phát triển cây trồng chuyển gen ở việt nam

Lê Quỳnh Liên và Th.S Bùi Thị Hải Hà thuộc Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học tiến hành thực hiện các nội dung chuyển gen thuộc đ

HộI ĐồNG BIÊN TậP

Chủ tịch Hội đồng: GS.TSKH Đặng vũ minh

Phó Chủ tịch Hội đồng: GS.TSKH Nguyễn Khoa Sơn

pgs.tskh Nguyễn Tác An, pgs.ts Lê Trần Bình, pgs.tskh Nguyễn Văn C , gs.tskh Vũ Quang Côn, ts Mai H , gs.vs Nguyễn Văn Hiệu, gs.TSKH H Huy Khoái, gs.tskh Nguyễn Xuân Phúc, gs.ts Bùi Công Quế, gs.tskh Trần Văn Sung,pgs.ts Phạm Huy Tiến, gs.ts Trần Mạnh Tuấn, gs.tskh Nguyễn ái Việt

Viện Khoa học v Công nghệ Việt Nam l cơ quan nghiên cứu khoa học tự nhiên v công nghệ đa ng nh lớn nhất cả n'ớc, có thế mạnh trong nghiên cứu cơ bản, nghiên c u v phát triển công nghệ,

điều tra t i nguyên thiên nhiên v môi tr'ờng Việt Nam Viện tập trung một đội ngũ cán bộ nghiên cứu có trình độ cao, cơ sở vật chất

kỹ thuật hiện đại đáp ứng các yêu cầu về nghiên cứu v thực nghiệm của nhiều ng nh khoa học tự nhiên v công nghệ

Trong suốt 30 năm xây dựng v phát triển, nhiều công trình v kết quả nghiên cứu có giá trị của Viện đC ra đời phục vụ đắc lực cho

sự nghiệp xây dựng v bảo vệ Tổ quốc Để tổng hợp v giới thiệu có

hệ thống ở trình độ cao, các công trình v kết quả nghiên cứu tới bạn đọc trong n'ớc v quốc tế, Viện Khoa học v Công nghệ Việt Nam quyết định xuất bản bộ sách chuyên khảo Bộ sách tập trung

v o ba lĩnh vực sau:

Nghiên cứu cơ bản;

Phát triển v ứng dụng công nghệ cao;

T i nguyên thiên nhiên v môi tr'ờng Việt Nam

Tác giả của các chuyên khảo l những nh khoa học đầu ng nh của Viện hoặc các cộng tác viên đC từng hợp tác nghiên cứu

Viện Khoa học v Công nghệ Việt Nam xin trân trọng giới thiệu tới các quý độc giả bộ sách n y v hy vọng bộ sách chuyên khảo sẽ

l t i liệu tham khảo bổ ích, có giá trị phục vụ cho công tác nghiên cứu khoa học, ứng dụng công nghệ, đ o tạo đại học v sau đại học

Hội đồng Biên tập

Lời cảm ơn

Cuốn  sách  chuyên  khảo  này  là  tập  hợp  công  trình  nghiên cứu hơn 10 năm của nhiều đề tài đề tài và đề án. Tác giả xin đươc trân trọng cám ơn các cá nhân và tập thể khoa học sau đây:  

(1) PGS.TS. Lê Thị Muội, TS. Nguyễn Trung Nam, Th.S. Lâm  Đại  Nhân,  PGS.TS.  Nguyễn  Đức  Thành,  TS.  Trần Thanh  Thu,  ThS.  Phạm  Bích  Ngọc,  KS.  Bùi  Chi  Lăng,  TS. Nguyễn  Hữu  Cường,  TS.  Lê  Văn  Sơn,  TS.  Chu  Hoàng  Hà, 

TS.  Lê  Quỳnh  Liên  và  Th.S  Bùi  Thị  Hải  Hà  thuộc  Phòng Công  nghệ  tế  bào  thực  vật  và Phòng  Di  truyền  tế  bào  thực vật,  Viện  Công  nghệ  sinh  học  tiến  hành  thực  hiện  các  nội dung  chuyển  gen  thuộc  đề  tài  KHCN.02.01  thuộc  Chương trình  Công  nghệ  sinh  học  giai  đoạn  1996  –  2000,  nội  dung phân lập gen, chuyển gen và đánh giá cây trồng chuyển gen của  đề  tài  KC.04.13,  các  đề  tài  và  đề  án  hợp  tác  quốc  tế  về chuyển gen ở lúa, ở đu đủ. 

(2) GS. TS. Nguyễn Văn Uyển và cán bộ thuộc Viện Sinh học  nhiệt  đới,  TS.  Trần  Thị  Cúc  Hòa  và  cán  bộ  thuộc  Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long,  PGS.TS. Vũ Đức Quang và cán  bộ  thuộc  Viện  Di  truyền  Nông  nghiệp,  TS.  Lê  Quang Quyến  và  cán  bộ  thuộc  Viện  Nghiên  cứu  và  phát  triển  cây bông,  PGS. TS. Hồ Hữu Nhị và cán bộ thuộc Viện Khoa học 

Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam đã chủ trì và tham gia thực hiện  các  nội  dung  chuyển  gen  kháng  sâu  vào  cây  hông, 

chuyển  gen  cry  vào  cây  lúa  bằng  công  nghệ  chuyển  gen 

sạch,  chuyển  gen  giữ  hoa  lâu  tàn  vào  cây  hoa  cúc,  chuyển 

(3) Ban chủ nhiệm các chương trình Công nghệ sinh hoc 1996‐2000  (KHCN‐02),  chương  trình  Nghiên  cứu  và  phát triển công nghệ sinh học 2001‐2005 (KC04) của Bộ Khoa học 

và Công nghệ, Tổ chức quốc tế Dịch vụ tiếp nhận và chuyển giao  công  nghệ  sinh  học  nông  nghiệp  (ISAAA),  Chương trình  Hợp  tác  nghiên  cứu  cới  các  nước  đang  phát  triển  của  Liên  minh  Châu  Âu  (INCO‐DC)  và  Bộ  Đào  tạo  và  Nghiên cứu (BMBF) của Cộng hòa Liên bang Đức đã tài trợ cho các nghiên cứu phát triển cây trồng chuyển gen này. 

Lời mở đầu

Các kỹ thuật tạo giống truyền thống như lai tạo và chọn lọc nhân tạo đã được con người sử dụng hàng ngàn năm qua để tạo ra các cây trồng có đặc tính nông học thích hợp và riêng biệt Tuy nhiên, những kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian và có thể phải trải qua nhiều thế hệ mới có được những tính trạng mong muốn và loại bỏ những tính trạng không mong muốn Công nghệ sinh học (CNSH)

sử dụng kỹ thuật di truyền để biến đổi cây trồng bằng cách đưa trực tiếp những gen có giá trị vào bộ gen của cây nhận (kể cả gen của các loài vốn không có quan hệ họ hàng) và nhanh chóng tạo ra cây trồng biến đổi gen (GMC) mang những đặc tính mong muốn Hiện nay, CNSH hiện đại và các cây trồng biến đổi gen đang được ứng dụng rộng rãi và đã có những đóng góp đáng kể Theo thông báo tóm tắt của tổ chức Tổ chức Dịch vụ Quốc tế ứng dụng Công nghệ sinh học vào Nông nghiệp (International Service for the Acquisition of the AgriBiotech Applications, ISAAA) chỉ mới trong thời gian chưa đầy 10 năm, bắt đầu từ 1995 với 0,5 triệu ha cây trồng chuyển gen đầu tiên được gieo trồng, đến năm 2003 đã

có đến trên 67 triệu ha và cuối năm 2005 có tới gần 100 triệu ha cây chuyển gen được trồng trên qui mô toàn cầu Riêng trong giai đoạn 1986 -1997, trên toàn cầu có tới 25000 thử nghiệm trên đồng ruộng đối với các cây trồng biến đổi di truyền Trong đó, gần 3/4 các cuộc thử nghiệm được tiến hành tại Mỹ, tiếp đến là Canada, châu Âu, châu Mỹ la tinh và châu Á Các thử nghiệm này tập trung vào 10 loại tính trạng trên đối tượng là 60 loại cây trồng Đến nay phần lớn các quốc gia ở Đông Nam Á cũng đang nhập cuộc

Ở Việt Nam, lĩnh vực nghiên cứu tạo sinh vật GM đang được tiếp cận, đầu tư và triển khai nghiên cứu Nhiều gen quý có giá trị ứng dụng như năng suất, chất lượng, chống chịu được phân lập và nghiên cứu nhằm chuyển vào cây trồng Những vấn đề như: thiết

kế vector, hoàn thiện hệ thống tái sinh cây khởi đầu cho nghiên cứu chuyển gen cũng nhận được sự quan tâm của nhiều nhóm tác giả Một số công trình nghiên cứu chuyển gen chọn lọc và sàng lọc như gen kháng kanamycine, hygromycine, gen mã hóa β-glucuronidase (GUS) vào thuốc lá, lúa cũng được tiến hành nhằm

mục đích hoàn thiện các quy trình chuyển gen làm cơ sở cho các bước chuyển gen có giá trị vào các đối tượng cây trồng này v.v Các phương pháp chuyển gen khác nhau như dùng súng bắn gen,

chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã

được áp dụng thành công trên một loạt các đối tượng cây trồng quan trọng như: lúa, khoai lang, cà chua, thuốc lá v.v

Cụ thể là trong Chương trình CNSH giai đoạn 1996 - 2000, Viện Công nghệ sinh học đã thực hiện đề tài cấp Nhà nước có nội

dung về chuyển gen ở cây trồng trong đó gen Xa21 kháng bạc lá ở lúa và gen cry đã được chuyển thành công vào giống lúa C71

Trong khuôn khổ chương trình Nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học giai đoạn 2001 - 2005 Viện CNSH lại tiếp tục chủ

trì và thực hiện đề tài KC.04.13 với nội dung “Nghiên cứu áp dụng công nghệ gen để tạo cây chuyển gen nâng cao sức chống chịu sâu bệnh và ngoại cảnh bất lợi” Ngoài ra, trong khuôn khổ các đề án

hợp tác trong nước Viện Công nghệ sinh học đã tiến hành thực hiện với Viện Nghiên cứu và Phát triển cây Bông nội dung chuyển gen kháng sâu vào cây bông vải, với Viện Di truyền Nông nghiệp

về phân lập và chuyển gen kháng bọ hà vào cây khoai lang Cũng trong khuôn khổ hợp tác khoa học với nước ngoài Viện Công nghệ sinh học cùng Trường Đại học Tự do Brussel, Bỉ; Trường Đại học Tổng hợp Valencia, Tây Ban Nha và Viện CIRAD Monpellier, Pháp nghiên cứu chuyển gen chịu hạn vào cây lúa, với Viện Max Plank về Sinh lý thực vật phân tử Golm, Đức chuyển gen chất lượng vào lúa; hợp tác với các quốc gia ASEAN là Thái Lan, Indonesia, Malaysia và Philippin về chuyển gen kháng virus đốm vòng vào cây đu đủ v.v

Nhằm giới thiệu những kết quả ban đầu của quá trình nghiên cứu về lĩnh vực nêu trên, cuốn sách này được biên soạn như một tài liệu chuyên khảo dành cho cán bộ nghiên cứu, sinh viên và giảng viên, cán bộ quản lý và những người quan tâm đến lĩnh vực phát triển cây trồng chuyển gen ở Việt Nam

Ch vi t

t t

G c t ti ng Anh

Promotor

�o�n gen kh�i

��ng c�a virus gây b�nh

xúp lơ

Gen mã hoá protein tinh th� ��c t� di�t côn trùng c�a

vi khu�n

Bacillus thuringiensis

DNA Deoxyribonucleic

acid

Axit Deoxyribonucleic

GMC

Genetically Modified Crops (GMC)

Cây tr�ng bi�n

��i gen

Cây tr�ng ���c bi�n ��i di truy�n b�ng công ngh� sinh

tr�ng chuy�n gen

GML

Genetically Modified Living Organism (GML)

��ơng GMO GMO

Gentically Modified Organism (GMO)

Sinh v�t bi�n ��i gen

Sinh v�t chuy�n gen

GFP

Green Flourescent Protein

-D-galactoside

KDa Kilo dalton

MTA Materia Transfer

Agreement

chuy�n giao v�t li�u

NAA 1 Napthye Acetic

Acid NOS-P

Nopaline Synthase Promotor

nptII

Neomycine phosphotransfera

se II gene

Gen mã hoá neomycine phosphotransfe rase II

Chain Reaction

Ph�n �ng chu�i polymerase

các �o�n DNA RT-PCR

Reverse Transcriptase PCR

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis

�i�n di bi�n tính trên gel polyacrylamide

T-DNA

DNA=DNA chuy�n

Transfer-Ti-plasmid Tumor inducing

plasmitd

Plasmit gây kh�i u th�c v�t

VIP

Vegetative insecticidal protein

protein sinh d��ng di�t côn trùng

Protein ���c sinh ra trong pha phát tri�n sinh d��ng c�a

vi khu�n

Vùng gây ��c

có kh� n�ng t�o kh�i u X-gal

5-bromo-chloro- galactosidase X-gluc

3-indolyl-�-D- chloro-3-indolyl glucuronide

Khái ni�m liên quan ��n m�c

�� gây �nh h��ng c�a ��i t��ng t�i các h� sinh v�t và h� sinh thái

M c l c

LLLL I C M ƠN Error! Bookmark not defined.Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined

LLLL I M Đ U Error! Bookmark not defined.Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined G

GI I THÍCH VÀ T NG VÀ CH VI T T T Error! Bookmark not Error! Bookmark not defined.

defined

C

Chương 1g 1g 1.TTTT NG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN C U TRONG

NƯ C VÀ NGOÀI NƯ C Error! Bookmark not defined.Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined

1.1 Tình hình nghiên c u trong nư c Error! Bookmark not Error! Bookmark not defined.

Chương 2 Đ I TƯ NG VÀ PHƯƠNG PHÁP T O CÂY

TR NG CHUY N GEN Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined

2.1 L a ch n ñ i tư ng cây tr ng ñ chuy n gen Error! Error! BBBBookmark not defined ookmark not defined ookmark not defined

2.1.1 Các gi ng cây tr ng ñã dùng làm ñ i tư ng chuy n gen Error! Bookmark not defined.

2.1.2 Các lo i sinh ph m, v t tư và hóa ch t Error! Bookmark not defined.

2.2 Sưu t p gen t các ngu n khác nhau Error! Bookmark not Error! Bookmark not defined.

Bookmark not defined ark not defined ark not defined

2.4.1 Gen công c Error! Bookmark not defined.

2.4.2 Gen kháng b nh cây tr ng Error! Bookmark not defined.

2.4.3 Gen kháng côn trùng có h i Error! Bookmark not defined.

2.4.4 Gen b t d c ñ c Error! Bookmark not defined.

2.4.5 Gen ngư c ch ng chín nhũn và làm chín ch m Error! Bookmark not defined.

2.4.6 Gen ch ng ch u ñi u ki n sinh thái b t l i Error! Bookmark not defined.

2.4.7 Gen có giá tr y - dư c Error! Bookmark not defined.

2.4.8 Bi n ñ i gen nh m tăng cư ng s bi u hi n Error! Bookmark not defined.

2.5 Phương pháp bi n n p gen vào th c v t Error! Bookmark Error! Bookmark not defined.

not defined

2.5.1 Đi u ki n cho chuy n gen th c v tError! Bookmark not defined.

2.5.2 Các phương pháp bi n n p gen vào th c v t Error! Bookmark not defined.

2.5.3 M c ñích chuy n gen vào m t s cây tr ng nư c ta Error! Bookmark not defined.

2.6 Phương pháp phân tích th c v t mang gen bi n n p Error! Error! Bookmark not defined.

Bookmark not defined

2.6.1 Phương pháp phân tích tính kháng thu c Error! Bookmark not defined.

2.6.2 Phương pháp phân tích hóa t bào Error! Bookmark not defined.

2.6.3 Phương pháp phân tích b ng k! thu t sinh h c phân tử Error! Bookmark not defined.

2.6.4 Phương pháp phân tích ch c năng sinh h c c"a gen chuy n Error! Bookmark not defined.

2.7 Sơ b v ý nghĩa kinh t - xã h i c"a nh$ng nghiên c u v cây tr ng chuy n gen Error! Bookmark not Error! Bookmark not Error! Bookmark not defined defined defined Ch

Chương 3g 3 g 3 PH PHPHÂN L P GEN Error! Bookmark not defined.Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined

3.1 Phân l p gen vip Error! Bookmark not defined.Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined

3.1.1 Gi i thi u v gen vip Error! Bookmark not defined.

3.1.2 Phát hi n protein vip2, vip3 b ng lai mi%n d ch Error! Bookmark not defined.

3.1.3 K t qu tinh ch protein vip2 Error! Bookmark not defined.

3.1.4 Phân l p gen vip3 và thi t k vector chuy n gen Error! Bookmark not defined.

3.1.5 Xây d ng thư vi n genomic c"a Bt.AB51 di t u trùng

b hà Error! Bookmark not defined.

3.2 Phân l p gen Pi-1(t) và gen Pi-2(t) kháng b nh ñ o ôn Error! Error! Bookmark not defined.

Bookmark not defined

3.2.1.Căn c khoa h c và th c ti%n c"a vi c tìm ki m gen kháng b nh ñ o ôn Error! Bookmark not defined.

3.2.2 Phân l p gen Pi-2(t) Error! Bookmark not defined.

3.2.3 Phân l p gen Pi-1(t) kháng ñ o ôn Error! Bookmark not defined.

3.3 Phân l p gen t cây ñu ñ" Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 3.3.1 Nguyên li u thí nghi m Error! Bookmark not defined.

3.3.2 Phương pháp nghiên c u Error! Bookmark not defined.

3.3.3 Phân l p gen CP t PRSV Error! Bookmark not defined.

3.3.4 Thi t k vector chuy n gen mang gen CP c"a PRSV Error! Bookmark not defined.

3.3.5 Bi u hi n gen CP c"a PRSVN trong E.coli Error! Bookmark not defined.

Ch

Chương 4 HOÀN THI N CÁC QUI TRÌNH CHUY N GEN VÀO H

CÂY BÔNG V I Error! Bookmark not defined.Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined

4.1 Cơ s khoa h c và th c ti%n c"a vi c chuy n gen vào cây bông v i Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 4.2 Hoàn thi n h th ng nuôi c y mô và tái sinh cây bông

n vitro ph c v chuy n gen Error! Bookmark not defined.Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 4.2.1.Tái sinh cây bông b ng phương pháp t o ña ch iError! Bookmark not defined

4.2.2.Tái sinh cây bông qua phôi soma Error! Bookmark not defined

4.3 Xây d ng qui trình chuy n gen qua ng ph n b ng vi tiêm Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined.

4.3.1 Nguyên lý chung Error! Bookmark not defined

4.3.2 V t li u và phương pháp nghiên c u Error! Bookmark not defined

Chương 5 TTTTẠO CÂY ẠO CÂYẠO CÂY HÔNG CHUY N GEN KHÁNG SÂU Error! Error! Bookmark not defined.

Bookmark not defined

5.1 Cơ s khoa h c và th c ti%n c"a vi c chuy n gen vào cây

hông (Paulownia) Error! Bookmark not defined.Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 5.2 H th ng tái sinh cây hông Erro Erro Error! Bookmark not defined r! Bookmark not defined r! Bookmark not defined 5.2.1 Nguyên li u và phương pháp Error! Bookmark not defined.

5.2.2 Xây d ng h th ng tái sinh cây hông Error! Bookmark not defined.

5.2.3 Đánh giá kh năng tái sinh cây hông b ng ch t ch n

l c PPT Error! Bookmark not defined.

5.3 Hoàn thi n quy trình chuy n gen vào cây hông Error! Error! Bookmark not defined.

Bookmark not defined

5.3.1 Nguyên li u và phương pháp Error! Bookmark not defined.

5.3.2 K t qu chuy n gen cây hông Error! Bookmark not defined.

6.2.1.V t li u Error! Bookmark not defined.

6.2.2 Phương pháp nghiên c u Error! Bookmark not defined.

6.3 Chuy n gen vào cây hoa cúc Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 6.3.1 Hoàn thi n qui trình nuôi c y mô hoa cúc Error! Bookmark not defined.

6.3.2 Chuy n gen thông qua vi khu n A tumefaciens Error! Bookmark not defined.3

Ch

Chương 7.g 7 T O DÒNG LÚA INDICA CHUY N GEN Error! Error! Bookmark not defined.

Bookmark not defined

7.1 Căn c khoa h c và th c ti%n c"a vi c chuy n gen vào cây lúa Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 7.2 Hoàn thi n quy trình chuy n gen vào lúa và t o dòng lúa

bi n ñ i gen kháng r y nâu Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 7.2.1 N i dung nghiên c u Error! Bookmark not defined.

7.2.2 V t li u và phương pháp nghiên c u Error! Bookmark not defined.

7.2.3 K t qu th c hi n chuy n gen Error! Bookmark not defined.

7.3 Chuy n gen cryIA(b,c) kháng sâu và gen Xa21 kháng

b nh b c lá vào cây lúa thông qua A tumefaciens Error! Error! Bookmark not defined.

Bookmark not defined

7.3.1 T o dòng lúa bi n ñ i gen kháng sâu ñ c thân và

kháng b nh b c lá thông qua A tumefaciens và ch n

l c b ng Hyg Error! Bookmark not defined.

7.3.2 T o dòng lúa bi n ñ i gen kháng sâu ñ c thân qua trung gian A tumefaciens và ch n l c b ng mannose

Error! Bookmark not defined.

Chương 8.ng 8 CCHUY N GEN GEN GEN Ở C Ở CỞ CÂY ĐU Đ Error! Bookmark not Error! Bookmark not defined.

defined

8.1 Cơ s khoa h c và th c ti%n c"a vi c chuy n gen vào cây

ñu ñ" và b nh ñ m vòng Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 8.1.1 Cây ñu ñ" và b nh ñ m vòng Error! Bookmark not defined.

8.1.2 Gen kháng virus ñ m vòng PRSV Error! Bookmark not defined.

8.2 So sánh gen CP c"a các ch"ng PSRV Vi t Nam Error! Error! Bookmark not defined.

Bookmark not defined

8.2.1 K t qu phân tích trình t gen CP Vi t Nam Error! Bookmark not defined.

8.2.2 So sánh trình t gen CP c"a các ch"ng PSRV Error! Bookmark not defined.

8.2.3 Thi t k vector chuy n gen mang gen CP c"a PRSV

Vi t Nam Error! Bookmark not defined.

8.3 Gen ACO oxydase và tính tr ng chín ch m Error! Bookmark Error! Bookmark not defined.

not defined

8.4 Phân l p gen ACO t qu ñu ñ" Error! Bookmark not Error! Bookmark not defined.

defined

8.4.1 Nguyên li u Error! Bookmark not defined.

8.4.2 Phương pháp nghiên c u Error! Bookmark not defined.

8.4.3 K t qu phân l p gen ACO Error! Bookmark not defined.

8.5 Chuy n gen vào cây ñu ñ" Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 8.5.1 Xây d ng h th ng tái sinh cây t phôi soma Error! Bookmark not defined.

8.5.2 Chuy n gen vào cây ñu đủ Error! Bookmark not defined.

8.6 Th tính kháng virus trong nhà kính Error! Bookmark not Error! Bookmark not defined.

9.2.2 Phương pháp sinh hóa Error! Bookmark not defined.

9.2.3 Phương pháp sinh h c phân t Error! Bookmark not defined.39

9.3 Th nghi m cây chuy n gen trong nhà kínhError! Bookmark Error! Bookmark not defined.

defined.5

9.5 Giám ñ nh GMO ñ i v i g o thành ph m Error! Bookmark Error! Bookmark not defined.

not defined.7

Chương 10 ĐÁNH GIÁ AN TOÀN SINH H C CÂY Đ

CHUY N GEN Error! Bookmark not defined.Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined

10.1 Cơ s khoa h c, th c ti%n và xã h i h c c"a vi c ñánh giá an toàn sinh h c ñ i v i GMO Error! Bookmark not Error! Bookmark not defined.

10.2.2 Quy mô nhà kính Error! Bookmark not defined.0 10.2.3 Quy mô ñ ng ru ng Error! Bookmark not defined.

10.3 Các th nghi m ñ ng ru ng Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined.1 C

Chương 11 H I VÀ ĐÁP V CÂY TR NG VÀ TH C PH M H

CHUY N GEN Error! Bookmark not defined.Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined

11.1 Đ&t v n ñ Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 11.2 Có ph i cây chuy n gen ñang tr thành ch" ñ c"a nhi u cu c ñ i tho i? Erro Erro Error! Bookmark not defined r! Bookmark not defined r! Bookmark not defined 11.3 T i sao l i có kh i ni m k' nguyên m i c i ti n gi ng cây tr ng? Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 11.4 Bi n ñ i di truy n là gì? Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 11.5 Ý nghĩa c"a k! thu t di truy n? Error! Bookmark not Error! Bookmark not defined.

defined

11.6 Ích l i c"a công ngh DNA tái t h p là gì? Error! Error! Bookmark not defined.

Bookmark not defined

11.7 K! thu t di truy n chính xác như th nào? Error! Error! Bookmark not defined.

Bookmark not defined

11.8 Các gen m i ñư c ñưa vào và các s n ph m bi u hi n c"a chúng như th nào? Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 11.9 (nh hư ng ph c"a các s n ph m bi u hi n gen như

th nào? Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 11.10 S chèn gen ng)u nhiên gây nh hư ng gì? Error! Error! Bookmark not defined.

Bookmark not defined

11.11 S khác nhau gi$a k! thu t di truy n và ch n gi ng

th c v t? Error! B Error! B Error! Bookmark not defined ookmark not defined ookmark not defined 11.12 T i sao ph i t o cây chuy n gen? Error! Bookmark not Error! Bookmark not defined.

defined

11.13 Cây chuy n gen ñư c t o ra như th nào? Error! Error! Bookmark not defined.

Bookmark not defined

11.14 Li u cây chuy n gen có phù h p v i nh$ng qu c gia ñang phát tri n không? Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 11.15 Nh$ng qu c gia nào ñang phát tri n gi ng cây

tr ng chuy n gen? Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 11.16 Th nào là m t cây chuy n gen? Error! Bookmark not Error! Bookmark not defined.

Bookmark not defined

11.19 Công ngh DNA tái t h p có an toàn không? Error! Error! Bookmark not defined.

Bookmark not defined

11.20 Nh$ng nguy cơ ti m n c"a cây chuy n gen là gì? Error! Error! Bookm

Bookmark not defined ark not defined ark not defined

11.21 Nh$ng cây chuy n gen có tr thành c* d i hay không? Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 11.22 S phát tri n c"a cây chuy n gen có làm m t cân b ng sinh thái hay không ? Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 11.23 K! thu t di truy n v kháng sâu, b nh có d)n ñ n s phát tri n c"a các siêu sâu, b nh hay không ? Error! Error! Bookmark not defined.

Bookmark not defined

11.24 Nh$ng gen m i có ñư c chuy n vào c* hay không? Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 11.25 S phát tri n c"a cây tr ng kháng thu c tr c* có làm nông dân tăng cư ng s d ng thu c tr c* hay không? Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 11.26 K! thu t di truy n có lo i b* m t s cây bi n ñ i di truy n nào ñó hay không? Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 11.27 Th c v t c i bi n di truy n có k th a và bi u hi n n

ñ nh các gen m i hay không? Error! Bookmark not Error! Bookmark not defined.

defined

11.28 T i sao m t s cây bi n ñ i di truy n ñư c l y t

th trư ng? Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 11.29 Nh$ng gen kháng kháng sinh có gây h i hay không? Error! Bookmark Error! Bookmark Error! Bookmark not defined not defined not defined 11.30 S chuy n gen t ñ ng v t vào th c v t có an toàn hay không? Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 11.31 Th c ăn c i bi n di truy n có gây ñ c hay d ng? Error! Error! Bookmark not defined.

Bookmark not defined

11.32 Có ph i L-tryptophan áp d ng k! thu t di truy n ñã gây

m ho&c ch t hay không? Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined

11.33 S ki m soát th c ăn có ngu n g c t cây bi n ñ i di truy n Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 11.34 V n ñ dán nhãn th c ph m Error! Bookmark not Error! Bookmark not defined.

defined

11.35 S th ng nh t qu c t trong Ngành Nông nghi p và Công nghi p th c ph m ph c v m c ñích gì? Error! Error! Bookmark not defined.

Bookmark not defined

11.36 Th c ph m có ngu n g c t GMO có an toàn không? Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 11.37 GMO có gây nh hư ng lên môi trư ng không? Error! Error! Bookmark not defined.

Bookmark not defined

11.38 Kh năng lai chéo xa c"a các th c v t áp d ng k! thu t DNA tái t h p v i các loài lân c n? Error! Bookmark not Error! Bookmark not defined.

defined

11.39 Li u th c v t có kh năng kháng sâu b nh có làm cho sâu b nh tr thành "siêu sâu b nh" hay không? Error! Error! Bookmark not defined.

Bookmark not defined

11.40 Ngô Bt có gây h i v i u trùng bư m hay không? Error! Error! Bookmark not defined.

Bookmark not defined

11.41 Đánh giá v s nguy h i như th nào? Error! Bookmark Error! Bookmark not defined.

not defined

11.42 Nh$ng ng d ng ph bi n c"a công ngh DNA tái t

h p ngoài th c v t là gì ? Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined 11.43 Th c ăn có ngu n g c GMO có nên ñư c dán nhãn không? Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined

TTTTÀI LI U THAM KH O Error! Bookmark not defined.Error! Bookmark not defined Error! Bookmark not defined

Chương 1

TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ NGOÀI NƯỚC

1.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Lĩnh vực công nghệ sinh học đã có những đóng góp quan trọng góp phần nâng cao hiệu quả của sản xuất và đáp ứng nhu cầu của đời sống con người Chỉ tính riêng trong lĩnh vực nông nghiệp, nhiều giống cây trồng vật nuôi có giá trị đã được chọn tạo bằng con đường công nghệ sinh học Nhiều gen quý như: các gen quy định năng suất, chất lượng, chống chịu đã được phân lập và chuyển vào cây trồng vật nuôi tạo nên những giống lý tưởng

Sinh vật chuyển gen (GMO) cho năng suất cao, đem lại lợi ích cho người sản xuất là điều đã được khẳng định qua khoa học và thực tiễn Ở nước ta, trước năm 2001, các dự án nghiên cứu công nghệ sinh học quốc gia vẫn được hỗ trợ từ các Chính phủ và tổ chức quốc tế Từ năm 2001, Chính phủ đã đầu tư 3 dự án nghiên cứu về GMO Những dự án này liên quan đến nhiều cây trồng quan trọng của Việt Nam như: cây bông, hoa, cây có củ và cây rừng Tuy nhiên, trong lĩnh vực chuyển gen tạo các sinh vật biến đổi di truyền, Việt Nam vẫn còn xuất phát chậm hơn so với thế giới hàng chục năm Do điều kiện còn hạn chế nên các công trình nghiên cứu về chuyển gen còn ít

Một số phòng thí nghiệm đã và đang được nhà nước đầu tư bước đầu và có điều kiện gửi các cán bộ đi thực tập ở những phòng thí nghiệm tiên tiến của nước ngoài Do vậy, chúng ta đã làm chủ được các kỹ thuật cơ bản của công nghệ gen như phân lập và xác định trình tự gen, thiết kế và biến nạp gen vào tế bào vi sinh vật, động vật, thực vật, nghiên cứu biểu hiện gen v.v Hiện tại, một số công trình nghiên cứu là cơ sở để tạo GMO đang được triển khai

như nghiên cứu gen thủy phân và lên men tinh bột, gen hormon sinh trưởng ở cá, gen chịu hạn, lạnh ở lúa, gen mã hóa protein tinh

thể độc tố có hoạt tính diệt côn trùng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) và các gen có giá trị khác

Trong các lĩnh vực tạo GMO, nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng đang được tiếp cận, đầu tư và triển khai nghiên cứu, ứng dụng chủ yếu tại các phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ sinh học và Viện Sinh học Nhiệt đới (thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Nghiên cứu Lúa đồng bằng sông Cửu Long (thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) Một số công trình nghiên cứu chuyển gen chọn lọc như: gen kháng kanamycin, hygromycin v.v đã được tiến hành nhằm mục đích hoàn thiện các quy trình chuyển gen vào một số cây trồng quan trọng làm cơ sở cho các bước chuyển gen có giá trị vào các đối tượng cây trồng này Một số phòng thí nghiệm đã thu được thành công nhất định khi nghiên cứu tạo GMO Nhiều phưng pháp chuyển gen khác nhau đã được nghiên cứu và áp dụng thành công để đưa các gen có giá trị vào hàng loạt cây trồng quan trọng như lúa, thuốc lá, đu đủ, cà chua, khoai tây, cải bắp, v.v Năm

1994, Phan Tố Phượng & CS đã thành công trong việc sử dụng

phưng pháp gián tiếp thông qua vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens để chuyển gen vào cây Arabidopsis Vào năm 1998, cũng chính nhóm tác giả này đã công bố kết quả chuyển gen Xa21

vào giống lúa Việt Nam bằng phương pháp sử dụng súng bắn gen Tại Viện Di truyền Nông nghiệp, nhóm nghiên cứu của Đặng Trọng Lương đã tiến hành phân lập và thiết kế vector mang gen tổng hợp insulin để chuyển vào cây lúa mì; thiết kế vector và

chuyển gen cryIA(c) vào cây cải bắp Ngoài Đặng Trọng Lương &

CS, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Văn Uyển tại Viện Sinh học Nhiệt đới, Thành phố Hồ Chí Minh cũng đã tạo được các cây thuốc lá, đậu xanh, cải bông, cải xanh và cây cà tím bằng phương

pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn A tumefaciens chủng EHA105 Hầu hết các cây trồng biến đổi di truyền này mang gen bar, gen cryIA(c) và gen chỉ thị gusA Trên lĩnh vực này, Viện Công nghệ

sinh học nói riêng đã đào tạo được đội ngũ cán bộ có chuyên môn sâu, đồng thời thu thập và phân lập được hàng chục loại gen quý

có giá trị Viện cũng đã và đang tiến hành nghiên cứu các giống cây trồng chuyển gen Trong chương trình CNSH mang ký hiệu

KHCN-02 giai đoạn 1996 - 2000, Viện Công nghệ sinh học đã thực hiện đề tài liên quan đến công nghệ chuyển gen ở cây trồng,

trong đó gen Xa21 kháng bệnh bạc lá ở lúa do vi khuẩn gây ra và gen cry mã hóa protein tinh thể độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis đã được chuyển vào lúa Trước đó, Viện Công nghệ

sinh học cũng đã tiến hành các nghiên cứu phân lập gen chịu lạnh

ở cây lúa và tham gia thực hiện đề án INCO18 với Bỉ, Pháp, Tây Ban Nha và Trung Quốc về tăng cường tính chịu hạn và chịu mặn

ở cây lúa bằng công nghệ chuyển gen Cũng trong chương trình hợp tác quốc tế, được sự hỗ trợ của ISAAA, Viện đã và đang tiến hành nghiên cứu chuyển gen kháng virus đốm vòng vào cây đu đủ

và đã thu được các cây đu đủ chuyển gen trong nhà lưới Gần đây, Viện đang hợp tác với Viện Nghiên cứu vaf Phát triển cây Bông ở

Nha Hố để triển khai chuyển gen cry và gen chịu hạn tạo cây bông

kháng sâu và chịu hạn

Kết quả của những nghiên cứu trên là những cây chuyển gen đã

được tạo ra và lưu giữ trong điều kiện in vitro và trong điều kiện

nhà kính Tuy nhiên, tất cả các cây trồng chuyển gen được tạo ra ở Việt Nam mới chỉ tồn tại ở quy mô thí nghiệm và chờ thử nghiệm, trước khi quy chế cho việc tiến hành thử nghiệm các cây trồng này

ở ngoài đồng ruộng có hiệu lực

Việt Nam hiện nay và trong thời gian dài nữa đã và sẽ còn là một nước nhập khẩu các sản phẩm công nghệ sinh học hiện đại là chính Hiện nay chưa có cơ quan nào thống kê, đánh giá đầy đủ tình trạng các giống cây con thuộc GMO, số lượng vi sinh vật lạ, các sản phẩm của chúng được sử dụng trong nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, dược phẩm đã nhập vào Việt Nam Do chúng ta chưa có văn bản pháp lý để quản lý thống nhất trên cả nước nên các hoạt động nghiên cứu, ứng dụng, bảo quản, sản xuất, xuất nhập khẩu, vận chuyển GMO hoặc sản phẩm, phụ phẩm của chúng đang trôi nổi tự do, không thể quản lý hay kiểm soát được Mặc dù chúng ta chưa tạo ra được cây trồng chuyển gen ở quy mô thương mại và sản phẩm của GMO chưa nhiều nhưng ở nước ta hiện nay đang tồn tại một số cây trồng chuyển gen cũng như lưu hành trong thương trường một số sản phẩm biến đổi gen Trong số đó phải kể

đến cây bông chuyển gen cry được nhập không chính thức Ngoài

ra, một phần khá lớn lượng dầu đậu tương cũng như ngô trong thành phần thức ăn gia súc nhập vào Việt Nam đều chứa một tỷ lệ

sản phẩm biến đổi di truyền Năm 1995 - 1996 một số công ty chăn nuôi liên doanh đã nhập hàng chục ngàn tấn ngô từ Mỹ Không ai có thể trả lời ngô đó là GMO hay không và cũng có nhiều thức ăn chín được nhập từ nước ngoài như: thịt, trứng, sữa v.v cũng có thể là sản phẩm của cơ thể sống biến đổi gen (LMO) (Tạp chí Hoạt động Khoa học số 10/2000) Hiện nay, Quỹ Rockerfeller đang tài trợ cho Việt Nam (và các nước châu Á khác) tiếp nhận cây lúa vàng (Golden Rice) giàu tiền vitamin A (β-caroten) tạo được nhờ chuyển gen tổng hợp caroten từ cây hoa thủy tiên vàng vào cây lúa Về vấn đề chuyển gen đối với vật nuôi, hiện tại, Viện Công nghệ sinh học đang triển khai và tạo được giống cá chép trắng và cá bống mang gen sản xuất ra hoormon sinh trưởng tái tổ hợp ở quy mô phòng thí nghiệm

Nhiều hội thảo liên quan đến GMO đã được tổ chức ở Việt Nam, hội thảo đã thống nhất một số điểm chính: CNSH nói chung

và công nghệ gen nói riêng đã đạt được nhiều thành tựu to lớn trong giải quyết một số vấn đề lương thực, thực phẩm và dược phẩm mà các công nghệ thông thường không thể đạt được Tuy nhiên, việc áp dụng công nghệ gen tại Việt Nam cần có chọn lọc và thận trọng Các vấn đề liên quan đến rủi ro cần được nghiên cứu và cần sớm có văn bản pháp quy về an toàn sinh học (ATSH) Công bố thông tin cần hết sức thận trọng vì đây là vấn đề nhạy cảm, có liên quan đến lợi ích quốc gia Cần tuyên truyền rộng rãi cho công chúng

am hiểu về GMO Đề nghị chính phủ đặc biệt quan tâm và có chính sách ưu tiên phát triển nghiên cứu công nghệ gen

Kết quả nổi bật là ngày 19 tháng 1 năm 2004 Việt Nam đã chính thức phê chuẩn việc tham gia Nghị định thư Cartagena về an toàn sinh học và ngày 26 tháng 8 năm 2005 Qui chế quản lý an toàn sinh học đối với các sinh vật biến đổi gen; sản phẩm, hàng hóa có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen đã được Thủ tướng Chính phủ ban hành kèm theo quyết định số 212/2005/QĐ-TTg Gần đây, Thủ tướng Chính phủ đã ban hành thêm quyết định số 79/2007/QĐ-TTg về việc phê duyệt “Kế hoạch hành động quốc gia về Đa dạng sinh học đến năm 2010 và định hướng đến năm

2020 thực hiện Công ước Đa dạng sinh học và Nghị định thư Catagena về An toàn sinh học”

Trong giai đoạn từ 2001 đến nay (2007) nhiều đề tài nghiên cứu

về cây trồng chuyển gen được triển khai, trong đó đáng chú ý là

kết quả của đề tài KC04.13 về chuyển gen chủ yếu ở các cây trồng

“không làm thực phẩm” và đề tài KC04-22 về chuyển gen ở cây có

củ Hiện tại, hướng phát triển cây trồng chuyển gen đang được tập trung mạnh vào các đối tượng là cây lâm nghiệp như thông, bạch đàn, keo và cây công nghiệp như bông và mía

1.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Năm 1984, trên thế giới đã có một số nghiên cứu thành công khi chuyển gen vào cây trồng Đến nay, vấn đề cải biến giống cây trồng đã phát triển vượt bậc Theo thông báo tóm tắt của tổ chức ISAAA trong giai đoạn 1986 -1997, trên toàn cầu có tới 25.000 thử nghiệm trên đồng ruộng đối với các cây trồng biến đổi di truyền Trong đó, 72% các cuộc thử nghiệm được tiến hành tại

Mỹ, tiếp đến là Canada, châu Âu, châu Mỹ la tinh và châu Á Các thử nghiệm này tập trung vào 10 loại tính trạng trên đối tượng là

60 loại cây trồng

Năm 2003, diện tích trồng cây chuyển gen tiếp tục tăng với tỉ lệ hơn 15% so với năm 2002 Theo đánh giá, diện tích trồng cây chuyển gen toàn cầu năm 2003 là 67,7 triệu ha tăng 40 lần so với năm 1996 là 1,7 triệu ha, thu hút khoảng 7 triệu nông dân ở 18 nước tham gia Có 5 quốc gia chính trồng cây chuyển gen là Mỹ (48,2 triệu ha), Argentina (13,9 triệu ha), Canada (4,4 triệu ha), Braxin (3 triệu ha) và Trung Quốc (2,8 triệu ha) Trong đó, Braxin

là nước lần đầu tiên tham gia trồng thử nghiệm và thương mại hóa cây chuyển gen trên diện tích 3 triệu hecta đứng hàng thứ 4 trên thế giới

Nhìn chung hiện nay, thương mại hóa các sinh vật GM trong nông nghiệp tập trung chủ yếu vào các giống khác nhau của các cây trồng chính là đậu tương (36,5 triệu ha), ngô (12,4), bông (6,8)

và cải dầu (3) Trong đó, hai tính trạng được tập trung chuyển gen nhiều nhất là kháng thuốc diệt cỏ và kháng côn trùng Vào năm

2003, diện tích trồng cây chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ là 44,2 triệu hecta (73%) chủ yếu là cây ngô, đậu tương, bông và 12,2 triệu hecta (18%) trồng cây chuyển gen kháng sâu, tăng 2,1 triệu hecta so với năm 2002 tập trung chủ yếu vào hai loại cây trồng là

bông và ngô Bt Ngoài ra, một số thử nghiệm nhỏ trồng cây đu đủ,

bí, khoai tây chuyển gen kháng virus, gen chín chậm và một số tính trạng khác Hiện nay, trừ những giống cây công nghiệp như

bông vải, các giống cây lương thực kia đều có mặt trong tất cả các loại thực phẩm cho con người và thức ăn dùng cho chăn nuôi Các sản phẩm GM này đã được phân phối khắp nơi, không những có mặt ở châu Mỹ, châu Úc Châu Âu mà còn ở các nước thứ ba thông qua hình thức viện trợ

Trên qui mô toàn cầu có hai xu thế đối nghịch nhau trong quan điểm phát triển cây trồng chuyển gen: (1) Xu thế ủng hộ, coi rằng việc phát triển cây trồng biến đổi gen là một thành tựu to lớn của thời đại CNSH và việc sử dụng sản phẩm của cây trồng biến đổi gen là cứu cánh cho nhân loại trước nạn thiếu lương thực và nạn sử dụng tràn lan phân bón thuốc trừ sâu hóa học Đại diện cho xu thế ủng hộ này có các quốc gia như: Hoa Kỳ, Canada, Australia, Argentina, Braxin, Trung Quốc, Ấn Độ (2) Xu thế không ủng hộ cho rằng cây trồng biến đổi gen tiềm ẩn những nguy hại đến hệ sinh thái, đến sức khỏe con người và động vật và làm giảm mức độ

đa dạng sinh học của giống cây trồng Đại diện cho quan điểm này

là những tổ chức chính trị nhân danh bảo vệ môi trường, bảo vệ tôn giáo và được khá nhiều chính phủ của các nước châu Âu chấp nhận như một lực lượng chính trị xã hội, tác động kìm hãm không nhỏ đến sự phát triển của lĩnh vực công nghệ cây trồng biến đổi gen Chương 3 cuốn sách sẽ đề cập thêm đến vấn đề này một cách chi tiết hơn

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TẠO CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN

2.1 Lựa chọn đối tượng cây trồng để chuyển gen

Trên thế giới người ta tập trung chọn những đối tượng có tính khả thi cao để tiến hành tạo cây trồng chuyển gen theo những tiêu chí

sau: (i) Có khả năng thích ứng và thành công cao trong nuôi cấy in vitro; (ii) có gen đáp ứng nhu cầu của thực tiễn như tạo tính kháng

bệnh virus, kháng chất diệt cỏ, kháng côn trùng, tăng chất lượng dinh dưỡng của hạt v.v.; (iii) Có giá trị thương mại cao, nghĩa là có thị trường tiêu thụ trong nước và xuất khẩu ra nước ngoài; và (iv)

Có khả năng bảo vệ quyền sở hữu trí tuệ khi đưa ra thị trường (như giống ngô lai, giống bông lai v.v.)

Ở Việt Nam, nền nông nghiệp đang phụ thuộc vào thị trường nông sản quốc tế, chủ yếu là thị trường châu Âu, vì thế việc lựa chọn đối tượng triển khai công nghệ chuyển gen đòi hỏi những yêu cầu khác: (i) Đối với những cây trồng qui mô nhỏ, chưa xuất khẩu như khoai lang, đu đủ v.v có thể hợp tác với các tổ chức nước ngoài để tiếp nhận chuyển giao công nghệ, rút ngắn thời gian từ nghiên cứu đến triển khai; (ii) Đối với những cây trồng quan trọng

có giá trị kinh tế cao thì ưu tiên nhóm cây trồng “không làm thực phẩm - non - food crops) như: cây bông vải, cây hoa cảnh, cây lâm nghiệp v.v.; (iii) Đối với cây lương thực thực phẩm cần có sự ưu tiên cho các gen tăng cường chất lượng, các công nghệ chuyển gen sạch, nghĩa là thận trọng trong việc sử dụng các loại gen kháng kháng sinh v.v

Nội dung cuốn sách này sẽ đề cập đến sự chọn lựa thích hợp với hoàn cảnh kinh tế thương mại của đất nước ta trong giai đoạn hiện nay, đồng thời cũng lưu ý đến khả năng chuyển giao công nghệ từ

các tổ chức khoa học công nghệ và doanh nghiệp của các nước phát triển

2.1.1 Các giống cây trồng đã dùng làm đối tượng chuyển gen

Các giống cây trồng thuộc các nhóm cây không làm lương thực như bông vải được dùng là các giống trong tập đoàn giống, các giống đang dùng trong sản xuất đại trà (TM1, VN36P, 254 SB1, C118, LRA, SSR, Cooker) và các dòng bông chuyển gen kháng sâu

cryIA(c) được sử dụng để xây dựng phương pháp đánh giá cây

chuyển gen do Viện Nghiên cứu và Phát triển cây Bông Nha Hố, Ninh Thuận cung cấp

Cây trồng rừng: chỉ có cây hông được chọn vì đây là loài cây

mọc nhanh, có chất lượng gỗ tốt, nhưng lại dễ bị sâu ăn lá phá

hoại, cụ thể là giống cây gỗ Hông (Paulownia)

Cây cảnh: chỉ chọn đối tượng là hoa cúc được nuôi cấy trong điều kiện in vitro

Cây lương thực: lấy đối tượng là các giống lúa thuộc loài phụ indica (IR64, KDML105, C71) và được sử dụng chuyển gen bằng máy bắn gen và thông qua Agrobacterium v.v và các dòng lúa chuyển gen OAT, P5CS, TPS, nhaA giống Taipei 309 để thử tính

kháng sâu đục thân

Đu đủ là các giống đang được trồng phổ biến, chủ yếu là các giống thuộc giống polo quả to, ruột vàng

2.1.2 Các loại sinh phẩm, vật tư và hóa chất

Bộ sưu tập các gen và các chủng Agrobacterium được sử dụng cho

thí nghiệm chuyển gen vào cây trồng có nguồn gốc từ các tổ chức khoa học công nghệ quốc tế được chuyển giao cho Viện Công

nghệ sinh học thông qua Thỏa thuận chuyển giao nguyên vật liệu

(Materia Transfer Agreement - MTA)

Chủng Bt AB51 có tính kháng sâu non bọ hà đã được Phòng

Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học sàng lọc

Các kháng thể kháng protein Cry, Vip2,3: Có nguồn gốc từ

ICGEB, New Dehli và do Viện Công nghệ sinh học sản xuất Các primer được tổng hợp dựa trên trình tự các gen nghiên cứu

Tiến hành phân lập và thiết kế các gen có ích từ nguồn trong và ngoài nước để thực hiện việc chuyển các gen trên vào một số giống cây trồng như cây bông vải, cây hoa cúc, cây trồng rừng như

Paulownia (cây hông) và cây lương thực như cây lúa nhằm nâng

cao tính chống chịu đối với sâu, bệnh (nấm, vi khuẩn và virus) hoặc ngoại cảnh bất lợi (hạn và mặn) và nâng cao chất lượng sản phẩm, cây đu đủ kháng virus đốm vòng

2.2 Sưu tập gen từ các nguồn khác nhau

Thông qua các tổ chức phi chính phủ, các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam, từng bước tiếp cận, ký các thỏa thuận được phép sử dụng bản quyền thông qua ký Văn bản chuyển giao Vật liệu

về công nghệ và gen với CAMBIA (Australia), Mosanto (Mỹ), Syngenta (Thụy Sĩ), Zeneca (Anh), Đại học Ottawa (Canada), Viện Max Planck (CHLB Đức) Trong khuôn khổ nghiên cứu, các đề tài Viện Công nghệ sinh học đã sưu tập được các gen có chức năng khác nhau từ nhiều nguồn khác nhau như trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Danh sách các nhóm gen thu thập từ các nguồn gốc khác nhau Nhóm gen Chức năng sinh học Nguồn gốc

cryIA(a), cryIA(b),

cryIA(c) và cryIA(d) Protein độc tố diệt sâu Đại học Ottawa (Canada)

ACO antisense Ức chế tạo ethylen làm

chín chậm MARDI (Malaysia)

Xa21 Kháng bạc lá vi khuẩn UC Davis (Mỹ)

Chitinase Kháng bệnh nấm NFRI Tsukuba (Nhật Bản)

P5CS, OAT, TPS,

nhaA, HAL

Chống chịu mặn và hạn

Đại học Tự do Brussel (Bỉ) Đại học Tổng hợp Valencia, (Tây Ban Nha)

CgS, SAT

Tăng hàm lượng amino axít chứa lưu

2.3 Phân lập gen

2.3.1 Giới thiệu chung

Có nhiều phương pháp phân lập gen được trình bày trong các báo cáo khoa học cụ thể Mọi phương pháp phân lập gen đều có mục tiêu là có được phân tử DNA mã hóa cho protein mang trọn vẹn tính trạng đang quan tâm và có thể sử dụng được vào việc chuyển gen để cải tạo giống cây trồng Trước đây phần nhiều các phòng thí nghiệm đều bắt đầu bằng việc phân lập protein với chức năng sinh học nhất định, sau đó xác định trình tự amino axít, rồi suy ra trình tự nucleotide của gen Trên cơ sở đó người ta tổng hợp một đoạn DNA ngắn làm mồi và dùng kỹ thuật lai phân tử để tìm ra đoạn gen từ genom của đối tượng sinh vật quan tâm

Trong những năm gần đây các kỹ thuật của phòng thí nghiệm

về sinh học phân tử đã được phát triển một cách nhanh chóng và thuận tiện, đặc biệt là từ khi các bộ gen dược giải mã hoàn chỉnh

và ngành genom học ra đời thì phương pháp phân lập gen có những bước tiến mang tính đột phá với những lĩnh vực như genom chức năng (functional genomics); lập phổ biểu hiện gen (expression profiling) v.v Dựa trên cơ sở khoa học và nguyên lý hoạt động có thể phân chia các phương pháp phân lập gen thành 3 nhóm chính như sau:

2.3.2 Phân lập gen thông qua nhân bản DNA bằng PCR

Đây là phương pháp mới ra đời nhờ hai dữ kiện tiên quyết là: (1) Các Ngân hàng dữ liệu gen trên mạng được công bố mà bất kỳ người nghiên cứu nào cũng có thể truy cập tìm kiếm thông tin về gen được; (2) Phương pháp này cũng chỉ mới được thực hiện từ khi

kỹ thuật PCR trở thành thông dụng cho mọi phòng thí nghiệm sinh học phân tử

Có thể tóm tắt cách thức phân lập gen bằng PCR như sau:

(i) Tìm kiếm thông tin về trình tự nucleotide của gen quan tâm trên các Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế như: Ngân hàng EMBL – http://ww.ebi.ac.uk/embl; World Gen Bank -

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ hay DNA Data Bank of Japan (DDJB)- http://www.ddbj.nig.ac.jp

(ii) Khi có thông tin về trình tự nucleotide của gen quan tâm thì dùng phần mềm chuyên dụng để thiết kế các cặp mồi cần thiết cho viêc nhân bản gen đó Tiến hành đặt mua hay tổng hợp mồi

(iii) Tách chiết DNA tổng số từ đối tượng cần nghiên cứu, trong trường hợp khẳng định được trạng thái biểu hiện của gen quan tâm thì

có thể tách mRNA rồi tổng hợp thành cDNA để làm khuôn cho PCR (iv) Tiến hành PCR với mồi thu được ở bước (ii) DNA khuôn ở bước (iii) Khẳng định độ dài của sản phẩm PCR thông qua điện di trên gel Agarose có chuẩn phân tử

(v) Dòng hóa sản phẩm PCR vào vector thích hợp như pCR2.1 TOPO hoặc bất kỳ plasmid tương thích khác

(vi) Đọc trình tự đoạn gen nhân được, so sánh với số liệu của Ngân hàng tìm kiếm được để khẳng định mức độ giống nhau và khác nhau của gen cần phân lập

Nhìn chung, phương pháp phân lập gen bằng PCR đơn giản, có thể tiến hành ở hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử trang bị tối thiểu Kết quả phân lập tuy chưa phải là mới, nhưng là sự bổ sung rất quan trọng cho Ngân hàng gen và điều thiết yếu nhất là người nghiên cứu có được đoạn gen cần thiết cho công việc tiếp theo

2.3.3 Phân lập gen thông qua sàng lọc Thư viện cDNA hay phân tích transcriptomic

Vào thời điểm chưa có kỹ thuật phân tích toàn bộ sản phẩm phiên

mã gen – Transcriptomics, các nhà nghiên cứu phải sử dụng kỹ thuật sàng lọc Thư viện cDNA (Screening cDNA library) là tiền thân của phương pháp phân tích transcriptomic Nguyên lý của phương pháp sàng lọc thư viện phân tử cDNA là những gen chịu trách nhiệm cho một tính trạng nhất định sẽ hoạt động trong điều kiện nhất định thông qua quá trình phiên mã và dịch mã Sản phẩm phiên mã là những phân tử mRNA, nếu như sàng lọc và định lượng được chúng thì có xác định được chức năng gen Đây cũng

là một trong hai nguyên lý cơ bản của lĩnh vực nghiên cứu Genom

học chức năng (Functional Genomics) Dù kích thước genom của

các sinh vật rất khác nhau, khoảng 4.000 gen ở Bacillus và 40.000

ở con người thì cũng chỉ có khoảng 200-6.000 gen ở trạng thái hoạt động Như vậy, thay vì sàng lọc 40.000 gen người ta chỉ cần sàng lọc tối đa từ 6.000 phân tử mRNA dưới dạng cDNA sẽ phát

hiện được chức năng của những gen đang hoạt động Các bước tiến hành được trình bày tóm tắt như sau:

(i) Chọn hay xử lý sinh vật thí nghiệm ở điều kiện sinh trưởng phát triển, bệnh lý, stress đang quan tâm Luôn có đối chứng là không xử lý hoặc không phản ứng; (ii) Tách chiết mRNA tổng số; (iii) Tổng hợp cDNA từ mRNA bằng bộ kit dùng Reverse Transcriptase (RT); (iv) Đến bước này nếu theo cách sàng lọc thư viện cDNA thì thực hiện bước (v) còn nếu có điều kiện thực hiện

kỹ thuật microarray thì thực hiện bước (viii); (v) Dòng hóa cDNA thành thư viện cDNA bằng plasmid thích hợp; (vi) Dùng phương pháp lai phân biệt với mồi là toàn bộ mẫu mRNA đối chứng sẽ thu được những dòng không lai, tức là những dòng mới xuất hiện khi

xử lý; (vii) Đọc trình tự nucleotide các dòng này và kiểm tra chức năng để tìm ra gen; (viii) Microarray do các công ty chuyên sản xuất (ví dụ như: Affymetrix, Aligent Technologies, Amersham Biosciences, Axon Instruments, BioDiscovery, Clontech, Genomic Solutions, Mergen, Motorola Life Sciences, Nanogen, Partek, Perkin Elmer, Rosetta Inpharmatics, Spotfire, Virtek Vision International v.v.) với qui mô từ 1-2.000 gen đến 30.000 gen giúp ta phân biệt được những gen đang hoạt động thông qua lai toàn bộ mRNA với array Máy đọc (Microarray Scaner) cùng phần mềm chuyên dụng sẽ xác định những gen cần tìm đang hoạt động (Hình 2.1)

2.3.4 Phân lập gen thông qua phân tích proteomic

Một trong những lĩnh vực công nghệ sinh học thời kỳ sau genomic

là lĩnh vực proteomic Ngành proteom học nghiên cứu cấu trúc và chức năng của toàn bộ hệ protein có trong tế bào, mô hay cả cơ thể sinh vật trong những trạng thái phát triển hay điều kiện môi trường nhất định Hai tiền đề quan trọng quyết định việc phát triển proteom học là: (1) Trình tự nucleotide toàn bộ genom của nhiều nhóm đối tượng nghiên cứu (trên 100 loài) đã được hoàn tất và (2)

Có tổ hợp thiết bị phân tích gồm: thiết bị Sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatographer-LC), hoặc cao hơn là Sắc ký lỏng Nano (Nano LC) kết nối với khổi phổ MS (Mass Spectrometer) hoạt động theo nguyên lý TOF (Time-of-Flight Mass Analyser) đẩy và tách các phân đoạn chất phân tích qua vi cột capillary Toàn bộ thiết bị tùy theo cấu hình mà được gọi tắt là MALDI/MS/TOF hay Nano-LC/MS/MS/TOF

Hình 2.1: Minh họa hoạt động của microarray trong nghiên cứu tìm kiếm

chức năng hoạt động của gen và phân lập gen (a) Các bước lai phân tử DNA phối hợp với đánh dấu huỳnh quang (b1) Sản phẩm DNA Aray bán trên thị trườngcủa Hãng Affymetrix; (b2) Hình ảnh máy Scaner thu được sau khi lai, các màu sắc đỏ xanh vàng thể hiện mức độ biểu hiện của gen; (b3) Biểu đồ hóa kết quả lai

Hình 2.2: So sánh qui trình phân tích proteomic cũ sử dụng điện di gel

polyacryl amid hai chiều (2D-PAGE) và mới dùng sắc ký lỏng nano (Nano-LC)

Hình 2.2 so sánh nguyên lý hoạt động của phương pháp phân tích proteomic truyền thống và phương pháp mới cho thấy với kỹ

thuật sắc ký lỏng nano, lượng mẫu cần thiết cho phân tích là cực nhỏ, số lượng protein phân biệt được trong một hỗn hợp protein toàn phần là rất lớn Hiện tại có thể xác định được 1.400 loại protein khác nhau có trong một mẫu huyết thanh có dung tích vài trăm microlit

Bằng cách thức này những protein mới, lạ là sản phẩm hoạt động của một hay nhiều gen được hoạt hóa dưới điều kiện hoặc trạng thái nhất định sẽ được phát hiện Qua đó không những trình

tự gen được tìm thấy, mà ít nhiều đã có thể khẳng định được chức năng sinh học của những gen đó

Một số ví dụ cụ thể về phương pháp tiến hành phân lập gen

Pi-2t và Pi-1t từ cây lúa kháng đạo ôn hay phân lập gen vip kháng sâu

từ Bt được trình bày trong chương 3

2.4 Các nhóm gen có giá trị đang được sử dụng

Nguồn gen ngoại lai có giá trị để biến nạp vào thực vật có nguồn gốc từ vi khuẩn, siêu vi khuẩn, động vật và từ thực vật khác, gen tổng hợp hóa học cũng được biến nạp vào cây trồng Điều đó chứng tỏ công nghệ gen có sức mạnh vượt xa phương pháp tạo giống truyền thống về phương diện các gen được chuyển

Có thể phân loại các nhóm gen chính đang được sử dụng theo chức năng của chúng trong quá trình phát triển cây trồng chuyển gen Sau đây là những nhóm gen chính:

2.4.1 Gen công cụ

Gen công cụ là những gen được sử dụng làm phương tiện cho việc thực hiện quá trình chuyển gen và tạo cây trồng chuyển gen, nhưng không tham gia vào việc hình thành tính trạng mong muốn Trong

số các gen công cụ phải kể đến các gen làm nhiệm vụ chỉ thị và các gen hỗ trợ quá trình chọn lọc tế bào và cây mang gen chuyển

(i) Gen chỉ thị

Gen chỉ thị là gen có khả năng giúp người nghiên cứu nhận biết những tế bào, mô, dòng cây đã tiếp nhận được gen chuyển Hiện nay có ba loại gen chỉ thị với hai phương thức chỉ thị khác nhau

Đó là:

- Gen gusA chỉ thị nhuộm màu mô tế bào thông qua phản ứng

ôxy hóa cơ chất X-Gluc không màu thành màu xanh lam dưới tác dụng xúc tác của β-Glucuronidase (GUS) Hoạt tính GUS trong tế bào, dịch chiết, cặn tế bào còn có thể định lượng được thông qua phản ứng xúc tác cơ chất huỳnh quang MUG (4- methylumbelliferyl ß-D-Glucuronide, Research Organics Inc., Cleveland, Ohio) (Jefferson 1987) và đo bằng RF-Mini 150 Fluorometer (Schimadzu; Columbia) với chất chuẩn là MU (4-methylumbelliferone, Sigma) ở bước sóng 360 và 460 nm

- Gen GFP (Green Flourescent Protein) phát quang màu xanh

lục khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang (hình 2.3)

- Gen mã hóa của enzyme xúc tác quá trình phát ra ánh sáng dạ quang sinh học (bioluminescence) Tên gọi này có nghĩa là

Thần mang ánh sáng (Lucifer), và Luciferase có mã số là EC 1.13.12.7 được tách chiết từ con Đom đóm (Photinus pyralis)

Phản ứng dạ quang xảy ra như sau: Sắc tố luciferin bị ôxy hóa với sự có mặt của Adenosine triphosphate (ATP) dưới vai trò xúc tác của luciferase tạo ra luciferyl adenylate Sau đó luciferyl adenylate tác dụng với ôxy để tạo ra oxyluciferin, AMP và ánh sáng (Hình 2.4)

Hiện nay gen luciferase rất hay được dùng để chuyển vào động

và thực vật, coi đó như một bằng chứng cho sự thành công của kỹ thuật di truyền

Gen Aminoglycoside 3’ phosphotransferase II (nptII): Điển

hình là việc sử dụng những gen mã hóa tính kháng đối với kháng sinh như kanamycin (Herrera-Estrella et al., 1983) hoặc hygromycin (Van den Elzen et al., 1985) Tính kháng kanamycin được biết có nguồn gốc từ transposome của vi khuẩn do gen

aminoglycoside 3’ phosphotransferase II (nptII) quyết định Các

kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside như: neomycin, genticin

và kanamycin đều bị sản phẩm NPTII của gen nptII bất hoạt

- Gen Hygromycin phosphotransferase (hpt): Tính kháng

hygromycin B do gen hpt quyết định cũng có nguồn gốc từ Escherichia coli được cải biến để có thể biểu hiện trong thực

vật Các gen kháng kháng sinh thường không tồn tại trong thực vật, kể cả tảo, vì thế khi bổ sung các kháng sinh này vào môi trường nuôi cấy, chỉ những tế bào đã nhận được gen kháng kháng sinh biến nạp kèm gen tính trạng mới thì chúng có thể sống sót và phát triển, những tế bào còn lại sẽ bị chết

Hình 2.3: Cấu trúc phân tử của GFP với 11 chuỗi (xanh lục) tạo thành

cấu trúc vỏ hình ống tròn và hai chuỗi (xanh lam) tạo thành một cái lồng chứa các nhân phát huỳnh quang flourophore (vàng).

luciferin + ATP → luciferyl adenylate + PP i

luciferyl adenylate + O 2 → oxyluciferin + AMP + light

Hình 2.4: Cấu trúc phân tử của Luciferase và phản ứng ôxy hóa

luciferin để tạo ra ánh sáng dạ quang

- Gen kháng thuốc diệt cỏ

Gen kháng Glyphosphate: Thuốc trừ cỏ nhóm glyphosate gồm

Roundup, Rodeo, Accord, v.v tác động lên quá trình trao đổi chất của thực vật thông qua ức chế hoạt tính enzym "3-enolpyruvylshikimate-5-phosphate synthate" (EPSPS) Khi hoạt