sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai mlh1 liên quan đến ung thư ruột kết không polyp di truyền ở người việt nam

Việc phát hiện những biến đổi di truyền trong các gen MMR liên quan đến ung thư đại trực tràng có khuynh hướng di truyền, nhằm đưa ra những kết quả nghiên cứu bước đầu về gen MLH1 ở bệnh

-

Lê Thị Lan Anh

SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MLH1 LIÊN

QUAN ĐẾN UNG THƯ RUỘT KẾT KHÔNG POLYP DI TRUYỀN Ở

NGƯỜI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2012

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Thị Lan Anh

SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MLH1 LIÊN

QUAN ĐẾN UNG THƯ RUỘT KẾT KHÔNG POLYP DI TRUYỀN Ở

NGƯỜI VIỆT NAM

MỞ ĐẦU 1

1.1.2 Gen ung thƣ và gen ức chế khối u 3

1.3 Hội chứng ung thƣ ruột kết không polyp di truyền (Hội chứng Lynch) 6

1.4.2 Cơ chế sửa chữa ADN bắt cặp sai (MMR - Mismatch Repair) 13

1.5 Một số kỹ thuật di truyền sử dụng trong nghiên cứu HNPCC 23

1.5.2 Kỹ thuật PCR phiên mã ngƣợc (RT-PCR: Reverse Transcription -

1.5.3 Kỹ thuật phân tích các trình tự lăp lại đơn giản (SSR - Simple

1.5.4 Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP:

1.5.5 Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn (SSCP: Single Strand

3.2.2 Nhân bản các exon quan tâm bằng kỹ thuật PCR 42

3.5 Kết quả giải trình tự ADN và so sánh trình tự 59 3.5.1 Phân tích trình tự exon 13 của mẫu mô từ bệnh nhân số 6 59 3.5.2 Kết quả phân tích trình tự exon 14 từ mẫu T19 60

Bảng 2 Thống kê các bệnh ung thƣ liên quan đến HNPCC

Bảng 3 Các gen MMR liên quan tới HNPCC

Bảng 8 Thành phần PAGE 12% cho 10 ml dung dịch

Bảng 9 Thành phần tham gia phản ứng cắt exon 16, 18 và 19 gen MLH1

Bảng 10 Chu trình nhiệt PCR tối ƣu của exon 8, 13, 14, 16, 17, 18 và 19 gen

MLH1

Hình 2 Các phân nhóm chính của ung thư ruột kết

Hình 3 Sửa chữa bắt cặp sai ở trình tự vi vệ tinh

Hình 4 Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai ở E.coli

Hình 5 Sửa chữa ADN bắt cặp sai ở người

Hình 6 Con đường dẫn đến ung thư di truyền ở người thông qua đột biến các gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR)

Hình 7 Tỷ lệ các loại đột biến phát hiện ở gen MLH1, MSH2 và MSH6

Hình 8 Vị trí của MLH1 trong NST số 3

Hình 9 Sơ đồ gen MLH1

Hình 10 Sơ đồ các protein được mã hóa bởi MLH1

Hình 11 Kết quả phân tích SSCP exon 5 của gen AR

Hình 12 (A) Kết quả tách ADN tổng số từ mẫu mô (B) Kết quả tách ADN tổng số

từ mẫu máu

Hình 13 Sản phẩm PCR exon 8 gen MLH1 với các nhiệt độ gắn mồi: 600C, 60,50C,

610C, 61,50C

Hình 14 (A), (B) Sản phẩm PCR exon 8 gen MLH1

Hình 15 (A), (B) Sản phẩm PCR exon 13 gen MLH1

Hình 16 (A), (B) Sản phẩm PCR exon 14 gen MLH1

Hình 17 (A), (B) Sản phẩm PCR exon 16 gen MLH1

Hình 18 (A), (B) Sản phẩm PCR exon 17 gen MLH1

Hình 19 (A), (B) Sản phẩm PCR exon 18 gen MLH1

Hình 20 (A), (B) Sản phẩm PCR exon 19 gen MLH1

Hình 23 (A), (B) Kết quả phân tích SSCP exon 14 gen MLH1

Hình 24 Kết quả phân tích SSCP exon 16 gen MLH1

Hình 25 Kết quả phân tích SSCP exon 17 gen MLH1

Hình 26 Kết quả phân tích SSCP exon 18 gen MLH1

Hình 27 Kết quả phân tích SSCP exon 19 gen MLH1

Hình 28 Kết quả PCR-RFLP các mẫu máu từ 20 thành viên của gia đình mắc hội chứng ung thư ruột kết không polyp di truyền ở Nhật Bản

Hình 29 Dự đoán kết quả phản ứng cắt exon 16 gen MLH1 bằng enzym MspI

Hình 30 Sản phẩm cắt exon 16 và sản phẩm PCR exon 16 điện di trên gel agarose 2%

Hình 31 Dự đoán sản phẩm cắt exon 19 bằng enzym CviQI

Hình 32 Sản phẩm cắt exon 19 bằng enzym CviQI điện di trên gel polyacrylamide

12%

Hình 33 Dự đoán sản phẩm cắt exon 18 gen MLH1 bằng enzym CviQI

Hình 34 (A), (B), (C), (D) Sản phẩm cắt exon 18 bằng enzym CviQI điện di trên

gel polyacrylamide 12%

Hình 35 (A) Kết quả so sánh trình tự exon 13 của đối chứng và bệnh nhân số 6 (B)

Trình tự ngược của exon 13 gen MLH1 cho thấy có đột biến thay thế tại vị trí 203

G>A

Hình 36 (A) Kết quả so sánh trình tự exon 14 của đối chứng và bệnh nhân số 19

(B) Trình tự xuôi của exon 14 gen MLH1 cho thấy có đột biến thay thế tại vị trí

176C>G và một đột biến thay thế ở vị trí 185T>A

Hình 37 So sánh trình tự exon 18 từ mẫu mô ung thư của bệnh nhân 20 và mô người bình thường

Hình 38 Kết quả so sánh trình tự exon 18 từ mẫu máu và mẫu mô của bệnh nhân số 19

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

Deoxyribonucleotide Triphosphate Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Familial Adenomatous Polyposis

Hereditary Non – Polyposis Colorectal Cancer

Kilobase Loss of Heterozygosity Mismatch Repair Microsatellite Instability

Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism

Reverse Transcription PCR Single Nucleotide Polymorphism Single Strand Conformation Polymorphism

Simple Sequence Repeat Tissue Lysis Buffer Tris – Acetic acid – EDTA Tris – EDTA

N,N,N’,N’- tetramethylenediamine

Axit deoxyribonucleic Axit ribonucleic Ribonuclease

Dung dịch đệm phân giải tế bào máu cặp bazơ nitơ

Deoxyribonucleotit triphotphat

Hội chứng u tuyến polyp theo dòng

họ Ung thƣ ruột kết không polyp di truyền

Kilobazơ Mất tính dị hợp tử Sửa chữa bắt cặp sai Tính bất ổn vi vệ tinh Nhiễm sắc thể

Phản ứng chuỗi nhờ polymeraza Tính đa hình độ dài đoạn giới hạn

PCR phiên mã ngƣợc Tính đa hình đơn nucleotit Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn

Trình tự lặp lại đơn giản Dung dịch đệm phân giải tế bào mô

MỞ ĐẦU

Trong hơn 20 năm qua, những phát minh to lớn của di truyền học phân tử

đã góp phần thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học Các kỹ thuật mới như tách dòng gen, tạo ADN tái tổ hợp, giải trình tự gen và nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác ngày càng được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc phát hiện, chẩn đoán và điều trị bệnh, trong đó có bệnh ung thư

Sự phát hiện ung thư là một bệnh di truyền được coi là một thắng lợi của sinh y học hiện đại Nhiều nỗ lực nghiên cứu không ngừng nghỉ và hiệu quả đã giúp xác định chi tiết các biến đổi di truyền là nhân tố trực tiếp gây ung thư, bắt đầu từ sự hình thành các khối u, sau đó là sự tăng sinh và lan rộng của chúng

Tỷ lệ mắc bệnh ung thư có xu hướng gia tăng ở phần lớn các nước trên thế giới Hiện tại, qua thống kê cho thấy trên toàn cầu có khoảng 22,4 triệu người đang sống chung với bệnh ung thư Theo Tổ chức Y tế Thế giới, ước tính hàng năm trên thế giới có khoảng 10,1 triệu trường hợp mới mắc ung thư Các ung thư hàng đầu trên thế giới ở nam giới là ung thư phổi, dạ dày, đại trực tràng, tiền liệt tuyến, gan; Ở nữ giới là ung thư vú, đại trực tràng, cổ tử cung, dạ dày và phổi Cũng theo Tổ chức Y tế Thế giới, ước tính mỗi năm có khoảng trên 6,7 triệu người chết do ung thư Tỷ lệ chết do ung thư chiếm 12% trong số các nguyên nhân gây tử vong ở người [28] Riêng tại Việt Nam, mỗi năm phát hiện mới khoảng 200.000 người và khoảng 75.000 người chết vì bệnh ung thư [47]

Trong số các bệnh ung thư thường gặp ở người, ung thư đại trực tràng là loại ung thư tương đối phổ biến, chiếm khoảng 11,5% tổng số các trường hợp ung thư và chiếm tới 15,2% tổng số các trường hợp tử vong vì ung thư Loại ung thư này thường gặp nhiều hơn ở các nước phát triển và có xu hướng tăng nhanh

ở các nước đang phát triển Nguy cơ ung thư đại trực tràng tăng cao hơn ở những

người có tiền sử viêm đại tràng hoặc trong gia đình, dòng họ có người bị ung thư đại trực tràng [3]

Ung thư ruột kết không polyp di truyền (HNPCC - Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer), còn được gọi là hội chứng Lynch chiếm 15% các trường hợp ung thư đại trực tràng Đây là hội chứng di truyền trội do gen trên nhiễm sắc thể thường gây ra Những đột biến gây bất hoạt ở tế bào mầm

của một trong các gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) bao gồm gen MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2, dẫn đến sự thay đổi hoạt tính protein, làm bất hoạt hệ thống sửa

chữa bắt cặp sai là nguyên nhân gây HNPCC Nhiều nghiên cứu cho thấy, các

đột biến trong gen MLH1 chiếm khoảng 50% trong số các đột biến xác định được ở các gen MMR [2, 5] Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về gen MLH1

được thực hiện ở rất nhiều quần thể người khác nhau Tại Việt Nam, xét nghiệm

di truyền trong chẩn đoán ung thư nói chung và ung thu đại trực tràng nói riêng hầu như chưa được thực hiện Việc phát hiện những biến đổi di truyền trong các gen MMR liên quan đến ung thư đại trực tràng có khuynh hướng di truyền, nhằm

đưa ra những kết quả nghiên cứu bước đầu về gen MLH1 ở bệnh nhân ung thư

đại trực tràng tại Việt Nam góp phần cung cấp dữ liệu về đột biến ở gen này và

mở ra hướng nghiên cứu về các gen MMR khác, ứng dụng trong chẩn đoán sớm ung thư ruột kết không polyp di truyền tại Việt Nam là rất cần thiết

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài

“Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thư

ruột kết không polyp di truyền ở người Việt Nam”

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Phân tích di truyền thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Khoa Sinh học và Phòng Sinh học thụ thể và phát triển thuốc thuộc phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Di truyền ung thư

1.1.1 Khái niệm ung thư

Ung thư không phải là bệnh mà là một tên chung cho một nhóm các bệnh phát sinh từ các tế bào có tốc độ tăng trưởng không kiểm soát được, có được sự bất

tử, xâm lấn và khả năng di căn Thuật ngữ “ung thư” theo nghĩa hẹp được dùng

để chỉ những khối u có khả năng xâm lấn các mô xung quanh gồm các tế bào bình thường [17]

Khối u là tập hợp các tế bào có quan hệ di truyền với nhau và có khả năng

phân chia một cách không kiểm soát Sự phân biệt giữa các khối u lành và u ác tính đơn thuần dựa trên khả năng xâm lấn của chúng Nếu một khối u ác tính sau

khi xâm lấn tiếp cận được với mạch máu hoặc mạch bạch huyết, thì tế bào của nó

có thể di căn và phát triển tại các mô ở xa tại nơi chúng di chuyển tới U di căn

có thể gây rối loạn chức năng của các mô khác và dẫn đến tử vong Quá trình tăng trưởng của một khối u bắt đầu từ tế bào bị biến đổi di truyền bất thường

này được gọi là quá trình hay sự phát sinh ung thư Vì các khối u thường bắt

nguồn từ những khối u nhỏ lành tính, rồi sau đó chuyển sang trạng thái ác tính

và di căn, nên trong quá trình phát sinh ung thư, những tế bào hình thành khối u

có xu hướng tích lũy các biến đổi di truyền và qua đó có những đặc tính mới

Sự tích lũy các gen ung thư ở các tế bào khối u là căn nguyên của phát sinh ung thư [17]

1.1.2 Gen ung thư và gen ức chế khối u

Gen ung thư (oncogenes) có thể định nghĩa là dạng gen đột biến làm tăng nguy cơ ung thư hoặc làm thúc đẩy sự phát sinh ung thư Các gen ung thư cũng

có thể được coi như các dạng alen đặc biệt của các gen bình thường xuất hiện do

kết quả của đột biến [3]

Các cá thể được truyền các gen ung thư phát sinh từ các tế bào mầm sinh

dục (còn gọi là các gen ung thư bẩm sinh) từ bố, mẹ sẽ mang gen ung thư này

trong hầu hết các tế bào của cơ thể, ở cả các tế bào sinh dưỡng và các tế bào

sinh dục (những cá thể này được gọi là các thể mang) Ngược lại, các gen ung

thư phát sinh từ các tế bào sôma sẽ không được truyền cho các thế hệ sau [17]

Các khối u tích lũy dần các gen ung thư khi chúng tăng trưởng Sự tích lũy các gen đột biến gây ung thư có thể diễn ra theo ba con đường: 1) Được truyền qua dòng sinh dục, 2) Do đột biến tự phát trong tế bào sôma và 3) Do sự lây nhiễm của virut

Các gen ung thư quan trọng có thể được nhóm lại theo chức năng bình thường của chúng trong một tế bào Các tiền gen ung thư (Proto-oncogenes) là các gen có vai trò quan trọng, ví dụ điều hòa sự sinh trưởng tế bào, sinh sản và biệt hóa

tế bào Các gen tiền ung thư có thể được kích hoạt và trở thành gen ung thư thông qua đột biến điểm, sao chép hoặc chuyển đoạn Các gen ung thư được di truyền trội,

vì chỉ có một đột biến là đủ gây ra thay đổi chức năng tế bào, tuy nhiên, các gen ung thư hiếm khi là nguyên nhân gây ra sự nhạy cảm di truyền ung thư

Mặt khác, gen ức chế khối u là những gen khi bị bất hoạt không còn ức chế

sự sinh sản của tế bào có thể gây tổn thương ADN và do đó cung cấp cho các khối u một lợi thế tăng trưởng Knudson quan sát thấy rằng các gen ức chế khối u là các gen lặn, cần phải có “cú đánh thứ hai” (cả hai alen trở thành bất hoạt) cho sự phát triển của bệnh ung thư Sự ức chế khối u đã được mô tả trong một số hình thức di truyền của bệnh ung thư, “đòn thứ nhất” được di truyền và “đòn thứ hai” xảy ra ở tế bào soma [28] Hơn nữa, các gen ức chế khối u có thể được chia thành gen gác cổng (Gatekeeper), gen trông giữ (Caretaker) và gen làm cảnh (Lanscaper) Gen gác cổng

trực tiếp ức chế sự phát triển hoặc thúc đẩy tế bào chết, ví dụ gen APC khi bị đột

biến sinh u tuyến polyp theo dòng họ (FAP) Ngược lại, các gen trông giữ, không trực tiếp thúc đẩy sự phát triển khối u, nhưng sự bất hoạt của chúng dẫn đến sự mất

ổn định di truyền là nguyên nhân gia tăng tỷ lệ đột biến trong cả gen ung thư và gen

ức chế khối u, góp phần cho sự tạo thành các khối u Một ví dụ về gen trông giữ là

các gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) mở đường cho hội chứng Lynch Gen “làm cảnh”, như tên của nó, gián tiếp gây ra ung thư bằng cách thay đổi cảnh quan, có nghĩa là vi môi trường, tạo thuận lợi đối với sự hình thành khối u Hiện tượng này

đã được quan sát thấy trong ung thư ruột kết, nơi các môi trường mô đệm bất thường ảnh hưởng đến sự phát triển và tăng trưởng của các tế bào biểu mô, dẫn đến

sự hình thành ung thư (Hình 1)

Hình 1 Các con đường hình thành ung thư đại trực tràng [3]

1.2 Hội chứng ung thư ruột kết

Ung thư ruột kết hay còn gọi là ung thư đại trực tràng là một loại ung thư biểu mô rất thường gặp Đây là một trong những bệnh ung thư biểu mô phổ biến nhất trên thế giới, là ung thư gây tử vong đứng thứ hai ở Mỹ và đang có xu hướng tăng lên ở các nước đang phát triển [8, 19] Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc ung thư đại trực tràng chỉ sau ung thư dạ dày Tương tự như các loại ung thư khác, nguyên nhân gây ra ung thư đại trực tràng có thể là do đột biến phát sinh trong quá trình phát

triển cá thể (ung thư thứ phát) hoặc được di truyền từ cha mẹ Rất khó xác định chắc chắn sự di truyền các gen ung thư góp bao nhiêu phần vào sự phát sinh ung thư trực tràng, nhưng con số ước tính về tỉ lệ ca ung thư trực tràng liên quan đến các gen ung thư bẩm sinh vào khoảng 15 - 50% Độ tuổi mắc bệnh trung bình khoảng 45 – 50, nhưng cũng có thể sớm hơn ở giai đoạn thanh thiếu niên và gần đây có xu hướng trẻ hoá với nhiều trường hợp mắc bệnh ở độ tuổi 18 - 20 [47]

Ung thư đại trực tràng (Colorectal cancer – CRC) được chia thành 3 dạng chính là rải rác, gia đình và di truyền Trong đó, ung thư ruột kết rải rác (không di truyền) chiếm 65-85%, ung thư ruột kết gia đình chiếm tỉ lệ 10%-30% và ung thư đại trực tràng di truyền chiếm khoảng 5% trong tổng số các dạng ung thư ruột kết (Hình 2)

Hình 2 Các phân nhóm chính của ung thư ruột kết [11]

Ung thư đại trực tràng di truyền lại được chia thành 3 nhóm chính: Sinh polyp u tuyến theo dòng họ (FAP), Ung thư ruột kết không polyp di truyền (HNPCC - Hội chứng Lynch) và Hội chứng giống Lynch Hội chứng Lynch được lấy theo tên nhà khoa học đầu tiên công bố về căn bệnh này

1.3 Hội chứng ung thư ruột kết không polyp di truyền (Hội chứng Lynch)

Ung thư ruột kết không polyp di truyền (HNPCC - Hội chứng Lynch) là một bệnh di truyền tương đối phổ biến Sự nhận biết chậm trễ hội chứng này xảy ra

Rải rác (không di truyền) (65%–85%)

Theo dòng họ (10%–30%) HNPCC (5%)

FAP (1%)

Các hội chứng ung thư ruột hiếm gặp khác (<0.1%)

Rải rác (không di truyền) (65%–85%)

Theo dòng họ (10%–30%) HNPCC (5%)

FAP (1%)

Các hội chứng ung thư ruột hiếm gặp khác (<0.1%)

do ung thư đại trực tràng rất phổ biến trong quần thể, và vì các cá thể bị ảnh hưởng bởi HNPCC không có các tính trạng có thể phân biệt được, ngoài việc có tỷ

lệ mắc phải ung thư tăng cao Các nhân tố này đóng góp vào những khó khăn của việc xác định chắc chắn bệnh [14]

1.3.1 Đặc điểm di truyền của HNPCC

HNPCC là một hội chứng di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, gây nên bởi những đột biến dòng mầm gây bất hoạt ở những gen tham gia vào hệ

thống sửa chữa bắt cặp sai (MMR): MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2, trong đó chủ yếu là gen MLH1 và MSH2 [14] Đa số các đột biến ở gen MLH1 và MSH2 là đột

biến vô nghĩa, nhầm nghĩa hoặc đột biến dịch khung cũng như các thay đổi ảnh hưởng đến vị trí ghép nối Tuy nhiên, gần đây hơn, sử dụng kỹ thuật mới cho thấy trong một số quần thể, một tỷ lệ tương đối lớn của việc thay đổi tác nhân gây bệnh

là sắp xếp lại bộ gen, mất các vùng đa exon, đơn exon, tái bản của gen MLH1 hoặc gen MSH2 Các đột biến đã biết được phân bố rải rác ở khắp các vùng mã hóa của

các gen này Mặc dù vậy, ở một vài quần thể (ví dụ Phần Lan, Ba Lan và Hoa Kỳ) một số thay đổi lặp lại đã được tìm thấy và được mô tả như các đột biến khởi phát Cho đến nay, hơn 300 đột biến gen MMR khác nhau đã được xác định trong khoảng

500 gia đình HNPCC [42] Những bệnh nhân HNPCC hình thành ung thư ở tuổi còn trẻ, điển hình là khoảng giữa tuổi 40, nhưng cũng có thể sớm hơn ở giai đoạn thanh thiếu niên [34]

Bước đầu tiên có thể tiến hành xét nghiệm đối với các cá thể có nguy cơ mắc bệnh cao từ các quần thể được phân lập [44] Tuy nhiên, trong số các gia đình được chẩn đoán lâm sàng với hội chứng Lynch, tỷ lệ đột biến MMR thay đổi đáng kể giữa các nghiên cứu khác nhau, dao động khoảng từ 30 - 90% [32] Trong các gia đình âm tính với đột biến MMR, nguyên nhân vẫn chưa được giải thích rõ ràng, nhưng có thể giải thích do sự thay đổi cấu trúc phức tạp nhất định cũng như những thay đổi điều hòa trong các vùng không mã hóa [53] MSI được sử dụng để kiểm tra

trực tiếp xem tình trạng thiếu hụt MMR (một kiểu hình đột biến) tham gia vào các loại ung thư cụ thể

Mặc dù, tất cả các tế bào ở những bệnh nhân mắc hội chứng Lynch mang một đột biến gen MMR ("cú đánh đầu tiên"), nhưng sự phát triển khối u yêu cầu thêm sự bất hoạt thể soma của các alen kiểu dại còn lại ("cú đánh thứ hai") trong một mô đích Đột biến dòng mầm trong gen MMR dẫn đến sự tích lũy các lỗi sao chép, chủ yếu là tại các trình tự ADN ngắn lặp đi lặp lại trong các tế bào khối u và làm phát sinh các dấu hiệu phân tử của hội chứng Lynch Sự bất ổn vi vệ tinh (MSI) đóng góp đối với ung thư thông qua sự tăng tỷ lệ đột biến trong cả trình tự vi vệ tinh

và các gen quan trọng trong ức chế ung thư ADN từ các khối u HNPCC cho thấy

có sự bất ổn vi vệ tinh Các báo cáo cho thấy bệnh nhân HNPCC có tiên lượng tốt hơn so với bệnh nhân ung thư đại trực tràng rải rác [17]

Trong khi, HNPCC được nhận biết như là một thực thể bệnh bằng việc xác định một số lượng lớn thành viên trong gia đình bị ảnh hưởng, nhiều người mang các đột biến gen HNPCC khác cũng được xác định trong quần thể dựa vào những sàng lọc di truyền X é t nghiệm di truyền đã cho thấy rằng các đột biến gen MMR có độ thâm nhập khá cao trong các cá thể mang ung thư nội mạc tử cung và đại trực tràng di truyền, hầu hết trong số đó không phải là thành viên của các gia đình có HNPCC (Bảng 1)

Bảng 1 Độ thâm nhập của các đột biến MLH1 và MSH2 trong các bệnh nhân ung thư

[54]

Tiền sử cá nhân

Lịch sử gia đình

Tỷ lệ những người trong họ không bị bệnh (%)

Tỷ lệ những người bị bệnh ≥ 1 Ung thư đại trực tràng (< 50 tuổi) 9,1 22

Ung thư đại trực tràng (> 50 tuổi) < 5 15

Ung thư nội mạc tử cung (< 50 tuổi) 11 23

Xét nghiệm di truyền dự đoán cho các đột biến dòng mầm trong các gen

MMR như MLH1 hoặc MSH2 có thể cho phép xác định HNPCC theo dòng họ, tạo

điều kiện thuận lợi cho việc điều trị sớm và giảm tỷ lệ tử vong Vì vậy, sàng lọc các đột biến gen MMR có tầm quan trọng lâm sàng trực tiếp cho tư vấn và quản lý các gia đình HNPCC

Việc xác định thể mang bệnh thường dựa trên các thể được sàng lọc từ các gia đình đáp ứng tiêu chuẩn quốc tế cho hội chứng này, cụ thể là tiêu chuẩn Amsterdam I và II hoặc tiêu chuẩn ít nghiêm ngặt hơn được gọi là chỉ dẫn Bethesda [52]

1.3.2 Đặc điểm lâm sàng và phổ khối u

Khi hội chứng Lynch được mô tả lần đầu tiên, nó được coi là một hội chứng dòng họ đặc trưng bởi sự gia tăng của bệnh ung thư nội mạc tử cung và trực tràng Tuy nhiên, các khối u có nguy cơ tương đối cao so với quần thể chung được coi là các khối u của hội chứng Lynch [54] Vì vậy, thuật ngữ ung thư ruột kết không polyp di truyền có thể là quá hạn chế và hội chứng Lynch đã được đề xuất như một tên thích hợp hơn để bao phủ hội chứng này [49, 50]

Việc chẩn đoán của HNPCC có thể được thực hiện trên cơ sở các tiêu chuẩn lâm sàng Amsterdam hoặc bằng cách kiểm tra di truyền phân tử của các đột biến dòng mầm trong một gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) Năm 1990, tập đoàn hợp tác quốc tế về ung thư đại trực tràng không polyp di truyền đã thành lập các tiêu chí với mục đích chẩn đoán lâm sàng các gia đình có HNPCC (tiêu chuẩn Amsterdam I) Theo tiêu chuẩn Amsterdam I những gia đình đáp ứng các điều kiện sau đây được coi là mắc HNPCC: (1) Có tối thiểu ba người trong phả hệ mắc ung thư đại trực tràng; (2) Một người là trực hệ của một trong hai người còn lại; (3) Ít nhất có một người bị ung thư đại trực tràng ở độ tuổi dưới 50 Sau đó, các tiêu chí này được coi

là quá hạn chế cho các mục đích lâm sàng và được sửa đổi để phù hợp với các bệnh ung thư khác có liên quan đến HNPCC (tiêu chuẩn Amsterdam II) [51, 52] Độ

chính xác của một chẩn đoán dựa trên tiêu chuẩn lâm sàng phụ thuộc vào tính chính xác của các báo cáo về lịch sử gia đình nghiên cứu

Không giống với FAP, HNPCC không được đặc trưng bởi số lượng tăng lên của các polyp Ở các bệnh nhân HNPCC, thường thì số các u tuyến giống với

tỉ lệ chung của quần thể Tuy vậy, các u tuyến xuất hiện ở các bệnh nhân HNPCC có nguy cơ tiến triển thành ung thư cao hơn nhiều Không như nhiều loại khối u khác, các khối u trực tràng rất dễ tiếp cận Bằng thiết bị nội soi, các khối u này có thể quan sát được bằng mắt thường ở hầu hết các giai đoạn phát triển và lan rộng của nó Những khối u này có một số đặc điểm đặc thù Mức độ biệt hóa về mặt tế bào học của những khối u này thường thấp hơn so với các khối u đơn phát

có cùng kích thước; điều này cho thấy mức độ trầm trọng của thương tổn là cao hơn Đối lập với tiên lượng tiêu cực như vậy, các khối u ruột già ở các bệnh nhân HNPCC điển hình có biểu hiện tốt hơn so với các bệnh nhân ung thư đơn phát Điều này phần nào cho thấy các khối u ruột già liên quan đến bệnh HNPCC tiến hóa theo cách khác với các khối u đơn phát [17, 36]

1.3.3 Chẩn đoán lâm sàng

Những bệnh nhân mắc HNPCC thường hình thành ung thư khi còn khá trẻ, trung bình là 40 tuổi, có những trường hợp còn phát bệnh sớm hơn Những người mang đột biến HNPCC dòng mầm không những có nguy cơ cao phát sinh bệnh ung thư trực tràng mà còn làm tăng nguy cơ mắc một số bệnh ung thư khác như nội mạc

tử cung, dạ dày, buồng trứng, ruột non, gan, đường tiết niệu trên, não, da 80% người mắc HNPCC có nguy cơ sẽ mắc ung thư đại trực tràng Tuổi trung bình của người mắc bệnh ung thư đại trực tràng đơn phát là 61 tuổi, trong khi các bệnh nhân HNPCC đều phát triển ung thư ở độ tuổi trung bình là 42, tức là sớm hơn khoảng 20 năm Đối với phụ nữ, 20 - 60% bệnh nhân HNPCC có nguy cơ mắc ung thư nội mạc tử cung Tuổi trung bình của chẩn đoán ung thư nội mạc tử cung là 46 - 62 tuổi Trong số những phụ nữ có HNPCC phát triển thành cả ung thư ruột kết và ung thư nội mạc tử cung khoảng 50% xuất hiện ung thư nội mạc tử cung trước [23]

Trong HNPCC, tuổi trung bình của chẩn đoán ung thư dạ dày là 56 tuổi, với ung thư u biểu mô đường ruột là loại bệnh lý phổ biến nhất được báo cáo HNPCC kết hợp với ung thư buồng trứng có độ tuổi chẩn đoán trung bình là 42,5, khoảng 30% được chẩn đoán trước tuổi 40 (Bảng 2) [33]

Bảng 2 Thống kê các bệnh ung thư liên quan đến HNPCC [33]

Ung thư liên quan đến

HNPCC

Tỷ lệ mắc HNPCC

Nguy cơ mắc bệnh

Tuổi phát bệnh

ở giai đoạn muộn Vì thế, để xác định chính xác khả năng mắc ung thư cũng như xác định được loại ung thư, từ đó đưa ra phác đồ điều trị bệnh ung thư nhất thiết phải dùng các phương pháp sàng lọc sớm bằng các kỹ thuật sinh học phân tử: chẩn đoán tế bào học, các xét nghiệm huyết học, chẩn đoán mô bệnh học Khi chẩn đoán, các mẫu mô trực tràng có thể được phân lập để phân tích ADN Nhờ tính phổ biến và dễ tiếp cận, các khối u trực tràng là mô hình lí tưởng để nghiên cứu về các gen đóng góp vào sự phát sinh khối u

1.4 Cơ sở phân tử của HNPCC

Nghiên cứu về cơ sở phân tử của HNPCC bao gồm các hướng tiếp cận

bổ trợ được áp dụng bởi nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau Năm 1993, việc

khám phá một sai hỏng mới và ít gặp trong sửa chữa ADN ở các tế bào ung thư

đại trực tràng cung cấp một mấu chốt quan trọng Một nhóm đứng đầu là

Manuel Perucho, trong khi nghiên cứu những đột biến mất đoạn và đột biến

khuếch đại gen để có thể chỉ ra những gen ung thư và các gen ức chế khối u mới,

thay vào đó đã tìm thấy những biến đổi soma về độ dài của các yếu tố lặp lại

cao đã được biết như là các vi vệ tinh Một nhóm độc lập do Stephen

Thibodeau đứng đầu cũng đã tìm thấy những trình tự vi vệ tinh bị biến đổi và thấy

rằng chúng có thể liên quan đến các khối u ở đoạn đầu ruột kết Quan sát này

đã cung cấp một sự kết nối tiềm tàng giữa những bất thường về các vi vệ tinh

với HNPCC Gần đây, một nhóm hợp tác do Albert de la Chapelle và Bert

Vogelstein đứng đầu đã nỗ lực lập bản đồ vị trí các locus ức chế khối u ở những

bệnh nhân Lynch sử dụng các phương pháp tách dòng vị trí Trong khi lập bản đồ

các vùng LOH, nhóm của de la Chapelle/ Vogelstein đã phát hiện được các đột

biến ở các trình tự vi vệ tinh [35, 37, 59]

1.4.1 Tính bất ổn định vi vệ tinh

Ung thư đại trực tràng (CRC), như tất cả các ung thư khác, dường như có

liên quan đến sự bất ổn định về mặt di truyền Sự không ổn định di truyền có thể

chia hai loại: Bất ổn định nhiễm sắc thể (CIN) và sự bất ổn định vi vệ tinh (MSI)

Các vi vệ tinh được lặp lại đơn giản, thường là hai nucleotit, trên vùng không

mã hóa của ADN, cũng có thể nằm trong gen hoặc ở giữa gen Các trình tự vi vệ

tinh ở các tế bào sai hỏng MMR dễ bị ảnh hưởng và có xu hướng mở rộng hoặc thu

hẹp chiều dài của trình tự vi vệ tinh từ thế hệ này sang thế hệ khác (Hình 3) Dạng

siêu đột biến dễ phát hiện này được gọi là tính bất ổn vi vệ tinh (microsatellite

instability - MSI) [25, 55] MSI phản ánh tình trạng đột biến tăng cao ảnh hưởng lên

toàn bộ hệ gen Quan sát về các MSI ở các tế bào ung thư đại trực tràng cho thấy

một cơ chế hình thành khối u hoàn toàn mới MSI không chỉ bị hạn chế đối với các

khối u đại trực tràng mà nó có thể phát hiện ở các khối u ngoài ruột kết như dạ dày,

nội mạc tử cung [57]

Một thang chuẩn được sử dụng để đánh giá sự bất ổn vi vệ tinh trong mô

khối u và mô bình thường [10] Một khối u được phân loại như sau:

- MSI cao nếu có nhiều hơn 30% sự bất ổn

- MSI thấp nếu ít hơn 30% sự bất ổn

- MSI ổn định nếu không có sự bất ổn

Hình 3 Sửa chữa bắt cặp sai ở trình tự vi vệ tinh [10]

MSI có thể được phát hiện trong hơn 90% các khối u HNPCC Khoảng 12 -

17% các khối u ngẫu nhiên cũng cho thấy MSI [5, 47] Khoảng 10 - 20% ung thư

đại trực tràng xảy ra ở những cá thể không được biết là có hoặc nghi ngờ có

HNPCC có MSI gây ra bởi sự im lặng của gen MLH1 do sự methyl hóa hoặc gây ra

do đột biến soma ở các gen sửa chữa bắt cặp sai [22] Do đó, MSI trong một u tuyến

đã được xác định là một yếu tố dự báo tốt về đột biến sửa chữa bắt cặp sai dòng

mầm tiềm ẩn [16, 30] Tuy nhiên, vì nhiều u tuyến liên quan đến HNPCC không thể

hiện MSI nên sự vắng mặt của MSI trong các mẫu này không loại trừ HNPCC [31]

1.4.2 Cơ chế sửa chữa ADN bắt cặp sai (MMR - Mismatch Repair)

Trong quá trình sao chép ADN, các bazơ bắt cặp sai ngay lập tức được sửa

chữa bằng phức hợp ADN polymeraza sao chép, có chức năng đọc sửa Kết quả là

tỷ lệ lỗi của quá trình sao chép ADN theo thống kê chỉ là 10-12 bazơ Mức độ chính xác này cho thấy chỉ dưới 1% tế bào sẽ mang bazơ bắt cặp sai trong một pha S hoàn chỉnh Bên cạnh cơ chế sửa lỗi của ADN polymeraza, các bazơ bắt cặp sai còn được

xử lý nhờ cơ chế sửa chữa bắt cặp sai (MMR) Rất hiếm trường hợp các bazơ bắt cặp sai tránh được sự phát hiện của MMR trong quá trình sao chép ADN [3] Khoảng 15% các trường hợp ung thư đại trực tràng được thống kê là mang các sai hỏng trong MMR Những đột biến gây bất hoạt tế bào mầm ở một trong sáu gen

liên quan đến con đường sửa chữa bắt cặp sai (MLH1, MSH2, MSH3, MSH6, PMS1

và PMS2) là nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng không polyp di truyền

(HNPCC) [3]

Khi các gen mã hóa các protein này bị đột biến, sẽ dẫn đến việc các protein tạo thành bị bất hoạt, khiến hệ thống không còn khả năng đọc sửa các bazơ kết cặp sai, do đó làm mất tính ổn định di truyền của tế bào Các tế bào có đột biến trong MMR có tỷ lệ đột biến tăng 2 – 4 lần so với các tế bào bình thường Đối với bệnh ung thư đại trực tràng thứ phát, các đột biến này có thể xuất hiện dưới các tác nhân đột biến từ môi trường Nhưng với HNPCC, các đột biến đã tồn tại sẵn trong hệ gen của cơ thể bố mẹ, qua quá trình thụ tinh, được truyền vào cơ thể con cái [56]

Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai được phát hiện đầu tiên ở vi khuẩn E coli được gọi là con đường MutHLS Giai đoạn đầu của MMR liên quan đến 3 gen là mutS, mutL và mutH mã hóa cho 3 protein tương ứng là MutS, MutL, MutH Đầu tiên,

MutS ở dạng dimer sẽ nhận biết và liên kết vào bazơ bắt cặp sai Sau đó, hệ thống sửa chữa nhận ra bazơ nào đúng, bazơ nào sai tương ứng với mạch nào làm khuôn

và mạch nào được tổng hợp mới [3] Lúc này MutS đã liên kết với bazơ bắt cặp sai

sẽ tạo phức với MutL và MutH ở dạng dimer để mang trình tự [GAmTC] chưa được methyl hóa ở gần tới vị trí bắt cặp sai MutH sẽ làm đứt mạch tại vị trí trình tự [GAmTC] chưa được methyl hóa Từ vị trí đó một enzym exonucleaza sẽ cắt mạch ADN không được methyl hóa đến hết vị trí nucleotit bắt cặp sai Rồi sau đó enzym ADN polymeraza III và ligaza sẽ tổng hợp bù và lấp đoạn ADN rỗng (Hình 4) [3]

Hình 4 Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai ở E.coli [18]

Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai diễn ra ngay trong quá trình sao chép ADN Ngoài quá trình methyl hóa xảy ra đối với nucleotit A ở trình tự [GAmTC], quá trình methyl hóa còn xảy ra đối với nucleotit C ở trình tự CCm(A/T)GG Quá trình methyl hóa được thực hiện nhờ enzym ADN methyl tranferaza [17, 27]

Cơ chế MMR ở eukaryota cũng hoạt động tương tự như cơ chế hoạt động ở

vi khuẩn (E coli) Dạng tương đồng với mutS vi khuẩn của eukaryota được gọi là dạng tương đồng mutS hay MSH được tìm thấy ở nấm men (γMSH) và ở các tế bào người (hMSH) Sự kết hợp một số dạng protein MSH tạo ra các phức hợp có chức năng giống với protein MutS ở vi khuẩn Dạng tương đồng với mutL vi khuẩn của

eukaryota được gọi là dạng tương đồng mutL hay MLH cũng được tìm thấy ở nấm men (γMLH) và ở các tế bào người (hMLH) Tuy nhiên, các protein do các gen MLH mã hóa sẽ không thực hiện được chức năng mà phải kết hợp với protein do một số gen PMS và MSH quy định (γPMS, γMSH ở nấm men và hPMS, hMSH ở

người) mới có chức năng giống như protein MutL ở vi khuẩn [20, 26]

Ở người đã xác định được các gen có liên quan đến hoạt động của MMR

gồm có các gen human mutL homolog 1 (hMLH1), human mutL homolog 3 (hMLH3), human mutS homolog 2 (hMSH2), human mutS homolog 3 (hMSH3), human mutS homolog 6 (hMSH6), human postmeiotic segregation increased 2 (hPMS2), human postmeiotic segregation increased 1 (hPMS1) [13] Trong đó phức hợp chứa gen hMSH2 có chức năng tương đương với mutS ở E coli, phức hợp chứa gen hMLH1 có chức năng tương ứng với mutL ở E coli Các gen này còn được gọi

là các gen gây đột biến, bởi vì việc mất chức năng của chúng dẫn đến sự tích lũy tăng lên các đột biến trong hệ gen Các đột biến xảy ra ở các gen này làm tăng cao nguy cơ mắc các bệnh di truyền trong đó có HNPCC [21]

MMR là một quá trình sinh học có tính bảo thủ về mặt tiến hóa Các tế bào

người chứa ít nhất năm trình tự tương đồng MutS và bốn trình tự tương đồng MutL

Năm trong số các gen này đã được chỉ ra là đóng vai trò quan trọng trong MMR và gây HNPCC khi chúng bị đột biến (Bảng 3)

Bảng 3 Các gen MMR liên quan tới HNPCC [26]

40

10

HNPCC điển hình HNPCC không điển hình

hPMS1 hPMS2

3p21 2p31-33 7p22

50 Hiếm

<2

HNPCC điển hình HNPCC điển hình Hội chứng Turcot

Trong khi các bước đầu tiên của quá trình MMR ở vi khuẩn liên quan tới hoạt tính của MutS và MutL ở dạng homodimer thì hai protein ở người hình thành các heterodimer theo nhiều tổ hợp khác nhau Tính đặc hiệu khác nhau của các phức hợp này cho phép nhận biết các cơ chất khác nhau (Hình 5)

Hình 5 Sửa chữa ADN bắt cặp sai ở người [26]

Ở dạng tương đồng MutS, MSH2 đóng vai trò cơ bản trong sự nhận biết và bám vào các bazơ bắt cặp sai, trong khi MSH3 và MSH6 đóng vai trò sửa đổi tính đặc hiệu của sự nhận biết này [39] Heterodimer MSH2 – MSH6 được gọi là phức hợp MutSα nhận biết đơn bazơ bắt cặp sai, chiếm từ 80% đến 90% các bắt cặp sai trong tế bào [24] Heterodimer MSH2 – MSH3 được gọi là phức hợp MutSβ có nhiệm vụ nhận biết vị trí sai hỏng từ 2 đến 8 nucleotit, hoặc những đột biến mất hoặc thêm bazơ tạo ra các cấu trúc khác biệt như vòng thắt diel Có sự tương tác lẫn nhau trong ái lực nhận biết của MutSα và MutSβ [26, 29]

Ở người có ba dạng tương đồng MutL là heterodimer MLH1 – PMS2 (MutLα), heterodimer MLH1 – PMS1 (MutLβ) và heterodimer MLH1 – MLH3 (MutLγ) [31] Sau khi dạng tương đồng mutS nhận biết các sai hỏng, quá trình sửa chữa tiếp theo được thực hiện bởi dạng tương đồng MutL Đối với các sai hỏng bắt cặp sai đơn nucleotit, dạng tương đồng MutLα sẽ di chuyển tới vị trí sửa chữa và thực hiện chức năng xác định mạch ADN nào là mạch chứa bazơ sai, mạch nào là mạch gốc, sau đó truyền thông tin này tới các enzym sửa chữa ở phía sau, là các enzym có vai trò cắt bỏ một vùng ADN, tái tổng hợp phần bị tổn thương và nối nó với mạch được sửa chữa MutLβ đóng vai trò của dạng tương đồng MutL đối với các sai hỏng có cấu trúc đặc biệt như vòng thắt diel Ở đây vai trò của phức hợp MutLγ vẫn chưa được làm sáng tỏ [26, 38]

1.4.3 Đột biến gen MMR và nguy cơ ung thư

Phân tích các trường hợp ung thư theo dòng họ đã cung cấp cho chúng ta bản chất bên trong về khía cạnh quan trọng của di truyền học ung thư Trong trường hợp HNPCC đã cho thấy sự bất ổn định di truyền có thể tồn tại ở nhiều dạng và minh chứng một cách rõ ràng rằng tính bất ổn di truyền trực tiếp thúc đẩy sự phát sinh khối u Những ung thư xảy ra ở bệnh nhân HNPCC là kết quả của tính bất ổn di truyền bởi những con đường sửa chữa đột biến bị bất hoạt (Hình 6) [17]

Hình 6 Con đường dẫn đến ung thư di truyền ở người thông qua đột biến các gen

sửa chữa bắt cặp sai (MMR)

Tất cả các hệ thống sửa chữa ADN, bao gồm cả MMR gồm sự phối hợp hoạt

tính của nhiều protein Những đột biến gây bất hoạt ở tế bào mầm của một trong các

gen: MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 dẫn đến sự thay đổi hoạt tính protein, làm bất

hoạt hệ thống MMR là nguyên nhân gây HNPCC (Bảng 4)

Bảng 4 Thông tin về một số gen MMR [63]

Gen Số exon NST Số axit amin của

protein

Số đột biến đã được phát hiện

Phân tích di truyền các gen MMR ở người cho thấy rằng trên 90% bệnh nhân

mắc HNPCC là do đột biến ở hai gen MLH1 và MSH2 Trong số các bệnh nhân ung

thư ở độ tuổi 50 và trẻ hơn, ít nhất có một người họ hàng bị ung thư, khoảng 1/4 là

mang các đột biến dòng mầm ở một trong các gen HNPCC bị đột biến cao, MSH2 hoặc MLH1 [43] Riêng gen MLH1 có tần số đạt đến 1/400 và gen MSH2 là 1/500 ở

nhiều quần thể [41] Trong số tất cả các đột biến dòng mầm được báo cáo trong hội

chứng Lynch, gen MLH1 có ảnh hưởng lớn nhất, ước tính chiếm khoảng 50% tổng

Các đột đột biến thay thế nucleotit

Các đột biến thêm hoặc mất nucleotit

Các đột biến làm mất chức năng của các gen này bao gồm đột biến dịch

khung, đột biến vô nghĩa, nhầm nghĩa và trong trường hợp của gen MLH1 và MSH2

có thể liên quan đến mất các vùng mã hóa lớn (Hình 7)

Hình 7 Tỷ lệ các loại đột biến phát hiện ở gen MLH1, MSH2 và MSH6 [14]

Như vậy, gen MLH1 là gen quan trọng nhất trong nghiên cứu ung thư ruột

kết không polyp di truyền (HNPCC)

1.4.4 Gen MLH1

Gen MLH1 nằm trên NST số 3p21, tương ứng với vùng gen MutL ở E coli, nằm giữa các gen TRANK1 và LRRFIP2 với 19 exon, có kích thước khoảng 57,36

kb, mARN dài 2524 bp và protein được tổng hợp từ gen MLH1 gồm 756 axit amin

Đã có hơn 250 đột biến khác nhau đã được báo cáo trong gen MLH1, các đột biến

này khá phổ biến trong cộng đồng Đây cũng là gen có số lượng đột biến được phát hiện nhiều nhất trong số 6 gen liên quan đến HNPCC So với các gen khác thuộc hệ

thống sửa chữa bắt cặp sai MMR, khả năng đột biến xảy ra ở gen MLH1 gây nên

hội chứng Lynch là tương đối cao (50%) Theo thống kê, hiện nay đã phát hiện hơn

225 đột biến trong gen MLH1 ở các bệnh nhân HNPCC, kiểu đột biến chủ yếu được

tìm thấy là các đột biến thay thế (đột biến vô nghĩa, đột biến sai nghĩa, đột biến dịch khung) hoặc các đột biến thêm, mất nucleotit [15] Rossi và cộng sự nghiên cứu trên

25 gia đình Brazil đã tìm thấy 10 trong số 25 gia đình có đột biến ở gen MLH1 và MSH2, trong đó 8 gia đình phát hiện đột biến ở gen MLH1 Có 5 đột biến mất

nucleotit, 1 đột biến thêm và 3 đột biến dịch khung, 18 trong số 56 bệnh nhân

nghiên cứu phát hiện có đột biến (chiếm 32,1%) [17] Yamashita và cộng sự (2003) khi tiến hành nghiên cứu trên 31 gia đình ở Hàn Quốc đã phát hiện được 13 đột biến thay thế nucleotit làm thay đổi các axit amin tương ứng, 13 đột biến thêm và 5 đột biến mất nucleotit làm thay đổi khung đọc kể từ điểm bị đột biến (Hình 8, 9, 10)

Hình 8 Vị trí của gen MLH1 trong NST số 3, gen MLH1 nằm giữa hai gen TRANK1

và LRRFIP2 [63]

Hình 9 Sơ đồ gen MLH1, các hộp màu xanh đại diện cho các exon, khoảng trống đại diện cho các intron [62]

Hình 10 Sơ đồ các protein được mã hóa bởi gen MLH1, các hộp màu xanh đánh số chỉ

thứ tự các exon mã hóa cho protein đó, ba hộp màu vàng lần lượt đại diện cho các miền

mã hóa các protein: protein thủy phân ATP, các protein tương tác với dạng tương đồng MutS, các protein tương tác với PMS2, PMS1, MLH3 tạo dạng tương đồng MutL [62]

Gazzoli và cộng sự đã chứng minh rằng 60-90% đảo CpG được methyl hóa ở cytosine trong hệ gen người, mặc dù những vùng giàu CG không được methyl hóa thường liên kết với vùng hoạt động của gen Ở phần lớn các gen, đảo CpG được tìm thấy ở vùng trình tự promoter Khi sự methyl hóa xảy ra, nhân tố dịch mã không thể gắn vào vùng promoter, khiến sự dịch mã không thể diễn ra, dẫn đến sự im lặng của gen Nghiên cứu này đã được chứng minh dựa trên sự tăng quá trình methyl hóa ở

gen MLH1, được biết đến như các đột biến ngoại sinh không bị giới hạn bởi màng

tế bào Quá trình tăng methyl hóa được bắt nguồn từ các alen đơn sau đó được phân

bố tới các tế bào khác Hitchins và cộng sự khi nghiên cứu 24 bệnh nhân mắc ung thư đại trực tràng và ung thư nội mạc tử cung ở độ tuổi dưới 50, đã phát hiện 2 bệnh

nhân chứa đột biến ngoại sinh ở gen MLH1 Con trai của một trong số hai bệnh nhân này thể hiện sự methyl hóa một phần gen MLH1, tuy nhiên khi phân tích tinh

trùng của anh ta không phát hiện được bất cứ sự methyl hóa nào ở gen này Khi nghiên cứu tiếp với 160 bệnh nhân, họ đã phát hiện ra một bệnh nhân nữ có gen

MLH1 bị methyl hóa được kế thừa từ mẹ Tuy nhiên, sự di truyền các đột biến ngoại

sinh không tuân theo một quy luật nhất định và với tỷ lệ rất thấp (< 1%) [33]

Những bệnh nhân bị đột biến ở gen MLH1 thường có tỷ lệ cao mắc ung thư

đại trực tràng và ung thư dạ dày so với các đột biến ở gen khác Ở các gia đình mắc hội chứng HNPCC ở Châu Âu và các nước Bắc Mỹ ung thư đại tràng không phổ biến Ở các nước châu Á như Nhật Bản, tỷ lệ mắc ung thư đại tràng rất cao Mối liên hệ giữa điều kiện môi trường và sự biểu hiện của ung thư hiện nay vẫn chưa được làm sáng tỏ

Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về các đột biến

di truyền trong các gen MMR, đặc biệt là đối với các gen MLH1 và MSH2 Tuy

nhiên, cho đến nay ở Việt Nam chưa có công trình nào nghiên cứu về các đột biến trên các gen này Nguyên nhân chủ yếu là do:

+ Tính phức tạp của hội chứng HNPCC Biểu hiện của các bệnh nhân HNPCC không rõ ràng, không đặc trưng bởi số lượng các polyp mà chỉ làm tăng

khả năng phát triển các khối u lành tính thành các khối u ác tính gây ung thư Hơn nữa tỷ lệ xâm nhập lại tương đương với tỷ lệ ung thư trong quần thế nên khó xác định được đối tượng nghiên cứu Muốn tiến hành phải nghiên cứu với một số lượng bệnh nhân lớn

+ Tại Việt Nam, muốn tiến hành nghiên cứu theo quá trình lịch sử gia đình là rất khó khăn, do không có các báo cáo chính xác về tình trạng mắc bệnh của các thành viên trong gia đình đối tượng nghiên cứu Vì vậy, quá trình nghiên cứu tiến hành bằng phương pháp sàng lọc gây ra nhiều khó khăn

1.5 Một số kỹ thuật di truyền sử dụng trong nghiên cứu HNPCC

Ngày này, sự phát triển của công nghệ sinh học đã cung cấp nhiều phương pháp mới phục vụ cho việc nghiên cứu di truyền học phân tử Đánh giá được vai trò của những nghiên cứu đột biến gen MMR đối với việc chẩn đoán và phát hiện sớm HNPCC, rất nhiều công trình nghiên cứu đã được thực hiện ở nhiều nơi trên thế giới, nhằm xây dựng một cơ sở dữ liệu cho các gen MMR và các đột biến của chúng phục vụ công tác chẩn đoán và tìm hướng điều trị HNPCC Nhìn chung, các công trình nghiên cứu đó đều được thực hiện bằng những kỹ thuật di truyền dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR

Những phương pháp thường được dùng có thể kể đến như RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction), RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeat), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), PCR-RFLP (Restricted Fragment Length Polymorphism), PCR-SSCP (Single Strand Conformation Polymorphisms)

1.5.1 Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR được Kary Mullis và các cộng sự phát minh (1985), được sử dụng để khuếch đại một đoạn ADN bất kì khi biết trình tự nucleotit ở hai đầu ADN Dựa vào trình tự đó, các cặp oligonucleotit được tổng hợp nhân tạo, mỗi oligo tạo liên kết bổ sung với từng sợi đơn Chúng được sử dụng dùng làm mồi

để tổng hợp ADN in vitro nhờ enzym ADN polymeraza [4]

Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: (1) Giai doạn biến tính ADN thành dạng sợi đơn bằng cách nâng nhiệt độ lên 94-

950C trong khoảng thời gian ngắn (2) Giai đoạn bắt cặp: hai đoạn mồi chuyên biệt sẽ gắn với ADN tương đồng ở hai đầu đoạn ADN cần nhân bản theo nguyên tắc bổ sung khi hạ nhiệt độ xuống dưới nhiệt độ Tm tương ứng của các mồi (khoảng 37-650C); (3) Giai đoạn kéo dài chuỗi: phản ứng tổng hợp phân tử ADN kéo dài từ đoạn mồi, thực hiện ở 720C nhằm tránh hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu

1.5.2 Kỹ thuật PCR phiên mã ngược (RT-PCR: Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction)

Nguyên tắc của kỹ thuật này giống với kỹ thuật PCR thông thường, tuy nhiên khuôn được sử dụng trong phản ứng là mARN Và enzym tham gia phản ứng

là enzym reverse transcriptaza Thực chất kỹ thuật PCR ngược gồm hai giai đoạn: giai đoạn một sử dụng enzym phiên mã ngược tạo nên các đoạn cADN mạch kép từ mạch khuôn ARN và giai đoạn hai thực hiện phản ứng PCR chuẩn để nhân đoạn cADN, tạo nên số lượng bản sao ADN cần thiết [4]

Ưu điểm: có thể đánh giá được mức độ hoạt động của hệ gen, phát hiện được các đột biến trong HNPCC Nhược điểm: thực hiện khá tốn kém, thời gian tồn tại của các mARN thường ngắn, các mARN dễ bị sai hỏng bởi các tác nhân hóa học hoặc nhiệt độ Các đoạn được nhân dòng là các cADN không chứa intron gây một

số hạn chế trong việc nghiên cứu

1.5.3 Kỹ thuật phân tích các trình tự lăp lại đơn giản (SSR - Simple Sequence Repeat)

Kỹ thuật SSR dựa trên sự tồn tại của các vi vệ tinh (microsatellite) là các đoạn ADN lặp lại trong hệ gen, gồm những đơn vị lặp lại từ 2-6 nucleotit, điển hình

là những đoạn trình tự gồm 2-3 nucleotit được lặp lại từ 9 đến 30 lần [1] Các vi vệ tinh là những đoạn lặp lại ngẫu nhiên, ngắn, chúng có thể lặp lại hoàn toàn, lặp lại không hoàn toàn, hoặc lặp lại phức tạp Các vi vệ tinh nằm rải rác trong toàn bộ hệ

gen người Đặc biệt đối với những người mắc HNPCC thì mật độ các vi vệ tinh thường tăng cao (tính bất ổn vi vệ tinh – MSI) Do đó, kỹ thuật SSR là một trong những phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu HNPCC

Ưu điểm: Kỹ thuật SSR tương đối đơn giản, dễ thực hiện, ít tốn kém và hữu hiệu trong việc phát hiện đa hình di truyền Nhược điểm: các vi vệ tinh thường nằm ngoài gen nên khó nghiên cứu các đột biến trong gen, kỹ thuật này cần khá nhiều bước tiến hành, cần thiết kế cặp mồi chính xác tương ứng với vùng sườn để nhân các SSR rải rác trong hệ gen [1]

1.5.4 Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism)

Kỹ thuật RFLP là một kỹ thuật phổ biến được sử dụng trong sinh học phân

tử Sản phẩm PCR sau khi được nhân lên sẽ được tiến hành cắt bằng enzym giới hạn phù hợp thành các đoạn ngắn hơn, dựa vào số lượng và kích thước của các đoạn ADN thu được mà có thể phát hiện ra những sai khác di truyền xuất hiện trong đoạn gen đó

Mỗi một enzym giới hạn có một trình tự nhận biết các bazơ khác nhau, thường là nhận biết 4 hoặc 6 bazơ Nếu đột biến xảy ra trong đoạn ADN cần nghiên cứu tại vị trí cắt của enzym giới hạn, có thể làm tăng thêm hoặc giảm đi các vị trí cắt, do đó làm thay đổi số lượng cũng như kích thước của các đoạn ADN thu được

Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, dễ tiến hành, độ chính xác cao, thường được sử dụng trong nghiên cứu sự khác biệt trong cấu trúc bộ gen của các

cá thể, các loài sinh vật, nhằm so sánh sự khác nhau giữa các mẫu nghiên cứu, xác định nguồn gốc hoặc kiểm tra mức độ tiến hóa của các loài sinh vật [4]

Nhược điểm lớn nhất của phương pháp là việc tìm kiếm các enzym giới hạn tương ứng với đoạn ADN cần nghiên cứu Không phải đoạn ADN nào cũng có các

vị trí nhận biết của enzym giới hạn Hoặc nếu có vị trí nhận biết đó, thì chưa chắc các đột biến cần phát hiện đã nằm trong vị trí cắt của enzym Vì vậy, dù tiến hành

cắt bằng enzym thì cũng không dễ phát hiện được các đột biến có trong đoạn ADN

đó Để làm được việc này phải tiến hành cắt với nhiều enzym khác nhau

1.5.5 Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn (SSCP: Single Strand Conformation Polymorphism)

Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn do Orita và cộng sự phát minh được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1989 như một phương pháp mới để phát hiện sự đa hình ADN, hoặc sự biến đổi trong trình tự ADN [48] Kỹ thuật này cho phép phân tích tính đa hình của cấu hình sợi đơn axit nucleic Đây là một trong những kỹ thuật đơn giản và hiệu quả để phát hiện ra bất cứ một sự thay đổi nhỏ nào trong sản phẩm PCR

Nguyên tắc: Trong điều kiện điện di không biến tính, các mạch đơn ADN sẽ

có một cấu hình nhất định tùy theo trình tự của nó Cấu hình này được xác định bởi các liên kết nội phân tử Các cấu hình sẽ khác ngay cả khi chỉ khác một nucleotit

Sự khác biệt này dẫn đến sự khác về khả năng di chuyển trong gel polyacrylamide Gel polyacrylamide được sử dụng để phân tích ADN với hệ thống đệm đặc biệt và không chứa ure Trong môi trường điện di không biến tính, các thành phần được sử dụng để tổng hợp gel là các đơn phân acylamide, N,N-methylene bisacrylamide (Bis), ammonium persulphate (APS) và N,N,N,N-tetramethylenediamine (TEMED)

Sau khi biến tính ADN sợi kép, do tính chất tương đối không ổn định của sợi đơn khi vắng mặt của một sợi bổ sung, các nucleotit trên sợi đơn ADN có thể bắt gặp các trình tự nucleotit bổ sung ngay trên sợi ADN đó Kết quả là chúng bắt cặp với nhau, tạo ra những vòng hoặc những nếp gấp, tạo nên các cấu hình không gian

ba chiều đặc thù [64] Do cấu hình không gian của sợi đơn và sợi đôi khác nhau nên tốc độ di chuyển của chúng trên gel polyacrylamide không biến tính rất khác nhau Sợi đơn thường chạy chậm hơn rất nhiều so với sợi đôi (Hình 11) Hơn nữa, sự khác biệt nhau về hình dạng giữa hai sợi đơn với trình tự khác nhau sẽ làm cho chúng di

chuyển khác nhau trên cùng một bản gel điện di, mặc dù số lượng nucleotit của chúng như nhau [62, 66]

Hình 11 Kết quả phân tích SSCP exon 5 của gen AR [66]

M: marker 1-6: Sản phẩm PCR exon 5 (285bp) Mũi tên chỉ vị trí đột biến

Giống như kỹ thuật phân tích sự đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP), kỹ thuật SSCP cũng phân tích sự thay đổi alen được di truyền, các đặc tính

di truyền mà có thể được sử dụng như các dấu chuẩn di truyền Tuy nhiên, không giống phân tích RFLP, kỹ thuật SSCP có thể phát hiện được sự đa hình ADN và các đột biến ở nhiều vị trí trên đoạn ADN [40] Như một kỹ thuật rà soát đột biến, tuy nhiên, SSCP thường được sử dụng nhiều hơn để phân tích sự đa hình ở một vị trí đơn, đặc biệt được sử dụng nhiều cho chẩn đoán y khoa [48]

SSCP là một kỹ thuật đơn giản, dễ làm, ít tốn kém, khá chính xác; tuy nhiên, tốn khá nhiều thời gian và đòi hỏi sự khéo léo Theo Wagner và cộng sự (2002), kích thước của sản phẩm PCR ảnh hưởng đến kết quả phân tích SSCP Kỹ thuật SSCP cho kết quả tốt nhất khi kích thước ADN nằm trong khoảng 150 – 300 bp (97-99% đột biến được phát hiện), kích thước của sản phẩm PCR càng dài thì thời gian điện di càng lâu và tỷ lệ đột biến được phát hiện càng thấp (67-89% đột biến được phát hiện với sản phẩm ADN > 300bp)

Trong khuôn khổ đề tài và điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã sử dụng

kỹ thuật RFLP và kỹ thuật SSCP Đây cũng là hai phương pháp được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới sử dụng như: P.V Cecily và cộng sự (2008), Shin và cộng sự (2004), Han và cộng sự (1995), Han và cộng sự (1998), K S Young và cộng sự

(2004), H Zhang và cộng sự (2008)… để nghiên cứu đột biến trên gen MLH1 gây

ung thư ruột kết không polyp di truyền ở người với kết quả phát hiện đột biến cao; Đặc biệt, kỹ thuật SSCP đòi hỏi chi phí thấp hơn hẳn các kỹ thuật khác rất phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của chúng tôi nói riêng cũng như điều kiện nghiên cứu tại Việt Nam nói chung

1.5.6 Phương pháp giải trình tự ADN

Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotit trong phân tử ADN Từ những năm 1977, các phương pháp giải trình

tự gen đã được phát minh: giải trình tự gen theo phương pháp hóa học (Alan Maxam và Walter Gilbert); Xác định trình tự gen theo phương pháp dideoxy, dựa trên cơ chế tổng hợp ADN trong cơ thể (Frederick Sanger); Giải trình tự gen bằng máy tự động (Automatic DNA sequencer) được thiết kế trên nguyên tắc sử dụng ddNTP do Frederick Sanger và cộng sự phát minh [4] Tuy nhiên, để có thể tự động hóa, ngày nay người ta dùng các ddNTP có gắn các màu phát quang khác nhau

Nguyên tắc của phương pháp dideoxy dựa trên việc bổ sung các dẫn xuất tương ứng của các dNTP là 2’, 3’ – dideoxynucleotit (viết tắt là ddNTP) vào thành phần phản ứng tổng hợp ADN trong ống nghiệm Do ddNTP thiếu nhóm C3’- OH nên một khi nó được gắn vào mạch ADN đang tổng hợp thì quá trình tổng hợp sẽ dừng lại Do đó, thu được một hỗn hợp nhiều phân tử ADN được sao chép không hoàn chỉnh giống nhau ở đầu 5’ được đánh dấu và khác nhau ở đầu 3’ về chiều dài

và loại nucleotit kết thúc chuỗi Sau đó, các sản phẩm này được phân tách trên bản điện di

Phương pháp giải trình tự gen do F Sanger và cộng sự phát minh có độ chính xác tương đối cao, là cơ sở của các máy giải trình tự gen tự động [4]

1.6 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài

1.6.1 Mục tiêu nghiên cứu

Sàng lọc các đột biến ở một số exon trên gen MLH1 bằng các kĩ thuật

PCR-RFLP và PCR-SSCP, góp phần cung cấp dữ liệu về đột biến ở gen này và mở ra hướng nghiên cứu tiếp theo cho các gen MMR khác nhằm ứng dụng trong chẩn đoán sớm ung thư đại trực tràng không polyp di truyền tại Việt Nam

1.6.2 Nội dung nghiên cứu của đề tài

 Các nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm:

1 Thu thập các mẫu bệnh phẩm (máu và mô) của các bệnh nhân đã được xác định ung thư đại trực tràng và dạ dày

2 Nhân bản một số exon quan tâm của gen MLH1 bằng kỹ thuật PCR

3 Phân tích và xác định các đột biến ở một số exon nghiên cứu bằng SSCP và RFLP

4 Giải trình tự ADN một số mẫu đã được xác định đột biến bằng sàng lọc ở bước trên

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu

Mẫu mô và mẫu máu được thu thập từ các bệnh nhân ung thư đại trực tràng,

dạ dày đến khám và điều trị tại Bệnh viện K và Bệnh viện Đại học Y Hà Nội Mẫu đối chứng được lấy từ người không mắc bệnh được cung cấp bởi Bệnh viện Đại học

Y Hà Nội Mẫu máu được chống đông bằng EDTA Các mẫu được bảo quản trong điều kiện lạnh -200C Đề tài được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Phân tích di truyền (Trung tâm khoa học Sự sống, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội) và phòng Sinh học thụ thể và phát triển thuốc (phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein)

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu gồm:

 Nhóm hóa chất dùng cho tách ADN tổng số : PBS, proteinase K, phenol, chloroform, isoamyl alcohol, đệm Lysis tách máu, đệm Lysis tách mô; dung dịch NaCH3COO 3M pH 5,2 và pH 4; đệm TE; ethanol 100%, ethanol 70%; RNase

 Nhóm hóa chất dùng cho PCR: Taq ADN polymerase, Taq buffer, dNTP, mồi đặc hiệu

 Nhóm enzym giới hạn dùng cho phản ứng cắt: MspI, CviQI

 Nhóm hóa chất dùng cho điện di gel agarose: agarose, đệm TAE, dye, ethydium bromide

 Nhóm hóa chất SSCP: Acrylamide, Bis-Acrylamide, formaldehyde, TEMED, APS

 Nhóm hóa chất nhuộm và một số hóa chất khác: AgNO3, ADN loading dye 6X, Na2CO3, CH3COOH , EDTA, NaOH, Ethanol

Các hóa chất đảm bảo độ tinh sạch sử dụng trong sinh học phân tử và được cung cấp bởi các hãng có uy tín trên thế giới: Fermentas (Lithuania); Promega (Mỹ), Sigma (Mỹ)

2.1.3 Thiết bị

Các loại máy móc thiết bị, dụng cụ chính được sử dụng: ống eppendorf, các loại đầu côn, pipet Máy li tâm thường, máy li tâm lạnh, máy vortex, máy Spin down, bể ổn nhiệt, cân phân tích, tủ lạnh -200C, tủ hút, máy làm đá, máy PCR AmpGen 9700 (Perkin – Elmet), bộ điện di nhỏ, bộ điện di đứng, máy soi gel, máy chụp ảnh

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thu thập và bảo quản mẫu

Mẫu sinh phẩm được thu thập trong các ống chuyên dụng, đảm bảo không bị nhiễm bẩn, không bị lẫn các mẫu với nhau Các ống thu thập mẫu máu chứa sẵn EDTA có tác dụng chống đông máu Mẫu được bảo quản trong điều kiện -200C cho đến khi được sử dụng để tách chiết và phân tích ADN

2.2.2 Phương pháp tách chiết ADN tổng số

2.2.2.1 Tách ADN tổng số từ máu

ADN tổng số được tách từ các mẫu máu theo phương pháp được mô tả bởi Sambrook và cộng sự [45] với một số cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Các bước tiến hành như sau:

1 Mẫu máu được lấy ra khỏi tủ -200C, để tan trong điều kiện thường, hút bỏ dịch huyết thanh bên trên sau đó đảo trộn kỹ lượng máu còn lại

2 Thu tế bào: Thêm vào ống eppendorf (1,5ml) 0,7ml máu, bổ sung 0,7 ml

PBS 1X Đảo trộn đều Ly tâm 6000 v/p trong 15 phút ở nhiệt độ phòng (240C) Hút

bỏ dịch pha trên, chỉ giữ lại phần cặn tế bào dưới đáy ống Lặp lại bước này 3 lần

3 Phá màng tế bào: Bổ sung 0,6 ml dung dịch Lysis và 6µl proteinase K, đảo

đều Ủ trong ~3h ở 560

C bằng bể ổn nhiệt, cho đến khi mẫu tan hết cặn

4 Loại protein: Bổ sung 0,6 ml phenol, vortex Ly tâm 12000 v/p trong 15

12000 v/p trong 5 phút ở 40C Loại dịch pha trên, thu ADN kết tủa dưới đáy ống

6 Rửa tủa: Bổ sung 0,5 ml ethanol 70%, búng đều lên cả thành ống, ly tâm

12000 v/p trong 5 phút ở 40C Loại dịch, thu cặn Lặp lại với 0,2 ml ethanol 70%

Để tủa khô hoàn toàn ở nhiệt độ phòng

7 Hòa tan tủa: Bổ sung 50 µl đệm TE, búng đều để tủa tan hoàn toàn Lấy

10µl mẫu, pha loãng 10 lần bằng nước khử ion vô trùng

8 Loại ARN: Bổ sung 2 µl RNase, ủ ở 370C trong vòng 1h30 phút Bất hoạt enzym ở 900C trong vòng 30 phút Bảo quản mẫu trong tủ -200

C

2.2.2.2 Tách ADN từ mô

ADN tổng số từ mô được tách chiết theo phương pháp cơ bản được mô tả bởi Sambrook và cộng sự (2001) [45] đã được cải tiến cho phù hợp với điều kiện tách mô Các bước tiến hành tách chiết như sau :

1 Phá màng tế bào: Cắt nhỏ 0,1g mẫu cho vào ống eppendorf, bổ sung 0,7

ml đệm lysis và 10 µl proteinase K rồi ủ trong 8-10 giờ ở 560

C, thỉnh thoảng đảo đều ống cho đến khi mẫu tan hết

2 Loại protein: Bổ sung 0,6 ml phenol rồi lắc đều hỗn hợp bằng máy vortex

Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 12000 v/p trong 15 phút ở 40C để thu dịch pha trên Bổ sung hỗn hợp PCI (phenol : chloroform : isoamyl alcohol tỉ lệ thể tích 25 : 24 : 1) tỉ

lệ 1 : 1 với thể tích dung dịch thu được Lắc đều hồn hợp rồi ly tâm 12000 v/p trong