RAPD là chỉ thị trội nên không thể phát hiện được các cá thể dị hợp tử, do đó khó ứng dụng trong lập bản đồ di truyền [10, 76]

Để khắc phục những nhược điểm trên, nhiều biến thể của chỉ thị RAPD đã được nghiên cứu và phát triển như chỉ thị DAF (DNA Amplification Fringerprinting), chỉ thị AP- PCR (Arbitrary Primed polymerase Chain Reaction) [49] Các chỉ thị này có chiều dài đoạn mồi ngẫu nhiên thay đổi (ngắn đến 5 nucleotide- DAF hoặc dài 10-50 nucleotit- AP- PCR) và được sử dụng trong điều kiện phản ứng khác nhau nhằm ổn định kết quả phản ứng nhân gen (chỉ thị AP- PCR) hoặc tạo nhiều đoạn ADN sản phẩm đa hình đơn khi phân tích các cá thể

có quan hệ di truyền gần gũi (chỉ thị DAF) Tuy nhiên, do đòi hỏi các điều kiện thí nghiệm khắt khe nên các biến thể của chỉ thị RAPD ít được áp dụng, trong khi chỉ thị RAPD vẫn được sử dụng khá phổ biến, đặc biệt trong nghiên cứu các

đối tượng chưa có thông tin trình tự ADN

1.6.3.3 Chỉ thị ADN dựa trên đa hình các vị trí nhận biết giới hạn

RFLP là chỉ thị ADN thế hệ đầu tiên có thể phát hiện tính đa hình ADN giữa các cá thể nhờ vị trí nhận biết enzym giới hạn Nhưng hiện nay chỉ thị RFLP ít được sử dụng do chi phí lớn, tốn thời gian và độc hại Tuy nhiên, phân tích đa hình dựa trên các vị trí giới hạn cho kết quả đáng tin cậy và có thể ứng dụng trong xác định đột biến nên cùng với sự ra đời của kỹ thuật PCR, RFLP đã được cải tiến nhằm khắc phục những nhược điểm trên

Năm 1991, William và cs đã cải tiến kỹ thuật RFLP khi sử dụng enzym giới hạn phân cắt sản phẩm PCR được nhân lên từ ADN hệ gen lúa bởi cặp mồi đặc hiệu và đã ghi nhận được kết quả đa hình ADN giữa các mẫu nghiên cứu [48, 83] Kỹ thuật này được gọi là PCR-RFLP hay còn gọi là CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) Phân tích đa hình sử dụng chỉ thị CAPS đơn giản, nhanh chóng, chi phí thấp và có thể phân biệt được cá thể dị hợp tử Tuy nhiên, mức độ đa hình phát hiện được bởi chỉ thị này phụ thuộc vào các vị trí giới hạn cũng như các enzym giới hạn sử dụng để phân cắt sản phẩm PCR

Trang 29

Một cải tiến khác của chỉ thị RFLP cũng dựa trên kỹ thuật PCR là AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) được Zabeau và cs phát triển năm

1993 [48] Nguyên tắc của kỹ thuật AFLP như sau: (i) Tách chiết và tinh sạch ADN, phân cắt ADN bằng enzym giới hạn tạo đầu so le, sau đó gắn với adapter oligonucleotit có trình tự nhận biết các enzym giới hạn, (ii) Cặp mồi được thiết kế

bổ sung với trình tự adapter gắn vào sẽ được sử dụng để nhân bản đoạn ADN giữa hai vị trí nhận biết, (iii) điện di phân tách sản phẩm PCR trên gel polyacrylamit [10,48]

Ưu điểm của chỉ thị AFLP là sự kết hợp giữa khả năng cho kết quả đa hình cao và ổn định Nhờ đó chỉ thị AFLP không chỉ được áp dụng trong phân tích đa dạng di truyền mà còn được sử dụng trong xác định nguồn gốc cá thể (xác định bố- mẹ), trong chọn tạo giống và lập bản đồ gen [48,76]

1.6.3.4 Chỉ thị ADN dựa trên các trình tự lặp

Trong hệ gen sinh vật bậc cao, ngoài các đoạn trình tự (gen) mã hoá protein còn

có các yếu tố ADN lặp lại, phân bố trên mọi nhiễm sắc thể và có kích thước khác nhau Tùy thuộc vào sự phân bố trên hệ gen, các yếu tố ADN lặp lại được chia thành hai nhóm: trình tự ADN lặp rải rác (các ADN transposon) và trình tự ADN lặp lại nối tiếp

có kích thước khác nhau (VNTR- Variable Number of Tandem Repeat) [48, 83] VNTR bao gồm hàng loạt các đơn vị trình tự (motif) lặp lại nối tiếp nhau và có mặt trên các nhiễm sắc thể (kể cả nhiễm sắc thể giới tính) Các VNTR được phân chia thành các nhóm khác nhau dựa trên chiều dài motif, số lần lặp lại của các motif cũng như vị trí của chúng trên nhiễm sắc thể [79,83], bao gồm:

(i) ADN vệ tinh (Satellite ADN): năm 1974, khi thí nghiệm ly tâm gradient tỷ trọng nổi ADN tổng số, các nhà khoa học phát hiện các phân đoạn ADN tách riêng biệt và gọi là ADN vệ tinh (Skinner và cs, 1974) [83] ADN vệ tinh bao gồm số lượng rất lớn các đoạn lặp của một motif (từ 1000 đến hơn 100.000 đoạn lặp), mỗi motif có chiều dài từ hai đến hàng trăm bp, nhưng phổ biến từ 100 đến

Trang 30

300bp ADN vệ tinh thường tập trung thành nhóm lớn (lên đến 100 triệu bp) ở các vùng dị nhiễm sắc trên nhiễm sắc thể, gồm tâm động và đầu mút (telomer)

(ii) Minisatellite: là hệ lặp nối tiếp với mức độ trung bình của các motif

có kích thước vừa phải (10 đến 60bp) và thường phân bố ở vùng nhiễm sắc trên nhiễm sắc thể (Jeffrey, 1985) [48]

(iii) Vi vệ tinh- Microsatellite: là các đoạn lặp nối tiếp của các motif có kích thước rất ngắn (1đến 6bp) (Litt và Lutty, 1989)[48] Vi vệ tinh có nhiều motif khác nhau, thường có mức độ lặp lại thấp và biến đổi ở một locut nhất định, chính

vì vậy số lượng alen ở mỗi locut SSR là rất nhiều Các vệ tin có thể tìm thấy khắp nơi, ở vùng mang mã (exon) và không mang mã (intron) trên hệ gen trong nhân và

cả hệ gen ngoài nhân (ti thể, lục lạp) (Trojanowska, 2004) [81] Có nhiều danh pháp khác nhau được dùng để chỉ vi vệ tinh: trình tự lặp đơn giản- SRS (Simple Repetitive Sequences), đoạn lặp trình tự đơn giản- SSR (Simple Sequence Repeats) hay đoạn nối tiếp đơn giản- STR (Simple Tandem Repeat) [10, 76]

Trong ba loại trình tự lặp nêu trên, vi vệ tinh- SSR có số lượng motif rất phong phú, phân tán đều khắp hệ gen và có mức độ đa hình rất cao Theo Jurka và Pethiyagoda (1995) [83], với bốn loại base A-T-G-C, số lượng các motif SSR trên cấu trúc sợi đôi ADN có thể lên đến 501 loại khác nhau, bao gồm 2 motif một nucleotit (monomeric), 4 motif hai nucleotit (dimeric), 10 motif ba nucleotit (trimeric), 33 motif bốn nucleotit (tetrameric), 102 motif năm nucleotit (pentameric)

và 350 motif sáu nucleotit (hexameric) Motif phổ biến ở hệ gen động vật có vú là (A)n và (CA)n trong khi (A)n, (AT)n, (GA)n và (GAA)n là những motif lặp lại phổ biến nhất ở thực vật Bên cạnh đa dạng về số lượng, sự sắp xếp các motif trong đoạn trình tự lặp cũng góp phần làm phong phú SSR trong hệ gen Dựa trên mức độ hoàn chỉnh của các motif lặp, Weber (1990) đã phân chia các SSR thành ba nhóm khác nhau, bao gồm (1) SSR lặp lại hoàn chỉnh (Perfect repeats), bao gồm một motif lặp lại liên tục không bị ngắt quãng; (2) SSR lặp lại không hoàn chỉnh (Imperfect repeat), chuỗi motif lặp lại bị gián đoạn bởi một hay vài base không thuộc cấu trúc

Trang 31

motif; (3) SSR lặp lại phức hợp (Compound repeat), là sự kết hợp xen kẽ có/không

có quy luật của hơn hai motif khác nhau [83]

Trước đây, ADN lặp được coi là “ADN tạp” bởi chức năng của chúng chưa được tìm ra [81] Ngày nay, mặc dù vai trò của ADN lặp đối với hệ gen vẫn chưa được làm sáng tỏ nhưng chúng đã trở thành công cụ quan trọng trong nghiên cứu di truyền, đặc biệt là các ADN vi vệ tinh- SSR Các đặc điểm như phân bố khắp nơi trên hệ gen với tần suất xuất hiện cao (mỗi 21,2kb ở thực vật hai lá mầm và mỗi 64,6kb ở thực vật 1 lá mầm (Wang và cs, 1994) [74], có mức độ đa dạng alen ở mỗi locut cao, di truyền đồng trội đã đưa SSR trở thành loại chỉ thị ADN có hiệu quả nhất trong nghiên cứu đa dạng di truyền, lập bản đồ gen…Hiện nay, có nhiều loại chỉ thị ADN khác nhau được phát triển dựa trên các trình tự lặp, phổ biến hơn cả là chỉ thị SSR và ISSR

a Chỉ thị SSR (Simple sequence repeats)

Chỉ thị SSR cho phép ta phát hiện được tính đa hình về chiều dài các trình tự nucleotit đơn giản Hiện nay, hơn 15.000 chỉ thị SSR đã được thiết lập [87], phủ kín trên bản đồ liên kết di truyền của lúa [36] Nhiều công trình sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu đa dạng di truyền đã được công bố (Kalyan và cs., 2006 [49]; Jalaluddin và cs., 2007[47]; Muhammad và cs.,2009[60]; Navraj và cs., 2009 [62]) Ngoài ra, chỉ thị SSR còn được dùng để chọn lọc tính kháng bệnh do khảm virut ở cây đậu tương, chọn lọc giống phân tử ở lúa, xác lập mối quan hệ thân thuộc giữa các giống cây trồng như ngô (Ngô Thị Minh Tâm, 2007), đậu tương (Lương Thị Thu Hương, 2006), xây dựng bản đồ liên kết (Zhao, 1993)… [ 10, 12, 40] Chỉ thị SSR có hai ưu điểm lớn so với các chỉ thị ADN khác:

- Tính đặc hiệu cao: các đoạn mồi SSR được thiết kế dựa trên vùng trình tự sườn có tính bảo thủ cao của các đoạn lặp SSR, do đó sản phẩm nhân gen của phản ứng SSR-PCR đặc hiệu và ổn định hơn các chỉ thị ADN ngẫu nhiên Bên cạnh đó, nhờ tính chất bảo thủ của vùng trình tự sườn mà các mồi SSR có thể được sử dụng chéo giữa các loài có mối quan hệ di truyền gần gũi [10, 71]

Trang 32

- Di truyền đồng trội và mức độ đa hình cao: Trải qua tiến hoá và các biến đổi di truyền, số lần lặp lại các motif SSR thay đổi rất nhiều và làm cho các đoạn SSR có chiều dài khác nhau Bởi vậy phản ứng SSR- PCR có thể phát hiện các alen khác nhau trong cùng một locut SSR, qua đó phát hiện được các cá thể đồng hợp tử/dị hợp tử ở locut đó (chỉ thị đồng trội)

Không chỉ có những ưu điểm trên, với tần suất xuất hiện gen cao của các trình tự lặp thì số lượng chỉ thị SSR là rất phong phú với mức đa hình cao Dựa trên

kỹ thuật PCR và kết hợp với các phương thức phát hiện khác nhau, các phân tích sử dụng chỉ thị SSR rất đơn giản, nhanh chóng, tin cậy và đặc biệt có khả năng tự động hoá cao [10, 40, 74, 81], điều này rất phù hợp với các nghiên cứu di truyền quần thể như đánh giá đa dạng di truyền, lập bản đồ gen, chọn giống phân tử…Một số nghiên cứu so sánh, đánh giá ưu nhược điểm của chỉ thị SSR với các loại chỉ thị RFLP, AFLP, RAPD…đã khẳng định những ưu điểm của SSR so với các chỉ thị trên (Garcia và cs, 2004) [34, 42]

Hình 1.4: Đa hình ADN SSR giữa hai cá thể có motif (AT)n

Khác với chỉ thị ngẫu nhiên (RAPD) hay chỉ thị dựa trên các vị trí giới hạn (RFLP, AFLP), chỉ thị SSR được phát triển dựa trên trình tự ADN đã biết trước của đối tượng nghiên cứu Quy trình phát triển chỉ thị SSR gồm hai giai đoạn chính là xác định các trình tự lặp trên hệ gen và thiết kế mồi đặc hiệu cho đoạn

Trang 33

trình tự đó, đây là quy trình phức tạp, đòi hỏi áp dụng nhiều kỹ thuật, phương pháp khác nhau và đặc biệt có chi phí rất tốn kém [10, 55, 74, 81] Vì vậy, chỉ thị SSR chỉ thực sự phát huy hiệu quả khi trình tự ADN hệ gen của đối tượng cần nghiên cứu đã được khám phá đầy đủ Theo Brown và cs (1996), có ba hướng chính trong phát triển và thiết kế mồi SSR, bao gồm (i) tìm kiếm trình tự lặp và thiết kế mồi SSR trên cơ sở dữ liệu trình tự (ngân hàng cADN, EST, GeneBank); (ii) áp dụng tính chất bảo thủ của vùng trình tự sườn để áp dụng chéo mồi SSR giữa các đối tượng có quan hệ di truyền gần gũi và (iii) sàng lọc thư viện hệ gen (thư viện BAC, YAC) để phát hiện và thiết kế mồi SSR [55]

Mỗi hướng nghiên cứu phát triển chỉ thị SSR đã được cải tiến thành nhiều phương pháp khác nhau và được ứng dụng ở một số đối tượng như khoai tây (Milbourne và cs, 1998), lúa (Panaud và cs, 1995)… Hiện nay, với sự ra đời và phát triển nhanh chóng của các cơ sở dữ liệu di truyền (NCIB, EM…) đặc biệt là ngân hàng EST thì việc phân lập và phát triển chỉ thị SSR dựa trên cơ sở trình tự sẵn có đã trở thành hướng đi nhanh chóng, đơn giản, ít tốn kém và ngày càng phổ biến [30, 78]

b Chỉ thị ISSR (Inter- Simple Sequence Repeat)

ISSR là kỹ thuật dựa trên PCR, nhân bản các đoạn ADN nằm giữa hai vùng lặp SSR hướng ngược chiều nhau sử dụng một loại mồi duy nhất (dài 15-25 nucleotit)

có trình tự lặp giống SSR Các mồi ISSR có thể được bổ sung thêm từ một đến bốn nucleotit “neo” ở đầu 3’ (Yang và cs, 1996) hoặc đầu 5’ (Zietkiewicz và cs, 1994) nhằm tăng độ đặc hiệu của phản ứng nhân gen Hầu hết chỉ thị IRRS là chỉ thị trội và

có tính ổn định cao hơn chỉ thị RAPD Dựa trên motif lặp và số nucleotit làm “neo”

để thiết kế mồi IRRS thì số lượng chỉ thị IRRS gần như là không giới hạn [44, 48] Chỉ thị IRRS có tính đa hình cao và rất hiệu quả trong nghiên cứu đa dạng di truyền

Bên cạnh SSR và ISSR còn có nhiều chỉ thị khác được phát triển dựa trên trình

tự lặp không được sử dụng rộng rãi như STMS (Sequence-tagged microsatellite site marker) và DAMD-PCR (Direct Amplification of Minisatellite DNA markers) [48]

Trang 34

1.6.3.5 Chỉ thị ADN dựa trên trình tự ADN

Trong số nhiều dạng đột biến xảy ra tự nhiên trong hệ gen, sự thay đổi một nucleotit (các đột biến điểm hay hiện tượng đa hình nucleotit đơn- SNP (Single Nucleotide Polymorphism) là một hiện tượng phổ biến, có số lượng rất lớn và phân

bố khắp hệ gen Về bản chất, khái niệm SNP mô tả những vị trí cặp base trong hệ gen của hai (hay nhiều hơn) cá thể mà tại đó có sự thay đổi trong trình tự, ví dụ SNP có thể thay đổi trình tự ADN từ AAGGCTAA sang ATGGCTAA SNP có thể xảy ra ở vùng không mang mã hoặc vùng mang mã trên hệ gen, trong đó nhiều SNP không gây ảnh hưởng tới tế bào nhưng cũng có những SNP gây ra những biến đổi không có lợi cho cơ thể [44]

SNP là chỉ thị rất phù hợp cho nghiên cứu đa dạng di truyền và đa dạng quần thể bởi có số lượng lớn (mỗi 1000bp hệ gen có một SNP) và có thể áp dụng các phương pháp tự động trong phát hiện và phân tích [69] SNP được áp dụng phổ biến trong nghiwn cứu di truyền học ở người (trong chuẩn đoán bệnh và nghiên cứu đáp ứng thuốc) Đến nay, SNP đang ngày càng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu

di truyền thực vật [69]

Bên cạnh SNP, có nhiều chỉ thị khác dựa trên trình tự ADN cũng đã được nghiên cứu và ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền và phân loại như chỉ thị đặc hiệu các vùng bảo thủ rDNA, STS… [76]

1.6.3.6 Một số loại chỉ thị ADN khác

Phân tử ADN không chỉ khác nhau về trình tự mà còn khác nhau về hình dạng không gian khi ADN ở trạng thái sợi xoắn kép Hai trình tự ADN chỉ cần có một vị trí nucleotit khác nhau cũng có thể mang hình dạng khác nhau Bằng phương pháp điện di có thể phát hiện được sự đa hình (về hình dạng) giữa các đoạn ADN này (chỉ thị CSGE- Conformation Sensitive Gel Electrophoresis) [48,83]

Cùng với những thành tựu của công nghệ sinh học, nhiều loại chỉ thị mới

đã được phát triển và ứng dụng, làm phong phú hơn những công cụ sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền Với mục tiêu làm sáng tỏ hơn bản chất phân

Trang 35

tử trong các nghiên cứu, các chỉ thị mới đi sâu vào phân tích trình tự ADN của các gen cụ thể (chỉ thị STS, EST và ADN microarray…) giúp nghiên cứu đa dạng di truyền chính xác và chi tiết hơn Tuy nhiên, các chỉ thị này yêu cầu kĩ thuật và chi phí cao hơn các loại chỉ thị ADN trước (RAPD, SSR…) Đây chính

là điểm cơ bản hạn chế sự phổ biến của các chỉ thị này trong nghiên cứu đa dạng

di truyền

1.7 Thành tựu trong nghiên cứu đa dạng di truyền lúa

Lúa là cây lương thực chủ đạo trong nền nông nghiệp của nhiều nước trong khu vực Châu Á- Thái Bình Dương Việc nâng cao năng suất lúa bằng cách phối hợp giữa phương pháp truyền thống và công nghệ sinh học là chiến lược hàng đầu được nhiều quốc gia quan tâm Vì vậy, đến nay các nhà chọn giống đã

sử dụng những biến đổi di truyền để tạo ra những giống lúa có tiềm năng năng suất cao, chất lượng gạo tốt, kháng với sâu bệnh chính và chống chịu những điều kiện bất lợi như khô hạn, ngập úng, mặn [5, 38]

Tuy nhiên vì mục tiêu hướng tới năng suất, chất lượng nên số lượng các tính trạng được nhắm đến trong quá trình lai tạo bị thu hẹp, bởi vậy giữa các giống lúa lai có sự tương đồng di truyền cao hơn hẳn so với giống hoang dại Các hoạt động canh tác như thay thế giống truyền thống bằng giống lúa lai làm mất dần đi nguồn gen hoang dại (có thể mang những tính trạng quý chưa biết đến) là nguồn vật liệu quý cho công tác chọn tạo giống; cao hơn nữa làm mất đi

sự đa dạng di truyền của cây lúa và có thể ảnh hưởng đến đa dạng sinh học Chính vì vậy, nghiên cứu đa dạng di truyền lúa nhằm bảo tồn các giống lúa đặc sản và hỗ trợ công tác chọn tạo giống là yêu cầu rất cấp thiết

1.7.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hình thái

Chỉ thị hình thái được sử dụng khá phổ biến trong phân loại, đánh giá đa dạng di truyền lúa và nhất là đánh giá chọn lựa các tổ hợp lai trong công tác chọn tạo giống lúa Chỉ thị hình thái là công cụ đầu tiên được Kato sử dụng để phân loại dưới loài lúa trồng Châu Á Các tính trạng hình thái nông học như chiều dài

Trang 36

lá, chiều cao cây, thời gian sinh trưởng, màu phiến lá, dạng bông của 90 giống có nguồn gốc từ Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản và tỷ lệ kết hạt khi lai các giống mới với nhau đã được sử dụng để phân loại các giống lúa Kết quả cho thấy lúa trồng

Châu Á được chia thành hai nhóm là Indica và Japonica [6]

Chang và cs (1979) [28] xác định tính trạng chiều dài hạt thóc và tỷ lệ dài hạt/rộng hạt do đơn gen, hai gen hoặc trung gen điều khiển và có hệ số di truyền cao

và được xem là tính trạng quan trọng để đánh giá đa dạng di truyền lúa Tác giả đã đề

nghị chia lúa trồng Châu Á thành ba loài phụ: Indica, Japonica và Javanica Các chỉ

tiêu như độ dài của trụ gian lá mầm, độ phân huỷ kiềm, chiều dài/rộng hạt, phản ứng

của hạt thóc với dung dịch phenol cũng sử dụng để phân loại lúa Indica và Japonica

(Oka, 1958) [66] Oka đã tiến hành chọn ngẫu nhiên 147 giống từ tập đoàn lúa địa phương trên 1000 giống thu thập từ các nước Ấn Độ, Đông Dương, Trung Quốc và Nhật Bản, sau đó tiến hành quan sát 41 chỉ tiêu và tính trạng, trong đó có 11 tính trạng thể hiện sự biến dị lớn giữa các giống được sử dụng và phân loại Chỉ tiêu phản ứng của hạt thóc với dung dịch Phenol là chỉ tiêu quan trọng nhất Qua việc phân tích tương quan 11 tính trạng cho thấy các giống lúa nghiên cứu được chia thành hai

nhóm (1) nhóm bắt màu dung dịch phenol (dạng hình Indica) và (2) là nhóm không bắt màu với dung dịch phenol (dạng hình Japonica) [13]

Ở Việt Nam, đặc điểm hình thái được sử dụng phổ biến trong đánh giá các giống lúa và đóng vai trò quan trọng trong công tác chọn lọc và lai tạo giống lúa Năm 2006, Lưu Ngọc Trình đã đánh giá đầy đủ 60 tính trạng hình thái nông học của 1.819 giống, đánh giá 40-50 tính trạng của 1.385 giống và 20-30 tính trạng của 2.066 giống trong tổng số 6.083 giống lúa đang bảo quản tại Ngân hàng gen cây trồng Quốc Gia, Trung tâm Tài nguyên Thực vật [21]

1.7.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hoá sinh

Đánh giá đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hoá sinh được sử dụng rộng rãi

từ thập kỷ 70 của thế kỷ XX Second (1982) [75] dựa vào kết quả phân tích 40

locut đẳng men (isozym) của hai loại lúa trồng Châu Á (Oryza sativa) và lúa trồng

Trang 37

Châu Phi (Oryza glaberima) đã cho thấy lúa trồng Châu Á được chia thành hai nhóm là Indica và Japonica

Chỉ thị hoá sinh được Glaszmann (1987) [37] sử dụng để nghiên cứu cấu

trúc di truyền của lúa trồng Châu Á đã chia loài Oryza sativa thành sáu nhóm, trong đó nhóm Indica và Japonica là hai nhóm đối cực Tác giả nhận thấy lúa

Japonica và Javanica theo phân loại của Chang (1976) tuy khác nhau về mặt hình

thái nhưng bản chất di truyền không khác xa nhau nhiều lắm, Glaszmann ghép

chung vào nhóm lúa Japonica và gọi lúa Japonica theo phân loại của Chang (1976) là Japonica truyền thống hoặc Japonica ông đới và lúa Javanica là lúa

Japonica nhiệt đới

Cho đến nay, các nghiên cứu đa dạng di truyền thông qua chỉ thị hoá sinh của lúa ở Việt Nam cũng khá nhiều và với quy mô lớn Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền của 101 giống lúa địa phương bằng 9 locut thuộc của 5 enzym thu

từ huyện Nho Quan, Ninh Bình và huyện Đà Bắc, Hoà Bình cho thấy 44 giống

(43,6%) thuộc lúa Indica và 57 giống (56,4%) thuộc lúa Japonica (Trần Danh

Sửu, 2004) [16] Năm 1999, Nguyễn Văn Tạo đã phân tích đa dạng di truyền 53 giống lúa miền Nam dựa trên 19 locut của 10 enzym cho thấy có 21 trường hợp có

sự biến động di truyền trong giống[64]

1.7.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị ADN

Với những thành tựu của sinh học phân tử, chỉ thị ADN đã được ứng dụng rất hiệu quả trong nghiên cứu di truyền thực vật mà phân tích đa dạng và chọn giống phân tử (MAS- Marker Assisted Selection) là hai lĩnh vực thành công nhất Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa sử dụng chỉ thị ADN cũng được tiến hành mạnh

mẽ trong những năm gần đây, với các chỉ thị như RFLP, RAPD, AFLP, SSR…

Với ưu điểm đơn giản, nhanh chóng chi phí thấp và nhất là không yêu cầu biết trước trình tự ADN, RAPD là chỉ thị ADN được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu đa dạng di truyền lúa Virk và cs., (1995) [82] đã nghiên cứu đa dạng di truyền lúa và xác định các giống trùng lặp với 47 mẫu của 44 giống trong tập đoàn

Trang 38

nguồn gen lúa đang bảo quản tại IRRI Bùi Chí Bửu và cs., 1999 [4] đã sử dụng 20 chỉ thị RAPD để phân tích đa dạng di truyền 72 giống lúa địa phương Việt Nam

Do có nhược điểm kém ổn định nên một số nghiên cứu đã kết hợp chỉ thị RAPD với một số chỉ thị khác như SSR, AFLP… nhằm nâng cao độ tin cậy của kết quả Mahmoud nghiên cứu biến động và quan hệ di truyền của 7 giống lúa bằng việc kết hợp của 8 chỉ thị RAPD, 6 chỉ thị SSR và 8 chỉ thị AFLP cho thấy mức độ đa hình của mồi tương ứng là 72,2%; 90% và 67,9% và khẳng định các kỹ thuật nêu trên đều có thể áp dụng tốt cho nghiên cứu đa dạng di truyền cây lúa [56]

Song Z.P và cs., 2003 [77] đã sử dụng 23 chỉ thị SSR phân tích đa hình của

232 cá thể thuộc 6 quần thể lúa (3 quần thể từ Jiangxi và 3 quần thể từ Hunan- Trung Quốc) Kết quả thu được tổng số 115 alen và các nhà nghiên cứu cho rằng quần thể lúa ở Jiangxi có mức độ đa hình cao hơn Hunan

Võ Thị Minh Tuyền và cs., 2007 [23] đã sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu 10 giống/dòng lúa có nguồn gốc khác nhau và đã xác định được tương đồng di truyền dao động từ 0,49-0,96 Qua kết quả nghiên cứu đã phân loại các giống lúa thành các nhóm có khoảng cách di truyền khác nhau, đó là cơ sở để chọn bố mẹ cho chọn giống lúa lai

Chỉ thị RFLP và SSR đã được Olufowote và cs., 1997 [67] nghiên cứu biến động di truyền trong giống của 71 giống lúa Kết quả cho thấy các giống lúa địa phương có mức đa dạng, hỗn tạp và dị hợp tử cao hơn các giống lúa cải tiến Cả hai phương pháp này đều cho thấy số lượng các alen ở các giống lúa địa phương cao hơn hẳn các giống lúa cải tiến Chỉ thị SSR có khả năng phân biệt các cá thể

có quan hệ di truyền gần gũi, đồng thời số lượng các alen cao hơn chỉ thị RFLP

113 chỉ thị RFLP và 60 chỉ thị SSR được Xu và cs., 2004 [84] sử dụng để định lượng đa dạng alen của 125 giống lúa thu từ các Bang miền Tây và miền Nam nước Mỹ và 111 giống từ tập đoàn từ lúa Quốc tế đang bảo quản tại IRRI

Trang 39

Dựa trên trình tự lặp, Masood (2004) [54] đã giải trình tự toàn bộ gen lục lạp

của lúa dại (Oryza nivara) Fukuoka (2003) [73] đã nghiên cứu về đa dạng di truyền

của 129 giống lúa bản địa miền Bắc Việt Nam bằng chỉ thị phân tử RFLP và ADN lục lạp Phân tích nhóm dựa trên các chỉ thị RFLP cho thấy giống lúa ở miền Bắc Việt Nam đã chia thành 3 nhóm Trong đó, 86% các giống trong nhóm 1 gồm 23

giống thuộc phân loại phụ Indica, các giống này đều có ADN lục lạp khuyết thiếu tại đoạn Pst1 của ORF100 Tất cả các giống trong nhóm 2 và 3 thuộc phân loài phụ

giống Japonica, không có kiểu ADN lục lạp khuyết thiếu Trong nhóm giống

Japonica, nhóm 2 gồm các giống lúa ruộng và nhóm 3 gồm các giống lúa nương

Nghiên cứu cho thấy sự khác biệt di truyền giữa nhóm 2 và nhóm 3 liên quan đến

biến dị di truyền trong phân loài phụ lúa Japonica

Trang 40

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

- 40 mẫu giống/dòng lúa thu thập từ ven biển phía Bắc, miền Trung Việt Nam đang được lưu giữ tại Ngân hàng gen cây trồng Quốc Gia và một số giống từ Viện nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) (bảng 2.1)

Bảng 2.1: Danh sách 40 mẫu giống/dòng lúa trong nghiên cứu

Định dạng
Số trang	110
Dung lượng	3,49 MB