Đặc điểm mô bệnh học gan tụy của tôm dưới tác động của nông dược

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN LÊ KIM TRONG ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC GAN TỤY CỦA TÔM DƢỚI TÁC ĐỘNG CỦA NÔNG DƢỢC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2012TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN LÊ KIM TRONG ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC GAN TỤY CỦA TÔM DƢỚI TÁC ĐỘNG CỦA NÔNG DƢỢC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN PGs. Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH 2012i LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận văn tôi xin chân thành cảm ơn: Cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt những kiến thức chuyên môn và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Xin gởi lời cảm ơn đến các thầy cô, anh chị trong bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản đã hƣớng dẫn, giúp đỡ để tôi hoàn thành luận văn. Xin cảm ơn tập thể lớp Bệnh học thủy sản K34, các bạn đã giúp đỡ và trao đổi kiến thức trong quá trình học tập

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

LÊ KIM TRONG

ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC GAN TỤY CỦA TÔM

DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA NÔNG DƯỢC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2012

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

LÊ KIM TRONG

ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC GAN TỤY CỦA TÔM

DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA NÔNG DƯỢC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs Ts ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

2012

LỜI CẢM TẠ

Để hoàn thành luận văn tôi xin chân thành cảm ơn:

Cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức chuyên môn và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Xin gởi lời cảm ơn đến các thầy cô, anh chị trong bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản đã hướng dẫn, giúp đỡ để tôi hoàn thành luận văn

Xin cảm ơn tập thể lớp Bệnh học thủy sản K34, các bạn đã giúp đỡ và trao đổi kiến thức trong quá trình học tập

TÓM TẮT

Thí nghiệm cảm nhiễm của tôm sú với Decis và WSSV được thực hiện nhằm tìm hiểu những biến đổi mô bệnh học ở cơ quan gan tụy tôm và một số chỉ tiêu miễn dịch dưới ảnh hưởng của Decis có chứa hoạt chất Deltamethrin

và sự cảm nhiễm WSSV Thí nghiệm được bố trí với 5 nghiệm thức gồm nghiệm thức đối chứng, nghiệm thức có nồng độ Decis 0,001 µg/L có tiêm 0,1 ml WSSV sau 24 giờ, nồng độ Decis 0,01 µg/L có tiêm WSSV sau 24 giờ, nồng độ Decis 0,1 µg/L có tiêm WSSV sau 24 giờ và nghiệm thức chỉ tiêm WSSV sau 24 giờ Kết quả thu mẫu được ở thời gian 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ sau khi gây cảm nhiễm, sau khoảng 54 giờ tôm chết ở các nghiệm thức có Decis và WSSV Các chỉ tiêu phân tích miễn dịch máu tôm kết quả cho thấy giá trị tổng bạch cầu giảm khác biệt có ý nghĩa sau khi tiêm WSSV Giá trị của RES ở các nghiệm thức có Decis và WSSV tăng dần qua 24 giờ và 48 giờ, khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05) tại 48 giờ so với lúc 0 giờ Giá trị SOD ở các nghiệm thức có nồng độ Decis khác nhau tăng khác biệt có ý nghĩa ở 24 giờ, sau đó giảm ở 48 giờ sau khi tiêm WSSV, riêng nghiệm thức chỉ tiêm WSSV thì nồng độ SOD tăng dần từ 0 giờ đến 48 giờ và khác biệt có ý nghĩa lúc 48 giờ so với 0 giờ Giá trị PO tăng cao ở các nghiệm thức có Decis lúc 24 giờ, qua 48 giờ hàm lượng PO giảm xuống khác biệt có ý nghĩa thấp hơn giá trị lúc 0 giờ Bên cạnh đó khi phân tích mô học cơ quan gan tụy của tôm sú và tôm càng xanh cảm nhiễm với Decis và WSSV kết quả mô học cho thấy ống gan tụy của hai loại tôm đều bị hoại tử, quan sát thấy có sự hiện của thể vùi WSSV trong dạ dày và mang của tôm sú, biểu hiện sưng phồng mang ở tôm càng xanh

MỤC LỤC

Lời cảm tạ i

Tóm tắt ii

Mục lục iii

Danh sách bảng iv

Dang sách hình v

PHẦN I 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Nội dung đề tài 2

PHẦN II 3

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Phương pháp mô học 3

2.2 Sơ lược các nghiên cứu về mô gan tụy của tôm 4

2.3 Sơ lược những nghiên cứu về bệnh đốm trắng trên tôm 6

2.4 Đáp ứng miễn dịch trên giáp xác 6

2.4.1 Quá trình thực bào 7

2.4.2 Quá trình phong tỏa 7

2.4.3 Hệ thống Prophenoloxydase (proPO) 8

2.4.4 Chất chống oxy hóa 8

2.4.5 Sản sinh chất kháng khuẩn 8

2.5 Một số nghiên cứu về thuốc trừ sâu ảnh hưởng đến động vật thủy sản 8

2.5.1 Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu lên cá 8

2.5.2 Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu lên tôm 9

2.6 Sơ lược về thuốc trừ sâu Decis 10

2.6.1 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa học của Decis 11

2.6.2 Sơ lược về thuốc trừ sâu Decis 2,5 EC dùng nghiên cứu 12

PHẦN III 13

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 13

3.2 Vật liệu nghiên cứu 13

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

3.2.2 Dụng cụ 13

3.2.3 Hóa chất 13

3.3 Phương pháp nghiên cứu 13

3.3.1 Phương pháp nuôi dưỡng tôm 13

3.3.2 Bố trí thí nghiệm và thu mẫu 13

3.3.3 Pha nồng độ thuốc dùng thí nghiệm 14

3.3.5 Phương pháp mô học 16

PHẦN IV 20

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

4.1 Kết quả miễn dịch tôm sú cảm nhiễm với Decis và WSSV 20

4.1.1 Kết quả của quá trình gây cảm nhiễm 20

4.1.2 Kết quả các chỉ tiêu miễn dịch của tôm với Decis và WSSV 20

4.2 Kết quả mô bệnh học của tôm cảm nhiễm với Decis và WSSV 23

4.2.1 Đặc điểm mô học cơ quan gan tụy của tôm 23

4.2.2 Những biến đổi mô học trên gan tụy của tôm 24

PHẦN V 28

5.1 Kết luận 28

5.2 Đề xuất 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29

PHỤ LỤC 32

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Các dạng bạch cầu ở giáp xác và chức năng trong đáp ứng miễn dịch 7 Bảng 3.1 Quy trình xử lý mẫu tự động 17 Bảng 3.2 Nhuộm mẫu theo phương pháp Mayer’s Hematoxyline & Eosin 18

DANH SÁCH HÌNH

Hình 3.1 Buồng đếm hồng cầu 15

Hình 4.1 Biểu đồ so sánh số lượng tổng bạch của tôm sú giữa các nghiệm thức và các ngày thu mẫu 20

Hình 4.2 Biểu đồ so sánh hoạt tính Respiratory burst của tôm sú giữa các nghiệm thức và giữa các ngày thu mẫu 21

Hình 4.3 Biểu đồ so sánh hoạt tính superoxide dismutase của tôm càng xanh giữa các nghiệm thức và giữa các ngày thu mẫu 22

Hình 4.4 Biểu đồ so sánh hoạt tính Phenloloxidase của tôm sú giữa các nghiệm thức và các ngày thu mẫu 23

Hình 4.5 Cấu tạo ống tiểu quản gan tụy tôm sú bình thường ở mặt cắt ngang (H&E) Mẫu nghiệm thức đối chứng 23

Hình 4.6 Cấu tạo ống tiểu quản gan tụy tôm càng xanh bình thường ở mặt cắt ngang 24

Hình 4.7 Cơ quan gan tụy tôm sú bị hoại tử mất cấu trúc ( ) (10X) 25

Hình 4.8 Các tế bào máu bao xung quanh ống gan tụy bị hoại tử (40X) 25

Hình 4.9 Thể vùi WSSV trên tôm sú (100X) 26

Hình 4.10 Gan tụy tôm càng xanh bị hoại tử (10X) 26

Hình 4.11 Sợi mang tôm càng xanh sưng phồng ( ), sợi mang bình thường ( )(10X) 27

PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1Giới thiệu

Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) với tổng diện tích có khả năng nuôi trồng thủy sản khoảng 1,1 triệu ha, là vùng nuôi thủy sản trọng điểm chiếm 55% tổng diện tích nuôi của cả nước (Đào Bá Cường, 2010) Trong đó diện tích nuôi tôm chiếm khoảng 550.000 ha, tập trung chủ yếu ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Kiên Giang, Trà Vinh và Bến Tre (Cục NTTS, 2009) Tính đến hết tháng 7/2010 tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 2,49

tỷ USD Cơ cấu xuất khẩu thủy sản của Việt Nam chủ yếu tập trung các mặt hàng: tôm, cá Tra, cá Basa, mực và các sản phẩm cá Nhìn chung, xuất khẩu các mặt hàng này chiếm 97% kim ngạch thủy sản cả nước, trong đó xuất khẩu tôm chiếm cao nhất 37,4% (Tổng cục Hải Quan, 2010), trong khi đó cá Tra và

cá Basa chiếm 32% (ABS, 2010) Trong các đối tượng nuôi, tôm sú được xem

là đối tượng nuôi chủ lực của Việt Nam do giá trị xuất khẩu cao mang lại nguồn thu ngoại tệ đáng kể

Bên cạnh những giá trị đạt được về mặt kinh tế thì nghề nuôi tôm ở ĐBSCL đang phải đối mặt với nguy cơ suy thoái môi trường và dịch bệnh xảy ra hàng năm Một trong những nguyên nhân gây chết hàng loạt tôm nuôi

ở ĐBSCL như bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh đầu vàng (YHV), bệnh hoại tử gan tụy (HPV)…

Từ giữa năm 2010 đến nay, hội chứng hoại tử gan tụy trên tôm sú diễn biến khá phức tạp ở ĐBSCL và gây thiệt hại lớn cho người nuôi đặc biệt ở hai tỉnh Sóc Trăng và Bạc Liêu Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (Số: 5330/TB-BNN-VP) tính đến tháng 10/2011 diện tích thiệt hại tôm ở ĐBSCL khoảng 80.000 ha Tôm chết có các biểu hiện như: gan nhạt màu, nhũn, sưng, gan bị teo, dai và sậm màu, quan sát tiêu bản mô học thấy có biểu hiện hoại tử Theo kết quả nghiên cứu của viện nuôi trồng thủy sản II: một trong những nguyên nhân gây tôm chết hàng loạt và hội chứng hoại tử gan tụy trên tôm nuôi thời gian qua ở ĐBSCL là do việc sử dụng hóa chất nông dược Phần lớn các hộ bị thiệt hại thường dùng các sản phẩm có thành phần nông dược là Deltamethrin, Cypermethrin để diệt giáp xác và cải tạo ao nuôi, thậm chí một số hộ còn sử dụng trực tiếp các loại thuốc bảo vệ thực vật như: Padan, visher…

Theo quan niệm của người nuôi tôm việc sử dụng các hóa chất để phòng trị bệnh, tiêu diệt địch hại, kích thích tôm lột xác lớn nhanh là việc cần thiết

và sử dụng rất phổ biến Theo Nguyễn Thị Phương Nga (2004) chi phí thuốc

và hóa chất sử dụng trong ao nuôi chiếm khoảng 20,8-21% Do đó nhằm giảm chi phí thuốc, hóa chất người nuôi đã sử dụng thuốc trừ sâu để diệt tạp, giáp xác và kích thích tôm lột xác Trong đó thuốc trừ sâu Decis chứa hoạt chất Deltamethrin được được người nuôi sử dụng khá phổ biến (Nguyễn Hữu Đức, 2007) Độc tính của Deltamethrin thường gây chết sinh vật ở nồng độ rất thấp

Hiện nay đã có một số nghiên cứu về ảnh hưởng của Deltamethrin đối với đặc điểm sinh lý, sinh trưởng của tôm và cá nhưng nghiên cứu về đặc

điểm mô học thì chưa có Chính vì vậy, đề tài “Đặc điểm mô bệnh học gan

tụy của tôm dưới tác động của nông dược” được thực hiện

1.2 Mục tiêu đề tài

Tìm hiểu những biến đổi mô học gan tụy của tôm dưới tác động của thuốc trừ sâu Decis có chứa hoạt chất Deltamethrin

1.3 Nội dung đề tài

- Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của Deltamethrin lên tôm ở nhiều nồng độ khác nhau

- Xác định những biến đổi mô học của gan tụy dưới ảnh hưởng của Deltamethrin

PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

Hematoxyline và Eosin trên mô được thực hiện theo Lightner và ctv (1996)

và hình ảnh mô thu thập qua phân tích đem đối chiếu với CD hướng dẫn các phương pháp chuẩn đoán bệnh tôm sú do FAO & Multimedia Asia Co.Ltd

phát hành năm 1999 (Phạm Trần Nguyên Thảo & ctv, 2004)

Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) mô bệnh học là phương pháp xác định các tổn thương ở các mô tế bào dựa trên những thủ thuật nhuộm tế bào

và quan sát dưới kính hiển vi Phương pháp này cho phép người phân tích kết luận tính chất của các vùng bị tổn thương So sánh và đối chiếu với các kết quả quan sát bên ngoài là công việc rất cần thiết để có một chẩn đoán đúng Nếu chỉ dựa vào những hình thái tổn thương bên ngoài mà không có các dữ kiện khác liên quan đến tôm cá bệnh thì thường có những kết luận sai lầm vì những hình thái tổn thương của vài bệnh có thể giống nhau và gây lầm lẫn trong chẩn đoán Phương pháp mô học nghiên cứu cấu trúc mô ở mức độ hiển

vi và mô bệnh học là một chuyên môn hẹp của phương thức mô học đề cập tới quá trình phát triển bệnh Mô bệnh học là một kỹ thuật rất quan trọng trong nghiên cứu bệnh tôm và nhiều trường hợp bệnh chỉ có thể chẩn đoán được bằng phương pháp này Tuy nhiên nó có những hạn chế nhất định, thao tác chậm Phương pháp mô học chỉ nên sử dụng kết hợp với tất cả các dữ liệu

về môi trường và sức khỏe tôm để xác định tác nhân gây bệnh

Một số ứng dụng của mô học (trích dẫn từ Nguyễn Thùy Ngân, 2008) Young (1959) và Johnson (1980) đã ứng dụng giải phẩu học và mô học trong

việc hệ thống bệnh thường gặp trong nuôi tôm Châu Mỹ, Châu Á (Lightner et

al., 1992) Thời gian sau Wang và ctv (1997) chứng minh sự hiện diện của

virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú, tôm thẻ và tôm he Nhật Bản bằng việc quan sát tiêu bản mô học dưới kính hiển vi quang học và điện tử Năm 1998

Sudha và ctv bằng phương pháp mô học đã xác định mối quan hệ giữa các

loài virus gây nhiễm trên các loài tôm biển Ấn Độ Nguyễn Văn Hảo (1999) nghiên cứu bệnh tôm trên tôm sú nuôi tại Trà Vinh bằng phương pháp mô học

và PCR, bằng việc kết hợp hai phương pháp này ông mô tả rất cụ thể các đặc điểm mô học của các tác nhân gây bệnh trên tôm sú, năm 2000 ông cũng ứng dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu đề tài bệnh đỏ mang trên tôm bố mẹ Phương pháp mô học cũng được Hòa (2001) ứng dụng trong việc xác định cường độ cảm nhiễm MBV Bùi Quang Tề (2003) ứng dụng kỹ thuật mô học vào chuẩn đoán bệnh tôm và đưa ra phương pháp phòng trị Phạm Trần

Nguyên Thảo (2003) ứng dụng kỹ thuật mô học trong chuẩn đoán bệnh đốm trắng trong tôm sú

2.2 Sơ lược các nghiên cứu về mô gan tụy của tôm

Theo Lightner et al (1992) bệnh hoại tử gan tụy do vi khuẩn xuất hiện tại trại nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei), Texas-Hoa kỳ lần đầu

tiên vào năm 1985, làm tôm hao hụt 20-90% trong các trại nuôi, tác nhân gây

bệnh gồm hai chủng: Rickettsia hình que và Seliberia hình que hoặc hình

xoắn

Theo Bhavan và Gieraldine (2000) (trích dẫn từ Nguyễn Kim Cương, 2006) nghiên cứu mô bệnh học trên gan tụy và mang tôm càng xanh khi tiếp xúc với endosulfan Kết quả biến đổi mô bệnh học trên gan tụy và mang bao gồm: sự tích tụ của các tế bào máu trong khe của các xoang, ống gan tụy bị hoại tử; tấm mang không bình thường bị phát triển quá mức, bị hoại tử

Theo Nguyễn Khắc Lâm (2004) nghiên cứu về bệnh “phân trắng teo gan” trên tôm sú nuôi thương phẩm tại Ninh Thuận Tôm bệnh thường có những dấu hiệu: thải phân trắng, đường ruột tôm bị đứt quãng hoặc trống rỗng, có những chấm vàng nhạt trong ruột Sau giai đoạn thải phân trắng tôm chuyển sang giai đoạn teo gan, lúc này tôm có hiện tượng bỏ ăn kéo dài và bắt đầu chết Kiểm tra gan tôm thấy có hai dấu hiệu đặc trưng: gan bị chai cứng và teo nhỏ lại bằng 1/3 thể tích gan bình thường; dấu hiệu còn lại là gan tôm nhũng ra giống như sữa Kết quả nghiên cứu cho thấy có nhiều tác nhân gây ra bệnh “phân trắng, teo gan” gồm: vi khuẩn, virus, tảo độc, nguyên sinh động vật Vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio gây hoại tử gan tụy với tần suất 80%, virus HPV với tần suất 36%, tảo lam là loại tạo có chất độc với tần suất 45,5% và môi trường ao nuôi không tốt cũng là nguyên nhân gây ra bệnh Theo FAO (2005) đặc điểm mô bệnh học của bệnh gan tụy do vi khuẩn

có biểu hiện: khối gan tụy teo lại từ ít đến hoàn toàn của tuyến niêm mạc và

sự hình thành các dạng vi khuẩn thông qua các tiêu bản mô Xảy ra hiện tượng viêm hồng cầu trong lòng các tuyến để phản ứng lại hoại tử, tiêu hủy tế bào và hiện tượng lột vỏ tế bào biểu mô tuyến gan tụy Biểu mô tuyến gan tụy

bị teo lại rõ rệt, tạo nên vùng bị phù thủng rộng trong gan tụy Chúng chứa ít hoặc không còn chứa các giọt lipid, giảm đáng kể hoặc không còn các không bào

Theo Hoàng Tuấn (2007) xác định mầm bệnh virus phân lập trên tôm sú

(Penaeus monodon) bị bệnh phân trắng cho kết quả thấy có sự xuất hiện

MBV và HPV trên mẩu phân tích và sự xuất hiện của MBV cao hơn so với HPV Tuy nhiên dấu hiệu biểu hiện bệnh trên tiêu bản mô học tương đối giống nhau là tạo thể vùi trong nhân (đối với HPV) hoặc thể ẩn (đối với MBV) trên một cơ quan gan tụy

Theo Hoàng Quốc Trung Tuấn (2007) khi tôm bị nhiễm HPV không có dấu hiệu đặc trưng, nhưng nếu tôm nhiễm nặng thì gan có màu hơi trắng Ở giai đoạn đầu gan tụy phì đại nhưng về sau teo lại nhỏ hơn bình thường HPV chỉ nhiễm chủ yếu ở ở tế bào E nằm ở đỉnh đầu của ống tiểu quản gan tụy,

HPV làm cho các nhân trong tế bào biểu mô gan tụy hoại tử dưới hình thức tạo thể vùi trong nhân phì đại, sự phát triển thể vùi trong nhân làm chuyển đổi

vị trí hạch nhân Thông thường HPV chỉ tạo 1 thể vùi trong nhân phì đại nhưng đôi khi có thể quan sát thấy 2 thể vùi trong nhân phì đại Giai đoạn đầu thể vùi bắt màu kiềm nhẹ, kích thước nhân phì đại tương đối nhưng về sau thể vùi bắt màu kiềm đậm hơn và nhân phì đại chiếm gần hết thể tích của tế bào Một số biến đổi mô học của tôm sú bị nhiễm HPV thu ở ĐBSCL giống với

các nghiên cứu của Lightner (1994), Flegel et al., (2000), Chayaburakul et al.,

(2004) là tạo thể vùi trong nhân biểu mô gan tụy và đặc biệt là tế bào phôi Số lượng thể vùi do bệnh HPV tạo ra (1-2) thấp hơn thể ẩn MBV (5-7) HPV bắt màu tím của Haematoxylin, thể ẩn MBV bắt màu hồng của Eosin, HPV có kích thước lớn hơn MBV

Theo Nguyễn Thùy Ngân (2008) kết quả nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học tôm sú bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV) như sau Mô liên kết gan tụy tôm sú nhiễm IHHNV xuất hiện thể vùi Cowdry loại A Thể vùi này không tìm thấy ở tế bào gan tụy cũng như tổ chức lympho Đồng thời ở mô liên kết gan tụy có hiện tượng hoại tử làm mất liên kết giữa các ống tiểu quản gan tụy, tạo nhiều khoảng trống giữa các ống tiểu quản

Theo Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2008) Nghiên cứu về đặc điểm mô bệnh học tôm sú (Penaeus monodon) có dấu hiệu bệnh phân trắng nuôi ở một

số tỉnh ĐBSCL Tổng số 220 mẫu được thu ở các tỉnh: Bạc Liêu, Sóc Trăng, Bến Tre có dấu hiệu thải phân trắng nổi trên mặt nước, ruột rỗng và đứt quãng, tôm giảm ăn nhanh Sau giai đoạn thải phân trắng gan tôm teo lại, ốp

vỏ, bơi lờ đờ và tấp mé ao Kết quả phân tích mô học 220 mẫu tôm thu thấy

sự hiện diện của nhiều loại mầm bệnh bao gồm kí sinh trùng loa kèn, trùng hai tế bào, vi khuẩn, HPV và MBV Kí sinh trùng kí sinh trên mang gây tổn

thương và biến đổi cấu trúc mang, tạo không bào do nhiễm Zoothamnium và

Epistylis, trùng hai tế bào gây hoại tử niêm mạc ruột giữa và xuất huyết Vi

khuẩn tấn công nhiều nhất ở cơ quan gan tụy kế đến cơ quan lympho và ít nhất là mang, vi khuẩn tấn công gây hoại tử, có hiện tượng melanin hóa và tạo bào nang bao lấy vi khuẩn, mô gan nhiễm khuẩn thì xoang mạch máu bị giãn nỡ và hoại tử tế bào Cơ quan tấn công của HPV và MBV là gan tụy, quan sát mô học MBV tạo thể ẩn bắt màu Eosin hay tụ tập ở trong nhân phì đại của tế bào gan tụy hoặc tế bào biểu mô ruột giữa, HPV bắt màu kiềm tạo thể vùi trong nhân tế bào gan tụy làm chuyển đổi vị trí của hạch nhân Tỉ lệ nhiễm trùng loa kèn cao nhất trong các mầm bệnh Tỉ lệ chết cao nhất do nhiễm kép HPV và vi khuẩn (18,03%), kế đến nhiễm kép HPV và trùng hai tế bào (12,03%)

Theo Bùi Quang Tề (2010) bệnh gan tụy xảy ra trên tôm có nhiều tác nhân: virus (MBV, WSSV, HPV, BMN) làm nhân tế bào gan tụy trương to

hoặc làm nhân tế bào thoái hóa kết đặc (YHV), vi khuẩn Rickettsia, kí sinh trùng (vi bào tử Enterocytozoon hepatopenaei) kí sinh trong tế bào chất của tế

bào gan tụy Nghiên cứu về tình hình tôm chết hàng loạt ở tỉnh Sóc Trăng và Bạc Liêu Mẫu tôm bệnh thu vào tháng 8/2010 ở các tỉnh: Hải Phòng, Nghệ

An, Thừa Thiên Huế, Tiền Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau Tôm bệnh

có dấu hiệu hoạt động yếu, tấp bờ, tỉ lệ chết có thể lên đến 100% trong 2-3 ngày, gan tụy tôm bệnh nặng bị hoại tử, khi tôm yếu và chết gan tụy thối rữa rất nhanh Bằng các phương pháp chuẩn đoán mô bệnh học, kính hiển vi điện

tử, sinh học phân tử trên tôm bệnh có các biểu hiện: gan tụy bị hoại tử và có thể chứa các giọt mỡ, một số tế bào trên mô hình ống trương to chứa đầy các hạt nhỏ, nhân phân hóa, tôm hầu như không bị nhiễm những bệnh do virus (MBV, WSSV, YHV, HPV,…) nhưng trong tế bào gan tụy của tôm có chứa các bào tử trưởng thành Kết quả nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh ở

tôm sú là vi bào tử thuộc giống Enterocytozoon, họ Enterocytozoonidae kí

sinh nội bào

2.3 Sơ lược những nghiên cứu về bệnh đốm trắng trên tôm

Theo Flegel và ctv (1997) bệnh đốm trắng do tác nhân white spot

syndrome virus (WSSV) gây ra là một trong những bệnh nguy hiểm nhất và

gây thiệt hại nghiêm trọng đến ngành công nghiệp nuôi tôm trên thế giới Đây

là bệnh lây trên các loài tôm thuộc họ Penaedae

Theo Lightner (1996) cơ quan đầu tiên và cũng là cơ quan đích mà WSSV tấn công là lớp biểu mô mang bao gồm: biểu mô dưới vỏ, biểu mô dạ dày và biểu mô mang Trong trường hợp nhiễm cấp tính tôm không có biểu hiện bệnh lý rõ ràng, chỉ thấy tôm lờ đờ và giảm ăn Sau khi tôm bị nhiễm WSSV có dấu hiệu giảm ăn 1 – 2 ngày thì hiện tượng tôm chết bắt đầu xảy ra

và từ 3 – 10 ngày tỉ lệ tôm chết lên đến 100%

Phạm Trần Nguyên Thảo (2003), ứng dụng kỹ thuật mô bệnh học trong chẩn đoán bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú Kết quả là khi tôm bị bệnh đốm trắng ở mức độ vi thể thì thấy thể vùi trong nhân phì đại ở các tế bào biểu mô dạ dày, dưới da và mang

Nghiên cứu về sự nhạy cảm của WSSV đối với tôm càng xanh ở tất cả các giai đoạn: tôm Post-larvae, tôm giống, tôm tiền trưởng thành và tôm trưởng thành Kết quả mô học cho thấy rằng có những biểu hiện tương tự với những dấu hiệu tìm thấy trên tôm sú Tuy nhiên sự hoại tử và thể vùi trong

mô ít hơn so với tôm sú (Kiran và ctv, 2002)

Nghiên cứu của Lê Hữu Thôi (2011) nhằm đánh giá và so sánh khả năng đáp ứng miễn dịch tự nhiên của tôm càng xanh với WSSV và vi rút gây bệnh đục cơ (MrNV/XSV) Kết quả bước đầu cho thấy tôm càng xanh không có khả năng kháng với MrNV/XSV nhưng lại có thể kháng lại WSSV

2.4 Đáp ứng miễn dịch trên giáp xác

Đáp ứng miễn dịch ở động vật thủy sản gồm 2 dạng: đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu Trong hệ thống miễn dịch của giáp xác thiếu những yếu tố cần thiết cho đáp ứng miễn dịch đặc hiệu như tế bào lympho T, phân tử MHC và Ig cho nên sự đề kháng cơ thể ở giáp xác chủ yếu dựa vào các cơ chế đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu Ở giáp xác không

có đáp ứng miễn dịch đặc hiệu, đáp ứng bảo vệ chúng tồn tại được trong tự nhiên được thực hiện chủ yếu bởi các tế bào máu chuyên hóa như: thực bào, quá trình phong tỏa, sự sản sinh các chất kháng hay diệt khuẩn (Bảng 2.1) Bảng 2.1 Các dạng bạch cầu ở giáp xác và chức năng trong đáp ứng miễn dịch

Ngoài các cơ chế đáp ứng miễn dịch tư nhiên tương tự như ở động vật

có xương sống, một số cơ chế khá đặc thù ở giáp xác bao gồm: hình thành khối u, khả năng phong bế, khả năng sản sinh các protein kháng khuẩn (còn gọi là các peptit kháng khuẩn), phản ứng đông máu có thể bị kích thích bởi lipopolysaccharide (LPS) của vi khuẩn, khả năng sử dụng các enzym thủy phân, các chất kháng với nguyên sinh động vật và đặc biệt là hệ thống Phenoloxydase (Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương, 2007)

2.4.1 Quá trình thực bào

Thực bào là một cơ chế đáp ứng miễn dịch chính của động vật không xương sống vì nó có khả năng nuốt và tiêu hóa các vi sinh vật hoặc các vật thể lạ xâm nhập vào cơ thể Quá trình thực bào được chia làm 3 giai đoạn: di chuyển đến tác nhân gây bệnh, sau đó các tế bào thực bào sẽ bám chặt vào tác nhân gây bệnh, cuối cùng là ăn vào, phá hủy tác nhân gây bệnh và đào thải ra bên ngoài (Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương, 2007)

2.4.2 Quá trình phong tỏa

Theo Söderhäll và Cerenius (1992) được trích dẫn từ Lê Hữu Thôi (2011), tế bào có chức năng phong tỏa và hình thành khối u là bạch cầu bán hạt Bạch cầu bán hạt nhận ra các tác nhân gây bệnh xâm nhập vào và phong tỏa bằng các protein (76 kD) Những protein này hoạt động như một quá trình giải phóng hạt trong bạch cầu, là một chất hoạt hóa sự phong tỏa Các khối u

này được hình thành trong gan tụy và mang khi quá trình thực bào không thể tiêu diệt những vi sinh vật hay kháng nguyên có kích thước lớn

2.4.3 Hệ thống Prophenoloxydase (proPO)

Khi tác nhân gây bệnh xâm nhập vào cơ thể của giáp xác thì chúng gặp phải bạch cầu, hiện tượng thực bào xảy ra sẽ kích hoạt enzyme protease có trong huyết thanh Protease cùng với hiện tượng thực bào là tín hiệu để kích hoạt men pro-phenoloxidase thành dạng hoạt hóa phenoloxidase Khi phenoloxidase hoạt hóa thì sẽ chi phối quá trình sản sinh quinone melanin một cách mạnh mẽ, gây ra hiện tương melanin hóa trên vỏ của giáp xác khi vật lạ tấn công Ngoài ra, khi protease hoạt động nó còn kích thích quá trình opsonin để thu hút các thực bào tập trung lại chổ ấy, thúc đẩy hiện tượng thực bào diễn ra mạnh mẽ hơn (Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương, 2007)

2.4.4 Chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa gồm những enzyme catalase, glutathione peroxidase, superoxide dismutase, ascorbate, β- carotene Trong các chất đó thi superoxide dismutase (SOD) là một trong nhũng chất chống lại sự sốc oxy hóa bởi sự ô nhiễm, sự nhiễm bệnh, sự giảm hoặc tăng oxy trong cơ

thể…(Neves et al., 2000)

2.4.5 Sản sinh chất kháng khuẩn

Pepit kháng khuẩn (AMPs) là một dạng đáp ứng miễn dịch tự nhiên ở động vật không xương sống, chúng có khả năng kháng khuẩn, kháng độc tố… Peptit kháng khuẩn là những protein cation có trọng lượng phân tử thấp Những peptit này có khả năng tương tác trực tiếp với bề mặt tế bào vi sinh vật tạo nên những lỗ thủng, gây mất sự ổn định các ion và năng lượng của vi sinh vật (Marshall và Arenas, 2003)

2.5 Một số nghiên cứu về thuốc trừ sâu ảnh hưởng đến động vật thủy sản 2.5.1 Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu lên cá

Theo Murty (1985) được trích dẫn từ Lê Quốc Việt (2002) các loại hóa chất có gốc clo hữu cơ độc với cá hơn các loại hóa chất có gốc phosphat hữu

cơ Mỗi loài cá có khả năng chịu đựng khác nhau đối với chất độc, cá rô phi

(Oreochromis niloticus) chịu đựng Methy parathion (MP) tốt hơn cá Chép (Cyprinus carpio). Thuốc trừ sâu gốc chlor hữu cơ ở nồng độ dưới mức gây chết kích thích quá trình tiêu thụ oxy nhưng ở mức gây chết lại ngăn cản quá trình lấy oxy của cá Đối với thuốc gốc lân hữu cơ làm suy giảm tiêu thụ oxy của cá liên tục

Theo Nguyễn Thanh Phương và Đỗ Thị Thanh Hương (1997) cá rô phi

(Oreochromis niloticus) giống sau khi tiếp xúc với môi trường có thuốc

Methy parathion (MP) ở nồng độ thuốc 17mg/L và 24mg/L dần dần bị bất

động và chìm xuống đáy bể sau 2 giờ; 1-2 giờ sau cá di chuyển lên mặt nước đớp khí, sau đó hoạt động yếu dần và bắt đầu chết

Các số liệu được trích dẫn từ Phương Ngọc Tuyết (2009) Giá trị LC50

-96 giờ của cá rô phi (Guineesis) đối với Deltamethrin là 0,002µg/L và tỉ lệ

chết tăng dần khi cá tiếp xúc với nồng độ cao và thời gian kéo dài Theo

Yildirim et al., (2006) tìm ra giá trị LC50-48 giờ của cá rô phi (Oreochromis

niloticus) với Deltamethrin là 4,85µg/L Viran et al., (2003) tìm ra giá trị

LC50-48 giờ của Deltamethrin với cá guppies đực đã trưởng thành (Poecilia

reticulata) là 5,13µg/L và khẳng định Deltamethrin rất độc với cá, LC50-96

giờ của cá (Poecilia reticulata) với Deltamethrin là 5,13µg/L Theo Metres et

al., (1992) LC50-96 giờ của Deltamethrin đối với cá hồi (Salmo gairdneri) là 0,39µg/L, cá chép (Cyprinus carpio) là 1,84µg/L và rô phi (Sarotherodon

mossambica) là 3,5µg/L Theo Bradbury et al (1989) LC50-96 giờ của Deltamethrin đối với cá hồi nước ngọt là 0,5µg-1,97µg/L

2.5.2 Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu lên tôm

Theo Collins và Cappello (2006) giá trị LC50-96 giờ của tôm nước ngọt

(Palaemonets argentinus) đối với Cypermethrin là 0,0020µg/L

Theo Trần Thị Chi và Hồ Thị Xuân Thu (1990) giá trị LC50-96 giờ của tôm càng xanh đối với Sumithion, Methy parathion, Kitazin và Sherpa lần lượt là 5,16µg/L, 3,3µg/L, 2,2µg/L và 0,068µg/L

Theo Nguyễn Việt Phương (1995) khi nghiên cứu về ảnh hưởng của Saponin lên một số loài tôm cá, đã nhận định rằng tôm càng xanh có sức chịu đựng cao nhất rồi đến tôm sú và tôm thẻ Giá trị LC50-96 giờ của Saponin đối với tôm thẻ là 1,03 mg/L, tôm sú là 1,59 mg/L, tôm càng xanh là 1,89 mg/L

Theo Lignot et al., (1997) giá trị LC50-96 giờ ở từng giai đoạn tôm he

Nhật Bản (Penaeus japonicus) đối với thuốc trừ sâu gốc phospho hữu cơ

(Fenitrothion) như sau PL1 là 1,8µg/L, PL5 là 0,6µg/L, PL7 là 0,3µg/L, PL15

là 0,4µg/L và ấu niên là 0,8µg/L

Theo Lê Quốc Việt (2002) giá trị LC50-96 giờ của Dipterex, BKC, formalin đối với tôm sú (P30) lần lượt là 0,021 ppm; 1,45 ppm; 36,87 ppm Giá trị LC50-96 giờ của Dipterex thấp hơn rất nhiều lần so với BKC và formalin Tôm có biểu hiện ngộ độc nhanh với BKC và chậm nhất là Dipterex, nhưng sau 12 giờ thì độc tính của BKC giảm đáng Khi mới ngộ độc tôm bơi lội và búng lên mặt nước, lờ đờ, sau đó tăng cường hô hấp và tôm suy yếu dần

Theo Chang et al., (2006) được trích dẫn từ Ngô Thanh Toàn (2009) giá

trị LC50 của Chlor hữu cơ Trichlorfon đối với tôm càng xanh ở 24, 48, 72 và

96 giờ lần lượt là 0,7739; 0,3513; 0,2697 và 0,2555µg/L Ở nồng độ dưới ngưỡng gây chết, Trichlorfon làm ảnh hưởng đến sinh lý, sinh hóa của tôm càng xanh, sau 24 giờ tiếp xúc với Trichlorfon ở nồng độ 0,1-0,3µg/L, hoạt tính acetylcholinesterase, glycogen, Na+

, osmolality, Cl-, pCO2, HCO3- trong máu đều giảm thấp hơn đối chứng nhưng hàm lượng glucose trong huyết

tương trong thịt tăng; hàm lượng lactate trong huyết tương và trong cơ cũng gia tăng đáng kể Qua đó cho thấy lân hữu cơ làm gia tăng nhu cầu năng lượng của tôm và có thể dẫn đến giảm sinh trưởng

Theo Ngô Thanh Toàn (2009) nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc trừ sâu chứa hoạt chất Diazinon lên hoạt tính enzyme cholinesterase (ChE) và sinh

trưởng của tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) kết quả như sau

Diazinon rất độc đối với tôm càng xanh, giá trị LC50-96 giờ là 390µg/L Giá trị NOEC (nồng độ không thấy ảnh hưởng) và giá trị LOEC (nồng độ thấp nhất thấy được ảnh hưởng) đối với hoạt tính ChE sau 48 giờ tiếp xúc với Diazinon lần lượt là 39µg/L và 97,5µg/L, mức độ ức chế ChE trong thịt bởi Diazinon cao hơn ChE trong mắt và thời gian phục hồi trong thịt cũng lâu hơn trong mắt Tỉ lệ ChE bị ức chế phụ thuộc vào thời gian, nồng độ tiếp xúc và đạt cao nhất trong khoảng 24-48 giờ tiếp xúc, ChE phục hồi đến mức trên 80% sau 12 ngày (ở mắt) và trên 70% sau 18 ngày (ở thịt) Tôm chết khi hoạt tính ChE bị ức chế trên 80% ở mắt và 80% ở thịt Dưới tác dung của Diazinon tiêu hao oxy của tôm giảm ở nồng độ nhỏ hơn hoặc bằng 97,5µg/L và tăng ở nồng độ 195µg/L, sự bắt mồi hay tính thèm ăn của tôm giảm theo sự gia tăng nồng độ Diazinon, sau 4 ngày thay nước tôm bắt mồi bình thường trở lại Tôm chậm lột xác hơn lô đối chứng khi nồng độ Diazinon lớn hoặc bằng 97,5µg/L và tốc độ tăng trưởng tương đối của tôm bị ức chế 33,47% ở nồng

độ lớn hơn hoặc bằng 195µg/L

Theo Phương Ngọc Tuyết (2009) Dưới ảnh hưởng của Deltamethrin tôm tập trung lột xác ở nồng độ 0,75-1,25µg/L sau 24 giờ Giá trị LC50-48 giờ của tôm sú đối với Deltamethrin là 1,18µg/L, LC50-96 giờ là 1,05µg/L do đó

sử dụng Deltamethrin để kích thích tôm lột xác là cách không phù hợp vì có thể gây chết tôm Nồng độ Deltamethrin 0,01µg/L và 0,52µg/L ảnh hưởng đến điều hòa áp suất thẩm thấu và ion (Na+

, K+ và Cl-) của tôm sú ở độ mặn 15%o và 35%o, ở độ mặn 25%o không làm ảnh hưởng đến khả năng điều hòa

áp suất thẩm thấu và ion Na+

, Cl- nhưng làm ảnh hưởng đến điều hòa ion K+ Tôm sống trong môi trường nước có nhiễm Deltamethrin nhở hơn hoặc bằng 0,52µg/L ở độ mặn 25%o thì mất năng lượng ít hơn ở độ mặn 15%o và 35%o Nghiên cứu ảnh hưởng của Deltamethrin lên sự tăng trưởng của tôm có nồng

độ 0,01µg/L, 0,1µg/L và 0,52µg/L ở độ mặn 25%o cho kết quả khác biệt không có ý nghĩa so với lô đối chứng, điều đó cho thấy sử dụng Deltamethrin không gây ảnh hưởng đến tăng trong tôm mà làm tăng tỷ lệ chết và kéo dài thời gian lột xác

2.6 Sơ lược về thuốc trừ sâu Decis

Decis là thuốc trừ sâu thuộc nhóm Pyrethroid được tổng hợp từ thực vật Trên cơ sở bắt chước của hoạt chất Pyrethrin có trong cây cúc sát trùng, người ta đã tổng hợp và phát triển thành nhóm thuốc trừ sâu Pyrethroid (hiện

có trên 30 hoạt chất) với hoạt tính trừ sâu và độ bền quang học cao hơn Các hợp chất Pyrethrin đều là tan mạnh trong chất béo, gần như không tan trong nước, nên chúng có hiệu lực tiếp xúc mạnh hơn hiệu lực vị độc Hầu hết

thuốc trừ sâu Pyrethrin có điểm sôi khá cao, ở dạng lỏng nhầy, áp suất hơi thấp (trừ Allethrin, Prothrin, Pyrethrin I)

Các sản phẩm Pyrethrin đã trải qua 4 thế hệ: (1) Allethrin được tổng hợp đầu tiên năm 1949, được dùng làm hương mũi và phun sol khí để trừ ruồi muỗi trong y tế; trong nông nghiệp chúng được dùng trừ rệp, bọ cánh cứng, sâu, rầy, bảo quản hạt và các mục đích khác (2) Thế hệ thứ 2 có Dimethrin (1961), Tetramethrin (Phthalthrin, 1965), Resmethrin, Bioresmethrin và Biolethrin (1969) có tính quật ngã cao, phổ rộng nhưng bị phân hủy nhanh dưới ánh sáng và không khí nên chúng ít được sử dụng trong nông nghiệp, Phenothrin (Sumithrin) sản phẩm cuối 1973 dùng trừ côn trùng trong nhà (3) Các sản phẩm thế hệ thứ 3 như Permethrin, Cypermethrin, Deltamethrin và Fenvalerat bền dưới ánh sáng nhất (tổng hợp năm 1971, đưa ra thị trường 1980) được dùng nhiều trong nông nghiệp (4) Các sản phẩm thứ tư được đưa

ra thị trường vào các năm 1975-1983 dùng để trừ côn trùng hại bông (Flucythrinat, Cyfluthrin, Fluvalinat), một số sản phẩm khác được dùng để trừ ngoại ký sinh hại gia súc (Cyhalothrin, Cypothrin) và nhiều sản phẩm khác đang được nghiên cứu (Cycloprothrin và Penpyridin) (Nguyễn Trần Oánh &

ctv, 2007)

2.6.1 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa học của Decis

- Tên thông thường của Decis: Deltamethrin (ISO, BSI)

- Tên thương mại: deltamethrin, Decis®, K-Othrin®, NRDC 161, OMS

chất Deltamethrin bị thủy phân phụ thuộc vào pH, nếu pH 8,0 (23o

C)

là 31 ngày và pH 9,0 (25oC) là 25 ngày (European commission, 2002)

2.6.2 Sơ lược về thuốc trừ sâu Decis 2,5 EC dùng nghiên cứu

Thuốc trừ sâu Decis do công ty Bayer Việt Nam sản xuất Decis chứa hoạt chất gây hại là Deltamethrin và thuộc nhóm độc II Theo chỉ dẫn, Decis dùng để trị sâu cuống lá (đẩy bật sâu cuống lá ra khỏi nơi ẩn nấp hoặc làm tổ) Diệt sâu nhanh chỉ trong vòng vài giây nên sâu hại không có cơ hội phá hoại Sau khi phun thì thuốc thường bám rất chắc trên lá nên khó bị rữa trôi khi mưa Thời gian cách ly 3 ngày Hướng dẫn sử dụng

- Đối với bọ xít hôi gây hại cho lúa: pha 25-30 ml cho bình 16 L

- Đối với sâu cuống lá lúa: Pha 25-30 ml thuốc cho bình 16 L

- Phun ít nhất 2 bình cho 1000 m2

- Phun khi sâu non tuổi 1-2 hoặc 5-7 ngày sau khi bướm rộ

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

- Địa điểm : Các phòng thí nghiệm của Bộ môn sinh học & Bệnh Thủy

Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ

- Thời gian thực hiện : từ tháng 1/2012 đến tháng 7/2012

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Tôm sú có trọng lượng 7 - 13g được chọn mua từ các ao nuôi tôm

3.2.2 Dụng cụ

- Bể dùng chứa tôm và bố trí thí nghiệm

- Bộ dụng cụ tiểu phẩu khay nhựa, lame, lamelle, keo nhựa, cốc thủy tinh, khuôn đúc mẫu, cassette, viết chì, sổ ghi chép, găng tay,…và các dụng cụ cần thiết để làm tiêu bản mô

- Máy xử lý mô, máy đúc khối, máy cắt lát mỏng (Microtome), khay nhuộm mẫu, kính hiển vi, tủ lạnh, tủ hút, máy ảnh,…

3.2.3 Hóa chất

- Thuốc trừ sâu Decis 2,5EC chứa hoạt chất Deltamethrin

- Nước cất, cồn tuyệt đối, formaline, acid acetic, xylen, paraffin, sáp ong,…

- Dung dịch nhuộm mẫu Haematocyline và Eosin (H&E)

- Keo dán Enterlan

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp nuôi dưỡng tôm

Tôm sú có trọng lượng từ 7 – 13g mua từ các ao nuôi tôm được chuyển

về phòng thí nghiệm, dưỡng trong bể 1m3

, 2m3, 200L có chứa nước với độ mặn 10%o Cho tôm ăn 3 lần trong ngày lúc 7giờ, 17giờ, 21giờ bằng thức ăn Tomboy và cung cấp sục khí đầy đủ Hằng ngày theo dõi tôm chết, siphon chất cặn, thức ăn thừa trong bể và bổ sung nước sau khi cho tôm ăn xong

3.3.2 Bố trí thí nghiệm và thu mẫu

Dưỡng tôm sau 10 ngày tiến hành bố trí thí nghiệm Chuẩn bị bể nhựa 200L có qua vệ sinh bằng xà phòng và Chlorine Cấp nước với độ mặn 10%o

vào bể Thí nghiệm được bố trí ngẩu nhiên với 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi bể bố trí 30 con tôm

Thu mẫu lúc 0h, thu ngẫu nhiên 3 con ở 3 bể khác nhau Sau đó cho Decis vào bể ở các nồng độ khác nhau cho mỗi nghiệm thức Sau khi thu mẫu lúc 24h tiến hành tiêm 0,1ml WSSV vào mỗi con tôm

Theo dõi lượng tôm chết và tiến hành thu mẫu sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ

và 96 giờ bằng cách chọn ngẫu nhiên 3 con từ mỗi bể Máu dùng để phân tích các chỉ tiêu miễn dịch, phần đầu tôm cố định trong dung dịch Davidson’s AFA để phân tích mô học Thí nghiệm được bố trí với các nồng độ Decis như sau:

1 Nghiệm thức Đối chứng

2 Nghiệm thức I: 0,001 µg/L + 0,1ml WSSV sau 24 giờ

3 Nghiệm thức II: 0,01 µg/L + 0,1ml WSSV sau 24 giờ

4 Nghiệm thức III:0,1 µg/L + 0,1 ml WSSV sau 24 giờ

5 Nghiệm thức IV: Không có Decis, tiêm 0,1ml WSSV sau 24 giờ

3.3.3 Pha nồng độ thuốc dùng thí nghiệm

- Thuốc trừ sâu Decis 2,5EC, thuốc chứa 25g/L hoạt chất Deltamethrin và 975g/L chất phụ gia

- Thuốc được chuẩn bị bằng cách pha dung dịch mẹ có nồng độ 2.500µg/L Dung dịch mẹ được sử dụng để pha thành các nồng độ thí nghiệm dựa vào thể tích nước trong bể thí nghiệm

Áp dụng công thức: C1V1 = C2V2 để pha nồng độ thuốc Trong đó:

C1 là nồng độ thuốc cần trong thí nghiệm

V1 là thể tích dung dịch trong bể thí nghiệm

C2 là nồng độ dung dịch mẹ

V2 là thể tích dung dịch mẹ cần cho vào bể

Để pha dung 1 L dung dịch mẹ có nồng độ 2.500µg/L từ thuốc trừ sâu Decis 25g/L thì thể tích dung dịch Decis cần phải pha là:

V2 = (C1xV1)/C2 = (2.500µg x 1.000mL)/25.000.000µg = 0,1mL (100µL)

C1 là nồng độ dung dịch mẹ

V1 là thể tích dung dịch mẹ cần pha

C2 là nồng độ thuốc trừ sâu Decis

V2 là thể tích thuốc trừ sâu Decis

Áp dụng công thức trên để pha các nồng độ 0,001 µg/L, 0,01 µg/L, 0,1µg/L cho thí nghiệm với bể 200L có chứa 50L nước

3.3.4 Phương pháp phân tích miễn dịch

3.3.4.1 Tổng tế bào máu

- Tổng số bạch cầu được đếm theo phương pháp của Le Mollac et al (1997)

điều chỉnh theo Lê Hữu Thôi và ctv (2011)

- Máu tôm được thu bằng cách dùng kim tiêm vô trùng có chứa 900µl dung dịch chống đông rút 100µl máu

- Mật độ tế bào máu được xác định bằng buồng đếm hồng cầu và quan sát dưới kính hiển vi (40X) Đầu tiên xem ở vật kính 10X, định vị 5 buồng đếm (vùng kí hiệu chữ C), đưa vào giữa thị trường, chuyển sang vật kính 40X (Hình 3.1 ) Đếm 2 lần lặp lại

Hình 3.1 Buồng đếm hồng cầu

Cách tính tổng tế bào máu: TBC = C x 10 x 5 x 10 (tb/mm3

) (Trong đó C

là tổng số tế bào máu trên 5 vùng đếm)

3.3.4.2 Hoạt tính của Phenoloxidase (PO)

Hoạt tính của Phenoloxidase xác định theo phương pháp của López et al (1996) điều chỉnh theo Lê Hữu Thôi và ctv (2011)

Herández Ly tâm 200µl máu ở 2000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC Loại bỏ phần dịch phía trên Rửa phần viên, hòa tan nhẹ nhàng trong trong 1ml cacodylate-citrate buffer Sau đó ly tâm 2,000 vòng/phút trong

10 phút ở 4o

C Phần viên được hòa tan với 200µl cacodylate buffer Ủ 100µl mẫu với 50µl trypsin (1 mg/ml) trong 10 phút ở 25 – 26o

C Thêm 50µl L-DOPA (3 mg/ml) 5 phút sau thêm 800µl cacodylate buffer

- Mẫu đối chứng gồm 100µl mẫu, 50µl cacodylate (thay thế trypsin), 50µl L-DOPA

- Đo mẫu bằng Microplate reader ở bước sóng 490 nm

- Đọc kết quả sau 1 phút hoặc khi độ hấp thụ trong mẫu đối chứng khoảng 0.02 – 0.05

3.3.4.3 Hoạt tính của Respiratory burst (RES)

Hoạt tính của Respiratory burst xác định theo phương pháp của Song và

Hsieh (1994) điều chỉnh theo Lê Hữu Thôi và ctv (2011)

- Cho 100µl máu trong dung dịch chống đông được làm lắng xuống

trong eppendorf 0.2 ml có chứa 100 µl dung dịch poly-L-lysine (0,2%) để tăng sự kết dính của tế bào

- Ly tâm 2000 vòng/phút trong 15 phút Loại bỏ huyết tương

- Thêm vào 100 µl zymosan (0,1% trong Hanks’ solution minus phenol red)

- Để 30 phút ở nhiệt độ phòng Loại bỏ zymosan

- Tế bào máu được rửa 3 lần với 100µl Hanks’ solution

- Nhuộm với 100 µl NBT solution (0,3%) trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Loại bỏ NBT solution, tế bào máu đã được cố định

- Rửa 3 lần với 100 µl methanol 70%, để khô

- Hòa tan bằng cách thêm vào 120 µl KOH 2M và 140 µl dimethyl – sulphoxide

- Đo 3 lần ở bước sóng 630 nm bằng Microplate reader

3.3.4.4 Hoạt tính của Superoxide dismutase (SOD)

Hoạt tính của Superoxide dismutase được xác định theo phương pháp

của Beauchamp và Fridovich (1971) điều chỉnh theo Lê Hữu Thôi và ctv

3.3.5.2 Cắt tỉa và định hướng mẫu

Mẫu sau khi chuyển sang cồn 70% phần đầu tôm được cắt với độ dày 5mm, sau đó cho vào cassette để xử lý mẫu

3-3.3.5.3 Xử lý mẫu

Khử nước: Mục đích của khử nước là loại nước hoàn toàn trong mô mà

không làm mô và các tế bào bị teo hoặc vị trí của các thành phần cấu tạo trong mô không bị thay đổi Vì thế mẫu sẽ được chuyển sang các lọ cồn có nồng độ tăng dần từ 80%, 95%, 100% để quá trình xử lý nước không xảy ra quá nhanh

Làm trong mẫu: Vì cồn không thể hòa lẫn với paraffin nên sau khi khử

nước thì cồn cũng được loại ra khỏi mẫu Nếu không loại bỏ hết cồn, phần mô

đó sẽ bị co rút lại, khối mẫu đúc trong paraffin sẽ không đồng nhất, tạo nên những lỗ trên lát cắt Do đó, mẫu mô sẽ được ngấm trong dung môi trung gian (xylen) có thể hòa tan cồn và paraffin

Ngấm paraffin: Paraffin là chất nền để bảo đảm cho tế bào giữ nguyên

hình dạng khi cắt Vì thế sau khi làm trong, mẫu mô sẽ được ngấm paraffin nóng chảy (57-60oC) bằng cách chuyển mẫu qua nhiều lọ paraffin

Quy trình xử lý mẫu mô được cài đặt trong máy xử lý mô tự động (microm, STP 120-2) qua các bước sau:

Bảng 3.1 Quy trình xử lý mẫu tự động

Sau khi hoàn thành các bước cài đặt chương trình xử lý mô thì tiến hành cho sọt chứa mẫu mô tôm vào lọ số 1 và tiến hành quy trình xử lý

3.3.5.4 Đúc khối

Chuyển cassette chứa mẫu đã được xử lý vào khoang chứa paraffin nóng

STT Hóa chất sử dụng Thời gian

sẽ được đặt trong một khung cố định bằng inox và tiến hành đúc khối bằng paraffin nóng chảy ở 65oC Đổ một ít paraffin vào khuôn inox, gắp bỏ mẫu vào khuôn sau đó đặt mẫu ngay ngắn và ấn sát mẫu vào đáy khuôn, đặt cassette có kí hiệu mẫu lên trên, tiếp tục đổ paraffin vào khuôn inox, đặt khuôn inox qua ngăn làm lạnh nhanh để paraffin rắn lại, sau đó tách khối paraffin ra khỏi khuôn và chuẩn bị cắt mẫu

3.3.5.5 Cắt mẫu

Chuẩn bị máy cắt: Đặt dao vào máy cắt, vặn ốc thật chặt Độ lệch của

lưỡi dao so với mặt cắt của khối mẫu tạo thành một góc 15-30o Khối mẫu sẽ được cắt thành những lát cắt khi tay quay của máy quay tròn, sau mỗi vòng quay sẽ có một lát cắt được hình thành

Tiến hành cắt mẫu: Gắn mẫu vào máy cắt theo chiều ngang của

cassette sao cho khối mẫu ngang và thẳng đứng, sau đó điều chỉnh độ dày của lát cắt Bắt đầu những lát cắt 12-16µm, sau khi đã cắt bằng mặt của khối mẫu

và đến vị trí mong muốn, điều chỉnh độ dày của lát cắt về vạch 2µm và tiến hành cắt mẫu

3.3.5.6 Dán mẫu lên lame

- Chuẩn bị dung dịch dán mẫu Mayer albumin (lòng trắng trứng và glycerol với tỉ lệ 1:1 theo thể tích, trộn đều sau đó lọc qua giấy lọc thô

- Cho một giọt dung dịch Mayer albumin lên lame dùng tay xoa đều để tạo thành một màng mỏng trên lame

- Mẫu được cắt ra thành những băng dài, dùng dao hoặc kim mũi giáo trãi mẫu lên 1 khay lớn đựng nước ấm (40-50oC) để cho mẫu được căng ra

- Sau khi đã chọn được những đoạn mẫu đạt yêu cầu, dùng làm có dán dung dịch Mayer albumin vớt mẫu lên Cầm một đầu của lame, đầu kia cho vào cốc nước thủy tinh phía dưới mẫu, sau đó từ từ nâng lên và điều chỉnh cho mẫu ngay ngắn trên lame

- Để cho mẫu khô tự nhiên khoảng 15 phút sau đó chuyển lame lên bàn sấy

ủ ở nhiệt độ 37oC khoảng 12 giờ hoặc sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 60oC để loại bỏ paraffin sau đó tiến hành nhuộm mẫu

3.3.5.7 Nhuộm mẫu

Bảng 3.2 Nhuộm mẫu theo phương pháp Mayer’s Hematoxyline & Eosin

STT Hóa chất sử dụng Thời gian

3.3.4.10 Dán lamelle vào lame

Để bảo quản mẫu được lâu cần dùng keo dán Enterlan để dán tiêu bản vĩnh viễn Nhỏ một giọt keo dán lên vùng có miếng mô, đặt lamelle nghiên

45o và tiếp xúc với giọt keo, dùng kim mũi giáo hạ lamelle xuống từ từ để tránh bọt khí Để khô lame sau đó đọc kết quả

3.3.4.11 Quan sát tiêu bản và đọc kết quả

Đầu tiên mẫu được quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 4X để nhìn tổng quát tiêu bản, sau đó chuyển qua độ phóng đại lớn hơn lần lượt ở 10X, 40X và 100X

3.3.6 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thu được sẽ được phân tích bằng cách sử dụng ANOVA một nhân tố (P < 0,05) từ chương trình SPSS 13.0 và chương trình Microsoft Excel

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả miễn dịch tôm sú cảm nhiễm với Decis và WSSV

4.1.1 Kết quả của quá trình gây cảm nhiễm

Tôm sú gây cảm nhiễm đƣợc thu mẫu lúc 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ, máu tôm đƣợc sử dụng cho việc phân tích các chỉ tiêu miễn dịch, phần đầu tôm đƣợc cố định trong Davidson’ AFA để phân tích mô Đến khoảng 54 giờ sau khi gây cảm nhiễm tôm đồng loạt chết ở các nghiệm thức I, II, III và IV Nghiệm thức IV chỉ tiêm WSSV chết hoàn toàn, nghiệm thức I, II, III còn sống vài con, trong khi đó nghiệm thức đối chứng chỉ chết 1 con (Phụ luc C, bảng 2) Vấn đề tôm chết đồng loạt nguyên nhân có thể là do tiêm WSSV vào

cơ thể tôm với nồng độ không phù hợp, vƣợt quá khả năng chịu đựng của tôm, gây sốc tôm

4.1.2 Kết quả các chỉ tiêu miễn dịch của tôm với Decis và WSSV

Hình 4.1 Biểu đồ so sánh số lƣợng tổng bạch của tôm sú giữa các nghiệm

thức và các ngày thu mẫu

Kết quả phân tích ANOVA tổng bạch cầu cho thấy mẫu thu lúc 0 giờ,

24 giờ và nghiệm thức đối chứng 48 giờ không có sự khác biệt nhƣng lại

có sự khác biệt ở nghiệm thức I, II, II, IV lúc 48 giờ (hình 4.1) Theo Söderhäll và Cerenius (1992) trong đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của giáp xác, bạch cầu đƣợc sinh ra có khả năng thực bào, phong tỏa melanin hóa và độc tế bào khi có tác nhân gây bệnh xâm nhập Kết quả phân tích tổng bạch cầu cho thấy sau khi bỏ Decis vào thí nghiệm sau 24 giờ, tôm không có sự thay đổi nhiều về số lƣợng bạch cầu sản sinh ra để đáp ứng với