biểu hiện gen mã hoá kháng thể kháng cd20 và thử nghiệm để phát hiện cd20 trong huyết thanh của bệnh nhân ung thư lympho không hodgkin

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Thu Thùy BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ KHÁNG CD20 VÀ THỬ NGHIỆM ĐỂ PHÁT HIỆN CD20 TRONG HUYẾT THANH CỦA BỆNH NHÂN UNG TH

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Thu Thùy

BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ

KHÁNG CD20 VÀ THỬ NGHIỆM ĐỂ PHÁT HIỆN CD20 TRONG HUYẾT THANH CỦA BỆNH NHÂN

UNG THƯ LYMPHO KHÔNG HODGKIN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Thu Thùy

BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ

KHÁNG CD20 VÀ THỬ NGHIỆM ĐỂ PHÁT HIỆN CD20 TRONG HUYẾT THANH CỦA BỆNH NHÂN

UNG THƯ LYMPHO KHÔNG HODGKIN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân,

được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS TS Trần Minh Đạo và

PGS TS Lê Quang Huấn

Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Nghiên cứu sinh

Phạm Thu Thùy

Lời cảm ơn

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới: PGS TS

Trần Minh Đạo – Giám đốc bệnh viện 198 – Bộ Công an và PGS TS Lê Quang Huấn – Trưởng phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học –

Viện Khoa học Việt Nam đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận án tiến sĩ

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.T.S Nguyễn Thị Hồng Vân – Trưởng bộ

môn Di truyền học, các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học và Khoa Sinh học – Trường đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội đã chỉ bảo tận tình

và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới T.S Lã Thị Huyền, các cô chú, anh chị và

các bạn công tác tại phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam

Tôi xin chân thành cảm ơn các cô chú, anh chị và các bạn đồng nghiệp Khoa

Vi sinh – Bệnh viện 198 đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa giải phẫu bệnh – Học viện quân y, Trung tâm Ung bướu - Bệnh viện 198 và Viện chăn nuôi đã cung cấp mẫu thí nghiệm cho tôi

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và tất cả những người thân, bạn bè đã giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Nghiên cứu sinh Phạm Thu Thùy

1.1.2 Tình hình ung thư máu trên thế giới và Việt Nam 5 1.1.3 Các phương pháp chẩn đoán và điều trị ung thư máu 7 1.1.4 Bệnh ung thư lympho không Hodgkin (Non-Hodgkin

CD trên thế giới 27 1.4 KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN CD20 28 1.4.1 Cơ chế hoạt động của kháng thể đặc hiệu CD20 28 1.4.2 Một số mAb đặc hiệu CD20 đang được sử dụng trong điều trị 32 1.4.3 Tình hình nghiên cứu mAb đặc hiệu CD20 hiện nay 36

2.1.3 Hóa chất và trang thiết bị 40

2.2.1 Các phương pháp thao tác với DNA VÀ RNA 41 2.2.1.1 Tách chiết RNA từ máu của bệnh nhân và tủy gà đã gây miễn

2.2.1.9 Thu đoạn DNA từ gel agarose 47 2.2.1.10 Tinh sạch DNA và cắt, gắn DNA 47 2.2.1.11 Phương pháp nhân gen bằng PCR 48 2.2.1.12 Xác định trình tự nucleotide 49 2.2.2 Các phương pháp thao tác với protein tái tổ hợp 49 2.2.2.1 Biểu hiện gen trong tế bào E coli 49 2.2.2.2 Tinh sạch protein tái tổ hợp 50

2.2.3 Kĩ thuật Western blot và Dot blot 51

2.2.4 Gây miễn dịch gà bằng kháng nguyên CD20 52

2.2.5.1 Tạo kháng thể phage-scFv từ thƣ viện Griffin.1 53 2.2.5.2 Sàng lọc kháng thể phage-scFv đặc hiệu kháng nguyên đích 53

2.2.7 Xác định khả năng liên kết của kháng thể scFv-CH2 với CD20 54

3.1 TẠO KHÁNG NGUYÊN CD20 TÁI TỔ HỢP 57 3.1.1 Tách chiết RNA tổng số từ máu bệnh nhân ung thƣ lympho

3.1.2 Nhân bản các gen mã hoá CD20 58 3.1.3 Tách dòng gen mã hoá CD20 58 3.1.4 Xác định trình tự gen mã hóa CD20 59 3.1.5 Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên CD20 60

3.1.6 Biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của CD20 61 3.2 KẾT QUẢ GÂY MIỄN DỊCH GÀ BẰNG CD20 TẠO RA 64 3.3 THU NHẬN GEN MÃ HÓA scFv KHÁNG CD20 TỪ GÀ 65 3.3.1 Tạo gen tái tổ hợp mã hóa cho scFv từ gà gây miễn dịch 65 3.3.2 Tạo phage biểu lộ scFv và sàng lọc các scFv có khả năng gắn

đặc hiệu với kháng nguyên đích 68 3.4 TẠO KHÁNG THỂ scFv KHÁNG CD20 69 3.4.1 Tách dòng gen antiCD20 mã hóa scFv 69 3.4.2 Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+)/antiCD20 69 3.4.3 Tối ƣu một số điều kiện biểu hiện scFv 71 3.4.4 Tinh sạch kháng thể scFv đặc hiệu CD20 76 3.4.5 Khả năng liên kết của scFv với kháng thể cộng hợp 78 3.4.6 Độ ổn định của scFv tinh sạch 79 3.5 TẠO KHÁNG THỂ scFv-CH2 KHÁNG CD20 81 3.5.1 Tách dòng gen antiCD20Fa mã hóa scFv-CH2 81 3.5.2 Sàng lọc hệ vector biểu hiện scFv-CH2 82 3.5.2.1 Nhân dòng các vector biểu hiện scFv-CH2 82

3.5.2.2 Biểu hiện kháng thể scFv-CH2 trong hệ vector 83 3.5.2.3 Chọn vector biểu hiện scFv-CH2 84 3.5.3 Tối ƣu một số điều kiện biểu hiện scFv-CH2 85 3.5.4 Tinh sạch kháng thể scFv-CH2 88 3.5.5 Độ ổn định của scFv-CH2 tinh sạch 91 3.5.6 Khả năng liên kết của scFv-CH2 với CD20 91 3.6 THỬ NGHIỆM scFv-CH2 PHÁT HIỆN CD20 TRONG

HUYẾT THANH BỆNH NHÂN NHL

93

3.6.1 Phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân bằng Western blot 93 3.6.2 Phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân bằng ELISA 95 3.6.2.1 Lựa chọn độ pha loãng huyết thanh 95 3.6.2.2 Thử nghiệm scFv-CH2 phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN

PHỤ LỤC

Danh mục các kí hiệu, các từ viết tắt

ADCC Antibody dependent cellular

cytotoxicity

Gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể

ADC Antibody drug conjugate Kháng thể mang thuốc

AIDS acquired immune deficiency

CR Complete remission Đáp ứng hoàn toàn

DNA Deoxyribonucleic acid

HAMA Human against mouse allergic Hiện tƣợng mAb có nguồn gốc

từ chuột khi tiêm vào cơ thể do không tương hợp với hệ miễn dịch của người, khiến cơ thể sinh ra kháng thể chống lại nó HBV Hepatitis B virus Virut viêm gan B

HL Hodgkin’s lymphoma U lympho Hodgkin

IFN Interferon

IPTG Isopropyl β-D-thiogalactoside Chất cảm ứng IPTG

IARC International Agency for

Research on Cancer

Tổ chức Nghiên cứu ung thư Quốc tế

mAb Monoclonal antibody Kháng thể đơn dòng

NHL non-Hodgkin’s lymphoma Ung thư lympho không

RA Rheumatoid arthritis Viêm kh ớp dạng thấp

RNA Ribonucleic acid ARN

RT-PCR Reverse transcription

Polymerase chain Reaction

Phản ứng chuỗi phiên mã ngược

Hình 1.5 Sơ đồ cấu tạo của kháng thể 18 Hình 1.6 Sự biệt hóa và sinh kháng thể của lympho B 19 Hình 1.7 Sơ đồ cấu tạo của mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv) 20 Hình 1.8 Một số cấu trúc gắn đặc hiệu kháng nguyên 21 Hình 1.9 Cấu trúc của phage mang gen mã hóa scFv 24 Hình 1.10 Cơ chế hoạt động của rituximab đối với sự suy giảm của tế

bào B

29

Hình 2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính của scFv-CH2 55 Hình 3.1 Ảnh điện di tách RNA tổng số từ bệnh phẩm 57 Hình 3.2 Ảnh điện di nhân bản gen mã hoá cho CD20 58 Hình 3.3 Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn

Hình 3.9 Biểu đồ xác định đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA sau

khi gây miễn dịch lần 4 (trước khi lấy tủy xương và lách)

Hình 3.14 Ảnh điện di sản phẩm PCR gen antiCD20 69

Hình 3.15 Ảnh điện di pET22b(+) và gen antiCD20 70

Hình 3.16 Ảnh điện di biểu hiện gen antiCD20 ở E coli BL21 71 Hình 3.17 Ảnh điện di mức độ biểu hiện scFv theo nồng độ IPTG 72 Hình 3.18 Ảnh điện di protein tái tổ hợp (scFv) theo thời gian 73 Hình 3.19 Ảnh điện di mức độ biểu hiện scFv ở các nhiệt độ khác nhau 74 Hình 3.20 Ảnh điện di mức độ biểu hiện scFv theo mật độ tế bào 75 Hình 3.21 Ảnh điện di mức độ biểu hiện scFv ở một số điều kiện tối ưu 75 Hình 3.22 Ảnh điện di mức độ hòa tan của kháng thể scFv tái tổ hợp 76 Hình 3.23 Ảnh điện di kháng thể scFv tái tổ hợp tinh sạch biến tính (B)

Hình 3.24 Nồng độ imidazol thu kháng thể scFv khi tinh sạch 78 Hình 3.25 Hình ảnh Dot blot của kháng thể scFv đặc hiệu CD20 78 Hình 3.26 Hình ảnh Western blot của kháng thể scFv đặc hiệu CD20 79 Hình 3.27 Biểu đồ xác định hàm lượng kháng thể scFv bảo quản ở các

thời gian và nhiệt độ khác nhau 80 Hình 3.28 Ảnh điện di sản phẩm PCR gen mã hóa CH2 và kháng thể scFv

(A) và nối gen mã hóa scFv và CH2 (B)

81

Hình 3.29 Ảnh điện di sản phẩm PCR gen antiCD20Fa gắn vào các

Hình 3.30 Ảnh điện di biểu hiện gen mã hóa scFv-CH2 trong 3 vector 83 Hình 3.31 Hình ảnh Western blot của kháng thể scFv-CH2 ở 3 vector 84

biểu hiện Hình 3.32 Ảnh hưởng của IPTG đến mức độ biểu hiện của scFv-CH2 86 Hình 3.33 Ảnh điện di mức độ biểu hiện của scFv-CH2 theo nhiệt độ 86 Hình 3.34 Ảnh điện di mức độ biểu hiện scFv-CH2 theo mật độ vi khuẩn 87 Hình 3.35 Ảnh điện di mức độ biểu hiện scFv-CH2 theo thời gian 88 Hình 3.36 Ảnh điện di độ hòa tan của scFv-CH2 89 Hình 3.37 Ảnh điện di scFv-CH2 tinh sạch ở nồng độ imidazol trên cột

Ni+

90

Hình 3.38 Ảnh điện di scFv-CH2 tinh sạch 90 Hình 3.39 Hàm lượng scFv-CH2 bảo quản ở nhiệt độ và thời gian khác

Hình 3.40 Hình ảnh các tế bào lympho B và kết quả ELISA xác định khả

năng liên kết của kháng thể scFv-CH2 với CD20 92 Hình 3.41 Kháng nguyên CD20 trong huyết thanh bệnh nhân NHL 94 Hình 3.42 Kết quả Western blot với huyết thanh bệnh nhân NHL 95 Hình 3.43 Biểu đồ kết quả ELISA xác định độ pha loãng của huyết thanh

bệnh nhân NHL

96

Hình 3.44 Biểu đồ kết quả ELISA so sánh hoạt tính liên kết của

scFv-CH2 với kháng thể chuẩn ở các bệnh nhân NHL

98

MỞ ĐẦU

Ung thư máu là một trong 10 loại ung thư phổ biến trên thế giới Ung thư máu được chia thành 3 loại chính: lymphoma (u lympho), leukemia và myeloma Theo thống kê của Tổ chức Nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC) ở Mĩ năm 2011, 2013 lymphoma chiếm tỉ lệ cao nhất (54%-2011, 51%-2014), tiếp đến là leukemia (31%-

2011, 33%-2013) và thấp nhất là myeloma (15%-2011, 15%-2013) trong các loại ung thư máu Ung thư lympho không Hodgkin (NHL) là một trong 2 loại của lymphoma và là loại ung thư đứng thứ 5 trên thế giới [51]

Ở Mĩ, hàng năm có hơn 66.000 trường hợp mắc mới và gần 20.000 người chết

do bệnh ung thư lympho không Hodgkin [49] Trong số các bệnh nhân ung thư lympho không Hodgkin, 85% người mắc bệnh có nguồn gốc từ tế bào lympho B và biểu hiện các chỉ thị kháng nguyên bề mặt tế bào B CD20 là chỉ thị phân tử biểu hiện chủ yếu trên tế bào B và xuất hiện khoảng 85 – 90% ở bệnh nhân NHL [52], [79], [82] CD20 không biểu hiện trong các tế bào gốc tạo máu, không dễ dàng bị đồng hóa và không bị tách rời khi gắn với kháng thể đánh dấu phóng xạ nên CD20

là một đích hấp dẫn cho liệu pháp điều trị hướng đích hay còn gọi là liệu pháp kháng thể đơn dòng (mAb) [37], [43]

Hiện nay có khoảng 28 mAb được Cục Quản lý thuốc và thực phẩm Mĩ (FDA) phê chuẩn dùng trong điều trị ung thư [80], [82] Trong đó, có 5 mAb đặc hiệu kháng nguyên CD20 được FDA phê chuẩn điều trị ung thư máu Tuy nhiên, 4 mAb đặc hiệu kháng nguyên CD20 (Rituximab, Y90- Ibritumomab, 131I-Tositumomab, Ofatumumab) có nguồn gốc từ chuột nên khi điều trị có nguy cơ bị hiện tượng HAMA và 1 kháng thể Obinutuzumab có nguồn gốc từ người được FDA phê chuẩn tháng 11 năm 2013 [78] và ở Việt Nam cũng mới dừng lại ở việc ứng dụng các kháng thể này trong chẩn đoán và điều trị bệnh

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn và góp phần vào việc nghiên cứu tạo kháng thể mới hiệu quả trong chẩn đoán và điều trị ung thư máu dạng ung thư lympho

không Hodgkin, chúng tôi thực hiện đề tài: “Biểu hiện gen mã hoá kháng thể

kháng CD20 và thử nghiệm để phát hiện CD20 trong huyết thanh của bệnh nhân ung thư lympho không Hodgkin”

Mục tiêu của luận án

1 Tạo đƣợc kháng thể dạng đơn chuỗi (scFv-CH2) có khả năng nhận biết, gắn kết đặc hiệu với kháng nguyên CD20

2 Thử nghiệm kháng thể tạo ra (scFv-CH2) phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin

Nội dung đề tài

1 Tạo kháng nguyên CD20 tái tổ hợp

2 Gây miễn dịch gà bằng kháng nguyên CD20 tạo ra

3 Thu nhận gen mã hóa kháng thể scFv từ gà gây miễn dịch

4 Tạo kháng thể scFv kháng CD20

5 Tạo kháng thể scFv-CH2 kháng CD20

6 Thử nghiệm kháng thể scFv-CH2 phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin

Ý nghĩa của luận án

 Lí luận: Góp phần hoàn thiện qui trình tạo kháng thể tái tổ hợp, kháng thể đơn chuỗi đặc hiệu kháng nguyên CD20 bằng công nghệ gen ở Việt Nam

 Thực tiễn: Sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để tạo ra kháng thể scFv,

scFv-CH2 đặc hiệu CD20 có thể sử dụng trong chẩn đoán bệnh NHL

Đóng góp mới của luận án

1 Kháng thể đơn chuỗi dạng scFv, scFv-CH2 và kháng nguyên CD20 đƣợc tạo ra bằng công nghệ gen

2 Kháng thể scFv-CH2 tạo ra có khả năng liên kết với kháng nguyên CD20

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 UNG THƯ MÁU

1.1.1 Đại cương ung thư máu

Ung thư máu là sự tăng sinh các tế bào máu một cách không bình thường, các

tế bào này thường là các tế bào bạch cầu và các tế bào tạo thành các tế bào máu Ung thư máu có thể ảnh hưởng đến tủy xương, các tế bào máu, hạch bạch huyết và các phần khác của hệ thống bạch huyết Nguyên nhân thực sự của ung thư máu hiện vẫn chưa biết rõ nhưng các nhà khoa học xác định được rằng khi cơ thể nhiễm các virus (HBV, HIV) hoặc rối loạn trong quá trình phát triển của các tế bào thuộc hệ lympho đều dẫn tới các bệnh ung thư máu Các nhà khoa học đang cố gắng xác định khi nào và tại sao cơ thể bắt đầu tạo ra các tế bào bất thường, và khi nào các tế bào này bắt đầu xâm nhập vào hệ thống máu Ở một chừng mực nào đó, những câu hỏi này đã được trả lời Các thông tin đã được sử dụng để cải thiện các ứng dụng phòng

và chữa trị bệnh ung thư máu

Phân loại ung thư máu

Dựa trên cơ sở nhóm bệnh và cơ chế sinh bệnh các nhà khoa học chia ung thư máu thành 3 nhóm lớn: Leukemia, myeloma và lymphoma [68]

Leukemia, lymphoma và myeloma đều có một số đặc điểm chung và những điểm khác biệt, chúng đại diện cho một số lượng lớn các bệnh về máu Các bệnh ung thư máu khác nhau về nguyên nhân, về mức độ phân tử và sự tiến triển tự nhiên của mỗi bệnh Trong thập kỷ vừa qua, cuộc cách mạng trong lĩnh vực sinh học phân

tử cùng hàng loạt kinh nghiệm, phương pháp và thiết bị hiện đại giúp quá trình sàng lọc phân loại các bệnh ung thư máu thuận lợi và chính xác hơn Có sự khác biệt về mặt phân tử giữa tế bào bình thường với tế bào ung thư và sự khác biệt rõ ràng giữa các tế bào của các loại ung thư khác nhau

 Leukemia (bệnh bạch cầu)

Leukemia là dạng ung thư các tế bào máu, thường là các tế bào bạch cầu Các tế bào leukemia nhìn khác biệt so với các tế bào thông thường và không có khả

năng thực hiện chức năng của mình Ung thư có thể xảy ra hoặc trong các tế bào bạch cầu trong hệ lympho hoặc trong các tế bào tủy Khi ung thư phát triển ở các tế bào lympho thì người ta gọi là lymphocytic leukemia, khi ung thư phát triển ở các tế bào hạt hoặc tế bào đơn nhân thì người ta gọi là myelogenous leukemia

Mỗi loại leukemia trên lại gồm có hai dạng: cấp tính và mạn tính [9] Dạng ung thư máu cấp tính là tình trạng bệnh lí cấp tính của tế bào sinh máu non - tế bào chưa chín, tủy xương có trên 30% tế bào non trong tổng số tế bào có nhân, chúng được chia hai nhóm chính: Ung thư tế bào lympho cấp và ung thư dòng tuỷ cấp Còn dạng leukemia mạn tính là một nhóm bệnh tăng sinh tủy đơn dòng hay nhiều tế bào sinh máu trong tủy hoặc tăng tạo máu các cơ quan ngoài tủy (lách và gan) Các

tế bào này sinh trưởng chậm và số lượng tăng cũng chậm do đó bệnh tiến triển từ

từ

Theo theo thống kê của Tổ chức Nghiên cứu ung thư quốc tế năm 2011 ở Mĩ

có 274930 người mắc các bệnh Leukemia [49], tỉ lệ mỗi loại là:

- Ung thư tế bào lympho cấp (Acute lymphocytic leukemia-ALL): 13%

- Ung thư tế bào lympho mạn tính (Chronic lymphocytic leukemia-CLL): 33%

- Ung thư dòng tuỷ cấp (Acute myelogenous leukemia-AML): 29%

- Ung thư dòng tuỷ mạn tính (Chronic myelogenous leukemia-CML): 12%

- Các dạng ung thư leukemia khác: 14%

 Myeloma (u tủy)

Là bệnh ung thư tương bào (plasma cells - cơ quan chịu trách nhiệm sản xuất kháng thể), thuộc tủy xương với sự có mặt của tổn thương xương, tăng tương bào non, xuất hiện protein đơn dòng trong huyết tương và nước tiểu, đau xương, tăng

Ca++ máu và thiếu máu [9]

Nguyên nhân của bệnh hiện chưa được làm rõ, nhưng chúng thường có các triệu chứng sau: đau xương, xuất hiện vết nứt trong xương, ốm yếu, mệt mỏi, giảm cân, có vấn đề trong hệ tiêu hóa, đau hoặc tê cóng chân Các triệu chứng này của u tủy thường khá giống so với các triệu chứng bệnh khác về xương nên để xác định rõ ràng cần phải có các xét nghiệm lâm sàng cụ thể

Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới năm 2001 tỉ lệ mắc bệnh nam/nữ là 1:1 [68] Theo Tổ chức Nghiên cứu ung thư quốc tế năm 2011 ở Mĩ có 74.814 người mắc bệnh myeloma, trong đó có 20.520 trường hợp mắc mới (11.400 nam

và 9.120 nữ) [49]

 Lymphoma (u lympho/u bạch huyết)

“Lymphoma” là thuật ngữ chung cho nhiều loại ung thư máu có nguồn gốc

từ hệ bạch huyết Lymphoma là kết quả khi một loại tế bào bạch cầu trải qua sự thay đổi ác tính và phát triển không có sự kiểm soát U lympho ác tính liên quan trực tiếp tới sự tăng sinh của dòng tế bào lympho, khác với bệnh leukemia, lymphoma xuất phát chủ yếu từ hạch bạch huyết, trong khi leukemia có nguồn gốc chủ yếu từ tủy xương

Do đặc điểm của lymphoma là liên quan trực tiếp tới sự tăng sinh dòng tế bào lympho B tại các cơ quan của hệ bạch huyết, nên lymphoma liên quan trực tiếp tới hệ miễn dịch của cơ thể, trong đó hệ bạch huyết đóng vai trò chủ đạo

Biểu hiện rõ nét của lymphoma là sự tăng sinh các tế bào lympho B trong các

cơ quan bạch huyết và tạo nên các khối u, nhất là tại các hạch bạch huyết ở vùng cổ, vùng nách, ngực và háng Tuy nhiên, vì các tế bào lympho còn phân bố ở khắp nơi trong cơ thể nên lymphoma có thể phát sinh ở ngoài hệ thống hạch và ngoài tổ chức bạch huyết như ở xương, dạ dày, ruột, vú, tuyến giáp trạng, não

Lymphoma được phân loại dựa trên hai cơ sở: hình dạng tế bào và mô hình phát triển của các quần thể tế bào ung thư Dựa trên hai đặc điểm này, người ta chia lymphoma thành hai nhóm chính: nhóm ung thư lympho không Hodgkin (NHL) và

u lympho Hodgkin (HD) [68]

1.1.2 Tình hình ung thư máu trên thế giới và ở Việt Nam

Tình hình ung thư máu trên thế giới

Ung thư máu là một trong 10 loại ung thư phổ biến ở các nước trên thế giới Theo thống kê của IARC năm 2011 ở Mĩ [49], khoảng 4 phút có một trường hợp được chẩn đoán ung thư máu và có 140310 trường hợp phát hiện mới, chiếm 9% tổng số các loại ung thư Đến năm 2013, số trường hợp mắc mới tăng lên là 156420,

chiếm 9,4% tổng số các loại ung thư Trong 3 loại ung thư thì tỉ lệ mắc mới ở lymphoma cao nhất (54% - 2011; 51% - 2013), tiếp đến là leukemia (32% - 2011; 33% - 2013) và myeloma (15% - 2011; 15% - 2013) (Hình 1.1)

Tần suất mắc mới trên 100.000 dân năm 2011 xấp xỉ bằng năm 2013 ở 3 loại ung thư máu (leukemia: 12,5 - 2011; 12,8 - 2013); (lymphoma: NHL 19,8 - 2011; 19,7 - 2013; HL 2,8 - 2011, bằng 2013); (Myeloma: 5,7 - 2011; 5,9 - 2013) [49], [50] Trong đó, NHL và HL là loại ung thư phổ biến nhất ở trẻ em từ 0 đến 19 tuổi

Số người chết vì ung thư máu mỗi ngày có gần 145 người, hơn 6 người chết trong 1 giờ Tuy nhiên, tỉ lệ chết vì ung thư máu đã giảm từ năm 1999 đến 2008

Tình hình ung thư máu ở Việt Nam

Theo ghi nhận của Nguyễn Trần Anh Thư và cộng sự trong 2 năm 2007) bệnh nhân điều trị u lympho Hodgkin/bệnh lympho ác tính chung tại Bệnh viện Ung bướu Thành phố Hồ Chí Minh là 6,2%, tỉ lệ mắc bệnh nam/nữ là 1,7/1, chiếm tỉ lệ cao là 15-35 tuổi (46,2%) và trên 55 tuổi (32,3%) [11]

(2006-Năm 2008, ung thư máu được thống kê ở 5 tỉnh (Hà Nội, Hải Phòng, Huế, Cần Thơ, Thái Nguyên) là chiếm vị trí hàng đầu trong các loại ung thư phổ biến ở trẻ em [1] Năm 2010, tỉ lệ mắc bệnh NHL chuẩn theo tuổi là 6,3 và 3,7/100.000 dân, đứng thứ 7 ở nam giới và đứng thứ 9 ở nữ trong các loại ung thư Bệnh có tỉ lệ mắc cao ở nhóm tuổi 35-40 và 50-55 [2] Năm 2013, theo nghiên cứu của Nguyễn

Hình 1.1 Trường hợp mắc mới các bệnh ung thư máu ở Mĩ năm 2011(A) và

2013 (B) [49], [50]

(TH mắc mới: Trường hợp mắc mới)

Kim Lưu và cộng sự cho thấy bệnh NHL tuổi mắc trung bình là 50,9 ± 15,3, ung thư tập trung lứa tuổi 40 – 60 và tỉ lệ mắc theo giới nam/nữ là 2,3/1 [8]

1.1.3 Các phương pháp chẩn đoán và điều trị ung thư máu

Các phương pháp chẩn đoán

Chẩn đoán xác định ung thư máu là bước đầu tiên quan trọng nhất khi bệnh nhân ung thư đến khám bệnh Quá trình chẩn đoán ung thư từ đơn giản như hỏi, khám bệnh bằng nhìn, sờ, gõ, nghe đến phức tạp hơn như làm các xét nghiệm cận lâm sàng gồm có:

(1) Xét nghiệm máu; (2) Sinh thiết tế bào Trong một số trường hợp, cần nhuộm hóa mô miễn dịch với một số chỉ thị phân tử: tế bào B (CD10, CD20, CD21, CD23, CD20, CD55, CD19), tế bào T (CD3, CD5, CD43, CD45R0) để chẩn đoán phân biệt hay chẩn đoán xác định; (3) Chụp Xquang được chỉ định cho những bệnh nhân

có triệu chứng ung thư phổi hay ung thư máu ở các vị trí khác có thể di căn vào phổi Siêu âm, chụp cắt lớp vi tính, chụp cộng hưởng từ; (4) Chẩn đoán bằng xác định biến đổi gen: Kazenwadel J và cộng sự đã phát hiện biến đổi gen GATA2 có

thể gây bệnh u tủy và bệnh bạch cầu cấp tính (AML) [71] Đây là một phát hiện

khoa học đột phá và quan trọng đối với việc điều trị và phát hiện sớm căn bệnh

nguy hiểm này

Phương pháp điều trị

Năm 1960, chỉ có 4% trẻ em chẩn đoán mắc bệnh leukemia được cứu sống Ngày nay, 79% hy vọng sống sót nếu họ nhận được sự điều trị tốt Bệnh nhân ung thư máu được cứu sống với tỉ lệ rất cao, điều này cho thấy việc nghiên cứu chẩn đoán và chữa trị bệnh trong những năm qua rất thành công Hóa trị liệu và xạ trị là các liệu pháp đã được sử dụng trong điều trị ung thư máu từ rất lâu Tuy nhiên, các liệu pháp này gây ra nhiều tác dụng phụ cho người bệnh và kết quả điều trị không như mong muốn Những liệu pháp mới hơn như ghép tủy và các liệu pháp sinh học

(liệu pháp miễn dịch, liệu pháp gen và điều trị đáp ứng nhân tố gây bệnh

(Risk-Adapted Therapy) đang được nhiều nhà khoa học nghiên cứu và cũng đã thu được những kết quả nhất định [49]

1.1.4 Bệnh ung thư lympho không Hodgkin (Non-Hodgkin lymphoma)

U lympho ác tính là nhóm bệnh của hệ lympho ngoại vi, chia 2 nhóm: Hodgkin lympho với đặc điểm có tế bào RS (Reed Sternberg) và non Hodgkin lympho (NHL) với đặc điểm thâm nhiễm lympho nhiều nơi

Bệnh NHL là sự tăng sinh các tế bào lympho B trong các cơ quan bạch huyết

và tạo nên các khối u, nhất là tại các hạch bạch huyết ở vùng cổ, vùng nách, ngực và bẹn NHL là ung thư phổ biến thứ 5 trên thế giới [51] NHL tăng hơn 82,5% từ năm

1975 đến 2008, trung bình hàng năm tăng khoảng 2,4% Tỷ lệ bệnh NHL cao hơn nhiều so với bệnh ung thư lympho Hodgkin (HL) và có xu hướng tăng ở cả nam và

nữ Theo thống kê của IARC tỷ lệ bệnh NHL năm 2011 và 2013 bằng nhau (chiếm 88,5%) trong tổng số người mắc bệnh u lympho ở Mĩ và phụ thuộc theo tuổi [49], [50]

Phân loại NHL

Có nhiều cách phân loại NHL khác nhau nhưng có 2 cách phân loại được sử dụng phổ biến trong chẩn đoán và điều trị hiện nay là phân loại theo WHO [42] ở bảng 1.1 và Working Formulation ở bảng 1.2 [106]

Bảng 1.1 Phân loại NHL theo WHO - 2008

3 Tế bào lympho lớn, lan tỏa (Diffuse Large Cell Lymphoma)

 Tế bào lympho B lớn, lan tỏa (Diffuse Large B Cell

Lymphoma)

 Tiền tế bào lympho T (Peripheral T Cell Lymphoma)

 Tế bào lympho T lớn (Anaplastic Large T Cell

(Angioimmunoblastic T Cell Lymphoma)

4 U lympho nguyên bào (Lymphoblastic Lymphoma)

 T Lymphoblastic Lymphoma

 B Lymphoblastic Lymphoma

4 (80%)

1 (20%)

5 U lympho nguyên bào miễn dịch (Immunoblastic Lymphoma) 3 (100%)

Bảng 1.2 Phân loại NHL trong điều trị (Working Formulation - 1982)

1 Độ ác tính thấp

 Tế bào lympho nhỏ, lan tỏa

 Tế bào nang, nhỏ, nhân chẻ

 Tế bào nang hỗn hợp: to, nhỏ xen kẽ

2 Độ ác tính trung gian

 Tế bào lympho nhỏ, lan tỏa, nhân chẻ

 Tế bào lan tỏa, hỗn hợp (to, nhỏ)

 Tế bào lan tỏa, tế bào lớn

triệu chứng nào NHL của họ chỉ có thể phát hiện khi xét nghiệm máu [9]

Các yếu tố nguy cơ

Nguyên nhân chính gây bệnh NHL cho đến nay chưa được biết rõ Có một số yếu tố có thể gây bệnh NHL như:

- Virut: lây nhiễm virut (EBV) và vi khuẩn H pylori Tuy nhiên, bệnh NHL không

lây nhiễm từ người này sang người khác

- Hệ miễn dịch: người suy giảm hệ thống miễn dịch mắc phải (AIDS) hoặc những người đang uống thuốc chống miễn dịch khi ghép tạng có thể tăng khả năng phát triển bệnh NHL

- Tuổi: nhóm người có nguy cơ mắc bệnh NHL cao là từ 20-24 tuổi và trên 60 tuổi

- Môi trường: nhiễm các chất hóa học (benzen, chất độc da cam) và tia phóng xạ

- Lịch sử bệnh của gia đình: Các thành viên trong gia đình, đặc biệt là anh chị em song sinh có người mắc bệnh NHL hay các bệnh liên quan đến lympho thì khả năng mắc bệnh NHL càng cao [38]

Chẩn đoán

Để chẩn đoán bệnh NHL ngoài các phương pháp cơ bản như xét nghiệm máu, chụp Xquang, chụp cộng hưởng từ thì sinh thiết tế bào và làm hóa mô miễn dịch xác định một số chỉ thị phân tử CD trên bề mặt tế bào lympho là rất cần thiết Một số chỉ thị phân tử được sử dụng trong chẩn đoán NHL như: CD20, CK, CD15, CD3, CD79, CD30, CD45, CD79a, CD43 Tuy nhiên, CD20 là chỉ thị có tần số xuất hiện cao trên bề mặt tế bào lympho B ác tính

Ngoài ra, phương pháp chẩn đoán chụp ảnh phóng xạ qua kháng thể đơn dòng cũng rất hiệu quả

Điều trị

Các liệu pháp hóa trị và phóng xạ được sử dụng phổ biến trong điều trị NHL, nhưng các liệu pháp này thường gây ra nhiều tác dụng phụ và hiệu quả điều trị không như mong muốn

Ngày nay, liệu pháp điều trị hướng đích hay liệu pháp kháng thể đơn dòng là một liệu pháp điều trị mới với các bệnh nhân ung thư máu đặc biệt là dạng NHL Có hơn 350 chỉ thị phân tử CD (kháng nguyên) Tất cả các tế bào có thể có một hay nhiều chỉ thị trên đó Hầu hết chúng có vai trò bảo vệ cơ thể khỏi sự lây nhiễm các

tác nhân có hại [83] Trong số các kháng nguyên bề mặt, CD20 có tần số xuất hiện cao (hơn 90% ở bệnh NHL), được lựa chọn làm mục tiêu phân tử điều trị bệnh NHL

và một số bệnh khác như bệnh ung thư tế bào lympho mạn tính và viêm khớp dạng thấp (RA)

Hiện nay, ở nước ta nhiều bệnh nhân NHL được điều trị bằng mAb (chủ yếu

là rituximab) kết hợp với hóa chất (R-CHOP) đã thu được kết quả tốt Theo nghiên cứu của Trần Quốc Hùng tại bệnh viện 198 bệnh nhân NHL điều trị bằng phác đồ R-CHOP và CHOP tỉ lệ đáp ứng hoàn toàn là 52%, đáp ứng bán phần 20% và không đáp ứng là 28% [5] Lê Thị Khánh Tâm theo dõi 23 bệnh nhân NHL điều trị bằng phác đồ R-CHOP cho thấy tỉ lệ đáp ứng hoàn toàn sau 6 đợt là 82,6%, kết quả này thấp hơn nghiên cứu của Van Oers và cộng sự (85,1%) [120], nhưng lại cao hơn nghiên cứu của Lê Thanh Tú (71%) [12]

1.2 KHÁNG NGUYÊN CD20

1.2.1 Cấu trúc gen và protein CD20

Một số kháng thể đơn dòng kháng CD20 đã thành công trong điều trị bệnh ung thư máu dạng ung thư lympho không Hodgkin [25], [35], [43] Tuy nhiên, chúng ta biết rất ít về mặt sinh học của CD20 và sự hiểu biết về phân tử này chủ yếu dựa trên cấu trúc gen và protein

Cấu trúc gen CD20

Gen mã hóa CD20 gồm 8 exon, dài 16 kb và đã được tách dòng thành công năm 1988 [116] Gen này nằm ở nhiễm sắc thể số 11 trên nhánh dài vùng q12-q13.1 (11q12-q13.1), nằm gần sát các gen mã hóa chuỗi FcRIβ và các protein HTm4 Dựa trên sự biểu hiện của tế bào, cấu trúc gen CD20 ở người, chuột và thỏ khá giống nhau Tuy nhiên, theo Liang và Tedder đã xác định một số thành viên họ mới,

mô tả nhóm lớn hơn như họ gen MS4Ab gồm 21 protein khác biệt giữa người và chuột [81]

Gen CD20 không có hộp TATA cổ điển và thay vào đó là sự xuất hiện một

số vị trí mở đầu khác nhau Do vậy, quá trình phiên mã bắt đầu ở một số điểm khác nhau ở exon 1 và 2 dẫn đến sự khác nhau về chiều dài phân tử mRNA từ 2,6 đến 3,4

kb Mặc dù có sự khác nhau về chiều dài của mRNA nhưng vùng dịch mã được bắt đầu từ ở exon 3, do đó tạo nên protein có cấu trúc đơn giản

Cấu trúc protein CD20

Kháng nguyên CD20 có bản chất là phosphoprotein gồm 297 amino acid với khối lượng phân tử 33-36 kDa Tiên đoán từ trình tự cDNA và dữ liệu thực nghiệm [35], [48] cho thấy protein này đặc trưng bởi 4 vùng xuyên màng, 2 đầu tận cùng

NH2- và COOH- đều nhúng trong tương bào, có 2 vòng không glycosyl hóa nằm ở ngoại bào: 1 vòng nhỏ 13 amino acid (từ aa thứ 72 đến 80), vòng lớn 41 amino acid (từ aa thứ 142 đến 182) (Hình 1.2) Cả 2 vòng nằm ở ngoại bào đều chứa các cấu trúc quyết định các loại kháng thể đặc hiệu kháng nguyên CD20 hiện có, bao gồm Rituximab (kháng thể đơn dòng (mAb) kháng CD20 được FDA phê chuẩn dùng trong điều trị bệnh u lympho không Hogdkin (NHL) đầu tiên Cấu trúc bậc hai vùng vòng ngoại bào phụ thuộc vào hai amino acid, alanine và proline tại vị trí 170 và

172 tương ứng Đột biến gen mã hóa các amino acid này làm tất cả các kháng thể mất khả năng gắn với CD20 [41], [44]

1.2.2 Chức năng của CD20 trong cơ thể

Kháng nguyên CD20 biểu hiện ở lympho bào B từ giai đoạn sớm (pre-B) tới giai đoạn muộn (late B), sự biểu hiện được cho là ngừng lại khi tế bào B biệt hóa thành tương bào (plasma cell) (Hình 1.3) [27]

Hình 1.2 CD20 biểu hiện trên màng tế bào B [28]

Hiện nay, chức năng của CD20 vẫn chưa được biết đầy đủ nhưng nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, với cấu trúc đặc biệt gồm 4 vùng xoắn xuyên màng và vùng nhúng trong tương bào có thể bị phosphoryl hóa, CD20 đóng vai trò như một kênh vận chuyển xuyên màng hay một kênh ion Sau khi gắn với các phân tử (kháng thể)

có khả năng nhận biết và gắn đặc hiệu với nó sẽ gây ra:

- Sự dịch chuyển vị trí của các CD20 vào “mảng” lipid giàu sphingolipid và cholesterol trên màng tế bào (Hình 1.4)

- Hòa các “mảng” lipid ở cạnh nhau này thành những mảng lớn hơn Chính sự tập trung CD20 và tạo thành các mảng lipid lớn làm tăng nồng độ tại chỗ của CD20, tạo điều kiện thuận lợi cho sự oligomeric hóa cũng như sự hoạt động như một kênh vận chuyển ion Ca2+ của các kháng nguyên CD20

- Hoạt hóa các protein kinase, phosphoryl hóa CD20, làm ổn định “kênh” CD20 ở trạng thái hoạt động

Hình 1.3 Tiến trình biểu hiện của CD20 [53]

Hình 1.4 Sự chuyển vị trí của CD20 vào “mảng” lipid sau khi gắn kháng thể [28]

Chính những thay đổi này làm thay đổi các tín hiệu trong tế bào, tăng nồng độ Ca2+ nội bào, dẫn đến ức chế chu trình tế bào, ức chế tăng sinh và biệt hóa lympho B và cuối cùng là dẫn đến sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis)

[28], [41]

CD20 có vai trò như kênh calci

Cấu trúc của CD20 dẫn đến giả thuyết CD20 có thể hình thành một kênh trên màng tế bào và đóng vai trò điều chỉnh dòng chảy ion Giả thuyết này được đưa ra bởi thực tế CD20 có cấu trúc rất tương đồng với FcRIβ mà FcRIβ liên quan đến

độ dẫn truyền calci [28] Bubien và cộng sự [26] đã chứng minh sự vận chuyển của CD20 vào các dòng tế bào CD20 âm tính dẫn đến tăng nồng độ calci trong tương bào Có lẽ hầu hết sự biểu hiện ở các tế bào B, nơi các kháng thể kháng CD20 xuất hiện và gây ra các dòng vận chuyển calci khác nhau phản ứng với kháng thể đơn dòng đã sử dụng Tuy nhiên, tác giả khác lại chứng minh: Gắn CD20 với kháng thể đơn dòng có các tác động khác nhau lên chu kì sinh trưởng tế bào (có thể kìm hãm hoặc kích thích sự tăng trưởng của CD20) [116] Vì vậy, các tác động về chức năng khác nhau của kháng thể đơn dòng kháng CD20 liên quan một phần đến sự khác nhau trong vận chuyển calci mà chúng gây ra

1.2.3 Kháng nguyên CD20 – mục tiêu phân tử trong chẩn đoán và điều trị ung

thư máu và ung thư lympho không Hodgkin

CD20 là một đích phân tử có nhiều ưu điểm hơn so với các đích phân tử khác được lựa chọn trong điều trị ung thư máu:

- CD20 biểu hiện với nồng độ cao trên bề mặt lympho B khi so sánh với các mục tiêu phân tử khác (hơn 250 000 phân tử CD20 trên một tế bào B) Điều này cho phép tập trung mật độ các phân tử gắn đặc hiệu với nó trên bề mặt tế bào, tăng hiệu quả tiêu diệt tế bào đích và đặc biệt có ý nghĩa đối với hiệu quả gây độc phụ thuộc bổ thể (CDC) [58]

- Với cấu trúc có 4 chuỗi xuyên màng cho phép CD20 bám chắc vào màng tế bào, thậm chí sau khi liên kết với phân tử gắn đặc hiệu, CD20 có thể bám trên màng trong nhiều giờ thậm chí đến nhiều ngày Đây là ưu điểm nổi trội hơn so với các mục tiêu phân tử khác trên lympho B (ví dụ so với CD22) [58]

- CD20 khó bị đồng hóa sau khi gắn với các cấu trúc gắn đặc hiệu, do đó giảm

sự tiêu thụ các cấu trúc nhận biết và gắn đặc hiệu với kháng nguyên CD20 của các tế bào đích [58]

- Hai vòng ngoài của CD20 là nơi chứa hầu hết các epitope của nó không xa màng tế bào nên các phân tử gắn đặc hiệu với nó rất thuận lợi cho hiệu ứng gây độc phụ thuộc bổ thể (CDC) [58]

Với những ưu điểm nói trên, CD20 đang là một mục tiêu phân tử quan trọng trong điều trị ung thư liên quan tới sự tăng sinh các tế bào lympho B ác tính Thực

tế trong điều trị ung thư máu, thành công trong điều trị được ghi nhận cho đến nay chủ yếu là các cấu trúc gắn đặc hiệu kháng nguyên CD20 Hiện nay, số lượng các nghiên cứu về CD20 và cấu trúc gắn đặc hiệu kháng nguyên CD20 tăng lên nhanh chóng và những “cấu trúc” này đang được “thiết kế” mới nhằm tăng hiệu quả điều trị [16]

Hiện nay, nhiều bệnh viện trong nước và trên thế giới đã dựa vào sự xuất hiện các chỉ thị phân tử trên bề mặt tế bào lympho để chẩn đoán bệnh thông qua phương pháp xét nghiệm hóa mô miễn dịch, đếm tế bào dòng chảy, CD20 biểu hiện khoảng 85 – 90% ở bệnh NHL và biểu hiện thấp hơn ở các loại ung thư máu khác [52] Theo các nghiên cứu CD20 có thể xuất hiện ở tủy sống, máu ngoại biên [125], huyết tương [88], và huyết thanh [57]

Vì vậy, để có thể chẩn đoán sớm và đơn giản khi lấy mẫu xét nghiệm, ngoài

ra có thể theo dõi sự tiến triển của bệnh trước và sau khi điều trị thì một số nhà khoa học đã nghiên cứu xác định sự có mặt của CD20 trong máu, huyết tương và huyết thanh bệnh nhân Ở bệnh nhân ung thư tế bào lympho mạn tính, Manshouri và cộng

sự đã xác định được CD20 có trong huyết tương với nồng độ cao (từ 52,89 đến

15740 nM) [88], Alatrash và cộng sự cũng xác định CD20 trong máu ngoại biên trung bình là 257 nmol/l [15] Ở bệnh nhân ung thư lympho không Hodgkin và ung thư lympho Hodgkin, Giles và cộng sự đã xác định sự có mặt của CD20 trong huyết thanh của một số bệnh nhân này [57] Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ CD20 ở bệnh NHL (341 nmol/l) cao hơn ở bệnh HD (73 nmol/l)

CD20 có trong máu, huyết tương hay huyết thanh có thể là kết quả của sự đứt gãy hay vỡ các tế bào lympho thành các mảnh mà các mảnh có CD20 bám trên

đó, các mảnh vỡ này có thể di chuyển tự do trong máu [88]

Từ những nghiên cứu trên, trong đề tài này chúng tôi thử nghiệm kháng thể tạo ra để phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân ung thư lympho không Hodgkin

1.2.4 Tình hình nghiên cứu kháng nguyên CD20 tái tổ hợp

Kháng nguyên CD là những protein màng biểu hiện chủ yếu trên các tế bào miễn dịch (tế bào lympho) Một số lượng nhỏ CD được biểu hiện trên các tế bào nội

mô, hồng cầu và tế bào gốc Köhler và Milstein đã chứng minh mô hình của kháng nguyên CD hòa tan xuất hiện trong máu tương quan với sự biểu hiện của các bệnh

cụ thể [75] Điều này cho thấy các protein CD có thể sử dụng cho việc chẩn đoán nhiều loại bệnh khác nhau Số lượng chỉ thị phân tử CD được phát hiện đã tăng đáng kể, năm 2002 có hơn 250 CD [83] đến năm 2010 có hơn 350 CD [30] Hiện nay có hơn 300 kháng nguyên CD đã được sản xuất và thương mại hóa (một số công ty cung cấp như Sino Biologycal, ACRO Biosystems, NovateinBio)

CD20 là một trong số chỉ thị phân tử đích tiềm năng trong chẩn đoán, điều trị bệnh ung thư máu và một số bệnh tự miễn dịch Từ năm 1988, có một vài nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên CD20 tái tổ hợp với các mục đích khác nhau [46]

Phân tử CD20 có chiều dài đầy đủ đã đƣợc tách dòng và biểu hiện, tuy nhiên kháng nguyên này tồn tại ở dạng thể vùi và bị lỗi khi cuôn xoắn thành phân tử protein có hoạt tính [48] Các nghiên cứu khác nhƣ, phân tử CD20 có chiều dài đầy đủ gắn vào vector biểu hiện sau đó biến nạp vào tế bào động vật và biểu hiện trên bề mặt tế bào này để nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của CD20 [26] Vùng ngoại bào của phân tử CD20 đƣợc biểu hiện trên bề mặt phage M13K07 và phage tái tổ hợp đƣợc

sử dụng để gây miễn dịch ở động vật [130] Ngoài ra, gen mã hóa cho vùng ngoại

bào của CD20 gắn vào vector biểu hiện pET32a(+) và biểu biện ở E.coli Kháng

nguyên thu đƣợc có hoạt tính, ở dạng hòa tan và bền, có thể sử dụng trong phản ứng ELISA, Western blot, sàng lọc, tinh sạch và gây miễn dịch [17]

Hầu nhƣ các kháng thể đặc hiệu kháng nguyên CD20 đƣợc ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị bệnh hiện nay đều kháng lại vùng ngoại bào của CD20 [117]

Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi tách dòng và biểu hiện đoạn gen mã hóa cho vùng ngoại bào của CD20

Các kháng thể có cấu tạo hình chữ Y, có hai bộ “cành” gắn vào một “thân” Các đầu của Y (Fab) đƣợc gọi là các vùng biến đổi còn thân (Fc) là một vùng cố định Kháng thể gồm 4 chuỗi polypeptide, 2 chuỗi nặng và 2 chuỗi nhẹ Mỗi chuỗi

có 2 vùng, vùng V (variable) biến đổi và vùng C (constant) cố định

Ở chuỗi nhẹ, vùng biến đổi và cố định lần lƣợt là VL, CL Chuỗi nặng có 2 vùng VH, CH (CH1, CH2, CH3) Chuỗi nặng và chuỗi nhẹ đƣợc nối với nhau bởi 1 cầu disulfide, 2 chuỗi nặng đƣợc nối với nhau bởi 2 cầu disulfide Kiểu của chuỗi nặng quyết định kiểu lớp của Ig (IgA, IgD, IgG, IgM và IgE) [3], [107]

Sự kết hợp giữa VL và VH tạo nên vị trí nhận biết và gắn đặc hiệu với kháng nguyên (paratope) Các vùng siêu biến đổi hoặc vùng quyết định bổ trợ (CDR: CDR1, CDR2, CDR3) được xác định trong vùng biến đổi, có vai trò quan trọng nhất đến việc gắn kháng nguyên của kháng thể Ngược lại, các vùng cố định không

có vai trò nhận diện kháng nguyên, chúng làm nhiệm vụ cầu nối với tế bào miễn dịch cũng như các bổ thể

Trong chuỗi nặng, giáp ranh giữa CH1 và CH2 gọi là vùng bản lề (hinge) Vùng bản lề có đặc tính linh động giúp 2 cánh tay của kháng thể di động được, nhờ

đó mà nó có thể đồng thời kết hợp dễ dàng với các epitope ở xa nhau Vùng bản lề còn là nơi dễ bị tác động bởi các enzyme như papain, pepsin Khi xử lí IgG với papain thu được 3 mảnh: 2 mảnh Fab (Frangment antigen - binding) và 1 mảnh Fc (Frangment crystalizable) [107] Cấu trúc phân tử của một kháng thể hoàn chỉnh được minh họa trong Hình 1.5

Kháng thể có các chức năng như liên kết với kháng nguyên; hoạt hóa bổ thể tiêu diệt các vi khuẩn xâm hại (bằng cách: đục các lỗ thủng trên vi khuẩn, tạo điều kiện cho hiện tượng thực bào, thanh lọc các phức hợp miễn dịch và phóng thích các phân tử hóa hướng động; hoạt hóa các tế bào miễn dịch và các chức năng phụ khác

Hình 1.5 Sơ đồ cấu tạo của kháng thể [93]

(Vùng CH1 có thể cố định cấu phần C4 của bổ thể và có thể được nhận biết bởi một

số yếu tố: Liên kết với protein A của tụ cầu trùng, phân hủy và di chuyển qua nhau thai ) [3]

1.3.2 Kháng thể đơn dòng (mAb)

Lympho B là tế bào chịu trách nhiệm sinh kháng thể Quá trình biệt hóa lympho B bắt đầu khi các gen mã hóa cho các globulin miễn dịch sắp xếp thành các chuỗi và mã hóa cho tính đặc hiệu với các kháng nguyên nhất định Khi gặp các kháng nguyên đặc hiệu, cùng với sự kích thích của lympho T hỗ trợ, các dòng lympho B này tăng sinh và biệt hóa thành tương bào sản xuất ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên ấy (Hình 1.6) [40] Mỗi tế bào lympho B chỉ có thể sản xuất một loại kháng thể đặc hiệu với một epitope kháng nguyên nhất định Thông thường một

tế bào B sản xuất đồng thời nhiều lớp kháng thể, chúng khác nhau ở vùng cố định của các chuỗi nặng nhưng giống nhau ở tính đặc hiệu với một kháng nguyên Đây là

cơ sở cho kháng thể đơn dòng (mAb) ra đời và có tên gọi như vậy [3]

Kháng thể đơn dòng là thuật ngữ chỉ các kháng thể đồng nhất nhận được từ một dòng tế bào B và có một vị trí kết hợp kháng nguyên (epitope) y hệt nhau, nghĩa là kháng thể đơn dòng là tập hợp các kháng thể giống nhau cùng nhận biết và

Hình 1.6 Sự biệt hóa và sinh kháng thể của lympho B [40]

gắn kết với một loại epitope Ngược lại, các kháng thể đa dòng là tập hợp Hnhiều loại kháng thể không giống nhau và nhận biết các epitope khác nhau [3], [111] Các kháng thể đơn dòng có thể được tổng hợp theo các phương pháp sau:

(1) Phương pháp tạo tế bào hybridoma của Kohler và Milstein khi dung hợp các tế bào myeloma với các tế bào sản xuất kháng thể tách từ chuột đã gây miễn dịch [75] (2) Phương pháp DNA tái tổ hợp [98]

(3) Phương pháp tạo các kháng thể phage của Clackson, 1991 [34], nghĩa là tạo thư viện các vùng biến đổi của kháng thể và bộc lộ chúng trên bề mặt phage

1.3.3 Kháng thể đơn chuỗi (kháng thể scFv)

Kháng thể đơn chuỗi hay kháng thể scFv là kháng thể có kích thước nhỏ nhất, là protein dung hợp các vùng biến đổi của chuỗi nặng (VH) và chuỗi nhẹ (VL) của các globulin miễn dịch, được nối với nhau bằng một đoạn nối (linker peptit) ngắn khoảng 15 amino acid có trình tự (Gly4Ser)3 Đoạn nối này thường giàu Glycine để tạo tính linh hoạt, cũng như giàu serine cần cho khả năng hòa tan và có thể kết nối vùng đầu N của VH với vùng đầu C của VL hay ngược lại, [124], [63] Đoạn nối cho phép vùng biến đổi của chuỗi nặng (VH) kết hợp với vùng biến đổi của chuỗi nhẹ (VL) tạo thành phân tử đơn chuỗi (scFv) ScFv được biểu hiện như một chuỗi polypeptide đơn và được mã hóa bởi một gen [23] Và scFv vẫn bảo tồn hoạt tính nhận biết và liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích

Ứng dụng trong chẩn đoán, scFv có thể được sử dụng để xác định các loại tế bào khác nhau trong huyết thanh hay đếm các tế bào đó [131]

Hình 1.7 Sơ đồ cấu tạo của mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv) [31]

Để tăng hiệu quả trong điều trị, từ scFv các nhà khoa học có thể tạo ra các loại “mảnh” kháng thể khác như: Fab, diabody, minibody (2 scFv-CH3 của người), scFv-Fc,… (Hình 1.8) [99] Trong đó, scFv-Fc là dạng có cấu trúc gần với cấu trúc của phân tử mAb hoàn chỉnh nhất, nó giữ được phần Fc có nguồn gốc từ người Vì vậy, khi sử dụng trong điều trị, scFv hiệu quả trong việc gây phản ứng miễn dịch khi cần tới sự có mặt của Fc (như gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể - ADCC, CDC) [73]

Để thay thế sử dụng các phân tử mAb truyền thống, các mảnh kháng thể cần đảm bảo 4 đặc điểm sau:

(1) Có ái lực cao và liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích

(2) Đảm bảo độ bền với thời gian cần thiết ở nhiệt độ cơ thể cũng như trong quá trình bảo quản

(3) Phù hợp sản xuất ở quy mô lớn để đảm bảo số lượng cần thiết cho điều trị (4) Không kích thích sinh miễn dịch ở người sử dụng

Hiện nay, scFv là kháng thể phổ biến nhất của kháng thể tái tổ hợp, so với kháng thể mAb thì các scFv đã có nhiều ưu điểm như:

(1) Được tạo ra khá dễ dàng với một lượng lớn và chi phí thấp

(2) scFv có thể được tạo ra từ thư viện gen người [61]

Hình 1.8 Một số cấu trúc gắn đặc hiệu kháng nguyên [99]

(3) Tối ưu cấu trúc scFv mà không mất khả năng liên kết với kháng nguyên

và các bổ thể, hạn chế tối đa hiện tượng HAMA

(4) Kích thước nhỏ của scFv thuận lợi khi thâm nhập vào các mô đích và tiêu diệt các mô này [74]

(5) Kháng thể scFv có thể dễ dàng dung hợp với protein đánh dấu khác như enzym hoặc protein gắn huỳnh quang tạo thành các chất sẵn sàng cho các phân tích miễn dịch [91], [104] Tuy nhiên, các phân tử scFv thể hiện ái lực thấp hơn các phân tử kháng thể đơn dòng gốc [86], điều này đã làm hạn chế tới việc ứng dụng các scFv trong các phép thử miễn dịch

1.3.4 Kháng thể phage-scFv

Kháng thể phage-scFv là một thực khuẩn thể hình sợi mang các mảnh kháng thể ở một đầu của nó, hiện nay thực khuẩn thể được dùng nhiều nhất để biểu lộ kháng thể là M13 Kháng thể phage-scFv được tạo ra nhờ công nghệ phage display

- Cấu trúc của thực khuẩn thể M13:

Hệ gen của phage có hình sợi, nhỏ, chứa khoảng hơn 10 gen phân bố sát nhau

và một vùng không mã hóa, chứa trình tự cần thiết cho sự nhân bản và đóng gói của phage Khác với các virus gây nhiễm vi khuẩn khác, phage hình sợi được tổng hợp và bài tiết khỏi tế bào vi khuẩn chủ mà không làm tan tế bào chủ Các phage f1, M13, fd

đã được sử dụng để biểu hiện các chuỗi polypeptide Hệ gen của các phage hình sợi

có sự tương đồng với nhau hơn 98% và các sản phẩm gen của chúng có thể thay thế cho nhau vì vậy mà các phage này được gọi chung là phage Fd M13 kiểu dại có đường kính khoảng 65Ao, dài 9300Ao Trong cấu trúc virion của M13 chứa bộ gen DNA mạch đơn có độ lớn 6407 bp [72] bao gói trong 2700 bản sao protein vỏ chính pVIII Mỗi đầu của phage được bao phủ bởi hai protein vỏ phụ: một đầu gồm 5 bản sao của pVII và pIX, đầu kia chứa 5 bản sao của pIII và PVI Ngoài các protein vỏ, M13 còn tạo ra 6 protein khác là pII, pX, pV, pI, pIV, pXI Chiều dài của virion phụ thuộc vào chiều dài của bộ gen: bộ gen dài hơn sẽ tạo ra phage dài hơn và ngược lại Điều đặc biệt là bộ gen có thể gắn thêm đoạn DNA lớn, kích thước bộ gen có thể lên đến gần 12.000 bp mà vẫn không phá vỡ quá trình bao gói của thể hoang dại [127]

- Cấu trúc của kháng thể phage-scFv:

Các gen mã hoá cho các mảnh kháng thể liên kết scFv có thể được dung hợp với hệ gen của M13 hoặc với gen mã hóa pIII kiểu dại Tuy nhiên, việc gắn các gen kháng thể vào hệ gen của phage gặp một số bất lợi như:

Thứ nhất là hiệu quả biến nạp của hệ gen phage thấp hơn nhiều so với phagemid, do đó làm cản trở việc xây dựng các thư viện kháng thể phức tạp

Thứ hai, việc nhân bản và biểu hiện kháng thể gắn với việc nhân bản và biểu hiện của hệ gen, điều này dẫn tới việc chọn lọc rất khó khăn Khi sử dụng hệ gen phage để chèn đoạn gen kháng thể thì tất cả các bản sao của pIII đều dung hợp với các mảnh kháng thể Điều này là một lợi thế cho việc chọn lọc kháng thể có khả năng liên kết với kháng nguyên Kết quả, các phagemid được sử dụng rộng rãi trong việc bộc lộ các kháng thể phage

Kháng thể phage-scFv về cơ bản là giống với M13 kiểu dại, nhưng chúng có một số đặc điểm khác biệt như:

- Về cấu trúc protein, kháng thể phage-scFv mang đầy đủ các protein cấu trúc giống như M13, riêng protein pIII được dung hợp với phân tử kháng thể (Hình 1.9) [112], như vậy một đầu của kháng thể phage-scFv sẽ đảm nhiệm chức năng liên kết với kháng nguyên

- Về hệ gen, kháng thể phage-scFv chỉ mang trong mình một phagemid chứa

gen III dung hợp với gen mã hóa cho kháng thể

Đối với thư viện Griffin.1, các scFv được đưa vào phagemid pHEN2, phagemid này chứa tín hiệu nhân bản, promoter, gen kháng kháng sinh và tín hiệu tạo hình thái phage riêng Điều này cho phép phagemid có thể bọc gói lắp ráp thành hạt phage hoàn chỉnh [60] Bằng cách sử dụng các phagemid, việc nhân bản và tạo ra kháng thể độc lập với hệ gen phage Tuy nhiên, để tạo ra các kháng thể phage-scFv hoàn chỉnh phải cần tới sự có mặt của helper phage, thường dùng là M13K07

Kháng thể phage-scFv sử dụng lông giới tính F (pilus) để nhiễm vào E coli

nhờ tương tác giữa pIII với lông giới tính [112] Hệ gen của kháng thể phage-scFv sau đó được chuyển vào tế bào chất của tế bào vi khuẩn, tại đó chúng nhân lên, dưới

sự hỗ trợ của helperphage, các protein cần thiết cho quá trình đóng gói được tổng hợp, sắp xếp lại hình thành các kháng thể phage-scFv mới, sau đó giải phóng ra ngoài môi trường

Các kháng thể phage-scFv có một số ưu điểm so với các kháng thể tạo ra bằng kỹ thuật lai tế bào (hybridoma), cụ thể là tạo kháng thể bằng kỹ thuật lai dung hợp cần thời gian và các thiết bị chuyên dụng, trong khi đó kỹ thuật bộc lộ trên thực khuẩn thể (phage display) thì các gen kháng thể được tách dòng trực tiếp từ các tế bào lách với các kỹ thuật DNA tái tổ hợp Việc tạo ra thư viện kháng thể phage-scFv từ các nguồn gen có thể loại bỏ việc gây miễn dịch động vật thí nghiệm và nuôi cấy một lượng lớn các tế bào dung hợp và cho phép tách kháng thể có ái lực cao kháng lại bất kỳ kháng nguyên nào Biểu hiện trên phage có hiệu ích lớn trong

trường hợp mà các kháng thể đơn dòng không thể thu nhận được bằng kỹ thuật lai dung hợp, chẳng hạn các kháng thể kháng kháng nguyên là các độc tố và các chất không gây đáp ứng miễn dịch

Kỹ thuật kháng thể phage-scFv cũng có thể sử dụng để tách dòng và thu nhận các kháng thể đơn dòng từ các thể lai không ổn định về mặt di truyền Các gen kháng thể phage-scFv còn là nguyên liệu để thu các kháng thể tái tổ hợp, từ đó

Hình 1.9 Cấu trúc của phage mang gen mã hóa scFv [112]