xác định tên một số loài thuộc chi tre (bambusa schreb.) do biến đổi hình thái ở việt nam bằng kỹ thuật phân tích and

Phương pháp phân loại học phân tử Molecular taxonomy là phương pháp phân loại chủ yếu dựa trên các kỹ thuật phân tích ADN và đã cho những kết quả khá chính xác, giúp cho việc phát hiện l

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG

XÁC ĐỊNH TÊN MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI TRE

(Bambusa Schreb.) DO BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI Ở

VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH ADN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG

“XÁC ĐỊNH TÊN MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI TRE

(Bambusa Schreb.) DO BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI Ở VIỆT

NAM BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH ADN”

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số : 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS ĐINH THỊ PHÒNG

Hà Nội - 2012

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14

1.1 Giới thiệu tổng quát về một số loài thuộc chi tre (Bambusa Schreb.) .14

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Bambusa Schreb .14

1.1.2 Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị sử dụng một số loài tre14 1.1.2.1 Tre Bụng phật 15

1.1.2.2 Tre Vàng sọc 16

1.1.2.3 Tre Đùi gà 17

1.1.3 Sự biến đổi hình thái do điều kiện sống của ba loài tre nghiên cứu .19

1.1.4 Tình hình phân bố tre trên thế giới và Việt Nam 20

1.1.4.1 Trên thế giới 20

1.1.4.2 Việt Nam 21

1.2 Giới thiệu một số phương pháp phân loại thực vật 22

1.2.1 Phương pháp hình thái học (phân loại học truyền thống) 22

1.2.2 Phương pháp giải phẫu so sánh 23

1.2.3 Phương pháp hoá học 24

1.2.4 Phương pháp phân loại phân tử 24

1.3 Một số thành tựu nghiên cứu về phân loại học phân tử 25

1.4 Hệ gen sử dụng trong nghiên cứu phân loại phân tử ở thực vật 27

1.4.1 Cấu trúc hệ gen lục lạp 27

1.4.2 Vùng gen nhân 29

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 31

2.2 Vật liệu nghiên cứu 31

2.2.1 Vật liệu 31

2.2.2 Hóa chất 32

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ 32

2.2.4 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 33

2.3 Phương pháp nghiên cứu 33

2.3.1 Phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN tổng số 33

2.3.2 Thiết kế cặp mồi 34

2.3.3 Nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR 34

2.3.5 Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR 35

2.3.6 Giải mã trình tự nucleotide các đoạn ADN 35

2.3.7 Phân tích số liệu 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Kết quả tách chiết và làm sạch ADN tổng số từ các mẫu tre 36

3.2 Kết quả nhân bản trình tự ADN đích ở 01 vùng gen nhân và 03 vùng gen lục lạp 36

3.2.1 Kết quả nhân bản gen PIF 27

3.2.2 Kết quả nhân bản gen psbA-trnH 37

3.2.3 Kết quả nhân bản gen matK 38

3.2.4 Kết quả nhân bản gen trnL - trnF 39

3.3 Kết quả gia ̉ i trình tự 4 vùng gen nghiên cứu 29

3.3.1 Kết quả giải trình tự gen PIF .39

3.3.2 Kết quả giải trình tự vùng psbA - trnH 41

3.3.3 Kết quả giải trình tự vùng gen matK 43

3.3.4 Kết quả giải trình tự vùng gen trnL-trnF 45

3.4 Mức độ tương đồng nucleotide giữa các mẫu trong một loài tre nghiên cứu 48

3.5 Kết quả so sánh trình tự nucleotide giữa loài tre Bụng phật, tre Vàng

sọc và loài B vulgaris đã công bố trình tự trên Genbank 51 3.6 Kết quả so sánh trình tự nucleotide giữa loài tre Đùi gà với loài B

ventricosa và loài B tuldoides đã công bố trình tự trên Genbank 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

Bảng 3.1 Mức độ tương đồng nucleotide của loài tre Vàng sọc phân tích với bốn vùng gen

trnL-trnF, psbA-trnH, matK và PIF 38

Bảng 3.2 Mức độ tương đồng nucleotide của loài tre Bụng phật và tre Đùi gà phân tích

với 2 vùng gen trnL-trnF và psbA-trnH 39

Bảng 3.3 Mức độ tương đồng nucleotide của loài tre Bụng phật và tre Đùi gà phân tích

với 2 vùng gen matK và PIF

40

Bảng 3.4 Mức độ tương đồng nucleotide phân tích với cặp mồi trnLF/trnFR giữa loài tre

Bụng phật, tre Vàng sọc và loài B vulgaris (mã số EF137524)

41

Bảng 3.5 Mức độ tương đồng nucleotide phân tích với cặp mồi psbA3’f/trnH giữa loài tre

Bụng phật, tre Vàng sọc và loài B vulgaris (mã số GU063097)

42

Bảng 3.6 Mức độ tương đồng nucleotide phân tích với cặp mồi psbA3’f/trnH của loài tre

Đùi gà với loài B ventricosa (mã số GU063074)

43

Bảng 3.7 Mức độ tương đồng nucleotide phân tích với cặp mồi trnLF/trnFR của loài tre

Đùi gà với loài B tuldoides (mã số HM448967)

44

Bảng 3.8 Mức độ tương đồng nucleotide phân tích với cặp mồi psbA3’f/trnHf của loài tre

Đùi gà với loài B tuldoides (mã số GU063083

44

Bảng 3.9 Mức độ tương đồng nucleotide phân tích với cặp mồi matK19F/matKR của loài

tre Đùi gà với loài B tuldoides (mã số HM448937)

45

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Loài tre Bụng phật dạng lóng thẳng (Bambusa vulgaris) 5

Hình 1.2 Loài tre Bụng phật dạng lóng phồng (Bambusa vulgaris) 6

Hình 1.3 Loài tre Vàng sọc (Bambusa vulgaris) 7

Hình 1.4 Loài tre Đùi gà dạng lóng thẳng (Bambusa ventricosa) 8

Hình 1.5 Loài tre Đùi gà dạng lóng phồng (Bambusa ventricosa) 8

Hình 1.6 Hệ gen lục lạp của hoa Nhài Jasminum nudiflorum 18

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra ADN tổng số đại diện của một số mẫu tre trên gel agarose 26

Hình 3.2 Sản phẩm PCR một số mẫu tre phân tích với cặp mồi PIF5/PIF3 27

Hình 3.3 Sản phẩm PCR một số mẫu tre phân tích với cặp mồi psbA3’f/trnH 28

Hình 3.4 Sản phẩm PCR một số mẫu tre phân tích với cặp mồi matK19F/matKR 28

Hình 3.5 Sản phẩm PCR một số mẫu tre phân tích với cặp mồi trnL/trnF 29

Hình 3.6 Kết quả so sánh trình nucleotide vùng gen PIF giải mã từ 19 mẫu nghiên cứu 31

Hình 3.7 Kết quả so sánh trình nucleotide gen psbA-trnL giải mã từ 25 mẫu nghiên cứu 33

Hình 3.8 Kết quả so sánh trình nucleotide vùng gen matK giải mã từ 19 mẫu nghiên cứu 35

Hình 3.9 Kết quả so sánh trình nucleotide vùng gen trnL-trnF giải mã từ 19 mẫu nghiên cứu 37

Hình 3.10 Mối quan hệ di truyền đươ ̣c xây dựng bằng phương pháp Neighbor -Joinng giữa hai loài tre Bụng phật và tre Vàng sọc với loài Bambusa vulgaris trên ngân hàng Genbank phân tích với vùng gen trnL-trnF (A) và vùng gen psbA-trnH (B) 42

Hình 3.11 Mối quan hệ di truyền đươ ̣c xây dựng bằng phương pháp Neighbor -Joinng giữa loài tre Đùi gà với loài Bambusa ventricosa trên ngân hàng Genbank phân tích với vùng gen psbA-trnH 43

Hình 3.12 Mối quan hệ di truyền đươ ̣c xây dựng bằng phương pháp Neighbor -Joinng giữa loài tre Đùi gà với loài Bambusa tuldoides trên ngân hàng Genbank phân tích với vùng gen trnL-trnF (A), psbA-trnH (B) và matK (C) 45

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Axit Deoxyribonucleic

ARN Axit Ribonucleic

Barcode Mã vạch

bp Cặp bazơ (base pair)

BTTNVN Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam

CNSH Viện công nghệ sinh học

cpDNA Choloroplast Deoxyribonucleic Acid (Axit Deoxyribonucleic lục lạp)

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

EtBr Ethidium Bromide

Genbank Ngân hàng gen quốc tế

ITS Internal Transcribed Spacer

kb Kilobase ( 1000 cặp bazơ)

MEGA Software of Molecular Evolution Genetics Analysis (Phần mềm phân

tích di truyền tiến hóa phân tử)

MP Maximum Parsimony

NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông tin

công nghệ sinh học quốc gia)

Nxb Nhà xuất bản

NJ Neighbor Joining

OD Optical Density (mật độ quang học)

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại gen)

psbA Gen mã hóa protein D1, tham gia quang hóa II

PIF P instability factor ( đoạn ADN có khả năng di chuyển độc lập)

tARN Transfer-ARN (ARN vận chuyển)

trnF ARN vận chuyển Phenylalanine

trnH ARN vận chuyển Histidine

trnL ARN vận chuyển Leucin

TE Tris – EDTA

TEs Transpoable elements

TAE Tris - Acetate - EDTA

Tm Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)

UV Ánh sáng tử ngoại

MỞ ĐẦU

Từ bao đời nay cây tre là hình ảnh rất quen thuộc trong tâm trí của người Việt Nam Tre có mặt hầu khắp các nẻo đường đất nước và gắn bó với cộng đồng dân tộc Việt Nam Đặc biệt trong tâm thức người Việt, cây tre chiếm vị trí sâu sắc

và lâu bền hơn cả và được xem như là biểu tượng của con người Việt Nam Tre là loại cây dễ trồng, sinh trưởng nhanh, sớm khai thác, dễ chế biến và có nhiều đặc tính phù hợp với các mục đích sử dụng khác nhau

Tre trúc phân bố ở nhiều châu lục, trừ châu Âu Châu Á là nơi có số lượng loài nhiều nhất với 65 chi và 900 loài Việt Nam nằm ở vùng nhiệt đới châu Á, với

25 chi và 216 loài trong đó chi tre (Bambusa Schreb.) có 67 loài [51], có thể nói tre

ở Việt Nam rất phong phú và đa dạng Những nghiên cứu về tre đã được bắt đầu từ lâu nhưng việc phân loại và định loại tên loài cho chi tre vẫn chưa thống nhất giữa các tác giả vì phương pháp áp dụng chủ yếu dựa trên phương pháp hình thái Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi mẫu vật phải có đầy đủ các đặc điểm phân loại, đặc biệt là cơ quan sinh sản mà đối với tre thì các mẫu vật chỉ có cơ quan dinh dưỡng, hầu hết không có đặc điểm về cơ quan sinh sản (hoa và quả) vì chu kỳ ra hoa tới vài chục năm, nếu ra hoa thì thường chỉ một lần rồi chết vì vậy việc phân loại bằng phương pháp này gặp khó khăn Hơn nữa, trong một số trường hợp phương pháp phân loại bằng hình thái khó thực hiện hoặc dễ bị nhầm lẫn do mẫu không còn nguyên vẹn hoặc bị biến đổi trong những điều kiện sinh thái khác nhau

Hai loài tre Bụng phật (Bambusa vulgaris Schr.cv Wamin McClure) và tre Vàng sọc (Bambusa vulgaris Schr ex Wendland.cv Vittata McClure) có chung tên khoa học là Bambusa vulgaris [15], bởi sự giống nhau cơ bản ở nhiều đặc điểm

hình thái, nhưng là các thứ trồng khác nhau nên giữa hai loài có một số đặc điểm khác nhau như: chiều cao thân khí sinh (13-15 m đối với tre Vàng sọc, 4 – 6 m đối với tre Bụng phật), độ dài lóng thân (tre Vàng sọc dài 20 – 30 cm, tre Bụng phật dài

4 – 10 cm), tre Bụng phật có dạng lóng phồng, lóng thẳng và lóng phồng thẳng (½ thân phía dưới phồng, ½ thân phía trên thẳng), còn tre Vàng sọc thì chỉ có dạng lóng thẳng và tròn đều Theo các tác giả Nguyễn Khắc Khôi (2007), Nguyễn Hoàng Nghĩa (2006) [15, 51] đều đồng ý các dạng này chỉ là biến thể của một loài dựa trên

một số đặc điểm hình thái nhưng vẫn thiếu tính xác thực vì không có cơ quan sinh sản Tương tự, đối với tre Đùi gà theo Lê Nguyên (1971), Nguyễn Hoàng Nghĩa

(2006) [16, 51] cho rằng tre Đùi gà có tên khoa học là Bambusa ventricosa McClure

nhưng Nguyễn Khắc Khôi (2007), Vũ Văn Dũng (2000), Dransfield và Widjaja

(1995) [15, 4, 34] cho rằng tre Đùi gà là sự biến danh của loài Bambusa tuldoides

(tên Việt Nam là Hóp nhỏ) Khó khăn này không chỉ ở Việt Nam mà ngay cả trên thế giới Vì vậy việc định loại tên loài ở chi tre vẫn còn rất nan giải, cần có sự hỗ trợ của kỹ thuật phân tích ADN

Phương pháp phân loại học phân tử (Molecular taxonomy) là phương pháp phân loại chủ yếu dựa trên các kỹ thuật phân tích ADN và đã cho những kết quả khá chính xác, giúp cho việc phát hiện loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, chủng loại phát sinh và sự tiến hóa của nhiều loài động vật, thực vật và vi sinh vật So với chỉ thị hình thái thì chỉ thị ADN cho độ chính xác cao mà không lệ thuộc vào các yếu tố môi trường Đối với thực vật, hai nhóm gen chính thường được sử dụng là vùng gen nhân và hệ gen lục lạp (cpADN) là những gen rất bao thủ trong tiến hóa Hiện nay, trong cơ sở dữ liệu ngân hàng gen (Genbank, 2012) đã lưu giữ 16542 trình tự nucleotide cho phân

loại Họ phụ tre (Bambuso ideae), trong đó có 607 trình tự nucleotide cho chi

Bambusa Schreb trong số này rất nhiều loài cũng cớ ở Việt Nam Đây là nguồn dữ

liệu có giá trị để chúng ta có thể khai thác và ứng dụng cho nghiên cứu này Đến nay, ở Việt Nam có khá nhiều công trình công bố về hiệu quả của việc giải trình tự một số vùng gen giúp cho việc định loại tên loài ở nhiều đối tượng sinh vật [12, 22, 25], nhưng đối với các loài tre mới chỉ có Nguyễn Minh Tâm (2006) [21] đã sử dụng một số chỉ thị isozyme để nhận dạng cho hai loài tre của Việt Nam Mặc dù các kết quả thu nhận chưa được nhiều nhưng cũng là cơ sở để ứng dụng phương

pháp phân tích ADN góp phần làm sáng tỏ tên khoa học cho một số loài thuộc chi

tre (Bambusa Schreb.) do có sự biến đổi hình thái ở Việt Nam

Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định tên

một số loài thuộc chi tre (Bambusa Schreb.) do biến đổi hình thái ở Việt Nam bằng kỹ thuật phân tích ADN” Với các mục tiêu và nội dung nghiên cứu sau:

- Giải trình tự nucleotide 01 vùng gen nhân (PIF) và 03 vùng gen lục lạp

(trnL-trnF, psbA-trnH và matK) cho 19 mẫu của ba loài tre Bụng phật (Bambusa

vulgaris Schr cv Wamin McClure), tre Vàng sọc (Bambusa vulgaris Schr ex

Wendland cv Vittata McClure) và tre Đùi gà (Bambusa ventricosa McClure ) có sư ̣ biến đổi hình thái ở Việt Nam

- Các dạng biến đổi hình thái giữa các mẫu trong loài có phải là của cùng một loài tre Bụng phật hoặc tre Vàng sọc hoặc tre Đùi gà không ?

- Tre Bụng phật và tre Vàng sọc có phải là cùng loài B vulgaris ?

- Tre Đùi gà (B ventricosa) có phải là sự biến danh của loài Hóp nhỏ (B

tuldoides) hay không ?

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu tổng quát về một số loài thuộc chi tre (Bambusa Schreb.)

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Bambusa Schreb

Cây tre được phân bố rộng rãi trên nhiều vùng ở nước ta Tre rất quen thuộc đối với người Việt Nam vì tre được sử dụng rất nhiều trong tất cả các lĩnh vực liên quan đến đời sống như nông nghiệp, công nghiệp, ngư nghiệp, thủ công mỹ nghệ…Theo phân loại cổ điển, tre thuộc:

Giới (regnum) : Plantae

Ngành (division) : Magnoliophyta

Lớp (classic) : Liliopsida

Bộ (ordo) : Poales

Họ (familia) : Poaceae

Chi ( genus) : Bambusa Schreb

1.1.2 Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị sử dụng một số loài tre

Các loài tre rất phong phú, đa dạng, dễ trồng, sinh trưởng nhanh, sớm cho khai thác, dễ chế biến nên được sử dụng cho rất nhiều mục đích khác nhau Tre có thân cứng như gỗ song có đặc trưng là thân thường rỗng trong ruột, có hệ thống thân ngầm và phân cành khá phức tạp, có hệ thống mo thân hoàn hảo, được sử dụng hiệu quả trong quá trình phân loại [17] Tre có ba kiểu thân ngầm chính là thân ngầm mọc cụm, thân ngầm mọc rải và thân ngầm kiểu hỗn hợp Trong khi thân ngầm của tre thường nằm dưới mặt đất thì thân khí sinh lại sinh trưởng ở phần không gian phía trên mặt đất Tre có hai loại lá có chức năng khác nhau Loại thứ nhất làm nhiệm vụ bảo vệ măng, thân cây non là mo thân Loại thứ hai làm nhiệm

vụ quang hợp tổng hợp vật chất nuôi cây gọi là lá quang hợp Mo thân có hình vảy,

có các bộ phận bẹ mo, phiến mo, tai mo và lưỡi mo Khi tre trưởng thành thì mo thân tự bóc và chết Lá quang hợp có màu xanh, gồm phiến lá, bẹ lá, cuống lá, lưỡi

lá và tai lá Các loài tre còn có hoa và quả, tuy nhiên sau khi tre ra hoa hàng loạt thường chết hoặc chu kỳ ra hoa rất dài [16] Sau đây là những đặc điểm sinh học chính và giá trị sử dụng của ba loài tre đang nghiên cứu:

1.1.2.1 Tre Bụng phật

Tên khoa học: Bambusa vulgaris Schr.cv Wamin McClure

Tên khác: Bambusa wanin Camus

Thân ngầm: mọc cụm thưa, cây cách nhau 10 – 20cm

Thân khí sinh: cao 4 – 6m, đường kính thay đổi từ gốc lên ngọn Phần dưới thân thẳng hoặc cong, phần ngọn uốn cong Lóng dài khoảng 4 – 10cm, màu xanh thẫm, sáng bóng, các lóng phía dưới thường phình to, phần phình to có 2 dạng: phần gốc

có đường kính lớn nhất (10 – 12cm), dài 5 – 10cm, phình to đều; phần trên đến giữa thân đường kính nhỏ dần (5 – 7cm), chỉ phình to ở dưới, ở trên thót dần hình chiếc bình (như tre đùi gà); phần thân trên các lóng thẳng và nhỏ hơn, đường kính khoảng

4 – 5cm Một số vòng thân (khoảng 3 – 4) sát mặt đất có vòng rễ khí sinh nhỏ Vách thân dày 1,2 – 1,75cm Tuy nhiên mỗi cụm tre vẫn có một vài thân hoàn toàn

có lóng thẳng từ gốc trở lên (chiếm 5 – 10%) phân cành khoảng giữa thân, có một cành to và nhiều cành nhỏ ở mỗi đốt

Mo thân: bẹ mo hình thang, mặt ngoài phủ lông mềm, màu hung Phiến mo

và bẹ mo làm thành một mặt phẳng, mặt trong và ngoài phủ lông cứng màu đen Tai

mo rộng 2,5cm, cao 1cm, mép có một hàng lông tua, dài 1mm Thìa lìa cao 1mm

Lá: Phiến lá hình lưỡi mác hay ngọn giáo, dài 24 – 26,5cm, rộng 2,2 – 3cm, gốc gần tròn, đỉnh nhọn, có 6 đôi gân, 2 mép có răng cưa nhỏ và sắc Thìa lìa cao 1mm Tai lá nhỏ

Phân bố: Nhiều nơi trong nước và thế giới

Giá trị: Cây có dáng đẹp, lóng có hình dạng đặc biệt, thân có thể uốn thành các hình dạng con vật và tạo cảnh theo ý muốn Vì vậy, thường được trồng làm cảnh trong công viên, vườn nhà Đôi khi dùng thân làm đồ thủ công mỹ nghệ

Hình 1.1 Loài tre Bụng phật dạng lóng thẳng (Bambusa vulgaris) số hiệu K.3005

(A: đoạn thân; B: lá và C: mo)

Hình 1.2 Loài tre Bụng phật dạng lóng phồng (Bambusa vulgaris) số hiệu K.3005

(A: đoạn thân; B: lá và C: mo)

1.1.2.2 Tre Vàng sọc

Tên khoa học: Bambusa vulgaris Schr ex Wendland cvVittata McClure (1961)

Thân ngầm: Mọc cụm thưa, cây cách nhau 20 – 30cm

Thân khí sinh: Cao 8 – 15m, đường kính 8 – 12cm, phần dưới thân đứng thẳng hay hơi cong hình chử chi (Zic-zắc), phần ngọn cong Lóng dài 20 – 30cm, vách hơi dày, màu vàng tươi, có sọc dọc màu xanh lục rộng hẹp khác nhau, đôi khi một số cây có màu xanh với một số sọc dọc màu vàng tươi hoặc hoàn toàn màu xanh, khi non hơi phủ phấn sáp màu trắng và có lông gai màu nâu nhạt, khi già không còn phấn, không lông và cũng không còn màu vàng tươi, sọc xanh (màu vàng úa) Vòng đốt hơi nổi, một số vòng đốt ở gốc có rễ khí sinh ngắn Phân cành từ phía dưới thân, mỗi đốt có khoảng 3 cành mọc cụm hoặc nhiều hơn, cành chính khá dài và to

Mo thân: Bẹ mo hình thang, khi non màu lục tươi, có vân sọc dọc màu vàng, mặt lưng mọc dày lông gai màu nâu thẫm, dễ rụng Tai mo hơi tròn rất phát triển, mép có lông tua nhỏ cứng và cong Thìa lìa lồi lên, cao 3 – 4mm, mép xẻ răng cưa, phủ lông màu trắng Phiến mo hình tam giác, dễ rụng, nhiều lông, mặt lưng có lông gai nhỏ màu nâu thẫm

Lá: Phiến lá hình lưỡi mác hay ngọn giáo, dài 22 – 30cm, rộng 2,3 – 3,6cm,

có 8 đôi gân, 2 mặt nhẵn, gốc gần hình tròn, 2 bên không đối xứng, gân ngang nhỏ

ở mặt dưới có thể nhìn thấy được Tai lá thường ít phát triển Thìa lìa cao khoảng 1mm, mép nguyên Bẹ lá rộng 1,5mm, lúc non có lông thưa cứng, ráp, màu nâu, khi già nhẵn

Phân bố: Hầu hết các địa phương trong nước đều trồng Loài nhập nội

Giá trị: Cây trồng làm cảnh vì thân nhẵn bóng, có màu vàng tươi, sọc dọc màu xanh ở các lóng rất đẹp được nhiều người ưa thích Thường trồng trong công viên, vườn nhà, chậu cảnh Thân có thể uốn tạo dáng rất có giá trị, ngoài ra còn làm một số công dụng trong xây dựng nhà cửa Mùa măng quanh năm, nhiều nhất là tháng 5, 6

Tre Vàng sọc là một thứ trồng (cultivar) của tre Mỡ [15] Do hình thái dễ biến đổi theo môi trường sống nên tre Mỡ đã tạo thành nhiều thứ trồng trọt khác nhau, trong đó có tre Vàng sọc, tre Bụng phật Tuy nhiên, cơ sở khoa học của hiện tượng này chưa có nguồn gốc chứng minh vững chắc Cần phân tích ADN để làm rõ hơn (vì cùng nơi sống nhưng vẫn có cả 3 dạng khác nhau)

Hình 1.3 Loài tre Vàng sọc (Bambusa vulgaris) số hiệu K.3011 (A: đoạn thân; B:

gà, vách dày 1cm, vòng đốt hơi nhô cao, thân khi non màu xanh thẫm, khi già màu hơi vàng, phía trên và dưới vòng mo phủ một vòng lông mịn màu trắng Phân cành

ở đốt với 1 cành to và nhiều cành nhỏ

Mo thân: Bẹ mo hình thang Tai mo phát triển, mép phủ lông dài 2mm Thìa lìa cao 3mm, có răng cưa ngắn Phiến mo hình ngọn giáo, mặt ngoài phiến và bẹ mo tạo thành một mặt phẳng

Lá: Phiến lá hình trứng hay ngọn giáo, dài 22 – 24cm, rộng 2,1 – 2,7cm, đầu nhọn, gốc hơi tròn, có 7 đôi gân Tai lá rộng 1mm, cao 1,5mm Thìa lìa thấp

Phân bố: Mọc tự nhiên ở Quảng Ninh (Móng Cái), Lạng Sơn Trồng ở Phú Thọ (Đoan Hùng), Hà Nội (Ba Vì) Trên thế giới: phân bố ở vùng nam Trung Quốc

Giá trị: Cây trồng làm cảnh đẹp vì có lóng hình đùi gà, thường trồng trong công viên, vườn nhà, chậu cây Thân còn dùng làm gậy chống

Loài rất hiếm gặp trong tự nhiên cũng như trong trồng trọt Khi trồng làm cảnh thường có 2 loại thân trong một bụi cây: Một loại thân có lóng phồng to hình đùi gà ở phía dưới (1/4 thân), phía trên có lóng thẳng (3/4 thân) và một loại thân có lóng thẳng tròn đều trên toàn bộ chiều cao Tỷ lệ loại lóng thẳng tới 70 – 80% trong một bụi, loại lóng đùi gà chỉ 20 – 30% Trong tự nhiên cây to cao và hoàn toàn chỉ có

cây mang lóng thẳng tròn đều, có thể cùng loài với Hóp nhỏ (Bambusa tuldoides) [15]

Hình 1.4 Loài tre Đùi gà dạng lóng thẳng (Bambusa ventricosa) số hiệu K.3006

(A: đoạn thân; B: lá và C: mo)

Hình 1.5 Loài tre Đùi gà dạng lóng phồng (Bambusa ventricosa) số hiệu K.3006

(A: đoạn thân; B: lá và C: mo)

1.1.3 Sự biến đổi hình thái do điều kiện sống của ba loài tre nghiên cứu

Tre Bụng phật và tre Vàng sọc cùng có tên khoa học là Bambusa vulgaris [15] có một số đặc điểm giống nhau như thân ngầm mọc cụm, thân khí sinh có

đường kính 4 – 10cm, kích thước lá 22 – 30cm x 2,2 – 3,6cm; phân cành các đốt có một cành chính và một số cành nhỏ, vách thân hơi dày (0,7 – 1,7cm) Một số đặc điểm gần giống nhau như mo thân (hình dạng, kích thước ) Một số đặc điểm phân biệt nhau giữa chúng là chiều cao thân khí sinh: tre Vàng sọc cao hơn nhiều (8 – 15m) so với tre Bụng phật (4 – 6m), độ dài lóng thân: tre Vàng sọc dài hơn nhiều lần (20 – 30cm) so với tre Bụng phật ở lóng phồng (4 – 10cm) Lóng tre Vàng sọc thẳng, tròn đều; lóng tre Bụng phật phình to và ngắn (trừ nửa phía trên thân và những thân cây lóng thẳng hoàn toàn) Ngoài ra, những chi tiết khác có thể giống và khác nhau không nhiều và cơ bản như nhau (hình dạng, kích thước của bẹ mo, phiến

mo, tai mo, lưỡi mo, bẹ lá, tai lá, lưỡi lá các đặc điểm về lông, màu sắc ) Theo các tác giả Nguyễn Khắc Khôi (2007), Nguyễn Hoàng Nghĩa (2006) [15, 51] đều đồng ý các dạng này chỉ là biến thể của một loài dựa trên một số đặc điểm hình thái, nhưng vẫn thiếu tính xác thực vì không có cơ quan sinh sản Do đó cần có kết quả phân tích ADN để làm sáng tỏ

Hóp nhỏ (Bambusa tuldoides) và tre Đùi gà (Bambusa ventricosa) dạng lóng

phồng có một số đặc điểm hình thái giống nhau như thân ngầm mọc cụm dày, đường kính thân (3 – 6,2cm), độ dài lóng (28 – 33cm, trừ lóng ở sát gốc cuả tre Đùi

gà ngắn hơn) Khác nhau của 2 loài là kích thước lá (Hóp nhỏ 10 – 18cm x 1,8 – 2cm; tre Đùi gà 22 – 24cm x 2,1 – 2,7cm) Phân biệt cơ bản của tre Đùi gà với Hóp nhỏ là có các lóng phía gốc thân phồng lên dạng đùi gà và ngắn hơn các lóng thẳng phía trên Những đặc điểm như bẹ lá, phiến lá, tai lá, thìa lìa của mo và lá cũng không hoàn toàn khác nhau nhiều Ở những thân tre Đùi gà có cả 2 dạng lóng cũng như cả bụi toàn thân có lóng không phồng, chiều dài lóng là như ở Hóp nhỏ Tre

Đùi gà mọc tự nhiên hoàn toàn thân đều lóng thẳng và có lẽ giống như Hóp nhỏ

[15] Theo Nguyễn Khắc Khôi (2007), Vũ Văn Dũng (2000), S.Drasfield và E.A Widjaja (1995), But & Chia (1995), Ohrnberger (1999) [15, 4, 35, 32, 52] cho rằng

B ventricosa Mc Clure (1938) (tre Đùi gà) là sự biến danh của loài B tuldoides

Munro (1868) (Hóp nhỏ) bởi sự giống nhau ở nhiều đặc điểm hình thái nhưng là các thứ trồng khác nhau nên hai loài cũng có những đặc điểm khác nhau do điều kiện trồng trọt Trái lại, một số tác giả như McClure (1938), Lê Nguyên (1971), Nguyễn Hoàng Nghĩa (2006) [46, 16, 51] vẫn cho 2 loài trên độc lập nhau Vì không có hoa quả để xác định nên có thể còn nghi vấn chúng cùng loài hay không Cần phương pháp ADN xác định dạng Đùi gà thân phồng và thân thẳng cũng như với Hóp nhỏ về mặt phân loại

1.1.4 Tình hình phân bố tre trên thế giới và Việt Nam

1.1.4.1 Trên thế giới

Các loài Tre phân bố tự nhiên ở các vùng nhiệt đới, á nhiệt đới và ôn đới, từ vùng thấp tới độ cao 4000m (so với mực nước biển), song tập trung chủ yếu ở vùng thấp tới độ cao trung bình [15] Các loài tre có thể mọc hoang dại hoặc được gây trồng và có một đặc điểm nổi bật là có mặt ở rất nhiều các môi trường sống khác nhau [35] Theo Rao and Rao (1995), cả thế giới có khoảng 1250 loài tre trúc của

75 chi, phân bố ở khắp các châu lục, trừ châu Âu Châu Á đặc biệt phong phú về số lượng và chủng loại tre trúc với khoảng 900 loài của khoảng 65 chi [54, 55] Bảng 1.1 là số liệu năm 1995 về sự đa dạng của các loài tre trúc trên thế giới Từ đó tới nay có nhiều loài tre trúc mới đã được tìm ra và phân loại trong đó có Việt Nam làm tăng số loài tre trúc đã được xác định

Bảng 1 1 Phân bố của các loài tre trúc trên thế giới [54]

loài

Diện tích (ha) (ha)

Nước-Vùng lãnh thổ thổ

Số chi Số loài Diện tích

(ha) (ha)

Trung Quốc 26 300 2.900.000 Singapore 6 23

Nhật Bản 13 237 825.000 Băngladet 8 20 6.000.000

Ấn Độ 23 125 9.600.000 Papua New Guinea 26

Việt Nam 16 92* 1.942.000 Srilanka 7 14

Myanma 20 90 2.200.000 Hàn Quốc 10 13

Indonexia 10 65 50.000 Đài Loan 40 140.000 Phillipnines 8 54 Madagaxca 11 40

Thai Lan 12 41 1.000.000 Ôxtralia 4 4

Ghi chú *: Nay khoảng hơn 200 loài

1.1.4.2 Việt Nam

Là đất nước nằm ở trong vùng nhiệt đới gió mùa châu Á, Việt Nam có một

hệ thực vật rất phong phú và đa dạng, trong đó có các loài tre trúc Ở Việt Nam có thể gặp tre từ độ cao ngang mực nước biển ở các làng xóm thuộc vùng Tây Nam

Bộ, trên các đảo thuộc Vịnh Hạ Long đến các độ cao gần 3000m (Hoàng Liên Sơn) [33, 44] Theo Biswas (1995) [31] thì Việt Nam có khoảng 92 loài tre trúc của 16 chi (Bảng 1.1) Những nghiên cứu gần đây cho thấy số lượng loài tre trúc phân bố ở Việt Nam lớn hơn rất nhiều Theo Lê Viết Lâm (2005) [42] thì Việt Nam có trên

140 loài của 29 chi và có thể còn tìm thấy các loài mới Năm 2006, Nguyễn Hoàng Nghĩa đã rà soát các kết quả nghiên cứu về phân loại tre trúc ở Việt Nam kết hợp với một số nghiên cứu, khảo sát ở thực địa đã đưa ra danh sách của 216 loài thuộc

25 chi tre trúc phân bố tự nhiên ở Việt Nam [51]

Diện tích rừng tre trúc của Việt Nam cũng rất lớn Theo Nguyễn Ngọc Bình

và Phạm Đức Tuấn (2007) [2], tính từ năm 2001, tổng diện tích rừng tre trúc của Việt Nam có khoảng 1.489.000 ha, trong đó 1.415.500 ha là rừng tự nhiên (thuần loài hoặc hỗn loài), và khoảng 73.500 ha là rừng trồng tre trúc Tính tới tháng 12/2004, thì tổng diện tích rừng tre trúc của Việt Nam là 1.563.253 ha (Bảng 1.2), gần tương đương với số liệu thống kê năm 1990, trong đó:

- Diện tích rừng tre trúc tự nhiên thuần loài: 799.130 ha

- Diện tích rừng tre trúc tự nhiên pha gỗ: 682.642 ha

- Diện tích rừng tre trúc trồng (chủ yếu là rừng luồng): 81.484 ha

Bảng 1.2 Hiện trạng tre trúc Việt Nam tính tới tháng 12/2004 [2]

Các loại rừng tre trúc Diện tích (ha) Phân chia theo chức năng (ha)

Rừng đặc chủng

Rừng phòng hộ

Rừng sản xuất

Rừng tre trúc tự nhiên thuần loài 799.130 82.409 343.035 373.686 Rừng tre trúc tự nhiên hỗn loài 682.642 113.850 319.266 249.526 Rừng tre trúc trồng 81.484 285 10.186 71.013 Tổng cộng 1.563.256 196.544 672.487 694.225

Nhờ tác dụng che phủ tốt của tán lá làm giảm động năng của hạt mưa trước khi rơi xuống mặt đất và rễ tre trúc phân bố tập trung ở tầng đất mặt, nên có tác dụng làm tăng độ xốp, tăng khả năng thấm nước của đất, bám giữ đất tốt, do đó rừng

tự nhiên có tre trúc tăng được khả năng chống xói mòn của đất trong mùa mưa và tăng dòng chảy kiệt trong mùa khô, nên điều tiết tốt hơn dòng chảy của các lưu vực sông ngòi ở miền núi, đặc biệt là ở các vùng đầu nguồn của các lưu vực sông quan trọng ở nước ta Nhân dân ta trong cuộc sống từ lâu đời đã có kinh nghiệm trồng các bụi tre ven theo các bờ sông, suối, chân đê, tạo thành các hành lang cây xanh có hệ

rễ bám giữ đất tốt để chống xói lở các bờ sông suối và các chân đê trong mùa mưa lũ

Tre trúc là các loài cây cho sợi dài, thân tròn, rỗng, nhẹ, nhưng rất dẻo và dễ uốn cong, chẻ thành nan, mảnh nhỏ dễ dàng, có độ bền cao, ít co trương, nên chúng

là nguyên liệu để sản xuất ra rất nhiều các đồ dùng trong sản xuất và đời sống của nhân dân ta Đặc biệt là nguyên liệu của các nghề phụ đan lát ở nông thôn, để sử dụng có hiệu quả hàng triệu công lao động ở nông thôn, góp phần tích cực trong chương trình xóa đói giảm nghèo của Chính phủ

1.2 Giới thiệu một số phương pháp phân loại thực vật

Phân loại, hiểu theo nghĩa thông dụng, là sự sắp xếp các đối tượng có những đặc điểm chung vào thành từng nhóm, theo một thứ tự nhất định Việc phân loại các loài sinh vật, làm sáng tỏ mối quan hệ giữa chúng, không những có tầm quan trọng

về mặt lý thuyết mà còn có ý nghĩa thực tiễn rất lớn, góp phần vào việc cải tạo, sử dụng những sinh vật có lợi, loại bỏ những sinh vật có hại Nhờ có phân loại học chúng ta hiểu được tính đa dạng của sự sống, nghĩa là sự khác biệt giữa các sinh vật được xuất hiện do kết quả của sự tiến hóa thích nghi Một số phương pháp thường được sử dụng như:

1.2.1 Phương pháp hình thái học (phân loại học truyền thống)

Dựa vào đặc điểm hình thái, đặc biệt là hình thái cơ quan sinh sản, vì cơ quan này ít biến đổi hơn so với cơ quan sinh dưỡng khi điều kiện môi trường thay đổi Những thực vật càng gần nhau càng có nhiều đặc điểm chung về hình thái Đây

là phương pháp cổ điển nhưng hiện nay vẫn được dùng phổ biến, hạn chế của

phương pháp này đã được ghi nhận trên một số taxa, thực tế nhiều loài khác nhau nhưng có hình thái rất giống nhau và ngược lại Phương pháp phân loại hình thái thực sự gặp khó khăn khi phân loại ở các đơn vị taxon dưới loài [27]

Phân loại học truyền thống sử dụng chủ yếu các đặc điểm hình thái nhưng các tính trạng hình thái thường biến đổi rất phức tạp, nên đôi khi việc xác định sự tương đồng là rất khó Hiện tượng tiến hoá hội tụ, tiến hoá song song và tiến hoá ngược dẫn đến các đặc điểm tương tự giữa các loài có họ hàng rất xa nhau, nghĩa là các đặc điểm giống nhau do tiến hoá độc lập từ các nguồn gốc khác nhau để thích nghi với điều kiện môi trường giống nhau là khá phổ biến trong sinh giới Việc phân biệt đặc điểm tương đồng với đặc điểm tương tự trong hệ thống học truyền thống là không dễ dàng, nhất là ở các bậc phân loại thấp Ngoài ra, việc so sánh trực tiếp giữa các bậc phân loại cao là rất khó, vì nhiều đặc điểm không còn khả năng xác định được sự tương đồng Vì vậy hệ thống học truyền thống phải sử dụng các đặc điểm, các khoá định loại riêng cho những nhóm sinh vật nhất định Ưu điểm lớn nhất của hệ thống học truyền thống là có lịch sử phát triển lâu dài và đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật tương đối đầy đủ, tiện lợi trong nghiên cứu ứng dụng Nhưng hệ thống học truyền thống có nhược điểm là thiếu tính thống nhất, phải sử dụng nhiều tiêu chuẩn và nhiều khoá phân loại khác nhau, nên bị hạn chế khi nghiên cứu các biến đổi tiến hoá nhỏ, khó xác định chính xác mối quan hệ giữa các nhóm sinh vật ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài [27]

1.2.2 Phương pháp giải phẫu so sánh

Đến thế kỷ XIX, nhờ sự phát triển của kính hiển vi mà giải phẫu học thực vật

có điều kiện phát triển Ngoài những đặc điểm hình thái bên ngoài, các nhà phân loại học còn sử dụng cả những đặc điểm hình thái giải phẫu hay vi hình thái (micromorphologie), tức là hình thái cấu trúc bên trong cơ thể, của mô, của tế bào, kể cả cấu trúc siêu hiển vi, để phân loại Việc sử dụng phương pháp này đã nhận được các kết quả nghiên cứu chính xác và khách quan cho phân loại thực vật Các đặc điểm giải phẫu so sánh cho phép xác lập mối quan hệ gần gũi không những của các nhóm lớn, mà cả của các bậc taxon nhỏ

1.2.3 Phương pháp hoá học

Có nhiều phương pháp phân tích hoá học khác nhau được sử dụng trong nghiên cứu và kiểm định nhất là đối với mẫu cây chứa các nhóm chất có hoạt tính sinh học, các cây chứa tinh dầu (Trầm hương, Xá xị, Pơ mu ) dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký cao áp, điện di mao quản, sắc kí khí - khối phổ… đặc điểm chung của phương pháp hóa học là cho kết quả nhanh, chính xác và có thể cho các thông số về cấu trúc hoá học Ưu điểm của phương pháp này là yêu cầu về tính nguyên vẹn của mẫu vật không cao Trên thế giới, phương pháp này đang được sử dụng nhiều Ở nước ta, phương pháp này mới chỉ được bắt đầu nghiên cứu ở một vài cơ sở

1.2.4 Phương pháp phân loại phân tử

Phân loại học phân tử là phương pháp phân loại sử dụng sự khác biệt các cấu trúc phân tử để đạt được các thông tin về mối quan hệ tiến hóa giữa các loài Các biến đổi phân tử đơn giản hơn nhiều so với biến đổi hình thái, vì vật chất di truyền ADN chỉ cấu thành từ 4 loại nucleotide (adenine, guanine, thymine và cytosine) Mặt khác các biến đổi phân tử ít bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường Vì vậy,

ưu thế lớn nhất của phân loại học phân tử là có thể phân biệt rõ ràng các đặc điểm tương đồng với các đặc điểm tương tự [30, 53]

Nguyên lý của phân loại học phân tử: Phương pháp này dựa trên nguyên lý

mỗi sinh vật sống đều có cơ sở phân tử của tính di truyền là ADN, ARN và protein, các sinh vật có họ hàng gần gũi sẽ có mức độ tương đồng cao trong cấu trúc phân tử những chất này, ngược lại những sinh vật có họ hàng xa nhau sẽ cho thấy những đặc điểm cấu trúc khác nhau Hiện nay các phân tử có tính bảo thủ như ADN ty thể, ADN lục lạp đang được sử dụng nhiều nhất cho phân loại và được coi là tích lũy các đột biến theo thời gian Thêm vào đó nếu coi tốc độ đột biến không đổi, chúng

ta sẽ tạo ra được một đồng hồ phân tử cho biết thời gian diễn ra các đột biến, nói cách khác chúng ta có thể ước lượng được thời gian hình thành loài Mặc dù phân loại học phân tử là phương pháp sử dụng đặc điểm cấu trúc của các phân tử để xây dựng hệ thống phát sinh chủng loại, tuy nhiên mãi cho đến những thập kỷ gần đây, con người mới có khả năng tách chiết và xác định được cấu trúc phân tử của những chất này

Sự ra đời của kỹ thuật giải trình tự ADN của Maxam – Gilbert ( 1977, 1980)

và Singer (1977) [30] đã mở ra một ứng dụng to lớn cho phân loại học phân tử, đó

là dựa vào sự so sánh trình tự ADN, sử dụng kỹ thuật sắp xếp phân tử bằng các phần mềm tin sinh học để xác định mức độ giống nhau Tuy nhiên, từ những năm cuối của thập kỷ 20, trình tự nucleotide được xác định trên máy đọc tự động ngày càng phổ biến Ưu điểm của phương pháp là giảm các thao tác, tiết kiệm hóa chất và trình tự đọc dài hơn

Phương pháp phân loại truyền thống và phân loại phân tử đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng Sự kết hợp giữa hai hệ thống phân loại này sẽ đem lại kết quả tốt nhất Thực tế cũng chứng minh rằng hầu hết những gì hệ thống học truyền thống đã giải quyết tốt, đều không mâu thuẫn với các kết quả nghiên cứu của

hệ thống học phân tử [30] Phân tích phân tử thường được sử dụng để giải quyết một số vấn đề mà hệ thống học truyền thống còn gặp khó khăn, trong khi chỉ thị phân tử có lợi thế hơn Hiện tại, hệ thống học phân tử là phương pháp hữu hiệu hỗ trợ cho phương pháp phân loại truyền thống và cho kết quả khá tin cậy

1.3 Một số thành tựu nghiên cứu về phân loại học phân tử

Ngoài nước

Trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hóa, phân loại và đa dạng di truyền quần thể sinh vật Phương pháp chủ yếu dựa trên kỹ thuật phân tích ADN Hiện nay cơ sở

dữ liệu gen ( Genbank, 2011) đã lưu giữ trên 80 triệu trình tự ADN với khoảng hơn

90 tỷ nucleotide Đây là nguồn dữ liệu có giá trị trong sinh học bảo tồn vì bốn lý do chính là (1) số liệu về trình tự các nucleotide rất có giá trị trong việc xác định các đơn vị bảo tồn giúp cho việc đánh giá, sắp xếp phân loại, nhất là bậc loài và dưới loài; (2) số liệu trình tự nucleotide đảm bảo độ chính xác cao nên tạo cơ sở khoa học tốt nhất cho bảo tồn đa dạng di truyền trong nghiên cứu di truyền quần thể, vì nó bộc

lộ rõ các biến đổi di truyền ở trong và giữa các quần thể, giữa các cá thể, giữa cha mẹ

và con cái… (3) kết quả phân tích ADN cho phép xác định chính xác loài, quần thể cho đến tận cá thể từ các mẫu vật không còn nguyên vẹn mà vẫn xác định thấy hiện tượng tạp lai giữa các loài, các quần thể địa lý…;(4) kết quả nghiên cứu ADN không

bị ảnh hưởng vào bất cứ yếu tố khách quan do con người hay môi trường gây ra

Tre trúc là loại cây được trồng phổ biến ở Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam

… có nhiều công dụng phục vụ cho đời sống con người nên rất được quan tâm nghiên cứu Vì thế cho đến nay trong cơ sở dữ liệu gen (Genbank, 2012) đã lưu giữ

khoảng 16.542 trình tự nucleotide cho phân loại Họ phụ tre (Bambusoideae), trong

đó có khoảng 607 trình tự nucleotide cho chi Bambusa, trong số này rất nhiều loài

cũng có ở Việt Nam Đối với thực vật hai nhóm gen chính thường được sử dụng là gen nhân và hệ gen lục lạp (cpADN) Chẳng hạn, Sun và cộng sự (2005) [61] đã sử dụng trình tự nucleotide ADN vùng ITS nhân để nghiên cứu 21 loài tre thuộc các

chi Bambusa, Dendrocalamopsis, Dendrocalamus, Guadua, Leleba và Lingnania

và đã giải quyết được mối quan hệ di truyền của một số loài thuộc chi Bambusa (B

subaequalis, B multiplex, B emeiensis, B chungii, B contracta, B hainanensis, B flexuosa, B sinospinosa, B tuldoides, B surrecta, B intermedia và B valida)

Tương tự, Yang và cộng sự (2008) [67] cũng đã sử dụng trình tự ADN vùng ITS và vùng trnL-F để nghiên cứu nguồn gốc phát sinh chủng loại của 53 loài thuộc phân

họ Bambusoideae Kết quả nhận được đã làm sáng tỏ mối quan hệ di truyền của một

số chi khác với chi Bambusa Năm 2010 W.L Goh và cộng sự [37] đã xác định

trình tự nucleotide vùng gen nhân GBSSI và bốn vùng gen lục lạp: rps16-trnQ; trnC-rpoB; trnH-psbA; trnD-T để nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa các loài tre

(climbing bamboos) ở Đông Nam Á với các loài trong chi Bambusa Cũng trong

năm 2010, Zhou và cộng sự [68] đã sử dụng trình tự ADN của PIF để làm rõ mối

quan hệ di truyền các loài thuộc phân họ Bambusoideae Năm 2009, Wu và cộng

sự [66] đã công bố trình tự genome lục lạp đầy đủ của hai loài tre là Dendrocalamus

latiflorus và Bambusa oldhamii, với kích thước tương ứng là 139.350bp và 139.365bp

Đây là nguồn dữ liệu có giá trị để chúng ta có thể khai thác ứng dụng cho nghiên cứu chi này của Việt Nam

Trong nước

Các nghiên cứu về đa dạng di truyền phục vụ công tác bảo tồn đa dạng sinh học và tái tạo nguồn gen đã được thế giới quan tâm và phát triển Theo hướng này, các nhà nghiên cứu trong nước cũng đã từng bước tiếp cận

Gần đây, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại và nhận dạng mẫu sinh vật ở Việt Nam cũng đã đạt được nhiều kết quả có giá trị Đối với một số loài động, thực vật là nhóm nghiên cứu của Nông Văn Hải [25] đã dùng gen ty thể (18S rRNA) để nghiên cứu phả hệ và giám định ADN một số loài lan Hài, cây Bình vôi, gà Lôi, cá Bạc má, cá Chim trắng, cá

Hố, cá Nục sò, cá Sòng gió và đã phát hiện ra mức độ tiến hóa của chúng Hay nhóm tác giả của Đặng Tất Thế (2003 -2006) cũng sử dụng các nhóm gen này để phân tích sự tiến hóa phân tử và phát sinh chủng loại của một số loài thú, bò sát quý hiếm của Việt Nam [26] Nhóm tác giả Vũ Thị Thu Hiền (2009) [12] đã sử dụng

vùng gen tRNA-leu để phân loại cho hai loài gỗ quý thuộc chi Dalbergia….Tuy

nhiên, đối với các loài tre, Việt Nam mới chỉ có tác giả Nguyễn Minh Tâm (2006) [21] sử dụng một số chỉ thị isozyme để nhận dạng cho hai loài tre của Việt Nam, mặc dù các kết quả thu nhận chưa nhiều nhưng cũng là cơ sở cho công tác bảo tồn

đa dạng di truyền , còn các công trình nghiên cứu khác của các tác giả Nguyễn Ngọc Bình, Phạm Đức Tuấn (2007), Vũ Văn Dũng, (2000), Phạm Hoàng Hộ (2000), Nguyễn Khắc Khôi (2007), Lê Nguyên (1971), Nguyễn Hoàng Nghĩa (2006) [2, 4, 11, 15, 16, 51] thì chủ yếu dựa trên cơ sở đặc điểm hình thái để nhận dạng và phân loại nên vẫn còn những nghi ngờ về vị trí phân loại, tên khoa học…vì vậy cần có kết quả phân tích ADN để làm sáng tỏ Đến nay chưa có một công trình công bố nào đề cập đến việc ứng dụng kỹ thuật phân tích ADN để hỗ trợ cho phân

loại chi tre Bambusa Schreb ở Việt Nam

1.4 Hệ gen sử dụng trong nghiên cứu phân loại phân tử ở thực vật

1.4.1 Cấu trúc hệ gen lục lạp

Lục lạp là bào quan nằm trong tế bào chất của thực vật và tảo (algae), chúng

có chứa ADN riêng ADN lục lạp có từ 102

– 104 bản sao trong mỗi tế bào [53] Lục lạp có chứa chất diệp lục (chlorophyll) và là nơi thực hiện quá trình quang hợp của cây Genome lục lạp thường được sử dụng cho phân loại thực vật do đặc tính di truyền theo dòng mẹ, không tái tổ hợp di truyền cho thế hệ sau và tốc độ đột biến cũng khá cao Hệ gen lục lạp được các nhà phân loại học phân tử đánh giá là sự tích lũy đột biến theo thời gian, do vậy sẽ phản ánh đúng mức độ tiến hóa giữa các loài

Hình 1.6 Hệ gen lục lạp của hoa Nhài Jasminum nudiflorum [45]

Genome lục lạp (cpADN) thực chất là một phân tử ADN vòng, sợi đơn, mỗi gen thường không lặp lại Không giống như các gen nhân, các gen lục lạp chỉ mã hóa cho các protein cần thiết cho chức năng quang hợp và bộ máy biểu hiện những protein này Vùng ADN không mã hóa trên hệ gen lục lạp là rất ít

Genome lục lạp (cpADN) có kích thước từ 120kb – 220kb (hình 1.6), kích thước này thay đổi do có sự tồn tại của hai vùng lặp lại ngược chiều nhau (Inverted repeat), tách genome lục lạp thành hai vùng Mặc dù phần lớn ADN lục lạp đều mang số lượng gen như nhau, tuy nhiên đôi khi một số gen di trú vào ADN nhân và biến mất khỏi hệ gen lục lạp Các gen lục lạp có tốc độ đột biến thấp hơn từ 4 – 5 lần so với gen trong nhân, nhưng nhanh hơn khoảng 3 lần so với ADN ty thể thưc vật và thường xuyên được sử dụng trong nghiên cứu phân loại [30, 53]

Hiện nay, các gen lục lạp thường được sử dụng trong nghiên cứu hệ thống

học phân tử thực vật bao gồm: gen matK, gen trnL, vùng đệm trnH – psbA Tất cả

các gen thuộc hệ gen lục lạp thường có mức độ biến đổi không lớn hơn 2% giữa các loài lân cận

- Vùng đệm psbA – trnH: thường được sử dụng cho nghiên cứu phân loại

[58, 59] Mức độ khác biệt trình tự nucleotide giữa các loài là 1,24% và sự khác biệt

bên trong loài rất thấp từ 0.00 – 0.08% [41] Trình tự psbA – trnH cũng đã được

công bố trên ngân hàng gen với nhiều loài khác nhau thuộc thực vật hạt trần, dương

xỉ, rêu, và rêu tản (liverwort)

- Gen matK: Cùng với vùng đệm psbA – trnH đã được đề xuất làm ADN

barcoding cho nhóm thực vật có hoa Kết quả sử dụng gen matK cho phân loại đã

thu được sự tương đồng rất cao với phân loại hình thái và cho giá trị bootstrap từ 92 – 100% [48, 49]

- Gen trnL: là gen mã hóa cho tRNA vận chuyển Leucine trong lục lạp, có

kích thước khoảng 452 bp đến 528bp với các loài thuộc họ đậu Gen này được sử dụng nhiều trong nghiên cứu phân loại phân tử [47, 40, 62] Các kết quả thu được trong các nghiên cứu nguồn gốc phát sinh loài sử dụng gen trnL cho thấy đây là một vùng ADN hữu ích cho phân loại

Việc sử dụng mỗi đoạn gen có những ưu điểm và nhược điểm khác nhau vì vậy kết quả phân loại sẽ chính xác hơn khi phân tích tổ hợp nhiều vùng gen

1.4.2 Vùng gen nhân

- Gen PIF (P instability factor): PIF - like transposable elements là đoạn

ADN có khả năng di chuyển độc lập ngay trong nội bộ một thể nhiễm sắc hoặc từ thể nhiễm sắc này sang thể nhiễm sắc khác, còn gọi là gen nhảy (transposon)

Gen nhảy lần đầu tiên được Barbara McKlintock phát hiện và nghiên cứu ở cây ngô từ những năm 40 của thế kỷ XX, nhưng phải chờ đến những năm 70 – 80 với sự tiến bộ của kỹ thuật phân tích di truyền người ta mới hiểu rõ được cấu trúc và

cơ chế hoạt động của transposon Transposon được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm, thực vật, động vật và con người Chúng rất đa dạng về độ lớn và cơ chế hoạt động, nhưng đều có điểm chung là được xếp xen kẽ vào hệ gen và sử dụng enzym transposaza để di chuyển từ vị trí này sang vị trí khác của phân tử ADN Nhiều nghiên cứu ở nhiều đối tượng khác nhau đã chứng minh rằng gen nhảy là cấu thành quan trọng của hệ gen và đóng vai trò quan trọng trong sự tiến hóa của cấu trúc thể nhiễm sắc Với khả năng di động di chuyển vị trí, các gen nhảy tạo nên sự tổ hợp lại

hệ gen làm cho hệ gen càng đa dạng Các gen nhảy có thể được xếp xen kẽ vào các đoạn exon, các đoạn intron hoặc vào vùng ADN điều chỉnh của gen và tạo nên các

đột biến gen rất đa dạng [5, 18] Trình tự amino acid vùng gen PIF khá bảo thủ

trong cả các loài động vật và thực vật nên thường được dùng để thiết lập mối quan

hệ tiến hóa giữa các loài [68] Trong công bố mới đây nhất của Zhou và cộng sự

(2010) [68] về việc so sánh 139 trình tự gen PIF tách từ 44 loài tre cho thấy PIF -

like transposase gen rất phổ biến, đa dạng và phong phú ở phân họ tre (Bambusoideae), nhưng lại tương đối bảo thủ ở mức độ loài

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài của luận văn được tiến hành tại Phòng Phân loại học thực nghiệm và

Đa dạng nguồn gen - Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam từ tháng 4/2011 đến tháng 8/2012

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu

Gồm 19 mẫu lá của 3 loài tre thuộc chi Bambusa Schreb cần làm sáng tỏ

tên khoa học do biến đổi hình thái, đó là:

- Tám mẫu tre Bụng phật (3 mẫu dạng lóng phồng, 3 mẫu dạng lóng thẳng và

ở -200C cho đến khi sử dụng Danh sách và một số đặc điểm hình thái các mẫu có

ký hiệu và nơi thu thập như trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Nguồn gốc và ký hiệu mẫu của 3 loài sử dụng trong nghiên cứu

Tên loài Tên khoa

học

Ký hiệu mẫu

Địa điểm thu mẫu

Một số đặc điểm hình thái

Tre Bụng

phật Bambusa

vulgaris

Schr.cv Wamin Mc Clure

Dương K3005/9 Châu Mộng,

Phú Thọ

Cả thân khí sinh các lóng đều thẳng Bẹ mo dài hơn 15-20 cm

K3005/10 Chợ Đồn, Bắc

Kạn K3005/12 Hà Nội K3005/13 Ba Vì Cả thân khí sinh có

lóng phồng và thẳng K3005/14 Ba Vì

Tre Vàng

sọc

Bambusa vulgaris

Schr ex Wendland

cvVittata McClure

K3011/3 Ba Vì, Hà Nội Lóng thẳng và tròn

đều, vỏ thân có màu vàng tươi xen lẫn sọc xanh Bẹ mo 22 cm x 15-17 cm x 8,3 cm

K3011/4 Chợ Đồn, Bắc

Kạn K3011/8 Tuyên Quang,

Chiêm Hóa Tre Đùi gà B

cm x 7,8cm x 7,8 cm

K3006/2 Thanh Ba,

Phú Thọ K3006/5 Thanh Ba,

Phú Thọ

Dạng thân có lóng phồng và thẳng trên cùng một thân

K3006/6 Chân Mộng,

Phú Thọ K3006/7 Ba Vì, Hà Nội K3006/11 Quản Bạ, Hà

Giang

Dạng thân có lóng thẳng toàn bụi cây Bẹ

mo dài hơn 10-15 cm K3006/12 Văn Bàn, Lào

Cai K3006/14 Đồng Hỷ,

Thái Nguyên

2.2.2 Hóa chất

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu bao gồm: Các hóa chất tách chiết và tinh sạch ADN (CTAB, EDTA, Tris-HCl, Isopropanol, ethanol, ARNase, chloroform,…); KIT tinh sạch genomic (fermentas); bộ hóa chất PCR (Fermentas), KIT tinh sạch sản phẩm PCR (QIAGEN Quick Gel Extraction Kit QIAGEN, Mỹ); hóa chất điện di agarose (agarose, đệm TAE…)

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: Các thiết bị chính sử dụng trong thí nghiệm: Máy PCR System

9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy ly tâm của hãng Hitachi (Nhật Bản), bộ điện di Nytechnich (Anh), máy chụp ảnh gel (Cleaver, Đức), máy ổn nhiệt (Memmert, Đức) Giải mã trình tự trên máy ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems)…

Dụng cụ: Cối, chày sứ, thìa vô trùng, giấy thấm vô trùng, ống eppendorf 2ml

và 1,5ml, pipetman, đầu côn các loại…

2.2.4 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Cặp mồi nhân bản vùng psbA - trnH bao gồm: mồi psbA3'f do Sang và cộng

sự thiết kế 1997 [57] và mồi trnH do Tate và cộng sự thiết kế năm 2003 [64] Cặp

mồi trnLF/trnFR nhân bản vùng trnL-trnF do Taberlet và cộng sự thiết kế năm

1991 [62] Cặp mồi matK được thiết kế dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen

matK của loài Bambusa chungii có mã HM448934 trên ngân hàng Genbank và cặp

mồi PIF5/PIF3 do Zhou và cộng sự công bố năm 2010 [68] Trình tự nucleotide, kích thước lý thuyết và nhiệt độ bắt mồi như trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Thông tin của bốn cặp mồi dùng trong nghiên cứu

Kích thước

lý thuyết (bp)

Nhiệt

độ bắt cặp (Tm)0C

Theo thiết kế của Taberlet

et al (1990) [62]

Mồi psbA3’f

theo thiết kế của Sang et

al (1997) [57]

Mồi trnH

theo thiết kế của Tate et al (2003) [64]

matK matK19F/

matKR

CGTTCTGACCATATTGCACTATG TACGAGCTAAAGTTCTAGC 1560 50

Thiết kế dựa trên trình tự của loài tre có

mã HM448934 trên ngân hàng Genbank

PIF PIF5/PIF3 GGGGCTTTGGATGGAACACA

ATGGCGAGGTTGAACAACTC

450 52

Theo thiết kế của Zhou at

al (2010) [68]

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN tổng số

ADN tổng số được tách chiết theo protocol CTAB của Doyle và Doyle

(1987) [34] có cải tiến phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm

Bảng 2.3 Pha đệm rửa (Washing buffer)

Bảng 2.4 Đệm tách chiết (Extration buffer)

Trong nghiên cứu này, chỉ thiết kế 01 cặp mồi để nhân bản vùng gen matK

Để thiết kế được cặp mồi có tính đặc hiệu cao và giảm thiểu khả năng bắt cặp không đặc hiệu Chúng tôi đã khai thác dữ liệu trong ngân hàng gen NCBI để tìm ra tất cả

các trình tự gen mã hoá cho matK đối với chi Bambusa Schreb Sau đó sử dụng phần mềm Bioedit để so sánh, vùng bảo thủ nhất được sử dụng Cặp mồi matK

được thiết kế dựa trên trình tự nucleotide đoạn gen matK của loài Bambusa chungii

có mã HM448934 trên ngân hàng Genbank Quá trình thiết kế được thực hiện trên

phần mềm ADNstar

2.3.3 Nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR

Mỗi phản ứng PCR có thể tích 25µl với các thành phần: 13 µl H2O deion; 2,5

µl buffer 10X; 1 µl MgCl2 25mM; 2,5 µl dNTPs 2,5mM; 1,25 µl mồi xuôi (10

pmol); 1,25 µl mồi ngược (10 pmol); 0,5 µl Taq polymerase (5U/µl); 3 µl ADN

(10-20ng) Phản ứng được thực hiện trên máy PCR model 9700 (GeneAmp PCR System 9700, Mỹ)

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm: 94  C trong 3 phút; tiếp sau là 35 chu kỳ nối tiếp nhau với các bước: 94  C trong 50 giây, 50 đến 55  C trong 55 giây,

72  C trong 45 giây; kết thúc phản ứng nhân gen ở 72  C trong 10 phút, giữ sản phẩm ở 4  C Sau khi kết thúc phản ứng, 5µ sản phẩm PCR mỗi ống sẽ được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,9% cùng với thang ADN chuẩn 1kb Gel agarose được nhuộm ethidium bromide 15 phút và quan sát dưới tia UV

2.3.5 Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR

Tinh sạch sản phẩm PCR là bước quan trọng để thực hiện phản ứng giải trình

tự Quá trình tinh sạch nhằm thu được sản phẩm đoạn gen mong muốn Sản phẩm PCR được tinh sạch theo bộ KIT QIAquick Gel Extraction của QIAGEN Kiểm tra sản phẩm thu được trên gel agarose 0,9%

2.3.6 Giải mã trình tự nucleotide các đoạn ADN

Trình tự nucleotide được xác định bằng kỹ thuật giải mã trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR theo hai chiều (mồi xuôi và mồi ngược) trên máy đọc trình tự ABI PRIMS® 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) tại phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen – Viện CNSH

2.3.7 Phân tích số liệu

Các trình tự gen thu được được chỉnh sửa và phân tích bằng phần mềm chuyên dụng MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) version 4.0 [49], Bioedit, Clustal X, ADNstar,…vv Trình tự ADN của 3 loài nghiên cứu được so sánh với các trình tự đã công bố trên Genbank tương ứng với 4 vùng gen nghiên cứu

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả tách chiết và làm sạch ADN tổng số từ các mẫu tre

Đã tách chiết và làm sạch ADN tổng số từ 19 mẫu lá của 3 loài tre Bụng phật, tre Đùi gà và tre Vàng sọc với chất lượng ADN cao (hình 3.1) đủ tiêu chuẩn

để thực hiện các bước tiếp theo Kết quả đo OD cho thấy chỉ số OD260/OD280 của các mẫu luôn nằm trong khoảng 1,8 đến 2 Điều đáng chú ý là trong quá trình tách chiết ADN từ các mẫu lá tre cần được nghiền mịn trong nitơ lỏng, ngoài chức năng làm dòn thành tế bào thì nhiệt độ thấp của nitơ lỏng còn kìm hãm hoạt động của các nuclease có trong tế bào Nuclease là các enzyme phân cắt ADN, sự hoạt động của nuclease có thể làm giảm chất lượng ADN với sự xuất hiện nhiều đoạn đứt gẫy Trong quy trình tách chiết ADN, cần làm sạch mẫu bằng việc bổ sung đệm rửa trước khi bổ sung đệm tách , bước này có thể loại bỏ phần lớn các chất bẩn có trong

tế bào Trong nghiên cứu này, để đảm bảo kết quả giải trình tự được chính xác chúng tôi tiến hành tinh sạch ADN tổng số bằng bộ KIT tinh sạch ADN (ADN Purification Kit)

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra ADN tổng số đại diện của một số mẫu tre trên gel

agarose 0,9% (Giếng 1 – 6: tre Bụng phật; giếng 7 - 9: tre Vàng sọc; giếng 10-15:

sản phẩm PCR đều có kích thước đúng như lý thuyết dự đoán, đủ tiêu chuẩn để tiếp tục thực hiện các bước tiếp theo

3.2.1 Kết quả nhân bản gen PIF

Trình tự ADN đích đã được nhân bản thành công với cặp mồi PIF5/PIF3 ở nhiệt độ gắn mồi là 52o

C cho 19 mẫu của ba loài tre Bụng phật (B vulgaris Schr.cv

Wamin McClure) tre Vàng sọc (Bambusa vulgaris Schr ex Wendland cv Vittata

McClure) và tre Đùi gà (B ventricosa McClure) Hình 3.2 là kết quả đại diện cho một số mẫu nghiên cứu của ba loài Bambusa, sản phẩm PCR có kích thước khoảng

450 bp (đúng như kích thước lý thuyết dự đoán) Chất lượng của sản phẩm PCR được thể hiện khi điện di trên gel agarose 0,9% chỉ có một băng duy nhất, sáng đậm, đủ tiêu chuẩn cho tách đoạn gen nhân để giải mã trình tự

Hình 3.2 Sản phẩm PCR đại diện của một số mẫu tre phân tích với cặp mồi

PIF5/PIF3 điện di trên gel agarose 0,9% (giếng 1: K3005/5; giếng 2: K3005/9; giếng 3: K3005/13; giếng 4: K3011/3; giếng 5: K3011/4; giếng 6: K3011/8; giếng 7: K3006/1; giếng 8: K3006/2; giếng 9: K3006/6; giếng 10: K3006/11; M: marker phân tử 1 kb)

3.2.2 Kết quả nhân bản gen psbA-trnH

Cặp mồi psbA3’f/trnH đã được sử dụng để nhân bản đoạn ADN ở ba loài tre

nghiên cứu Theo lý thuyết, cặp mồi này sẽ nhân được đoạn gen có kích thước khoảng 680 bp Kết quả cho thấy sản phẩm PCR trên gel agarose 0,9 % thu được có kích thước khoảng 680 bp, kết quả này phù hợp với kích thước lý thuyết, sản phẩm chỉ cho một băng đặc hiệu và không xuất hiện các băng phụ (hình 3.3), đủ tiêu chuẩn để tiếp tục tinh sạch và giải mã trình tự nucleotide

500 bp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M

250bp

Hình 3.3 Sản phẩm PCR đại diện của một số mẫu tre phân tích với cặp mồi

psbA3’f/trnH điện di trên gel agarose 0,9% (giếng 1: K3005/5; giếng 2: K3005/9;

giếng 3: K3005/13; giếng 4: K3011/3; giếng 5: K3011/4; giếng 6: K3011/8; giếng 7: K3006/1; giếng 8: K3006/2; giếng 9: K3006/6; giếng 10: K3006/11; M: marker phân tử 1 kb)

3.2.3 Kết quả nhân bản gen matK

Sử dụng cặp mồi matK19F/matKR do chúng tôi thiết kế đã nhân bản thành công gen matK cho ba loài nghiên cứu (hình 3.4) Gen matK có kích thước đẩy đủ

là 2450 bp, tuy nhiên trong nghiên cứu này cặp mồi được thiết kế cho nhân bản

đoạn ADN chỉ có kích thước 1560 bp và nằm gần đầu 3’ của gen Gen matK là một

gen chức năng do vậy thường không có các đột biến thêm bớt nucleotide xảy ra trên gen, nên kích thước giữa các loài cũng tương đối ổn định Sản phẩm PCR nhân bản

gen matK có kích thước đúng như kích thước lý thuyết dự đoán Kết quả nhân bản gen matK được thực hiện tốt nhất ở nhiệt độ gắn mồi là 500C

Hình 3.4 Sản phẩm PCR đại diện của một số mẫu tre phân tích với cặp mồi

matK19F/matKR điện di trên gel agarose 0,9% (giếng 1: K3005/5; giếng 2:

K3005/9; giếng 3: K3005/13; giếng 4: K3011/3; giếng 5: K3011/4; giếng 6:

K3011/8; giếng 7: K3006/1; giếng 8: K3006/2; giếng 9: K3006/6; giếng 10:

K3006/11; M: marker phân tử 1 kb)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M

0.75 kb 0.5 kb

3.2.4 Kết quả nhân bản gen trnL - trnF

Phản ứng nhân bản vùng gen trnL-trnF được thực hiện ở nhiệt độ tối ưu là

550C Kết quả cho thấy, đã nhân được 1 phân đoạn đặc hiệu đúng với kích thước dự đoán, đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu giải mã trình tự ADN

Hình 3.5 Sản phẩm PCR đại diện của một số mẫu tre phân tích với cặp mồi

trnL/trnF điện di trên gel agarose 0,9% (giếng 1: K3005/5; giếng 2: K3005/9; giếng

3: K3005/13; giếng 4: K3011/3; giếng 5: K3011/4; giếng 6: K3011/8; giếng 7: K3006/1; giếng 8: K3006/2; giếng 9: K3006/6; giếng 10: K3006/11; M: marker phân tử 1 kb)

3.3 Kết quả giải trình tự 4 vùng gen nghiên cứu

Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch sử dụng làm ADN khuôn cho phản ứng PCR đọc trình tự Quá trình xác định trình tự được thực hiện tại Viện CNSH trên máy ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) Phản ứng đọc trình tự được thực hiện theo hai chiều bằng phương pháp giải trình tự trực tiếp

3.3.1 Kết quả giải trình tự gen PIF

Kết quả xác định trình tự vùng gen PIF nhân cho ảnh điện di đồ với các đỉnh huỳnh quang rõ nét, cường độ mạnh và rõ ràng (kết quả không chỉ ra ở đây) Các trình tự thu được của 19 mẫu nghiên cứu được sắp xếp theo hàng (alignment) bởi phần mềm Bioedit (hình 3.6) Sau khi loại bỏ trình tự mồi và các nucleotide so le ở hai đầu, chúng tôi đã thu được trình tự nucleotide của cả ba loài nghiên cứu có độ dài là 444 nucleotide Kết quả thống kê ở hình 3.6 đã chỉ ra 7 vị trí (1, 22, 36, 291,

438, 441 và 444) đột biến thay thế hay mất đi nucleotide khi so sánh giữa ba loài nghiên cứu Tại vị trí nucleotide thứ 1, 36 và 291 khi so sánh giữa tre Bụng phật với

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 kb 0.5 kb

tre Vàng sọc và tre Đùi gà thì (TTT) được thay bằng (GCC), tương ứng So sánh trình tự nucleotide giữa tre Bụng phật và tre Vàng sọc với tre Đùi gà thì tại vị trí nucleotide thứ 22, 438 và 441 (ACT) được thay bằng (CTA), tương ứng Tại vị trí

444, tre Đùi gà đã không có nucleotide (A) Các vùng sai khác giữa các nucleotide khi so sánh ba loài nghiên cứu được thể hiện trên hình 3.6