xây dựng phương pháp đo tương tác thụ thể và phối tử đặc hiệu không sử dụng phóng xạ phục vụ định hướng phát triển thuốc ở việt nam

Vì vậy lý do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng phương pháp đo tương tác thụ thể và phối tử đặc hiệu không dùng đồng vị phóng xạ phục vụ định hướng phát triển thuốc ở Việt Nam” nh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Anh Lương

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO TƯƠNG TÁC THỤ THỂ VÀ

PHỐI TỬ ĐẶC HIỆU KHÔNG SỬ DỤNG PHÓNG XẠ PHỤC VỤ

ĐỊNH HƯỚNG PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Anh Lương

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO TƯƠNG TÁC THỤ THỂ VÀ

PHỐI TỬ ĐẶC HIỆU KHÔNG SỬ DỤNG PHÓNG XẠ PHỤC VỤ

ĐỊNH HƯỚNG PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS ĐINH ĐOÀN LONG

Hà Nội – 2011

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

1.4 Thụ thể angiotensin II 12

1.5 Các phương pháp nghiên cứu xác định tương tác thụ thể và phối tử 20

1.6 Y học cổ truyền và tài nguyên dược liệu 26

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 36

2.1 Vật liệu 35

2.2 Phương pháp nghiên cứu 37

2.2.1 Quy trình chiết xuất dịch chiết methanol 37

2.2.2 Thu thụ thể màng 37

2.2.3 Xác định nồng độ protein sử dụng phương pháp Bradford 38

2.2.4 Phương pháp elisa để xác định lượng phối tử gắn fluorescein 39

2.2.5 Quy trình thí nghiệm liên kết (binding assay) 39

2.2.6 Phản ứng tương tác giữa các phối tử đã biết và dịch chiết với thụ thể đích 40 2.2.7 Phương pháp xử lý kết quả 40

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Xác định nồng độ protein thu được từ gan chuột 41

3.2 Tối ưu phản ứng ELISA 43

3.3 Tối ưu nồng độ protein thụ thể trong phản ứng liên kết 45

3.4 Thí nghiệm liên kết thụ thể - phối tử đặc hiệu (thí nghiệm bão hòa) 46

3.5 Phả ứng cạnh tranh của F-AT II với các phối tử đã biết 47

3.6 Nghiên cứu sàng lọc một số dịch chiết thực vật 48

Chương 4 KẾT LUẬN 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

AT I Angiotensin I

AT II Angiotensin II

BSA Bovine serum albumin

ELISA Phản ứng miễn dịch hấp thụ liên kết enzym

F-AT II Fluorescein – angiotensin II (angiotensin II đánh dấu fluorescein F-BSA Fluorescein – BSA (BSA đánh dấu fluorescein)

GPCR G protein - coupled receptor

IC50 Nồng độ ức chế 50%

Kd Hằng số phân ly cân bằng

Ki Nồng độ chất gắn cạnh tranh mà liên kết với một nửa số vị trí

liên kết ở trạng thái cân bằng YHCT Y học cổ truyền

hệ Hơn 3800 bài thuốc đã được sưu tầm lại, cùng với hàng nghìn bài thuốc lưu truyền trong dân gian, đặc biệt là trong cộng đồng các dân tộc thiểu số Tuy nhiên, rất nhiều các bài thuốc và các nguyên liệu làm thuốc như vậy vẫn chưa được nghiên cứu cơ chế tác động cũng như cơ sở khoa học vẫn chưa được xác định

Có nhiều phương pháp nghiên cứu sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học trong phát triển thuốc trên thế giới, trong đó phổ biến là phương pháp sử dụng đồng vị phóng xạ (như 3H, 125I) để nghiên cứu trên các đích phân tử của thuốc Tuy nhiên, những phương pháp này chưa được áp dụng trong điều kiện Việt Nam với nguyên nhân chính là hầu hết các phòng thí nghiệm sinh dược học của ta thiếu trang thiết bị nghiên cứu, bảo quản và loại thải các chất phóng xạ

Vì vậy lý do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng phương pháp đo

tương tác thụ thể và phối tử đặc hiệu không dùng đồng vị phóng xạ phục vụ định hướng phát triển thuốc ở Việt Nam” nhằm tiến tới ứng dụng mô hình này

nhằm sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học trên đích phân tử có nguồn gốc từ các cây thuốc, bài thuốc được sử dụng hiệu quả trong y học cổ truyền với các tác dụng chữa bệnh tương ứng

Trong Luận văn này, chúng tôi tập trung vào đích phân tử là thụ thể angiotensin II, đây là đích tác dụng đã được biết của nhiều thuốc có tác dụng hạ huyết áp với cơ chế phân tử đã được nghiên cứu tương đối rõ, đồng thời bước đầu tiến hành thử nghiệm với một số dịch chiết từ một số cây thuốc Việt Nam đã được biết trong y học cổ truyền với tác dụng trong điều hòa huyết áp và điều trị các chứng bệnh liên quan đến tim, mạch và hệ tuần hoàn

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát về dược lý phân tử

Dược lý phân tử (molecular pharmacology) là môn khoa học nghiên cứu về tương tác của thuốc lên cơ thể sống ở cấp độ phân tử và tế bào, và gồm hai phân môn chính là dược động học (pharmacokinetics) và dược lực học (pharmacodynamics)

Dược lý phân tử bao gồm nhiều lĩnh vực nghiên cứu về tác dụng của phân tử thuốc đến toàn bộ cơ thể Dựa vào những hiểu biết về hóa sinh, sinh lý, bệnh học, sinh học phân tử và hóa hữu cơ để thấy rõ tác dụng của thuốc ở mức độ phân tử đưa đến áp dụng trong điều trị Qua dược lý phân tử, chúng ta có thể hiểu sâu sắc cơ chế phân tử tác dụng của thuốc, phát hiện thuốc mới, đề xuất những hướng dẫn sử dụng thuốc an toàn, hiệu quả trong điều trị hoặc ngăn chặn những phản ứng có hại của thuốc khi sử dụng Nội dung chủ yếu của dược lý phân tử là dược lý học về tác dụng của thuốc ở mức dưới tế bào [2]

Dược lý phân tử thể hiện ở nhiều giai đoạn của phân tử thuốc trong cơ thể, hiện nay dược lý phân tử được nghiên cứu với các hướng chính đó là:

1) Nghiên cứu tác dụng thuốc lên màng tế bào

2) Nghiên cứu hóa sinh dược lý phân tử đối với thụ thể màng tế bào

3) Nghiên cứu hóa sinh dược lý phân tử đối với enzym tế bào

4) Nghiên cứu hóa sinh dược lý phân tử trên gen

1.2 Các đích tác dụng của thuốc

Theo phân tích của Overington và cộng sự [38] hơn 21.000 sản phẩm thuốc lưu hành trên thị trường Mỹ, có nguồn gốc từ 1357 thuốc dưới các dạng thành phần, các dạng muối, vitamin Trong đó có 1204 các thuốc phân tử nhỏ, và 166 thuốc sinh học Khoảng 27% các thuốc này liên quan tới thụ thể kết cặp G protein, 13% tới thụ thể nhân, 7,9% tới các thụ thể liên kết với kênh ion (hình 1.1) [38]

Hình 1.1 Phân bố các họ gen với đích tác dụng của các thuốc hiện nay ( Nguồn:

Overington, 2006)

Hầu hết các thuốc tác dụng lên cơ thể, tế bào thông qua một số cơ chế phân tử khác nhau Mỗi cơ chế được thích ứng thông qua sự tiến hóa của các họ protein riêng, giúp truyền được nhiều loại tín hiệu Các họ protein này bao gồm các thụ thể trên bề mặt và bên trong tế bào cùng với các enzym và thành phần khác giúp tạo ra, khuếch đại, phối hợp và kết thúc các tín hiệu từ phân tử tác động là thuốc và các chất nội sinh

Có 5 cơ chế truyền tín hiệu qua màng tế bào cơ bản (hình 1.2) [28] Mỗi loại

sử dụng một chiến lược khác nhau để vượt qua các rào cản là lớp kép phospholipid của màng tế bào Các chiến lược được sử dụng là (1) phối tử (ligand) tan trong lipid vượt qua màng sinh chất và tác động lên một thụ thể nội bào; (2) protein thụ thể xuyên màng có hoạt tính enzym nội bào được điều khiển dị lập thể bởi một phối tử liên kết vào một vị trí trên miền ngoại bào của protein này; (3) thụ thể xuyên màng liên kết và kích thích một protein kinase; (4) kênh ion liên kết với tương tác với phối tử ( điều khiển hoạt động của kênh bằng liên kết với phối tử); hoặc (5) protein

Các thụ thể GPCR Các thụ thể nhân Các kênh ion liên kết phối tử Các kênh ion điện thế Protein liên kết penicillin Enzyme giống như myeloperoxidase Protein vận chuyển chất dẫn truyền thần kinh DNA topoisomerase typ II

Fibronectin typ III Cytochrome P450

thụ thể xuyên màng kích thích G protein, từ đó điều khiển một chất truyền tin thứ 2 trong tế bào

Hình 1.2 Các cơ chế truyền tín hiệu cơ bản Cơ chế thứ nhất (1) Một phân tử tín hiệu (phối tử) hóa học hòa tan trong lipid đi qua màng sinh chất và tác động lên các thụ thể nội bào (mà

có thể là một enzym hoặc một yếu tố điều hòa sự phiên mã của gen) (2) Phân tử tín hiệu liên kết với miền ngoại bào của một protein xuyên màng, qua đó kích hoạt hoạt tính enzym của miền nội bào của protein này (3) Phân tử tín hiệu liên kết với miền ngoại bào của một thụ thể liên kết xuyên màng với một protein kinase, làm kích hoạt protein kinase này (4) Phân tử tín hiệu liên kết và trực tiếp điều khiển việc mở một kênh ion (5) phân tử tín hiệu liên kết với một thụ thể bề mặt tế bào mà liên kết với một enzym tác động bởi một G protein (A, C: cơ chất; B, D: sản phẩm; R: thụ thể; G:

G protein; E: tác động (enzym hoặc kênh ion); Y: tyrosine; P: phosphate). (Nguồn: Katzung, 2007)

Các đích phân tử chính của phần lớn các dược phẩm hiện nay bao gồm các nhóm được nêu ở các mục dưới đây [48]:

1.2.1 Thụ thể kết cặp G protein (GPCR)

Hơn 26% các thuốc được bán trên thị trường có liên quan tới nhóm thụ thể này; đây là nhóm thụ thể phổ biến được biểu hiện trên bề mặt của nhiều loại tế bào Protein liên kết vào màng tế bào thông qua 7 lần xuyên màng, do đó còn được gọi với tên khác là thụ thể 7 lần xuyên màng (hay 7TM) Các G protein là các phân tử kết cặp với loại thụ thể này để truyền tín hiệu được sinh ra sau khi phối tử (hay chất gắn đặc hiệu) liên kết vào thụ thể rồi truyền tín hiệu vào trong tế bào Hệ gen người

có hơn 1000 gen mã hóa cho các GPCR, trong đó ước tính có khoảng 400 GPCR có

tiềm năng là các đích tác dụng của các loại thuốc Các nghiên cứu về vai trò, chức năng của các thụ thể GPCR vẫn đang tiếp tục được triển khai và phát triển

1.2.2 Các thụ thể nhân (NR)

Các thụ thể này liên kết với các phối tử bên trong tế bào và về số lượng có lẽ ít hơn nhiều so với các thụ thể trên màng tế bào Sau khi phối tử liên kết, một phức hợp được hình thành giữa thụ thể và phối tử đi vào trong nhân tế bào để “đóng” hoặc “mở” các gen đặc trưng Các thụ thể nhân liên kết với các phân tử ưa lipid như các dẫn xuất của steroid, retinoid (như các hoocmon giới tính và vitamin A) có ảnh hưởng sâu sắc tới sinh lý con người Hệ gen người mã hóa cho khoảng 50 thụ thể nhân, một nửa số đó là các thụ thể độc thân (orphan receptor), nghĩa là các thụ thể chưa xác định được phối tử đặc hiệu

1.2.3 Thụ thể cytokine

Một họ các protein có nhiều hơn 1 chuỗi protein được nhúng vào màng tế bào Các phối tử cytokine là các protein như interleukin, interferon và các yếu tố tăng trưởng Vì các phân tử nhỏ không thể phá vỡ liên kết của cytokine liên kết với thụ thể của nó, nên các thuốc được sử dụng thường là các protein lớn hơn Đó là các kháng thể hoặc các dạng tái tổ hợp của thụ thể mà hoạt động như những cái bẫy để ngăn cản sự liên kết của phối tử vào thụ thể

1.2.4 Các protease

Đó là những enzym cắt protein ở những điểm xác định bởi các trình tự axit amin đặc hiệu Các protease có nhiều vai trò trong cơ thể, như tham gia phản ứng đông máu, sản xuất các hoocmon peptit và cần cho chu kỳ sống của các virut như HIV Mặc dù các thuốc ức chế protease hiện vẫn là một thách thức lớn trong nghiên cứu thuốc, nhưng đã có một số thuốc đã được thương mại hóa có đích tác dụng là lớp enzym này

1.2.5 Các protein kinase

Đây là một họ enzym lớn giúp gắn nhóm photphat (-PO3) vào một phân tử protein để họa hóa nó trong tế bào Quá trình photphoryl hóa được dùng để chuyển tín hiệu từ ngoài tế bào qua các thụ thể trên màng để đi vào nhân tế bào, ở đó chúng khởi động sự biểu hiện của gen Kinase có vai trò đặc biệt trong sự phát sinh ung thư bởi vì các tế bào sinh trưởng phụ thuộc vào các yếu tố tăng trưởng bên ngoài là một kết quả của các enzym kinase đặc hiệu trở nên hoạt hóa thường xuyên Việc ức chế protein kinase hiện nay là một hướng lớn trong tìm kiếm thuốc phân tử nhỏ

1.2.6 Các protein phosphatase

Đây là những enzym có vai trò xúc tác các phản ứng ngược chiều so với các enzym kinase, chúng loại bỏ nhóm photphat của protein Đây cũng là một cơ chế quan trọng để truyền tín hiệu tế bào, vì nó hoạt động như một “công tắc đóng” để điều khiển các quá trình quá mức trong tế bào

1.2.7 Các enzym khác

Các họ protein và enzym được liệt kê trên tạo nên phần lớn các đích tác dụng của thuốc hiện nay Ngoài ra còn các enzym khác, có thể kể đến các chất ức chế HMG-CoA reductase (được biết như là các statin) làm giảm cholesterol và các chất

ức chế phosphodiesterase (PDE), trong đó Viagra là một ví dụ được biết nhiều nhất

1.2.8 Các kênh ion

Các ion là những nguyên tử hay phân tử tích điện Các ion kim loại, như Ca2+,

Na+ và K+ , đóng vai trò thiết yếu trong nhiều quá trình sinh lý của cơ thể Các ion

đi qua các lỗ trên màng tế bào còn được gọi là các kênh ion Hai loại kênh ion chính được biết là các kênh ion được đóng mở bởi phối tử và kênh ion được đóng mở bởi điện thế (ligand-gated and voltage-gated ion channels.) Mỗi kênh có tính chọn lọc cho một ion đặc trưng và cho phép các ion qua màng từ ngoài vào trong hoặc ngược lại Sự di chuyển của ion trong hoạt động của các tế bào thần kinh và liên quan tới các điều kiện như động kinh, đau và rối loạn nhịp tim Đó là những điều đáng quan tâm nhất của các kênh ion là đích của thuốc, với một số các thuốc quan trọng được lưu hành trên thị trường

1.3 Về thụ thể kết cặp G protein

Thụ thể là các phân tử kích hoạt điều hòa một loạt các quá trình trao đổi chất

và sinh lý trong tế bào cũng như ở các tổ chức phức tạp hơn Trong dược lý giác quan, thụ thể là các protein chuyển đổi một chiều và có chọn lọc của một phân tử truyền tín hiệu nội sinh hoặc các chất tổng hợp tương tự của chúng, trải qua biến đổi thông tin, và sửa đổi một đáp ứng tế bào như một hệ quả Nhóm thứ nhất là các thụ thể nội bào của các siêu họ thụ thể nhân và các thụ thể hoocmon steroid, retinoid và thyroid Nhóm thứ hai là các thụ thể liên kết với màng tế bào, nhóm này rất đa dạng Các thụ thể này giúp chuyển đổi tín hiệu từ bên ngoài vào trong tế bào đáp ứng Siêu họ này gồm có các thụ thể kết cặp kênh ion, thụ thể kết cặp kinase và họ lớn các thụ thể kết cặp G protein

1.3.1 Cấu trúc của các thụ thể kết cặp G protein

Các thụ thể kết cặp G protein (GPCR) là các protein xuyên màng với đặc điểm đặc trưng chung là xoắn 7 lần xuyên màng (cấu trúc bậc 2 xoắn ) Các phối tử nội sinh của chúng có thể là các chất tín hiệu monoamine (epinephrine, acetylcholine,

serotonin, histamine, dopamine), lipid (các prostaglandin, các lipid nội sinh) các peptid thần kinh (neuropeptide Y, cơ chất P, cholecystokinin, các opioid và các hoócmôn peptide (glucagon, angiotensin, bradykinin) cũng như các protein nhỏ (các chemokine) và các protein lớn (các hoocmon glycoprotein, thrombin) Tất cả các GPCR chuyển các tín hiệu của chúng vào bên trong tế bào thông qua sự tương tác với các G protein dị hình Thêm vào đó, các protein giác quan quan trọng như thụ thể rhodopsin và các thụ thể khứu giác cũng thuộc họ này Kích thước của các loại GPCR rất khác nhau, từ ít hơn 300 axit amin như thụ thể adrenocorticotropin, tới hơn 1100 axit amin đối với các thụ thể metabotropic glutamate Các thụ thể với các biến đổi sau dịch mã khác nhau như glycosyl hóa, thường dẫn đến khối lượng phân

tử cao hơn so với các trình tự axit amin ban đầu Các biến đổi khác bao gồm cầu disulfide và palmitoyl hóa ở các vị trí đặc biệt Đa số các GPCR được phân loại bằng các trình tự tương đồng ban đầu và các họ phụ được đặt tên bằng những đặc điểm đặc trưng nhất của các thành viên Trong khi mức độ tương đồng thấp chỉ được tìm thấy ở các đoạn vòng, thì các đoạn xoắn xuyên màng 7 lần có 20 - 25 axit amin kỵ nước ở mức độ bảo thủ cao [6]

Cơ chế kinh điển hoạt động chức năng của GPCR được xác định bởi sự kết cặp của chúng với các protein liên kết với nucleotide guanine (G protein) [9]

Thông thường, một GPCR ở trạng thái nghỉ ngơi hay ái lực thấp khi thiếu các chất chủ vận (agonist) Sự liên kết của một chất chủ vận tới một thụ thể kích thích một sự biến đổi trong cấu trúc của thụ thể và hình thành một phức hệ với các G protein nội bào (hình 1.3) G protein dị hình có chứa một tiểu phần liên kết với màng là Gα và các tiểu phần di động là Gβ và Gγ Phân tích di truyền học hiện đại có thể xác định được một số tiểu đơn vị G protein tạo thành 16 Gα, 5 Gβ và 12 Gγ như hiện nay đã được nhân dòng và xác định trình tự [39] Tiểu phần Gα liên kết GTP và GDP và nó gây ra thủy phân GTP Các tiểu phần Gβ và Gγ hình thành một phức hệ theo tỉ lệ 1:1

Hình 1.3 GPCR tuyền tín hiện thông qua các G protein Sự tương tác với chất chủ vận dẫn đến thay đổi cấu hình của thụ thể và tới sự kết cặp với các G protein Kết quả là sự hoạt hóa của chuỗi truyền tín hiệu thông qua tiểu đơn vị Gα G β và G γ cũng có thể gây ra các đáp ứng tế bào A: chất chủ vận (agonist) hoặc đối vận (antagonist) DAG: diacylglycerol PI3Kγ: phosphoinositide 3-kinase-γ PLCβ: phospholipase Cβ PKA, PKC: protein kinase A và C (Nguồn: Birnbaumer, 1990)

Sau khi GPCR và G protein tương tác (kết cặp), GDP được giải phóng và được thay thế bởi GTP, sau đó tiểu phần Gα được phân ly từ phức Gβγ Cả hai tiểu phần Gα và phức kép Gβγ có thể hoạt hóa các phân tử gây ra đáp ứng nội bào Ví dụ

Gα có thể hoạt hóa enzym adenyl cyclase, dẫn đến làm tăng lượng cAMP; phân tử này đến lượt nó làm giảm hoạt tính protein kinase A (PKA) PKA là một enzym serine-threonine kinase có chức năng photphoryl hóa, qua đó hoạt hóa nhiều yếu tố phiên mã, các kinase và các thụ thể GPCR khác

Bảng 1.1 Các G protein và chức năng trong sự truyền tin của tế bào

G protein Chức năng trong truyền tin tế bào

G αq , G α11 Hoạt hóa phospholipase C; điều hòa hoạt động của phospholipase C

đặc hiệu phosphoinositide

G α14 , G α15 , G α16 Hoạt hóa Rho GEF

G αs Hoạt hóa adenylyl cyclase; RGS-PX1 hoạt động như một protein

hoạt hóa GTPase cho Gαs

G αo1f Tương tác kênh Ca2+; kích hoạt c-Src tyrosine kinase

G αi Ức chế adenylyl cyclase; kích hoạt c-Src tyrosine kinase

dẫn đến phân cực quá mức

GIRK

GIRKs Hoạt hóa adenylyl cyclase; hoạt hóa phospholipase C

(Nguồn: Lundstrom, 2006), Các loại tiểu phần Gα khác nhau đóng vai trò quyết định đến truyền tín hiệu và

có thể được chia thành bốn nhóm Tiểu phần Gαs kích thích adenylyl cyclase, trong khi đó tiểu phần Gαi ức chế adenylyl cyclase và hoạt hóa kênh điều chỉnh ion K+liên kết G protein (GIRK) Gαq gây ra hoạt hóa phospholipase C và Ga12 hoạt hóa các yếu tố trao đổi guanidine nucleotide của Rho (Rho GEFs) Phức kép Gβγ có thể

độc lập hoạt hoá các kênh GIRK, adenylyl cyclase và các phospholipase Các chức năng khác của các tiểu phần G protein được nêu trên bảng 1.1 [32]

1.3.2 Thụ thể kết cặp G protein là đích của tìm kiếm thuốc

Khoảng 25% tổng số thuốc tân dược đang được sử dụng rộng rãi trong điều trị hiện nay có đích tác động là các GPCR; điều này làm cho GPCR trở thành các đích phổ biến nhất trong việc tìm thuốc trong công nghiệp dược dẫn đến sự phát triển của các loại thuốc bán chạy trên thị trường hiện nay bao gồm salmeterol, olanzapine, clopidrogel, losartan và risperidone Chúng và các thuốc khác nhắm vào đích là các GPCR được dùng để điều trị nhiều trạng thái bệnh khác nhau tác động lên hệ tim mạch và hệ thần kinh trung ương, hệ tiêu hóa và các chức năng tiêu hóa cũng như ung thư, đau, và dị ứng

Rất lâu trước khi chúng ta hiểu về các hoạt tính hóa học và phân tử của các GPCR, con người đã sử dụng các sản phẩm tự nhiên của cà độc dược, của lúa mạch

và thuốc phiện từ các nguồn khác nhau của thực vật để tìm ra các tác động dược lý

ở các đích chưa biết để điều trị một số bệnh tật Cho đến đầu thế kỷ 20, ý tưởng về thụ thể được đặt ra khi Paul Ehrlich chỉ ra rằng các cơ chất thuốc có thể tương tác với thụ thể hóa học (chemoreceptor) đơn lẻ và tạo ra các tác động dược lý Các nhà dược lý học hàng đầu khác bao gồm Henry Dale, Otto Loewi, R.P Ahlquist, và James Black đã có công trong việc miêu tả hoạt động của các hợp chất ở các thụ thể

về sau này được xác định là các GPCR, đặt nền móng cho việc thiết kế thuốc dựa trên sự tương tác của chúng với các đích phân tử

1.4 Thụ thể angiotensin

Angiotensin là một hoocmon peptide có vai trò quan trọng trọng cơ thể, gây co thắt mạch và tăng huyết áp Angiotensin là một phần của hệ renin-angiotensin, đây

là một đích chủ yếu của các thuốc điều hòa huyết áp Angiotensin cũng kích thích

sự giải phóng aldosterone - một hoocmon khác từ vỏ tuyến thượng thận

Aldosterone tăng cường sự lưu giữ natri trong ống sinh niệu ngoại biên ở thận, làm huyết áp tăng

Angiotensin có nguồn gốc từ phân tử angiotensinogen, một globulin huyết thanh dài 452 axit amin, được sản xuất trong gan và có vai trò quan trọng trong hệ renin - angiotensin Angiotensin được phân lập một cách độc lập ở Indianapolis (thuộc tiểu bang Indiana – Hoa kỳ) và Argentina vào cuối những năm 1930 (với tên gọi tương ứng là „Angiotonin‟ và „Hypertensin‟)

Angiotensin I (AT I) được tạo thành bởi hoạt động của renin trên angiotensinogen Renin cắt liên kết peptide giữa leucine (Leu) và valine (Val) trên angiotensinogen tạo ra chuỗi peptide gồm mười axit amin là angiotensin I Angiotensin I dường như không có hoạt tính sinh học và tồn tại chỉ như chất tiền thân của angiotensin II (AT II) Angiotensin I được chuyển thành angiotensin II qua việc loại bỏ 2 axit amin đầu C bởi enzym chuyển hóa angiotensin (ACE; đung cũng

là một kinase) mà chủ yếu thông qua ACE trong thận

Angiotensin II hoạt động như một nội tiết tố hay hoocmon nội bào Angiotensin II làm tăng huyết áp bằng cách kích thích các protein Gq trong các tế bào cơ trơn mạch máu (lần lượt kích hoạt co bởi một cơ chế phụ thuộc vào IP3) Angiotensin II tác động trực tiếp trên tiểu cầu (zona glomerulosa) của vỏ thượng thận để kích thích sinh tổng hợp aldosterone Ở nồng độ cao hơn, angiotensin II cũng kích thích sự sinh tổng hợp glucocorticoid Angiotensin II hoạt động trên thận gây co mạch thận, tăng tái hấp thu natri ở ống lượn gần, và ức chế tiết renin Angiotensin II còn là yếu tố phân chia tế bào cho các tế bào cơ tim mạch và tim và

có thể đóng góp vào sự phát triển của phì đại tim mạch Nó cũng tạo nên một loạt các hiệu ứng quan trọng về nội mô mạch máu [28]

Angiotensin II bị suy biến thành angiotensin III bởi các enzym angiotensinase

có trong các tế bào hồng cầu và các mạch máu ở hầu hết các mô Nó có thời gian

bán hủy ngắn trong khoảng 30 giây, trong khi đó, trong mô, nó có thể dài 15-30 phút

Hình 1.4 Hệ renin – angiotensin – aldosterone

(Nguồn http://en.wikipedia.org/wiki/Angiotensin_II_receptor)

1.4.1 Thụ thể angiotensin II

Thụ thể angiotensin II làm trung gian tác động của hệ thống renin – angiotensin, đóng vai trò quan trọng trong sinh lý (bệnh) tim mạch Có 4 loại thụ thể angiotensin II đã biết, trong đó thụ thể AT1 và AT2 là quan trọng nhất Sự kích thích của các thụ thể AT1 dẫn đến một loạt các con đường tín hiệu trong một số loại

tế bào, mà cuối cùng dẫn đến quá trình như co mạch, viêm và phát bệnh Các quá trình này rất quan trọng trong nhiều bệnh liên quan tim mạch khác nhau, bao gồm cao huyết áp, xơ vữa động mạnh và phì đại tâm thất

Các thụ thể AT2 chủ yếu được biểu hiện trong giai đoạn bào thai Ở cá thể trưởng thành, thụ thể AT2 được biểu hiện tối thiểu trong những hoàn cảnh bình thường Vai trò của chúng đối với hệ thống tim mạch người trưởng thành vẫn chưa được xác định rõ ràng, nhưng nó có tác động đối lập với thụ thể AT1

1.4.1.1 Thụ thể AT 1 (the AT 1 receptor)

Gen mã hóa thụ thể AT1 của người nằm ở băng số 22 ở vai dài của nst số 3 và được nhân dòng lần đầu tiên vào năm 1992 [7,13] Bao gồm 359 axit amin, là một thành viên của siêu họ thụ thể kết cặp g protein đặc trưng bởi đặc điểm 7 lần xuyên màng Thụ thể AT1 ở người không có các subtype, trong khi đó ở các loài gặm nhấm, được chia thành các subtype là AT1a và AT1b

Sơ đồ tổng quát truyền tín hiệu sau khi kích thích của thụ thể AT1 được biểu diễn trong hình 1.5 Khi chất chủ vận angiotensin II liên kết với thụ thể AT1, dẫn đến sự thay đổi cấu hình của thụ thể AT1, điều này dẫn đến không kết cặp Gq-protein [35] Điều này tăng cường sự hoạt động của phospholipase C (PLC) tạo ra

sự sản sinh của 1,4,5-inosioltriphosphate (IP3) và diacylglycerol (DAG) Cả IP3 và DAG đều có thể làm tăng nồng độ canxi nội bào IP3 giải phóng canxi từ các khoang nội bào và DAG dẫn đến sự đi vào trong tế bào của canxi ngoại bào, bằng

sự kích thích protein kinase C (PKC) Canxi nội bào tăng lên sẽ làm co của các tế bào cơ trơn thành mạch

Thụ thể AT1 cũng điều khiển các tyrosine kinase mà cần thiết cho các tác động tăng trưởng của angiotensin II [8] Các tyrosine kinase có thể là nguyên nhân của phosphryl hóa của một số phân tử tín hiệu, dẫn đến hoạt hóa của các enzym kinase của protein hoạt hóa phân chia (MAP-mitogen-activated protein) Các MAP kinase, cũng như PKC và canxi nội bào mức độ cao, khởi động các yếu tố phiên mã gen, như c-fos, c-myc và c-jun, dẫn đến tăng trưởng và phát triển tế bào

Con đường thứ 3 được hoạt hóa bởi thụ thể AT1 là sự cảm ứng của yếu tố phiên mã nhân kappa-B (NF-κB), mà được trung gian thông qua Janus kinase (JAK)/yếu tố cơ quan chuyển tín hiệu và yếu tố phiên mã (STAT factor), protein hoạt hóa (AP-1), và phosphotyrosine kinase (PTK) Hoạt tính của NF-κB tăng lên

có liên quan đến sự thâm nhập của đại thực bào, sự biểu hiện của monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) [42].

Hình 1.5 Sơ đồ tổng hợp sự truyền tín hiệu của thụ thể AT 1

AP-1: Protein hoạt hóa – 1; AT1r: Thụ thể Angiotensin II typ 1; DAG: Diacylglycerol; IP 3 : 1,4,5-inositoltriphosphate; JAK: Janus kinase; MAP: protein hoạt hóa phân bào; NADH: Nicotinamide-adenine dinucleotide; NADPH: Nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate; NF- κB: yếu tố nhân κB; NO: Nitric oxide; OxLDL: Các lipoprotein mật độ thấp bị oxi hóa (Oxidized low-density lipoprotein); ROS: các gốc oxi phản ứng; STAT: yếu tổ truyền tín hiệu và hoạt hóa phiên mã; PKC: Protein kinase C; PLC: Phospholipase C; PTK: Phosphotyrosine kinase (Nguồn : Ruiz-Ortega, 2000)

Thụ thể AT1 đóng vai trò quan trọng sinh lý bệnh tim mạch Sự kích thích thụ thể AT1 dẫn đến sự hoạt động một loạt các enzym truyền tín hiệu, dẫn đến sự giảm nitric oxide và tăng oxidized LDL, NF-κB, các yếu tố phiên mã gen và canxi nội bào Tùy thuộc vào các điều kiện vị trí, điều này dẫn đến co mạch, tăng tính

↑ Ca 2+

gen (c-fos, c-myc, c-jun)

atherogenicity (xơ vữa), viêm Những quá trình này quyết định đến các trạng thái khác nhau của chứng xơ vữa động mạch và cũng quan trọng trong cao huyết áp, phì đại tâm thất trái, suy tim mãn tính

1.4.1.2 Thụ thể AT 2

Thụ thể AT2 được tìm hiểu ít hơn so với AT1 Sự kích thích của thụ thể này dẫn đến làm giảm các kinase MAP, và gây ra tăng cGMP, làm cho sự sinh trưởng tế bào bị giảm đi và gây ra chết theo chương trình và giãn mạch Do đó, thụ thể AT2

thể hiện các quá trình ngược lại với thụ thể AT1

Hình 1.6 biểu diễn quá trình dẫn truyền tín hiệu sau khi bị kích thích của AT2 Angiotensin II liên kết với thụ thể AT2 dẫn đến tách cặp (uncoupling) của Giprotein Gi protein không kết cặp hoạt hóa serine/threonine phosphatase 2A (PP2A)

và phosphotyrosine phosphatase (PTP), tương ứng ức chế sự phosphoryl hóa protein serine/threonine và protein tyrosine Thông qua các con đường này, kích hoạt các tác động của thụ thể AT2 trong việc ngăn chặn hoạt động của MAP kinase sau khi được kích thích bởi thụ thể AT1 Do đó, ức chế tác dụng của thụ thể AT1trong sinh trưởng tế bào [34] Thụ thể AT2 cũng có khả năng cảm ứng NF-κB, thông qua việc sản xuất nội bào ceramide và ROS [24] Các tác động của thụ thể

AT2 trong sản xuất cGMP vẫn còn gây tranh cãi

Hình 1.6 Sơ đồ tổng hợp con đường truyền tín hiệu của thụ thể AT 2

AT2r : Thụ thể Angiotensin II type 2; BK : Bradykinin một trong những kinin huyết tương là trung gian hóa học, có vai trò trong phản ứng viêm (gây giãn mạch, tăng tính thấm mao mạch, và gây đau); cGMP : GMP vòng; MAP : Protein hoạt hóa phân bào; NF-kB : Yếu tố nhân κB; NO : Nitric oxide; PP2A : Serin/threonin phosphatase 2A; PTP : Phosphotyrosine phosphatase; ROS : Các các gốc oxi phản ứng (Nguồn : Ruiz-Ortega, 2000).

Một số nghiên cứu trên các động vật mô hình đã chỉ ra rằng AT2 có khả năng kích thích con đường bradykinin/NO-cGMP, dẫn đến gây giãn mạch [12] Tuy nhiên, cho đến nay con đường này vẫn chưa được chứng minh trong hệ mạch của người Đưa ra những đặc điểm này, các angiotensin II type 1 receptor blocker (ARBs-các thuốc chẹn thụ thể) có thể điều trị hiệu quả các bệnh đã được chỉ ra ở trên ARBs không chỉ làm việc bằng các làm giảm những tác động có hại của thụ thể

Tăng chết theo chương trình

Giãn mạch

AT1, mà còn làm tăng nồng độ angiotensin II bằng vòng phản hồi âm tính (phản hồi tiêu cực) Khi có mặt một ARB, sự tăng của angiotensin II sẽ hoạt động như là 1 chất chủ vận của thụ thể AT2, do đó đối chọi với các tác động của AT1 Đây là một lợi thế lý thuyết của ARBs khi so sánh với các chất ức chế ACE

Các ARB đã được chứng minh là có hiệu quả trong cao huyết áp Cũng như trong trụy tim và các trường hợp lắp van tim, các nghiên cứu đang được thực hiện, nhưng chưa được kết luận Để đánh giá giá trị của các ARB trong trụy tim, và ngăn ngừa thứ phát ở các bệnh nhân mắc bệnh thiếu máu tim mạch cục bộ, nhiều thử nghiệm ngẫu nhiên đã được thực hiên Hơn nữa, tại thời điểm hiện tại thì vẫn chưa

đủ những hiểu biết về tác động của sự kích thích của thụ thể AT2

Hệ renin – angiotensin – aldosterone đóng vai trò chủ đạo trong điều hòa cân bằng máu và các chất điện giải và huyết áp Có 2 nhóm thuốc tác động đặc hiệu trên

hệ renin – angiotensin, đó là nhóm các thuốc ức chế enzym chuyển hóa angiotensin (ACE) và các thuốc ức chế cạnh tranh với angiotensin ở thụ thể của nó (losartan và các chất đối vận không có bản chất peptid khác [28]

Các thuốc ACE ngăn cản hoạt tính của men chuyển qua đó ngăn angiotensin I chuyển hóa thành angiotensin II Trong khi đó các thuốc chẹn thụ thể angiotensin II (ARB) cạnh tranh vị trí liên kết của angiotensin II tại thụ thể của nó Các thuốc ức chế men chuyển có các tác dụng phụ đó là: tăng kali máu, qua đặc tính giảm tiết aldosterone của ức chế men chuyển Hạ đường huyết do đặc tính nhạy cảm với insulin của ức chế men chuyển Tương tác với erythropoietin, ức chế men chuyển

có thể ngăn cản một phần hoạt tính của erythropoietin, do đó làm thiếu máu Suy giảm chức năng thận Ho và co phế quản, đặc điểm là ho khan, từng cơn thường vào buổi tối kèm cảm giác ngứa ở cổ họng

Thuốc chẹn thụ thể angiotensin II đẩy angiotensin II ra khỏi thụ thể AT1 do đó làm mất tác dụng của angiotensin II làm hạ huyết áp, đồng thời trong khi nồng độ angiotensin II tăng cao trong tuần hoàn làm chúng tác động lên đích thụ thể AT2,

gây ra tác dụng hạ huyết áp theo con đường thụ thể này Do nguyên nhân là ngoài còn đường men chuyển, angiotensin I còn có thể chuyển thành angiotensin II qua đường men chymase và vài đường khác; do đó thuốc chẹn thụ thể angiotensin II sẽ ngăn chặn angiotensin II hoàn toàn hơn so với ức chế men chuyển Đồng thời có ít các tác dụng phụ hơn [4]

1.5 Các phương pháp nghiên cứu tương tác thụ thể và phối tử

1.5.1 Tương tác phân tử thụ thể và phối tử

Nhiều quá trình sinh hóa, thiết yếu cho hoạt động chức năng và tồn tại của tế bào và cơ thể, được điều khiển bởi hormone, các chất dẫn truyền thần kinh, cytokine và các phân tử truyền tin khác Sự điều hòa bắt nguồn bởi sự tương tác của các phân tử được tìm thấy trong tự nhiên với các thụ thể có trên màng tế bào hoặc

có ở trong tế bào chất hoặc nhân tế bào

Trong các thí nghiệm in-vitro, thụ thể được sử dụng với các mục đích khác

nhau, liên quan tới sàng lọc các thành phần hóa học mới hoặc để xác định và định lượng các thuốc trong mẫu sinh phẩm Kỹ thuật này được gọi là receptor assay (phép thử thụ thể- hay thí nghiệm thụ thể) Các thụ thể trong các phân tích này có thể dễ dàng thu được từ các nguồn động vật khác nhau Trong phép thử thụ thể, một phối tử được đánh dấu và chất phân tích sẽ cạnh tranh liên kết với thụ thể Sau khi cân bằng, các phần liên kết và không liên kết của phối tử đánh dấu phải được phân tách Có thể là bằng cách lọc hoặc bằng ly tâm, sau đó các phần đã liên kết và/hoặc phần không liên kết sẽ được định lượng Với các nồng độ tăng dần của chất cần phân tích, lượng phối tử đánh dấu liên kết với thụ thể sẽ giảm Đồ thị biểu diễn phần đã liên kết của phối tử đánh dấu với các nồng độ chất cần phân tích tương ứng tạo nên đường đồ thị ức chế, từ đó ái lực của chất phân tích với thụ thể có thể xác định được cũng như các nồng độ chưa biết của chất phân tích đó cũng có thể xác định được

Một thông số định lượng cho thấy mối quan hệ về ái lực của các phối tử đánh dấu với một thụ thể đặc trưng là hằng số phân ly cân bằng (Kd) Kd, cũng như số vị trí liên kết có ở trong vật liệu thụ thể - Bmax có thể được xác định bằng các thí nghiệm bão hòa (saturation experiment) Trong các thí nghiệm đó, nồng độ của phối

tử đánh dấu tăng dần được ủ với một lượng protein xác định

Tương tác của một phối tử đánh dấu với thụ thể được mô tả bằng phương trình sau:

(phương trình 1.2) Khi có một phối tử thứ 2, ví dụ như một chất phân tích, được thêm vào, tương tác có thể được mô tả bằng phương trình sau đây:

số ái lực của chất phân tích (Ki) có thể tính từ giá trị IC50 với phương trình Prusoff [15]:

Cheng-(phương trình 1.4)

1.5.2 Các phương pháp nghiên cứu tương tác thụ thể - phối tử

Receptor-ligand binding assays có thể được phân loại dựa theo sự cần hay không cần sự phân tách của các phối tử liên kết với các phối tử tự do hoặc dựa theo

kỹ thuật xác định phối tử liên kết Dựa theo tiêu chí đầu, có các loại phép thử đồng nhất và không đồng nhất Các phép thử không đồng nhất (heterogeneous assays) đòi hỏi sự phân tách các phối tử tự do ra khỏi phần liên kết bằng cách lọc, ly tâm hoặc thẩm tách trước khi đo Trong khi đó các phép thử đồng nhất (homogeneous assays) không cần phân tách hoặc các bước rửa trước khi đo Cách phân loại thứ 2, được chia thành kỹ thuật đo dựa vào đồng vị phóng xạ hay không sử dụng phóng xạ

Các kỹ thuật liên kết thụ thể-phối tử hoạt tính phóng xạ

Các phép thử liên kết thụ thể - phối tử phổ biến nhất là dạng không đồng nhất

và đã được phát triển sử dụng các phối tử được đánh dấu phóng xạ để liên kết với thụ thể màng Phương pháp định lượng sử dụng phóng xạ đầu tiêu được phát triển bởi Lefkowitz và cộng sự [29] Nguyên lý là dựa trên tương tác cạnh tranh giữa một phối tử được đánh dấu phóng xạ và chất phân tích với cùng một vị trí liên kết với thụ thể

Một thuận lợi chính của các phép thử liên kết thụ thể sử dụng phóng xạ là độ nhạy cao, tính đặc hiệu và dễ thực hiện Phép thử chỉ đòi hỏi một bước đánh dấu phóng xạ cho phối tử đặc hiệu, thường không làm giảm ái lực với thụ thể Các phối

tử có ái lực cao với thụ thể có sẵn trên thị trường cho phép xây dựng một phép thử một cách nhanh chóng Tuy vậy, hạn chế chính của những phép thử này là sử dụng đồng vị phóng xạ và cần tách phối tử tự do ra khỏi phần đã liên kết, điều này làm cho những thí nghiệm này tốn công sức và khá chậm Hơn nữa, chúng đòi hỏi rằng

sự phân ly của phối tử diễn ra chậm hơn nhiều so với thời gian thực hiện bước phân tách (như lọc) Để không phải thực hiện bước phân tách phối tử tự do, hiên nay đã phát triển được kỹ thuật đồng nhất (homogeneous assay) dựa trên scintillation proximity [16] Tuy vậy, việc sử dụng phối tử đánh dấu phóng xạ có những nhược điểm cố hữu, đó là chi phí cao, có hại đến sức khỏe, vấn đề về chất thải phóng xạ đòi hỏi yêu cầu giấy phép đặc biệt, và đặc biệt là ở các nước đang phát triển như Việt Nam, các vấn đề đó càng trở nên rõ nét Vì vậy, các nhà nghiên cứu đã cố gắng

để phát triển các phép thử thụ thể đánh dấu không sử dụng đông vị phóng xạ

1.5.3 Các phép thử thụ thể - phối tử không sử dụng phóng xạ

Nhiều phương pháp khác nhau đã được sử dụng để phát triển các phép thử không sử dụng đồng vị phóng xạ, bao gồm các các phép thử không đồng nhất cho đến các phép thử đồng nhất Như dựa trên chuyển năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (fluorescence resonance energy transfer - FRET), phân cực huỳnh quang (fluorescence polarization - FP) và đếm tế bào theo dòng (flow cytometry) Hầu hết các phép thử này đều đòi hỏi một số loại phân tử đánh dấu, gắn vào để đo liên kết phối tử - thụ thể Do vậy điều mấu chốt là tìm được các điều kiện gắn nhãn (đánh dấu) mà không làm ảnh hưởng đến sự tương tác phân tử Trong trường hợp phối tử được gắn nhãn không có hoạt tính phóng xạ, phối tử phải được chứng minh là có các đặc tính liên kết tương tự (về tính đặc hiệu với thụ thể, và ái lực) là tương tự hoặc được cải tiến về độ nhạy như là các phối tử được đánh dấu phóng xạ

Các phép thử không đồng nhất Một trong những phép thử đầu tiên sử dụng chất đánh dấu huỳnh quang được mô tả bởi McCabe, Takeuchi và Janssen [26, 44]

đã sử dụng RP-HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo) với đầu dò huỳnh quang Phương pháp của Takeuchi đo phân đoạn tự do của phối tử với RP-HPLC ngay sau khi ly tâm Điều này cần một lượng lớn thụ thể để đạt được mức liên kết đặc hiệu cho phép có thể đo được sự thay đổi trong tín hiệu huỳnh quang Phương pháp của Janssen và cộng sự thực hiện đo phần phối tử đã liên kết với thụ thể, do đó cần thêm bước phá vỡ liên kết thụ thể và phối tử sau khi ly tâm để thu được phối tử gắn

huỳnh quang từ thụ thể trước khi đo bằng RP-HPLC Việc đo trực tiếp phần phối tử liên kết thì đem lại kết quả chính xác hơn, và không đòi hỏi lượng lớn thụ thể và phối tử

Cách khác để giảm tín hiệu nền được trình bày bởi Takeuchi [44], người đã sử dụng time-resolved fluorescence (TRF), bằng cách gắn nhãn europium chelate cho phối tử benzodiazepine Sau khi ly tâm, dịch nổi được chuyển tới 1 vi phiến và fluorescence được tăng cường và ổn định, trước khi đo, bằng cách bổ sung phối tử huỳnh quang tăng cường

Các ví dụ khác của phương pháp không sử dụng phóng xạ dựa trên gắn nhãn enzym và đo tương tác của thụ thể-phối tử thông qua hoạt tính của enzym liên kết với phối tử Mahoney [33] đã gắn biotin vào thụ thể yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (PDGF-R platelet-derived growth factor receptor), thụ thể này được gắn vào đáy đĩa, và được xác định thông qua sự bổ sung neutravidin-HRP vào đĩa, thực hiện phản ứng kháng nguyên – kháng thể và phản ứng màu enzym để thu kết quả

Hiện nay, phương pháp sử dụng phối tử được đánh dấu huỳnh quang trong các nghiên cứu liên kết thụ thể ngày càng được sử dụng phổ biến Bên cạnh các phối tử đặc hiệu đánh dấu huỳnh quang còn các chất đánh dấu khác như biotin Các phối tử này đã được sử dụng rất thành công trong các nghiên cứu về tương tác thụ thể - phối

tử nói chung và trong các nghiên cứu sàng lọc thuốc nói riêng

1.5.4 Sử dụng phối tử đánh dấu fluorescein

Fluorescein là một chất hữu cơ tổng hợp, được sử dụng rộng rãi trong sinh học

để làm chất đánh dấu cho các phân tử trong nhiều ứng dụng Fluorescein cũng được gắn vào các phân tử có hoạt tính sinh học (như kháng thể), cho phép các nhà nghiên cứu có thể nghiên cứu được các protein đích đặc hiệu hoặc nghiên cứu các cấu trúc trong tế bào Fluorescein cũng có thể được gắn với các nucleotide triphosphate để

tạo thành probe trong lai tại chỗ Các ứng dụng khác có thể kể tên là mốc hiệu phân

tử (molecular beacon), hoặc làm đích của các kháng thể sử dụng hóa miễn dịch [36].Trong miễn dịch, các phân tử kháng nguyên đánh dấu fuorescein cũng được sử dụng, và cho kết quả tốt Hệ thống kháng nguyên – kháng thể kháng fluorescein và các dẫn xuất của fluorescein (như FITC) được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học, với rất nhiều ứng dụng như trong kết tủa miễn dịch (Immunoprecipitation), lai Western Blotting [27, 41] cùng các kỹ thuật trong miễn dịch huỳnh quang Fluorescein được đánh giá là một phân tử đánh dấu không có hoạt tính phóng xạ mới, có thể sử dụng trực tiếp hoặc gián tiếp giúp thay thế cho các chất đánh dấu có hoạt tính phóng xạ truyền thống [31] Hệ thống kháng nguyên kháng thể này đã được công nhận là có độ nhạy cao và thay thế cho các phương pháp sử dụng biotin-streptavidin sử dụng cho các phân tích miễn dịch hấp thụ liên kết enzym (ELISA - enzym-linked immunosorbent assays) [23]

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thực hiện phép thử không sử dụng phối tử đánh dấu phóng xạ Angiotensin II gắn thêm gốc fluorescein (F-AT II) (hợp chất này được cung cấp bởi nhiều công ty hóa chất trên thế giới) được chúng tôi sử dụng để thực hiện nghiên cứu này để thay thế cho phối tử đánh dấu phóng xạ được sử dụng trong các nghiên cứu trước đó Đầu N của phân tử angiotensin II được đánh dấu (gắn thêm) gốc huỳnh quang fluorescein (fluorescein-angiotensin II hay viết tắt là F-AT II) Đây là một hợp chất là công cụ hữu ích ứng dụng trong nghiên cứu sinh học, giúp hiển thị sự phân bố của các thụ thể angiotensin II [30] cũng như trong phân tích đếm tế bào theo dòng (flow cytometric) của quá trình nhập bào (endocytosis) của angiotensin II [21] Các nghiên cứu trên cũng chỉ ra rằng tương tác tác của phối tử được gắn thêm gốc fluorescein cho kết quả không khác biệt nhiều về mặt ái lực của phối tử với đích thụ thể

Phương pháp để xác định F-AT II đã liên kết với thụ thể trong các thí nghiệm

là phương pháp ELISA cạnh tranh, với kháng thể là kháng thể kháng fluorescein Trong đó, kháng nguyên fluorescein-BSA (F-BSA) được cố định trên bề mặt đĩa 96

giếng, và sự cạnh tranh giữa F-AT II với F-BSA với kháng thể kháng fluorescein sẽ giúp xác định được lượng F-AT II trong các phản ứng liên kết thụ thể angiotensin II

và phối tử của nó (F-AT II) Sơ đồ thí nghiệm ELISA cạnh tranh được mô tả trong hình 1.7 [14]

Hình 1.7 Minh họa phản ứng ELISA cạnh tranh (Ag: kháng nguyên, Ab: kháng thể, E: enzym) (Nguồn: Current Protocols in Molecular Biology)

1.6 Y học cổ truyền và tài nguyên dƣợc liệu

Những hóa thạch ghi lại thời gian con người sử dụng thực vật làm thuốc ít nhất là ở giữa thời kỳ Đồ đá cũ (Middle Paleolithic) khoảng 60.000 năm trước [43] Theo WHO, 65% dân số thế giới sử dụng phương thức chăm sóc sức khỏe chính là

sử dụng thuốc có nguồn gốc tự nhiên, được sử dụng trong đời sống hằng ngày, trải

Có kháng nguyên

cạnh tranh

Không có kháng nguyên cạnh tranh

Phủ đĩa với kháng nguyên (F-BSA)

Ủ kháng thể gắn enzyme, có hoặc không

có kháng nguyên cạnh tranh (F-AT II)

Bổ sung cơ chất và đo tín hiệu màu

Kháng nguyên cần đo (F-AT II)

Kháng nguyên phủ đĩa (F-BSA)

Ag

qua lịch sử lâu đời và được truyền lại qua các thế hệ với nền văn hóa riêng; được gọi là y học cổ truyền Vậy y học cổ truyền là gì?

1.6.1 Vài nét về y học cổ truyền

Theo WHO [48], Y học cổ truyền là tổng hợp của kiến thức, kỹ năng và thực hành dựa trên các lý thuyết, niềm tin và kinh nghiệm bản địa với các nền văn hóa khác nhau được sử dụng để duy trì sức khỏe, cũng như để ngăn ngừa, chẩn đoán, cải thiện hoặc điều trị các bệnh về thể chất và tinh thần Y học cổ truyền được sử dụng bởi những quần thể khác nhau (bên cạnh văn hóa bản địa) sử dụng sản phẩm thảo dược gồm có các thảo dược, các vật liệu thảo dược, dược thảo và các sản phẩm thành phẩm có chứa các bộ phận của thực vật hay các vật liệu thực vật khác làm thành phần hoạt tính

Nền y học cổ truyền là một thuật ngữ được dùng để chỉ nền y học truyền thống như y học cổ truyền Trung Quốc, Ấn Độ, Ả rập và các hình thức khác nhau của y học bản địa Các liệu pháp y học cổ truyền bao gồm các liệu pháp y dược nếu chúng

sử dụng thuốc có nguồn gốc thực vật, các bộ phận của động vật hoặc chất khoáng –

và các liệu pháp không sử dụng thuốc – như châm cứu, các liệu pháp bằng tay, và tâm linh Ở nhiều nước có hệ thống chăm sóc sức khỏe phát triển mạnh dựa trên thuốc tân dược hoặc nơi mà y học cổ truyền không được hợp thành vào hệ thống chăm sóc sức khỏe quốc gia, y học cổ truyền thường được gọi là thuốc bổ trợ, thay thế hoặc không phổ biến (CAM – complementary and alternative medicine)

Ở một số quốc gia châu Á và châu Phi, 80% dân số phụ thuộc vào y học cổ truyền để chăm sóc sức khỏe ban đầu Ở châu Á và Mỹ La tinh, người dân tiếp tục

sử dụng YHCT như là kết quả của lịch sử và tín ngưỡng văn hóa Ở Trung Quốc, YHCT chiếm khoảng 40% tổng số các hoạt động chăm sóc sức khỏe Trong khi đó,

ở nhiều nước phát triển, CAM đang trở nên ngày càng phổ biến Tỉ lệ phần trăm trong dân số sử dụng CAM ít nhất một lần là 48% ở Úc, 70% ở Canada, 42% ở Mỹ, 38% ở Bỉ và 75% ở Pháp