tiểu luận sinh học chức năng thực vật- sự cố định đạm sinh học

Một trong những phương pháp tăng cường lượng đạm cho đất được nhiều người quan tâm là sử dụng các loại vi sinh vật cố định nitơ từ không khí.. Các vi sinh vật có khả năng biến N2 trong k

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÀI TI U LU N: SINH H C CH C N Ể Ậ Ọ Ứ ĂNG TH C V T Ự Ậ

MỤC LỤC

I Khái quát về cố định đạm sinh học

Cố định đạm sinh học là quá trình khử N2 thành NH3 dưới sự xúc tác của enzyme nitrogenase Sau đó, NH3 có thể kết hợp với các acid hữu cơ để tạo thành các acid amin và protein Vi khuẩn cố định đạm có thể cộng sinh hoặc sống tự do nhưng cũng

có thể nội sinh

• Đạm là gì?

Chất đạm (còn gọi là protein) là một chất hữu cơ giàu dinh dưỡng, có trong động vật, thực vật Đạm là chất căn bản của sự sống mọi tế bào Đạm là chất dinh dưỡng có vai trò quan trọng hàng đầu đối với cây trồng Hàm lượng của chúng trong đất rất ít Vì vậy cây trồng thường thiếu đạm Một trong những phương pháp tăng cường lượng đạm cho đất được nhiều người quan tâm là sử dụng các loại vi sinh vật cố định nitơ từ không khí

Nitơ là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng không chỉ với cây trồng mà ngay cả đối với

vi sinh vật Nguồn dự trữ nito trong tự nhiên rất lớn, chỉ tính riêng trong không khí nitơ chiếm khoảng 78,16% thể tích Người ta ước tính trong bầu không khí bao trùm lên một ha đất đai chứa khoảng 8 triệu tấn nitơ, lượng nitơ này có thể cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng hàng chục triệu năm nếu như cây trồng đồng hóa được chúng Trong cơ thể các loại sinh vật chứa khảong 4,1015 tỷ tấn nitơ Nhưng tất cả

Hình: Chu trình cố định N trong tự nhiên

nguồn nitơ trên cây trồng đều không tự đồng hóa được mà phải nhờ VSV Thông qua hoạt động của các loài vi sinh vật, nitơ nằm trong các dạng khác nhau được chuyển hóa thành dễ tiêu cho cây trồng sử dụng Các vi sinh vật có khả năng biến N2 trong khí quyển thành NH3 cung cấp đạm cho cây, chúng được gọi là các vi sinhvật cố định đạm

II Vi sinh vật cố định đạm

1 Vi sinh vật cố định đạm là gì?

Vi sinh vật cố định đạm là nhóm vi sinh vật có vai trò quan trọng nhất trong việc cố định N2 trong đất và trong cây trồng Đặc biệt là nhóm vi sinh vật sống cộng sinh Hiện nay, người ta đã phát hiện được hơn 600 loài cây có vi sinh vật sống cộng sinh

có khả năng đồng hóa N2 thuộc nhiều họ khác nhau

2 Vai trò của vi sinh vật cố định đạm:

Cố định đạm là khả năng đồng hóa nitơ phân tử của một số sinh vật và dùng nitơ này

để cấu tạo nên tất cả các hợp chất chứa nitrogen của tế bào Khả năng này có ở nhiều

vi sinh vật sống tự do trong đất và trong nước

Trong môi trường đất, vi sinh vật tham gia chuyển hóa các chất hữu cơ, cố định nitơ làm giàu đạm cho đất, tích lũy vào đất các auxin kích thích sự phát triển của cây trồng, tổng hợp các vitamin thyamin, nicotinic và biotin… Vi sinh vật cố định đạm góp phần vào cân bằng sinh thái trong đất

Phần lớn VSV (vi sinh vật) sống trong đất là những sinh vật có ích sống theo kiểu cộng sinh, chỉ một số rất ít là có hại, gây bệnh cho cây trồng sống theo kiểu vừa ký sinh (gây bệnh cho thực vật) vừa hoại sinh (sống trong đất) Số lượng quần thể VSV

có ích trong đất chiếm ưu thế hơn rất nhiều lần so với VSV gây bệnh hại Phần lớn các VSV có ích tham gia vào quá trình phân giải xác thực vật thành thức ăn có nguồn gốc hữu cơ cho cây trồng và VSV khác, chúng có vai trò rất quan trọng trong quá trình khoáng hóa và cố định đạm VSV còn tạo ra rất nhiều loại enzym, acid amin, vitamin, kháng sinh…là thức ăn và vũ khí tự vệ quan trọng cho cây trồng Ngoài ra khi các VSV đất chết đi sẽ để lại một lượng thức ăn khổng lồ và có chất lượng rất tốt cho cây trồng…

VSV có ích giữ vai trò quan trọng cải tạo đất, làm cho đất tăng độ mùn, tơi xốp, thoáng khí, có độ pH trung tính; làm cho khả năng giữ nước, giữ phân của đất được tăng cường… Nhờ có hoạt động của VSV làm cho đời sống của đất được tăng lên.VSV có ích đã giúp cho cây trồng hấp thụ dinh dưỡng được tốt hơn VSV đã góp phần bảo vệ cây trồng làm giảm tác hại của ký sinh gây bệnh cây Trong tập đoàn VSV có ích có một số lượng rất lớn VSV đối kháng ngăn chặn sự phát triển các VSV gây bệnh hại cho cây trồng rất hữu hiệu…

3 Phân loại

3.1. Vi khuẩn nốt sần:

Vai trò cố định N2 quan trọng nhất thuộc về nhóm vi sinh vật cộng sinh Ở một số cây

gỗ hoặc cây bụi nhiệt đới thuộc họ Rabiaceae, các nốt sần chứa vi khuẩn cố định N2 không phải ở rễ mà ở trên lá

Vi khuẩn nốt sần thuộc loại hiếu khí không tạo bào tử có thể đồng hóa nhiều nguồn cacbon khác nhau pH thích hợp: 6,5 – 9,2; nhiệt độ phát triển thích hợp: 24 – 260C Phân loại vi khuẩn nốt sần có nhiều ý kiến chưa thống nhất:

- Theo Todorovic chia vi khuẩn nốt sần ra 2 loài: Rhizibiomonas leguminosarum và Rhizobacterum leguminosrum

- Theo Bergli thì giống Rhizobiumbao gồm 6 loài vi khuẩn nốt sần: Rh.leguminosarum, Rh.phaseoli, Rh.Trifolii, Rh.lupini, Rh.sapnicum, Rh.meliloti

Hình: Sinorhizobium và nốt sần trên rễ

Hình: Rhizobium và nốt sần trên rễ

3.2.Vi khuẩn cộng sinh với cây không thuộc họ Đậu

Có khoảng vài trăm loài thực vật, không thuộc họ Đậu có nốt cố định đạm, nhưng sự cộng sinh ít khi được thực hiện với các Rhizobium, mà hường nhất là với các Actinomycetes (xạ khuẩn) thuộc giống Frankia Cây chủ là Alnus, Casuarine, Hippophae, Elaeagnus, Myrica…

Những nghiên cứu gần đây cố gắng tạo sự hợp tác giữa lúa với Spirillum Trong trường hợp này, vi khuẩn cố định không vào rễ, chỉ ở gần rễ, và phóng thích một lượng đạm quan trọng cho thực vật (NH4 , aminoacid)

Hình: Xạ khuẩn (Actinomycetes)

Hình: Bradyrhizobium và nốt sần trên rễ

Hình: Loài alnus glutinosa Hình:Casuarine

3.3.Vi khuẩn cố định đạm sống tự do

Vi khuẩn cố định đạm sống tự do ở vùng rễ lúa và những cây thuộc họ hòa bản đã giúp cây trồng phát triển tốt cũng như hạn chế đến mức thấp nhất lượng đạm hóa học trong nền sản xuất nông nghiệp

Hình Một số nguồn nitơ cung cấp cho cây

• Vi khuẩn hiếu khí sống tự do thuộc giống Azotobacter và Beiferinckia:

Azotobacter: Chi vi khuẩn cố định nitơ hiếu khí, sống tự do trong đất và nước Tế bào

hình bầu dục, hình cầu, được bọc trong lớp vỏ nhày, kích thước khoảng 2 × 5 µm, di

động hoặc không, gram âm, không sinh bào tử Khi dùng 1 g đường, thường cố định được 2 mg N Ngoài ra, còn có khả năng tổng hợp vitamin, chất sinh trưởng (loại auxin) và một số chất chống nấm Loại chế phẩm được dùng trong nông nghiệp có nhiều tên thương phẩm khác nhau (azotobacterin, vv.) Các loài Azotobacter thuộc loại các VSV cố định nitơ họat động nhất, chúng có khả năng đồng hóa manit, tinh bột, sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ khác nhau để phát triển và cố định nitơ, làm giàu nitơ cho đất Azotobacter chủ yếu có 4 loài:

- Azotobacter chroocuccum: Kích thước 3,1x2,0µ; khi còn non có khả năng di động,

khi già có sắc tố màu nâu đến màu đỏ, không khuyếch tán vào môi trường

- Azotobacter beijerincki: kích thước 3,1x2,0µ; không di động, khi già có sắc tố màu

vàng đến màu nâu sáng, không khuyếch tán vào môi trường

- Azotobacter Vinelandi: Kích thước 3,4x1,5µ; có khả năng di động, sắc tố màu vàng

lục đến huỳnh quang, khuyếch tán vào môi trường

- Azotobacter agilis: Kích thước 3,3x2,8µ; có khả năng di động, sắc tố màu lục, huỳnh

quang, khuyếch tán vào môi trường

Azotobacter làm tăng cường nguồn thức ăn cung cấp cho cây trồng, kích thích khả năng tăng trưởng, nâng cao tỷ lệ nảy mầm và độ phát triển của mầm (vì nó tiết ra môi trường thiamin, a.nicotinic, a.pantotenic, piridoxin, biotin, ) và có khả năng tiết ra một

số chất chống nấm

Chế phẩm Azotobacterin là dịch Azotobacter cho hấp thụ trong than bùn (hoặc các loại đất giàu hữu cơ đã trung hòa và bổ sung photpho, kali)

Beiferinckia: Là loài hiếu khí, cố định nitơ giống Azotobacter nhưng có khả năng

chịu chua cao hơn Gồm có 3 nhóm:

- B.Indica: Kích thước tế bào 0,5-1,5 x 1,7-3,0µ; có khả năng di động hoặc không di

động, khi già có sắc tố màu đỏ đến màu nâu, có tốc độ cố định nitơ nhanh

- B.fluminensis: Kích thước tế bào 1,1-1,5 x 3,0-3,5µ; có khả năng di động, sắc tố

màu nâu tối, tốc độ cố định nitơ chậm

- B.derxii: Kích thước tế bào 1,5-2,0 x 3,5-4,5µ; không di động, sắc tố màu lục huỳnh

quang

• Vi khuẩn kỵ khí sống tự do thuộc Clostridium:

Loài được nghiên cứu nhiều nhất là Clostridium pasteriaum, ngoài ra còn có các loài Clostridium khác như Cl.butylicum, Cl Bacterinkin, Cl Aceticum,

Kích thước tế bào 2,5-7,5 x 0,7-1,3µ có thể riêng rẽ hoặc xếp đôi hoặc thành chuỗi ngắn Có khả năng di động khi còn non, có khả năng tạo bào tử, bào tử có kích thước lớn hơn tế bào và có thể nằm ở đầu hoặc ở giữa tế bào Ít mẫn cảm với môi trường, nhất là môi trường thừa P, K, Ca và có tính ổn định với pH, nó có thể phát triển ở pH 4,5 – 9; độ ẩm 60-80%, nhiệt độ 25-300C

Hình: Vi khuẩn Clostridium pasteriaum

• Tảo lam sống tự do và tảo lam cộng sinh trong bèo hoa dâu:

Hình : Azotobacter Vinelandi

Là thành phần cố định N quan trọng trong thiên nhiên Có trong các ao, mặt nước ruộng lúa…Cần độ ẩm cao, ánh sáng, điều kiện nhiệt độ khoảng 30oC, pH tối hảo là từ 7-8.5.Ở ruộng chua, sự tăng trưởng của tảo lam bị hạn chế, trường hợp này bón vôi giúp tăng thêm lượng tảo và lượng N cố định được.

Hiện nay đã phát hiện nhiều loài tảo lam sống tự do trong đất và trong nước có khả năng cố định nitơ Có một số sống cộng sinh với thực vật, trong đó đáng chú ý nhất là tảo cộng sinh trong bèo hoa dâu (tảo này có tên là Asiabaena azollae) Đa số các loài tảo phát triển tốt trong môi trường trung tính hoặc kiềm, hiếu khí, thích hợp ở nhiệt độ 28-30oC, cần khí CO2

3.4 Vi khuẩn cố định nitơ sống hội sinh

Vi sinh vật được sử dụng trong sản xuất phân bón nhiều nhất hiện nay

là Azospirillum – sống hội sinh trong rễ cây hoà thảo, cây họ đậu, bông và rau Hai giống được biết đến nay là Azospirillum lipoferum và Azospirillum brasilense.

Hình: Azospirillum lipoferu Hình:Azospirillum brasilense

III Sự cố định đạm sinh học

Hình: Asiabaena azollae

1 Cơ chế cố định đạm

1.1 Enzyme nitrogenase

Quá trình cố định đạm xảy ra trong tế bào vi khuẩn và vi khuẩn lam đều giống nhau là nhở chúng có hệ thống gen nif (ni là chữ viết tắt của nitrogen- nitơ và f là fixing –cố định.) điều khiển quá trình tổng hợp Enzyme nitrogenase

Nitrogenase là một đa enzyme (phức hệ enzyme) xúc tác cho phản ứng cố định N2, khử N2 thành NH3

Như vậy, hệ thống gen nif được xem là hệ thống gen điều khiển cho quá trình cố định đạm sinh học

1.2 Bộ gen (genome) của Pseudomonas và sự điều khiển tổng hợp nitrogenase Genome và hệ thống gen nif của Pseudomonas

Thông tin di truyền chuyên biệt về sự cố định đạm đã được xác định trong bộ genome của Pseudomonas stutzeri A1501 Đó là “vùng cố định đạm” (nitrogen fixation region)

có kích thước 49kb, gồm 59 gen có liên quan

Thứ tự của các gen nif trong cấu trúc của “vùng cố định đạm” ở Pseudomonas stutzeri A1501 được khởi đầu là vùng PST1301, vùng giữa lần lượt bao gồm các gen nifQ – nifB – nifA – nifL - nifY2 – nifHDKTY – nifENX – nifUSV – nifWZM – nifF

và vùng PST1360 ở đầu còn lại

Sự điều khiển tổng hợp enzyme nitrogenase

Theo nghiên cứu của Yan et al (2008), hệ thống của gen nif ở Pseudomonas stutzeri A1501 là một hệ thống hoàn chỉnh gồm các loại gen nif quy định tổng hợp các thành phần cấu tạo nên phức nitrogenase

Hình 3.1 “Vùng cố định đạm” (nitrogen fixation region) của Pseudomonas stutzeri A1501 (Yan et al., 2008)

1.3 Cơ chế cố định đạm

Trong thành phần cấu tạo nitrogenase, số nguyên tử Fe và nguyên tử S có thể không

ổn định với acid Phân tử protein nhỏ hơn có chức năng vận chuyển e–, trong đó e– của ferredoxin hoặc flavodoxin vận chuyển lên phức hệ Mo-Fe

Hầu hết các vi sinh vật không thể sử dụng N2 nên chúng phải cố định nguồn N2 tự nhiên để dễ dàng sử dụng

• Cơ chế cố định đạm xảy ra theo phương trình:

N2 + 8H+ + 8e + 16ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi

Cơ chế hóa sinh của quá trình cố định N cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ hoàn toàn, nhưng đa số các nhà nghiên cứu đồng ý với giả thuyết cho rằng N là sản phẩm đồng hóa sơ cấp của N2 và có thể nêu ra 2 giả thuyết về 2 con đường cố định N của vi sinh vật sống tự do trong đất như sau:

Trong công nghiệp, nhờ các chất xúc tác nên năng lượng dùng cho phản ứng cố định N2 được giảm nhiều, chỉ vào khoảng 16-20 Kcalo/M, song lượng năng lượng vẫn còn lớn so với trong cơ thể sinh vật Tốc độ phản ứng nhanh chóng trong tế bào vi sinh vật

ở nhiệt độ thấp nhờ có hệ thống enzyme hydrogenase họat hóa H2 và enzyme nitrogenase hoạt hóa N2

Năm 1961-1962, người ta đã tách từ Clostridium pasteurrianum hai tiểu phần hoạt hóa H2 và N2 Sau này người ta tìm thấy ởAzotobacter cũng có các tiểu phần đó Trong quá trình hoạt hóa này có sự tham gia của 2 nguyên tố khoáng Mo và Fe.Nguồn hydro để khử N2 có thể là hydro phân tử (H2) Trong trường hợp này thì dưới tác dụng của enzyme hydrogenase, điện tử được chuyền theo hệ thống:

Nguồn cho điện tử và hydro là acid pyruvic Đáng chú ý là trong quá trình chuyền điện tử có sự tham gia tích cực của feredocine (Fd) Fd là cầu nối giữa 2 hệ enzyme hydrogenase và nitrogenase để cố định N2

Hình: Sơ đồ giả thuyết về các con đường của quá trình cố định N2

CƠ CHẾ CỐ ĐỊNH NITƠ TRONG NỐT SẦN CỦA RỄ CÂY HỌ ĐẬU:

Sự cố định N2 của vi khuẩn nốt sần có thể xãy ra theo sơ đồ phức tạp hơn Trong các nốt sần có một chất có bản chất hem rất giống với hemoglobin trong máu gọi là leghemoglobin Nó dễ dàng liên kết với O2 để biến thành oxyhemoglobin

Leghemoglobin chỉ được tạo nên khi vi khuẩn sống cộng sinh với cây bộ đậu, còn khi nuôi cấy tinh khiết các Rhizobium sẽ không tạo leghemoglobin và không cố định được N2

Những nghiên cứu gần đây về quá trình cố định N2 cho thấy quá trình cố định này đòi hỏi:

- Quá trình cố định nitơ được thực hiện bởi phức hệ nitrogenase Thành phần chính của phức hệ này là nitrogenase reductase và nitrogenase Phức hệ này nằm trong tế bào chất của thể vi khuẩn (bacteroid) Có thể coi đây là nhân tố chìa khóa cho quá trình này Enzyme này hoạt động trong điều kiện yếm khí (Nitrogenase đặc biệt nhạy với oxy và bị bất hoạt khi có mặt oxy)

- Có lực khử mạnh với thế năng khử cao (NAD, NADP, )

- Có năng lượng (ATP) đủ và có sự tham gia của nguyên tố vi lượng Nhóm hoạt động của enzyme nitrogenase có chứa Mo và Fe Vì vậy sử dụng Mo và Fe cho cây họ đậu

thường có hiệu quả rất cao Bacteroid cần năng lượng từ thực vật cung cấp để cố định đạm.

- Tiến hành trong điều kiện yếm khí

Các chất khử là NADH2 và Fd cùng với năng lượng do hô hấp, quang hợp của cây chủ cung cấp Sự cố định N2 cần rất nhiều năng lượng, cần 16 ATP để khử 1 N2.NH3 tạo thành trong quá trình cố định N2 được sử dụng dễ dàng vào quá trình amine hóa các cetoacid để tổng hợp một cách nhanh chóng các acid amine, từ đó tham gia vào tổng hợp protein và nhiều quá trình trao đổi chất khác

Quá trình cố định nitơ phân tử theo hai hướng cơ bản: Con đường khử và con đường oxy hóa

Con đường khử theo chuỗi biến hóa: N2  HN=NH H2N-NH2 NH3 NH4OHCon đường oxy hóa: N2  N2O  HNO2 NH4OH

Qua 2 hướng đó, người ta thu được kết quả sau:

- Nếu nồng độ Oxy nhiều sẽ ức chế quá trình cố định nitơ phân tử

- Hiệu suất cố định nitơ phân tử của những vi sinh vật kỵ khí thường cao hơn những vi sinh vật hiếu khí

- Tìm thấy hợp chất loại khử khi nuôi các vi sinh vật cố đinh nitơ phân tử

N2 + 8H+ + 8e- → 2NH3 + H2

16-24ADP + 16-24Pi 16-24ATP

Qua đó cho thấy con đường khử có nhiều khả năng xảy ra hơn

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định đạm

Sự tổng hợp enzyme nitrogenase được điều khiển bởi enzyme glutamate synthetase, xúc tác cho tổng hợp glutamin từ NH3 Nếu trong hệ thống có ít NH3 thì glutamate synthetase kích thích tổng hợp nitrogenase, nồng độ NH3 cao thì ức chế sự tổng hợp nitrogenase

Phức hệ enzyme nitrogenase không bền khi có mặt oxy Vi khuẩn tự do cố định đạm chỉ thể hiện hoạt tính ở điều kiện yếm khí nhờ sử dụng điện tử xuất hiện trong quá trình tổng hợp ATP để ngăn ngừa oxy xâm nhập

• Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình cố định đạm: