nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chẽm mõm nhọn psammoperca waigiensis (cuvier, 1828) trong nitơ lỏng

Khi vào nước mặn, tinh trùng cá biển có khả năng điều hòa áp suất thẩm thấu để đảm bảo cho tế bào chất không bị mất nước, nhanh chóng thích nghi với môi trường, duy trì hoạt động và khả

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

- *&* -

NGUYỄN THỊ THANH THỦY

NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN TINH TRÙNG CÁ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

- *&* -

NGUYỄN THỊ THANH THỦY

NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN TINH TRÙNG CÁ

CHẼM MÕM NHỌN Psammoperca waigiensis

(Cuvier, 1828) TRONG NITƠ LỎNG

CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

MÃ SỐ: 60 62 03 01

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS LÊ MINH HOÀNG

Nha Trang, năm 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả của luận văn “Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá

chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis (Cuvier, 1828) trong nitơ lỏng” thuộc đề

tài “Nghiên cứu một số đặc tính và bảo quản tinh trùng cá chẽm mõm nhọn

Psammoperca waigiensis (Cuvier, 1828)” do Quỹ khoa học và công nghệ Quốc gia

(NAFOSTED) tài trợ - trường Đại Học Nha Trang chủ trì - TS Lê Minh Hoàng chủ

nhiệm, được thực hiện từ tháng 12 năm 2011 đến tháng 12 năm 2013 là chính xác Các số

liệu, kết quả trình bày trong luận văn hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong

bất cứ công trình khoa học nào khác tới thời điểm này

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thanh Thủy

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các quý

phòng ban trường Đại học Nha Trang nói chung và Viện Nuôi trồng thuỷ sản nói riêng;

đặc biệt là sự hướng dẫn trực tiếp và tận tình của TS Lê Minh Hoàng đã giúp tôi hoàn

thành tốt đề tài Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến sự giúp đỡ này

Tôi xin cảm ơn các cán bộ, công nhân tại lồng bè nuôi cá Vũng Ngán – Nha Trang –

Khánh Hòa đã giúp chúng tôi nuôi vỗ thành thục cá

Tôi xin ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) hỗ trợ

kinh phí thuộc đề tài giúp tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp

Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến tất cả quý thầy, cô giáo trong Viện

Nuôi trồng thuỷ sản – Trường Đại học Nha Trang đã truyền đạt cho tôi những kiến thức

cơ bản nhất làm cơ sở và nền tảng cho tôi thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và tất cả bạn bè đã giúp đỡ và động

viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày 25 tháng 6 năm 2014

Người thực hiện

Nguyễn Thị Thanh Thủy

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm mõm nhọn 3

1.1.1 Hệ thống phân loại 3

1.1.2 Phân bố: 4

1.1.3 Đặc điểm hình thái: 4

1.1.4 Đặc điểm sinh trưởng 5

1.1.5 Đặc điểm sinh sản 5

1.1.5.1 Tuổi và kích thước thành thục 5

1.1.5.2 Hệ số thành thục 5

1.1.5.2 Mùa vụ sinh sản: 6

1.1.5.3 Sức sinh sản: 6

1.1.5.4 Sự thay đổi giới tính 6

1.2 Đặc điểm tinh trùng cá 6

1.2.1 Quá trình tạo tinh 6

1.2.2 Cấu tạo tinh trùng 7

1.2.3 Đặc điểm sinh lý học của tinh trùng 8

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tinh trùng cá: 9

1.2.4.1 Yếu tố lý học 9

1.2.4.2 Các yếu tố hóa học 11

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình bảo quản tinh trùng cá trong nitơ lỏng 14

1.2.5.1 Kỹ thuật chọn cá thu mẫu: 14

1.2.5.2 Thao tác thu tinh: 14

1.2.5.3 Tỷ lệ pha loãng: 15

1.2.5.4 Chất bảo quản: 15

1.2.5.5 Chất chống đông và nồng độ chất chống đông: 16

1.2.5.6 Thời gian cân bằng: 18

1.2.5.7 Tốc độ hạ nhiệt: 18

1.2.5.8 Phương pháp rã đông: 19

1.3 Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng: 20

1.3.1 Trên thế giới: 20

1.3.2 Ở Việt Nam: 23

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Địa điểm nghiên cứu: 24

2.2 Thời gian nghiên cứu: 24

2.3 Đối tượng nghiên cứu: 24

2.4 Phương pháp nghiên cứu 24

2.4.1 Chọn cá đực và thu tinh 24

2.4.1.1 Chọn cá đực 24

2.4.1.2 Vuốt và thu tinh: 24

2.4.2 Một số đặc điểm của tinh dịch cá chẽm mõm nhọn đưa vào nghiên cứu: 24

2.4.2.1 Màu sắc tinh dịch 24

2.4.2.2 Dung lượng tinh dịch 25

2.4.2.3Mật độ tinh trùng 25

2.4.2.4 Hoạt lực của tinh trùng 25

2.4.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 26

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng lên hoạt lực và vận tốc của tinh trùng cá chẽm mõm nhọn bảo quản trong nitơ lỏng 30

3.2 Ảnh hưởng của chất bảo quản lên hoạt lực và vận tốc tinh trùng cá chẽm mõm nhọn

bảo quản trong nitơ lỏng 31

3.3 Ảnh hưởng của chất chống đông trong quá trình bảo quản tinh trùng cá chẽm mõm nhọn trong nitơ lỏng 33

3.4 Ảnh hưởng của quy trình làm lạnh đến hoạt lực và vận tốc tinh trùng cá chẽm mõm nhọn bảo quản trong nitơ lỏng 36

3.5 Tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở của tinh trùng cá chẽm mõm nhọn sau khi rã đông 38

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 41

4.1 Kết luận 41

4.2 Đề xuất ý kiến: 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các chất bảo quản dùng cho bảo quản lạnh tinh trùng một vài loài cá 16 Bảng 1.2 Các chất chống đông dùng trong nghiên cứu bảo quản lạnh tinh trùng 17 Bảng 1.3 Các loại chất chống đông dùng cho bảo quản lạnh tinh trùng một vài loài cá 18 Bảng 2.1 Một số đặc điểm lý học của tinh dịch cá chẽm mõm nhọn 26 Bảng 2.2 Thành phần 4 chất bảo quản trong 100ml nước cất 28

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình dạng ngoài của cá chẽm mõm nhọn 4

Hình 1.2 Vùng phân bố cá chẽm mõm nhọn trên thế giới 5

Hình 1.3 Cấu tạo tinh trùng cá 7

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chẽm mõm nhọn trong nitơ lỏng 26

Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng đến hoạt lực và vận tốc tinh trùng cá chẽm mõm nhọn bảo quản trong nitơ lỏng 30

Hình 3.2 Ảnh hưởng của chất bảo quản đến hoạt lực và vận tốc tinh trùng cá chẽm mõm nhọn bảo quản trong nitơ lỏng 32

Hình 3.3 Ảnh hưởng của chất chống đông đến hoạt lực và vận tốc tinh trùng cá chẽm mõm nhọn bảo quản trong nitơ lỏng 35

Hình 3.4 Ảnh hưởng của quy trình làm lạnh đến hoạt lực và vận tốc tinh trùng cá chẽm mõm nhọn bảo quản trong nitơ lỏng 37

Hình 3.5 Tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở của tinh trùng cá chẽm mõm nhọn sau 1 tuần, 1 tháng và 1 năm bảo quản trong nitơ lỏng 39

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CCSE : Common carp sperm extender

ASP : Artificial seminal plasma

RFS: : Ringer solution for seawater fish species RFW : Ringer solution for freshwater fish species M-Her : Modified of Her

DMSO : Dimethyl sulfoxide

MỞ ĐẦU

Cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis là loài phân bố ở vùng biển nhiệt đới

và có giá trị kinh tế cao Hiện nay, trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng không có nhiều nghiên cứu về loài này Năm 2003, Nguyễn Trọng Nho và ctv đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh sản và cho thử nghiệm sản xuất giống nhân tạo loài cá này, tuy nhiên số lượng con giống vẫn còn hạn chế [7] Để có thể sản xuất một lượng con giống lớn nhằm cung cấp cho nuôi thương phẩm thì những nghiên cứu về sinh sản nhân tạo và ương nuôi cá chẽm mõm nhọn là rất cần thiết Do đó, thành công của quá trình bảo quản lạnh tinh trùng cá chẽm mõm nhọn sẽ giúp có được nguồn tinh trùng trong bất cứ thời gian nào và giảm chi phí nuôi giữ cá đực

Bảo quản tinh trùng đóng vai trò quan trọng trong các chương trình chọn giống và bảo tồn nguồn gen của vật nuôi, góp phần cung cấp nguồn nguyên liệu cho công nghệ di truyền phân tử áp dụng trong các chương trình chọn giống Nhờ bảo quản tinh ta có thể chủ động trong quá trình sản xuất giống nhân tạo, nhất là trong trường hợp có hiện tượng lệch pha trong sự thành thục giữa giới đực và cái Việc bảo quản tinh góp phần làm đơn giản hóa quá trình vận chuyển cá bố từ nơi này đến nơi khác Ngoài ra, phương pháp này còn hạn chế tối đa việc lưu giữ cá đực bảo tồn dòng thuần ngăn cản suy giảm chất lượng

di truyền do lai cận huyết [98]

Những năm gần đây, cá chẽm mõm nhọn là loài được nuôi rất phổ biến, đặc biệt là

ở Việt Nam [94, 95, 107] Tuy nhiên, vẫn chưa có các nghiên cứu về việc xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình bảo quản lạnh tinh trùng Mặc dù trên thế giới đã có nhiều

nghiên cứu về lĩnh vực này trên nhiều đối tượng như: cá tuyết Đại Tây dương Gadus

morhua, cá tuyết chấm đen Melanogrammus aeglefinus [100], cá bơn Pseudopleronectes americanus [101], cá rô biển Lateolabrax japonicus [43], cá chẽm châu Âu Dicentrarchus labrax [50], cá mú đen Epinephelus malabaricus [56], …nhưng vẫn chưa

tiến hành nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chẽm mõm nhọn trong nitơ lỏng Chính vì thế, nhằm góp phần cung cấp thông tin về các điều kiện tối ưu trong bảo quản lạnh tinh trùng cá chẽm mõm nhọn cũng như chủ động trong sinh sản nhân tạo đối tượng này, đề

tài “Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis

trong nitơ lỏng” được thực hiện

Đề tài này được thực hiện với các nội dung chính sau:

- Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng đến hoạt lực tinh trùng cá chẽm mõm nhọn bảo quản trong nitơ lỏng

- Ảnh hưởng của chất bảo quản đến hoạt lực tinh trùng cá chẽm mõm nhọn bảo quản trong nitơ lỏng

- Ảnh hưởng của chất chống đông khác nhau đến hoạt lực tinh trùng cá chẽm mõm nhọn bảo quản trong nitơ lỏng

- Ảnh hưởng của quy trình làm lạnh đến hoạt lực tinh trùng cá chẽm mõm nhọn bảo quản trong nitơ lỏng

Mục tiêu của đề tài này nhằm tìm ra được: (1) tỷ lệ pha loãng thích hợp nhất, (2) chất bảo quản tốt nhất, (3) chất chống đông và (4) phương pháp làm lạnh tối ưu nhất cho bảo quản tinh trùng cá chẽm mõm nhọn trong nitơ lỏng Thành công của nghiên cứu này sẽ góp phần cung cấp thông tin về các điều kiện tối ưu cho bảo quản lạnh tinh trùng cá chẽm mõm nhọn trong nitơ lỏng giúp cho việc sinh sản nhân tạo đạt hiệu quả hơn; góp phần lưu giữ nguồn gen và bảo tồn giống thuần phục vụ sinh sản nhân tạo

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:

Ý nghĩa khoa học: Là tài liệu tham khảo, cơ sở bước đầu cho các nghiên cứu tương

tự sau này trên các đối tượng khác

Ý nghĩa thực tiễn: Lưu giữ tinh trùng cá chẽm mõm nhọn trong thời gian dài, cung

cấp nguồn tinh trùng luôn có sẵn cho sinh sản nhân tạo

Nha Trang, ngày 25 tháng 6 năm 2014

Học viên thực hiện

Nguyễn Thị Thanh Thủy

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm mõm nhọn

1.1.1 Hệ thống phân loại

Giới (Kingdom): Animalia

Ngành (Phylum): Chordata

Lớp (Class): Actinopterygii

Bộ (Order): Perciformes

Họ (Family): Centropomidae Giống (Genus): Psammoperca

Loài (Species): Psammoperca waigiensis

Sand bass Glass eyed perch Sand perch Waigieu sea perch

1.1.2 Phân bố:

Trên thế giới: Phân bố ở các vùng biển ven bờ các nước nhiệt đới từ đông Ấn Độ

Dương đến tây Thái Bình Dương, giới hạn ở Bắc bán cầu là vùng đảo Ryukyu [28]

Hình 1.2 Vùng phân bố cá chẽm mõm nhọn trên thế giới (Nguồn:www.aquamaps.org,

version of Aug 2010 Web Accessed 9 Mar 2013)

*Màu đỏ: Vùng phân bố của cá chẽm mõm nhọn

Ở Việt Nam: Cá phân bố từ vịnh Bắc Bộ đến vịnh Thái Lan nhưng không nhiều

Chúng thường sống ở vùng đáy, ven biển, cửa sông và ở các thủy vực nước lợ Thường gặp ở các hang, hốc đá, thích nghi với đáy là các rạn san hô có nhiều thực vật lớn như rong, cỏ biển [9]

1.1.3 Đặc điểm hình thái:

Thân dài, dẹt bên, đầu nhỏ nhọn, bắp đuôi ngắn, nền bụng hơi tròn Chiều dài thân bằng 2,7-3,6 lần chiều cao Mép sau xương nắp mang hình răng cưa, góc dưới có một gai khỏe kéo dài Xương nắp mang có một gai dẹp rất khỏe ở gần góc trên Miệng rộng, hàm dưới hơi ngắn hơn hàm trên Xương hàm trên kéo dài đến dưới nền trước đồng tử, phần sau phình rộng Màng nắp mang liền với ức, có 7 tia nắp mang, lược mang dài và cứng [12] Thân phủ vảy lược lớn, dày, phần lược yếu Má và nắp mang có vảy, đỉnh đầu phủ vảy đến giữa hai mắt Hai vây lưng liền nhau, lõm ở giữa Vây lưng thứ hai và vây lưng

hậu môn đều có vảy Vây đuôi tròn, lồi Thân màu nâu xám, bụng trắng bạc Chiều dài lớn nhất 47 cm, thông thường 19-25 cm [12]

1.1.4 Đặc điểm sinh trưởng

Cá chẽm mõm nhọn là loài cá dữ ăn thịt, có hình thái khá giống với cá chẽm châu Á

(Lates calcarifer), nhưng kích thước nhỏ hơn Ngoài tự nhiên, cá hoạt động và bắt mồi

nhiều về đêm, thức ăn chủ yếu là cá và giáp xác nhỏ Trong điều kiện nhân tạo, thức ăn thay đổi tùy theo giai đoạn phát triển Giai đoạn cá bột, thức ăn của chúng là các loại động vật phù du và giáp xác nhỏ như luân trùng, Nauplius của Artermia và Copepoda Từ giai đoạn cá giống trở đi, thức ăn được sử dụng là các loại cá tạp hoặc giáp xác nhỏ Sự sinh trưởng của cá Chẽm Mõm Nhọn tương đối chậm Trong cùng thời gian và điều kiện môi trường, con đựcthường có kích thước nhỏ hơn con cái Ở tuổi 2+ chiều dài trung bình

là 243 mm ở con cái và 223 mm ở con đực Ở tuổi 4+ chiều dài con cái là 269 mm và con đực là 247 mm [107] Ở vùng biển Khánh Hòa, cá chẽm mõm nhọn có tuổi thọ phổ biến trong khoảng 1- 6+, trong đó, nhóm tuổi chiếm tỷ lệ cao từ 2+ đến 4+ Tuổi thành thục lần đầu của Cá Chẽm Mõm Nhọn là 2+ với chiều dài và khối lượng trung bình là 256 mm và

233 gram Thời gian phát triển phôi bình quân 16-18 giờ ở nhiệt độ nước 27-30oC [5]

Cá chẽm mõm nhọn có tỉ lệ con đực thấp khi tuổi càng cao, cá đạt 5+ và 6+ tuổi thì không có con đực [7].Khác với kết quả nghiên cứu của Shimose, T.và ctv cho thấy tỷ lệ

cá đực càng cao khi tuổi cá càng lớn, trên 4+ tuổi [107]

1.1.5 Đặc điểm sinh sản

1.1.5.1 Tuổi và kích thước thành thục

Ở vùng biển Khánh Hòa, cá thành thục lần đầu khi đạt 2+ tuổi, chiều dài toàn thân trung bình đạt 256,2±6,9 mm [4] Tuổi tham gia sinh sản lần đầu của cá đực và cá cái là như nhau

1.1.5.2 Hệ số thành thục

Hệ số thành thục (GSI) của cá cái ở vùng đảo Okinawa Nhật Bản dao động từ 0,07 - 12,56% và ở con đực là 0,03 - 5,81% Hệ số này ở con cái tăng từ tháng 3 đến tháng 5, sau đó giảm đến tháng 10, thấp nhất từ tháng 11 đến tháng 2 Với con đực, hệ số này tăng

từ tháng 3 đến tháng 4, giảm đến tháng 9, thấp nhất từ tháng 11 đến tháng 2 [107] Tại

Khánh Hoà, hệ số thành thục của loài này như sau: con đực: 1- 4,28%; con cái từ 0,62 (giai đoạn II) đến 6,30% (giai đoạn IV) [4]

Hệ số thành thục GSI của cá Chẽm Lates calcarifer, một loài có quan hệ gần gũi với

cá Chẽm mõm nhọn, ở đầm Nha Phu, Khánh Hoà tương đối thấp: Giai đoạn I là 1,04 - 1,07 %; giai đoạn II 2,02 - 2,05%; giai đoạn IV 8,98 - 10,46% Tuyến sinh dục chỉ phát triển mạnh khi đến b ãi đẻ và phát triển nhanh trong thời gian ngắn [10]

1.1.5.2 Mùa vụ sinh sản:

Ở Việt Nam, những nghiên cứu ban đầu về cá chẽm mõm nhọn cho thấy loài này đẻ nhiều lần trong năm, rải rác từ tháng 3 đến tháng 10 trong điều kiện tự nhiên [5]

1.1.5.3 Sức sinh sản:

Sức sinh sản tuyệt đối (AF) của cá dao động trong khoảng 140.000 – 327.600 trứng/cá cái, trung bình 234.616±71.598 trứng/cá cái Sức sinh sản tương đối (RF) dao động trong khoảng 636 – 819 trứng/cá cái, trung bình là 714±73,7 trứng/cá cái [4]

1.1.5.4 Sự thay đổi giới tính

Đối với cá Chẽm mõm nhọn, hiện nay vẫn còn nhiều ý kiến đối lập nhau vềvấn đề này Theo Tamaki Shimose & Katsunori Tachihara (2006), trong quá trình nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh sản của loài này ở đảo Okinawa, Nhật Bản, không tìm thấy cá thể lưỡng tính Tác giả cho rằng không có hiện tượng chuyển đổigiới tính như ở cá chẽm

Lates calcarifer [107] Đối lập với ý kiến trên, SyamsulAkbar, Tinggal Hermawan dan

Zakimin lại cho rằng, cá chẽm mõm nhọn là loài cálưỡng tính với yếu tố đực chín trước Con đực thành thục khi cơ thể đạt 75 - 100 gtham gia sinh sản và sau đó chuyển thành con cái khi cơ thể đạt 150 g trở lên [16]

1.2 Đặc điểm tinh trùng cá

1.2.1 Quá trình tạo tinh

Sự phát triển của tinh trùng được chia làm ba giai đoạn chính: giai đoạn tăng sinh của tinh nguyên bào gốc, sự phân chia phân bào giảm nhiễm và sự biến đổi của tinh tử thành tinh trùng

- Giai đoạn 1: Giai đoạn tăng sinh: Trước khi bắt đầu phát triển tuyến sinh dục, tinh sào còn non chứa tinh nguyên bào gốc (spermatogonia) tăng sinh bằng cách phân chia

nguyên phân Trong giai đoạn này, số lượng của các tế bào gốc trong tinh sào tăng lên qua một số chu kỳ phân bào từ khoảng 5 đến 15 tùy thuộc vào loài Trong quá trình phân chia, tế bào con cần duy trì trực tiếp giữa các tế bào chất với nhau Trong giai đoạn của

sự gia tăng phân bào, các spermatogonia đầu tiên thông qua một giai đoạn có tốc độ phân chia chậm được gọi là spermatogonia A và sau đó thông qua một giai đoạn có tốc độ phân chia nhanh hơn được gọi là spermatogonia B

- Giai đoạn 2: Giai đoạn phân bào giảm nhiễm: Việc phân bào cuối cùng của spermatogonia B tạo ra túi tinh bào (spermatocytes) chính tham gia vào quá trình phân bào giảm nhiễm Trong suốt giai đoạn 2, spermatocytes tiếp tục sự phân chia phân bào giảm nhiễm lần đầu, trong đó bao gồm việc sao chép DNA và tái tổ hợp thông tin di truyền, dẫn đến sự hình thành của spermatocytes thứ cấp Chúng nhanh chóng đi đến phân bào giảm nhiễm thứ cấp nhưng không sao chép DNA, dẫn đến sự hình thành của các tế bào mầm đơn bội gọi là tiền tinh trùng hay tinh tử (spermatids)

- Giai đoạn 3: Sự biến đổi của tinh tử và tinh trùng Tinh tử bắt đầu quá trình biến đổi trong đó các tế bào đơn bội spermatids biệt hóa thành tinh trùng roi Quá trình này làm tế giảm mạnh về kích thước (>80%) [35]

1.2.2 Cấu tạo tinh trùng

Hình 1.3 Cấu tạo tinh trùng cá [104]

Ở các lớp động vật khác nhau, tinh trùng của chúng khác nhau khá nhiều Tuy nhiên tất cả đều có nét chung về hình thái và có liên quan mật thiết đến chức năng chủ yếu là khả năng sống và thụ tinh [1] Cấu tạo tinh trùng gồm 3 phần: phần đầu, phần cổ và phần đuôi

 Phần đầu: Đầu tinh trùng là phần có khả năng kích thích trứng và chuyển vật chất

di truyền vào trong trứng Hình thái của đầu tinh trùng khác nhau tùy loài, có thể là hình

đa giác, hình xoắn (ở cá sụn) hay hình ovan, ở cá xương đầu tinh trùng có cấu tạo đơn giản gần như hình tròn [1]

Đầu tinh trùng thường rất to so với các phần cổ và đuôi Trên cùng của đầu, nằm ngang dưới màng là thể đỉnh Thể đỉnh có hình như chiếc mũ trùm xuống phía dưới, trong đó chứa enzyme Hialuronidaza có tác dụng hòa tan màng tế bào trứng mở đường cho tinh trùng xâm nhập vào khi thụ tinh Thể đỉnh do bộ máy Golgi tạo thành Nhân tinh trùng nằm dưới thể đỉnh, rất to và đông đặc, chứa nguyên liệu di truyền của giao tử đực Bao quanh nhân và thể đỉnh là một lớp tế bào chất mỏng [3]

 Phần cổ: Phần cổ tương đối ngắn, cách đầu bằng một màng mỏng Trong cổ chứa trung tử đầu và trung tử đuôi nằm vuông góc với nhau Từ trung tử đuôi phát ra các sợi trục của tinh trùng Trung tử đầu đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân chia trứng

đã được thụ tinh [1]

 Phần đuôi: Đuôi tinh trùng cá là cơ quan vận động dài và mảnh tùy theo loài Phần đầu của đuôi tinh trùng là vòng xoắn ty thể Ty thể là bào quan mang các enzyme oxy hóa và enzyme oxyphosphorine hóa, do vậy nó có liên quan đến quá trình hoạt động chuyển hóa năng lượng của tinh trùng Phần cuối của đuôi gồm 10 đôi sợi trục: 1 đôi phân bố ở giữa và 9 đôi ở ngoại vi Đuôi đảm bảo cho tinh trùng hoạt động Vì để gặp được trứng, tinh trùng phải chuyển động một khoảng cách nhất định Sự di chuyển được thực hiện bằng cách chuyển động co duỗi lượn sóng và chuyển động đập của đuôi [1]

1.2.3 Đặc điểm sinh lý học của tinh trùng

- Kích thước và số lượng: Kích thước của tinh trùng thường rất bé so với tế bào trứng trong cùng 1 loài Ví dụ: cá rô 20 µm, người từ 50-70 µm, hầu 75 µm, tôm he 10 µm [3], ngược lại, số lượng tinh trùng của chúng lại rất lớn Ví dụ: 1ml tinh dịch cá trắm cỏ có 31,1±1,7 triệu tinh trùng; cá mè trắng có 31,6±2,8 triệu tinh trùng; cá trắm đen có 16,2±0,9 triệu tinh trùng [3]

- Đặc điểm vận động: Khi còn ở trong tuyến sinh dục, tinh trùng không vận động nhưng khi rơi vào nước nó vận động mạnh Ở cá nước ngọt, tinh trùng lao đầu về phía trước sau 1-2 phút chuyển động chậm dần và sau đó chuyển sang chuyển động dao động Khoảng 2-3 phút lượng tinh trùng chuyển động còn rất ít và cuối cùng toàn bộ ngừng hoạt động [1] Hoạt lực của tinh trùng phụ thuộc vào đặc điểm của loài, mức độ thành thục của nó

và điều kiện môi trường mà nó đang sống Sự chuyển động và thời gian vận động của tinh trùng có thể giúp đánh giá được chất lượng tinh trùng Persov [93] đã đề nghị một bảng để đánh giá mức độ (5 mức) chuyển động của tinh trùng sau khi cho vào dung dịch kích hoạt Cụ thể là: Mức 5: Tất cả tinh trùng đều chuyển động tiến thẳng, mức 4: Đa số tinh trùng chuyển động tiến trong hiển vi thường thấy chỉ có một số ít tinh trùng dao động, mức 3: Số tinh trùng chuyển động ít hơn số tinh trùng dao động, đã có một số tinh trùng bất hoạt, mức 2: Rất ít tinh trùng chuyển động tiến, một số ít chuyển động dao động, ¾ số tinh không chuyển động, mức 1: Tất cả tinh trùng không chuyển động

Năng lượng cung cấp cho sự vận động của tinh trùng chủ yếu dựa vào sự phân giải glucid, năng lượng dự trữ của tinh trùng Sự vận động là tiêu chuẩn quan trọng nhất để xác định sức sống của tinh trùng cá Cá đực thành thục tốt thì tinh trùng khỏe mạnh và tuổi thọ kéo dài hơn so với cá đực chưa thành thục

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tinh trùng cá:

1.2.4.1 Yếu tố lý học

Tinh dịch là sản phẩm tiết của tinh sào và ống dẫn tinh trùng, sự xáo trộn thành phần của nó sẽ dẫn đến thay đổi chất lượng tinh trùng [32, 35] Vai trò chính của các thành phần trong tinh dịch là tạo ra môi trường tối ưu cho hoạt lực tinh trùng [105] Các thông số lý học của tinh dịch được xác định bao gồm: Mật độ tinh trùng, độ quánh, pH, áp suất thẩm thấu, tổng hàm lượng protein [49, 53]

Mật độ tinh trùng là một yếu tố đánh giá chất lượng tinh trùng cá, tuy nhiên mật độ tinh trùng có sự khác nhau giữa các con đực trong cùng loài, giữa mùa sinh sản, giữa các

mùa trong năm và giữa các loài khác nhau [67, 96] Ví dụ, cá Carassius auratus có sự

thay đổi mật độ tinh trùng theo bốn mùa trong năm Mật độ tinh trùng (tb/ml/con đực) vào mùa hè (57,30±10,41tb/ml) và mùa đông (65,09±80,40 tb/ml) cao hơn mùa xuân 9

(48,0±7,08 tb/ml) và mùa thu ( 40,42±16,54×109 tb/ml) [126] Độ quánh (spermatocrit) tinh dịch là một trong yếu tố ảnh hưởng tới mật độ tinh trùng loài cá đó Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng có một sự tương quan giữa mật độ tinh trùng và độ quánh tinh dịch cá

như trên cá hồi Salmonids, cá chép Cyprinids và cá bơn Đại Tây Dương Hippoglossus

hippoglossus [60, 89] Độ quánh của tinh dịch loài được xem như thước đo cho mật độ

tinh trùng loài cá đó [59] Độ quánh cũng thay đổi tùy loài, đặc biệt độ quánh liên quan đến chất lượng nguồn cá đực Độ quánh cao chứng tỏ tinh dịch con cá đó cho mật độ cao hơn với những con cá khi vuốt tinh sẽ loãng hơn [60] Theo Ciereszko (1996) cho rằng mối liên hệ giữa đặc tính sinh lý của tinh trùng là do sự tác động qua lại giữa hàm lượng protein trong tinh dịch và mật độ tinh trùng nhưng vai trò đặc biệt của protein trong tinh dịch vẫn chưa được hiểu rõ [73]

Đối với cá nước mặn, áp suất thẩm thấu của tế bào chất tinh trùng gần bằng với dung dịch nước muối NaCl 0,75%, tức là thấp hơn so với áp suất thẩm thấu của nước biển Khi vào nước mặn, tinh trùng cá biển có khả năng điều hòa áp suất thẩm thấu để đảm bảo cho tế bào chất không bị mất nước, nhanh chóng thích nghi với môi trường, duy trì hoạt động và khả năng thụ tinh của tinh trùng trong điều kiện môi trường có áp suất thẩm thấu cao hơn Để thực hiện được quá trình điều chỉnh nói trên tinh trùng phải tiêu hao một phần năng lượng dự trữ dẫn đến làm giảm tuổi thọ của tinh trùng Tinh trùng cá biển không có khả năng điều hòa áp suất thẩm thấu khi chúng ở trong môi trường có áp suất thẩm thấu thấp hơn so với áp suất thẩm thấu của tế bào chất Tức không có khả năng chống lại sự xâm nhập của nước vào tế bào chất Do đó, khi tinh trùng cá biển vào nước ngọt thì tế bào chất của chúng hút nước, phần đuôi co lại biến thành hình tròn tựa viên bi, những tinh trùng dạng này tuy vẫn sống song không thể vận động được và không có khả năng thụ tinh Như tinh trùng cá đối khi vào nước ngọt bị biến dạng như trên mà vẫn có thể sống được khoảng 30 phút Nếu đưa chúng trở lại vào nước biển bình thường thì nước

từ trong tinh trùng lại có thể thấm ra ngoài, đuôi kéo dài ra như cũ, tinh trùng lại dần dần khôi phục sự vận động có hiệu quả [6, 14]

Đối với hầu hết các loài cá pH tinh dịch là một trong những yếu tố chính kích hoạt tinh trùng vận động như nghiên cứu trên nhóm cá hồi pH tinh dịch thường 7,5 đến 8,5 và

đó cũng là pH tốt nhất cho hoạt lực tinh trùng loài cá này [18] pH bên trong tế bào của tinh trùng thấp hơn khoảng 1 đơn vị so với pH bên ngoài môi trường [18]

1.2.4.2 Các yếu tố hóa học

Thành phần dịch tương tinh trùng cá đã được nghiên cứu từ nhiều thập kỷ qua và các tác giả đều đưa ra kết quả năm ion chiếm ưu thế trong tinh dịch: natri (Na+), kali (K+), clorua (Cl-), canxi (Ca2+) và magiê (Mg2+) Trong đó ion Na+, Cl- chiếm chủ yếu sau đó là K+, 2 ion thứ yếu là Ca2+ và Mg2+ [20, 23, 47] Việc xác định nồng độ của chúng sẽ thay đổi từ loài này sang loài khác, nhưng có một khoảng thích hợp cho mỗi ion để cung cấp những điều kiện tốt nhất cho tinh trùng [15, 31]

Tùy thuộc vào nồng độ của các ion, hầu hết chúng đều tham gia vào việc kích hoạt tinh trùng cá hoạt động bằng cách góp phần vào ion nội bào hoặc bằng cách tăng giảm nồng độ để điều hòa áp suất thẩm thấu [74, 91] Sự tương quan giữa các thành phần, nồng

độ các cation và hoạt lực tinh trùng đã được nghiên cứu trên nhiều loài khác nhau Lahnsteiner và ctv cho rằng có sự tương quan giữa khả năng di chuyển của tinh trùng và

thành phần dịch tương trong tinh dịch cá Alburnus alburnus và gợi ý rằng mối tương

quan này có thể cho biết các thành phần ảnh hưởng tới khả năng di chuyển của tinh trùng Các tác giả kết luận rằng hàm lượng ion Na+ và K+ có mối quan hệ tích cực đôi khi là tiêu cực tương ứng với tỷ lệ phần trăm (%) tinh trùng vận động [52, 74] Trong khi đó Hwang

và Idler đã công nhận sự tương quan giữa tỉ lệ Na+/K+ với khả năng sinh sản tinh trùng

trong cá hồi Đại Tây Dương (Salmo salar) mà không đưa ra một kết luận nào về sự liên

quan đến vận động của tinh trùng cá [60] Tuy nhiên, đa số các nghiên cứu của nhiều tác giả trên những đối tượng khác nhau về cả cá biển, cá nước ngọt hay các loài cá di cư nhận xét, không chỉ có nồng độ các ion nêu trên ảnh hưởng tới sự vận động của tinh trùng

cá mà tỉ lệ giữa các ion cũng có tác động lớn đến hoạt lực tinh trùng cả về mặt tích cực (tức là làm tăng hoạt lực tinh trùng) lẫn tiêu cực (tức là làm giảm, đôi khi kìm hãm hoạt

lực tinh trùng) [29, 111]

* Ion Kali:

Theo Alavi và Cosson, Ca2+ và K+ là 2 ion có nồng độ cao hiện diện trong dịch tương của cá [97] Chúng được coi là chìa khóa để kích hoạt sự vận động của tinh trùng ở

các đối tượng cá biển, nhóm cá hồi Salmonids, cá tầm Acipenseridae Ở nhóm cá hồi, nồng độ K+ trong dịch tương cao (từ 20 đến 60 mM), sự có mặt với nồng độ khá cao có thể liên quan đến sự bất động của tinh trùng trong tinh dịch [55, 86] Sự vận động của tinh trùng được kích hoạt do sự suy giảm nồng độ K+ ngoại bào Tuy nhiên, không chỉ có ion K+ liên quan đến sự kích hoạt khả năng vận động của tinh trùng mà còn có sự tác động của đến khả năng này [87] Một số nghiên cứu chỉ ra rằng các ion hóa trị 2 như Ca2+

và Mg2+ trong môi trường thụ tinh có tác dụng là ion đối kháng hay ức chế ion K+ [21] Các yếu tố ức chế nồng độ K+ có thể phụ thuộc vào sự nhạy cảm của tinh trùng với ion này thay đổi giữa con đực và mùa sinh sản [112]

Cơ chế điều chỉnh vận động của tinh trùng cá tầm và cá thìa Polyodon spathula cho

đến nay vẫn chưa được nghiên cứu sâu nhưng cũng đã được trình bày khá tương đồng với tinh trùng nhóm cá hồi Salmonids [79] Nồng độ ion K+ trong dịch tương cá tầm

Acipenser persicus là 6,92±0,88 mmol/l, với nồng độ này K+ là chất ức chế chủ yếu khả năng vận động của tinh trùng cá tầm [22] Tinh trùng cá chép ít nhạy cảm với ion K+

nhưng khả năng vận động của chúng được phục hồi sau khi cho chúng tiếp xúc với môi trường có ion K+ với nồng độ cao khi tinh trùng đang ở trạng thái bất động [127] Do đó,

K+ là ion quan trọng kiểm soát khả năng vận động của tinh trùng cá [116]

* Ion Canxi:

Canxi ngoại bào được xem là điều kiện tiên quyết bắt đầu sự vận động của tinh trùng

ở một số loài cá [68] Các dòng Ca2+ từ bên ngoài đi vào tế bào chất của tinh trùng có tác dụng gây kích thích vận động của tinh trùng và tham gia vào sự kích hoạt của một số enzym hoặc các protein [116] Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra ảnh hưởng có thể có hoặc sự đóng góp vào kho canxi nội bào trong ty thể cũng kích thích tinh trùng hoat động Krasznai lại cho rằng trong tinh trùng cá chép các dòng canxi ngoại bào tạo ra sự giải phóng các Ca2+ từ lưu trữ, nhưng trong trường hợp này không có các dòng của canxi từ bên ngoài vào, sự phóng thích canxi từ lưu trữ gây ra bởi các cơ chế khác mà không phải là kích hoạt vận động của tinh trùng, cho thấy rằng đường đi của Ca2+ bên ngoài cũng là một yếu tố cần thiết cho quá trình kích hoạt tinh trùng vận động khi chúng được phóng ra môi trường ngoài [17] Kết quả tương tự được ghi nhận bởi Alavi và Cosson trên tinh trùng cá

hồi thay đổi nồng độ bên trong tế bào của ion Ca2+ từ 30 nM đến 180 nM trước và sau khi vận động [35]

Ở những loài có thể kích hoạt sự vận động trong môi trường ưu trương không chứa ion, có thể tăng nồng độ ion Ca2+ nội bào để kích hoạt tinh trùng vận động hoặc để tạo ra các đợt kích hoạt bằng cách giải phóng từ các kho dự trữ bên trong cùng với lượng Ca2+

có trong tinh dịch

Đối với những loài có thể kích hoạt sự vận động ở môi trường ưu trương không chứa ion, có thể tăng canxi bên trong tế bào là cần thiết để kích hoạt tinh trùng hoạt động hoặc để tạo ra các đợt kích hoạt bằng cách giải phóng từ các kho dự trữ bên trong cùng với lượng canxi có trong tinh dịch Như vậy có thể thấy rằng nồng độ canxi trong tế bào

đã được cho là thành phần quan trọng trong kích hoạt khả năng vận động của tinh trùng

Một nghiên cứu khác cũng về nội dung này trên cá tầm Acipenser ruthenus hoạt lực tinh

trùng đã hoàn toàn bị ức chế tại 0,35 mM Ca2+ và tác giả cũng cho biết thêm chính ion K+

đã gây nên tác dụng ức chế đối với ion Ca2+ [19, 116]

* Ion Natri:

Na+ có một vai trò thứ yếu trong việc kích hoạt và duy trì vận động của tinh trùng cá Thực tế không có nhiều nghiên cứu được tìm thấy để chứng minh về vai trò kích hoạt vận động tinh trùng cá của ion này và chỉ gần đây vai trò của Na+ mới được biết đến qua một

nghiên cứu trên tinh trùng cá trích Sardinella aurit, Vines và đồng nghiệp phát hiện sự trao

đổi qua lại hàm lượng Na+/Ca2+ trong tinh trùng của loài này và công nhận rằng bắt đầu vận động xảy ra bằng cách đảo ngược sự trao đổi Na+/Ca2+ [28] Cơ chế này cho phép tinh trùng thay đổi về phía trước để đảo ngược kênh điều hành dưới sự kiểm soát nồng độ ion bên trong và bên ngoài tế bào Thời gian vận động của loài này có thể dài hơn 60 phút, có

vẻ như rõ ràng rằng các tế bào có thể điều chỉnh tăng canxi bên trong bằng cách hoạt động trong một chế độ đảo ngược Điều này sẽ cho phép khả năng vận động trong thời gian dài cũng như duy trì tinh trùng tiếp xúc với nước biển trong một trạng thái ít tiêu hao năng lượng trước khi tiếp xúc với trứng cho đến khi quá trình thụ tinh xảy ra [116]

* Ion Magie:

Đây cũng là một ion thứ yếu trong dịch tương tinh trùng cá mà có liên quan đến kích hoạt vận động của tinh trùng Theo các nghiên cứu trên cá nước ngọt, ion Mg2+ ức chế sự hoạt động của ion K+, song trên cá biển vẫn chưa có chứng minh nào cho điều đó

Sự ức chế khả năng vận động của tinh trùng trong tinh dịch chủ yếu là do ion K+ trong cá hồi và áp suất thẩm thấu trong cá chép nhưng Mg2+ cũng có phần ảnh hưởng tới tính bất hoạt của tinh trùng [34]

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình bảo quản tinh trùng cá trong nitơ lỏng

Ngoài các yếu tố trên thì quá trình bảo quản lạnh tinh trùng cũng góp phần vào làm giảm chất lượng tinh trùng sau khi bảo quản [42, 110]

1.2.5.1 Kỹ thuật chọn cá thu mẫu:

Đây là khâu đầu tiên rất quan trọng vì chất lượng tinh trùng của cá đực có tốt hay không phụ thuộc vào mức độ thành thục và điều kiện sống của cá đực Khả năng vận động của tinh trùng chưa thành thục hay quá thành thục đều rất kém so với tinh trùng thành thục vừa Ngoài ra, việc sử dụng kích dục tố cũng ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng

1.2.5.2 Thao tác thu tinh:

Trước khi thutinh, dụng cụ cần được khử trùng và để nơi thoáng mát và kiểm tra lại

cá đực Trước khi thu mẫu phải lau khô phần dọc theo bụng cá Khi thu mẫu phải hết sức cẩn thận và nhẹ nhàng, tránh không để phân cá, máu hay nước tiểulẫn vào tinh dịch, nếu không tinh trùng dễ bị kích hoạt dẫn đến thời gian cất giữ ngắn hay không đạt kết quả mong muồn Nên lấy tinh dịch vào buổi sáng sớm hoặc chiều mát để tinh dịch không bị biến đổi, không nên lấy tinh dưới ánh sáng mặt trời để tránh tinh trùng bị sát thương Những ống đựng tinh dịch (eppendorfs tube) nên được để trên khay đá khô, không nên nắm trong tay bởi nhiệt độ cơ thể cao làm giảm tuổi thọ tinh trùng Tinh thu xong được lưu giữ trên đá lạnh và vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm để kiểm tra và xử lý mẫu

1.2.5.3 Tỷ lệ pha loãng:

Theo Stein và Bayrle [108] tỷ lệ thích hợp cho cá chép là 1:3; Legendre và Billard [76] tỷ lệ pha loãng thích hợp cho tinh dịch cá hồi là 1:3; Harvey [61] tỷ lệ pha loãng thích hợp cho tinh dịch cá rô phi là 1:5

Việc lựa chọn được tỷ lệ pha loãng thích hợp sẽ nâng cao sức sống của tinh trùng khi

rã đông, vì vậy nghiên cứu để đưa ra các tỷ lệ thích hợp cho từng loài là cần thiết [92]

- Có chất dinh dưỡng cần cho việc trao đổi chất của tinh trùng

- Tránh được sự kích thích của nhiệt độ

- Áp lực thẩm thấu phải bằng áp suất thẩm thấu của tinh dich hoặc nguyên sinh chất trong tinh trùng

- Có pH thích hợp với pH tinh dịch

- Giúp tinh trùng sống nhưng không vận động

Chất bảo quản khác nhau theo loài, và quan trọng nhất là phải giữ được tinh trùng ở trạng thái bất động Chất bảo quản có thể được pha chế trước và giữ trong tủ lạnh trước khi sử dụng Tỷ lệ pha loãng tối ưu cần được xác định theo từng loài [118]

Công thức của chất bảo quản không nhất thiết phải phức tạp Một vài dung dịch đơn giản như dung dịch chứa NaCl, NaHCO3 và Leceithin [84] cũng cho hiệu quả tốt Ở một

số loài cá biển như cá trích Clupea harengus và cá đối Mugil cephalus [30]; các tác giả

đã sử dụng thành công nước biển pha loãng cho thêm chất chống đông Những nghiên cứu gần đây trên cá rô phi cho thấy sử dụng nước pha thêm 5% Methanol và 15% sữa bột

để pha loãng sẹ cũng có kết quả [84]

Gần đây một số tác giả đã sử dụng đường để làm chất bảo quản cho một số loài cá nước ngọt Horváth và ctv [63] đã sử dụng chất bảo quản với thành phần là 350mM glucose, 30mM Tris, pH 8,0 và 10% Methanol cho cá chép Yavas và Bozkurt [125] sử dụng 350mM glucose, 30mM Tris, và 5% Glycerol (pH = 8,0) cho cá trắm cỏ và kết quả

tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng sau bảo quản là 85,6±2,8%, hoạt lực tinh trùng sau bảo quản

là 83,4±2,1% Tóm lại, việc lựa chọn và sử dụng chất bảo quản là một khâu quan trọng góp phần vào sự thành công của kỹ thuật bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng

Bảng 1.1 Các chất bảo quản dùng cho bảo quản lạnh tinh trùng một vài loài cá

Cá tuyết Đại Tây Dương,

1.2.5.5 Chất chống đông và nồng độ chất chống đông:

Chất chống đông (chất bảo vệ tế bào) là những hợp chất nhỏ có khả năng xâm nhập vào các tế bào tinh trùng Chất chống đông được thêm vào chất bảo quản để hạn chế tối

đa ảnh hưởng của sốc nhiệt, giúp tinh trùng sống lâu trong quá trình làm lạnh và rã đông Một số nghiên cứu cho thấy, ở nhiệt độ thấp, khi trong dung dịch bảo quản không có chất chống đông, chất nguyên sinh của tinh trùng có hiện tượng bị kết lại và tế bào bị phá hủy, dẫn đến tinh trùng bị chết Hiện nay, các chất chống đông thường được sử dụng nhất là DMSO, Glycerol và Methanol Một việc quan trọng nữa là nồng độ chất chống đông Nồng độ chất chống đông phải thích hợp thì mới bảo vệ được các tế bào tốt nhất trong quá trình làm lạnh và rã đông Nồng độ các chất chống đông của các loài cá khác nhau thì

khác nhau, và nồng độ tốt nhất cho các loài cá thường từ 10-15% bao gồm cả DMSO, Glycerol và Methanol

Bảng 1.2 Các loại chất chống đông dùng trong nghiên cứu bảo quản lạnh tinh trùng [39]

monoacetate Glycerin Hydroxyethyl starch

Inositol Lactose Magnesium chloride Magnesium sulfate Maltose

Mannitol Mannose

Methanol Methyl acetamide Methyl formamide Methyl urea

Phenol Pluronic polyols Polyethylene glycol Polyvinyl

pyrrolidone Proline Propylene gycol Pyridine-N-Oxide Ribose

Serine Sodium bromide

Sodium chloride Sodium iodide Sodium nitrate Sodium sulfate Sorbitol Sucrose Triethylene glycol Trimethylamine acetate

Urea Valine Xylose

Trong nghiên cứu bảo quản tinh cá rô phi vằn O niloticus của Rana và McAndrew

[98] cho thấy DMSO có độc tố nặng hơn Methanol khi so sánh các mức nồng độ giống

nhau Có loài có phổ DMSO khá rộng như cá đù đỏ (Sciaenop ocellatusa) 7-15%, nhưng

cá hồi (Salmonid sp) chỉ cho kết quả tốt khi sử dụng Methanol 10% Tóm lại, việc lựa

chọn chất chống đông và nồng độ các chất chống đông là một trong những yếu tố góp phần vào thành công của bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng

Bảng 1.3 Các loại chất chống đông dùng cho bảo quản lạnh tinh trùng của một vài

loài cá

Lòng đỏ trứng 10% + sucrose 0,6M Erdahl-DMSO Cá chó [25]

1.2.5.6 Thời gian cân bằng:

Thời gian cần thiết để chất chống đông thẩm thấu vào tinh trùng gọi là thời gian cân bằng [120] Trong hầu hết các trường hợp, thời gian cân bằng có thể kéo dài từ 10 đến 30 phút nhưng có thể thay đổi phụ thuộc vào chất chống đông được sử dụng Nếu nồng độ chất chống đông cần thiết gây độc cho tế bào thì thời gian cân bằng để chất chống đông thẩm thấu vào tế bào cần được rút ngắn Một số tài liệu cho rằng, thời gian cân bằng là không cần thiết Rana và McAndrew [98] đã kết luận thời gian cân bằng ảnh hưởng

không có ý nghĩa tới hoạt lực tinh trùng cá rô phi (O niloticus) sau khi rã đông, vì trước

khi làm lạnh thời gian từ khi pha loãng đến khi đóng cọng đã mất khoảng 30 phút

1.2.5.7 Tốc độ hạ nhiệt:

Một trong những yếu tố quan trọng trong kỹ thuật bảo quản lạnh là tốc độ hạ nhiệt Tốc độ hạ nhiệt phải đủ chậm để cho nước ra khỏi các tế bào để các tinh thể băng không hình thành trong các tế bào và nhanh chóng gia tăng nồng độ muối trong các tế bào để không làm hỏng các thành phần trong tế bào [82, 83] Tốc độ hạ nhiệt ảnh hưởng lớn đến thành công của việc bảo quản tinh, vì vậy cần tìm được chu trình hạ nhiệt phù hợp cho từng đối tượng nghiên cứu Có nhiều phương pháp làm lạnh hỗn hợp tinh dịch trước khi chuyển vào lưu giữ trong nitơ lỏng Có thể làm lạnh trong nitơ lỏng cách bề mặt của nó khoảng 3-10 cm, hoặc làm lạnh trong đá Thuận lợi hơn cả là làm lạnh bằng chương trình

hạ nhiệt được cài sẵn trong máy tính Tốc độ làm lạnh được điều chỉnh với các tốc độ

khác nhau tùy theo loài Trong thực tế, phương pháp làm lạnh thành công và thực tế nhất

về bảo quản lạnh tinh trùng cá là phương pháp làm lạnh hai bước Bước đầu tiên là giảm nhiệt độ của tinh trùng từ nhiệt độ lưu giữ (ví dụ, nhiệt độ lưu giữ bình thường tinh trùng

cá hồi là 4oC) đến khoảng -70oC Tốc độ làm lạnh tối ưu cho tinh trùng từng loài khác nhau ở bước này là khác nhau Bước thứ hai là cho tinh dịch vào nitơ lỏng -196oC [44] Theo Forgason và ctv [51] phương pháp làm lạnh trong hơi nitơ lỏng ở mức cao vào khoảng 5-10cm trong khoảng thời gian từ 10-12 phút sau đó chuyển từ từ xuống nitơ lỏng, phương pháp này không cần thời gian cân bằng Moczarski [85] cũng làm lạnh tinh

cá chép Nhật bản trên bề mặt và cách nitơ lỏng 3-5cm Phương pháp của Bouysson và Chupin [13] đã thử nghiệm trên các mức nhiệt độ khác nhau trong nitơ lỏng như: nhiệt độ cách bề mặt nitơ lỏng 2mm là -80oC xuống -85oC, 4mm là -70oC xuống -75oC, và 20mm

là -50oC xuống -55oC Dung dịch tinh cá hồi có chứa 7-10% DMSO làm lạnh với tốc độ

hạ nhiệt 30-35oC/phút bằng chương tình đã cài đặt sẵn trong máy tính, kết quả từ 0-98% trứng được thụ tinh Tốc độ hạ nhiệt ảnh hưởng rất lớn đến kết quả bảo quản vì vậy cần tìm ra quy trình hạ nhiệt phù hợp cho từng đối tượng nghiên cứu

1.2.5.8 Phương pháp rã đông:

Sau quá trình bảo quản, tinh cá cần phải được rã đông để đưa vào sử dụng Do điều kiện bảo quản ở nhiệt độ thấp, tinh trùng đang ở trạng thái kết tinh nên cần áp dụng phương pháp rã đông chính xác mới đảm bảo tinh trùng sống lại sau khi rã đông Tùy vào các loài cá khác nhau, tùy vào việc sử các chất chống đông và tùy vào điều kiện thí nghiệm mà tiến hành rã đông ở các thang nhiệt độ và thời gian rã đông khác nhau Ví dụ Horvath và Urbanyri [62] rã đông tinh trùng cá trê ở 40oC trong 5 giây, tỷ lệ vận động

của tinh trùng đạt 50% Yasui và ctv [124] rã đông tinh trùng cá chạch Misgurnus

anguillicaudatus ở nhiệt độ 25oC trong 10 giây cho kết quả thụ tinh là 47% Theo nghiên

cứu của Le và ctv [75]đã tiến hành rã đông tinh trùng cá đù vàng Larimichthys polyactis

ở nhiệt độ 37oC trong 30 giây, tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở sau 1 tuần lần lượt là 45,7±3,2%

và 27,2±5,0%

Dựa vào những đặc điểm và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực của tinh trùng, cho đến nay đã cónhiều nghiên cứu ứng dụng rộng rãi biện pháp bảo quản tinh trùng ở dạng

nguyên tinh dịch trong các dụng cụ khô ráo ở nhiệt độ thấp đã có thể kéo dài tuổi thọ của tinh trùng một cách hiệu quả Đặc biệt là phương pháp bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng đang được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới

1.3 Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng:

1.3.1 Trên thế giới:

Tình hình nghiên cứu chung: Trước những năm 50 của thế kỷ XX, việc luu giữ

tinh trùng ở điều kiện nhiệt độ thấp như bảo quản trong tủ lạnh hoặc trong đá khô đã được thực hiện, tuy nhiên kể từ khi công trình của Blaxter được công bố vào năm 1953

trên đối tượng cá trích (Clupea herengus), việc bảo quản tinh đã được tiến hành phổ biến

trên nhiều đối tượng thủy sản Cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu bảo quản tinh được thực hiện trên hơn 200 loài cá, trong đó có trên 30 loài cá biển [110] với việc

sử dụng các dung dịch muối làm chất bảo quản [70] và một số chất làm chất chống đông như DMSO (Dimethyl sulfoxide), Ethylene glycol, Methanol, Glycerol, Trehalose Tóm lại, ở các đối tượng khác nhau sẽ có các quy trình bảo quản tinh khác nhau Và có rất nhiều công trình nghiên cứu bảo quản tinh trùng đã được nghiên cứu thành công và công

bố rộng rãi như cá trích [30]; cá hồi [26, 27, 33]; cá chạch [69], cá mú đen [56]; cá trê châu Âu [77]; cá chình Nhật [90]; cá chép [64, 66, 80, 115, 117]; cá đù vàng [75], …

Đối với cá nước ngọt: Năm 1986, Chao và ctv [41]công bố kết quả bảo quản tinh 6

loài cá rô phi bao gồm Oreochromis aureus, O mossambicus, O niloticuscá rô lai giữa

O niloticus và O mosambicus, và Oreochromis spp pH của tinh dịch các loài cá rô phi

dao động từ 6,2-8,2 Dung dịch bảo quản bao gồm 15% sữa và sử dụng chất chống đông

là Methanol ở nồng độ 5% Tinh trùng được pha loãng với tỉ lệ 1:1 và được nhanh chóng làm lạnh xuống -35oC và hạ nhiệt độ với tốc độ 5oC/ phút cho tới -70oC rồi chuyển vào giữ trong nitơ lỏng Tỉ lệ thụ tinh của tinh trùng rã đông đạt được sau 22 ngày bảo quản (tinh rã đông) khá tương đồng với lô đối chứng (tinh tươi) (72,7%, và 85,7%); với con lai

đạt được tỉ lệ thụ tinh là 93,4%, đối chứng là 90,0% Riêng cá rô phi đỏ (Oreochromis

spp.) sau 304 ngày bảo quản, tinh vẫn có khả năng thụ tinh

Năm 1978, Stein và Bayrle [108] tiến hành bảo quản tinh trùng các loài cá hồi nước ngọt theo phương pháp của Nagase Dung dịch bảo quản bao gồm 10% DMSO và hai

chất bảo quản khác nhau; chất bảo quản 1 có các thành phần như sau: 750 mg NaCl, 200

mg NaHCO3, 53 mg Na2HPO4, 23 mg MgSO4.7H2O, 38 mg KCl, 46 mg CaCl2, 100 mg glucose, 500 mg glycine, 100 ml nước cất và 200 ml lòng đỏ trứng gà; chất bảo quản 2 gồm có: 750 mg NaCl, 200 mg NaHCO3, 38 mg KCl, 100 mg glucose, 100 ml nước cất

và 200 ml lòng đỏ trứng gà Tinh trùng được pha loãng ở tỉ lệ 1:3 (tinh dịch: chất bảo quản), tinh pha loãng được cho trực tiếp vào nitơ lỏng Sau 7 ngày bảo quản, tiến hành rã đông tinh trùng trong 10 ml dung dịch NaHCO3 1% Hoạt lực tinh trùng đạt 70% với thời gian hoạt động của tinh trùng chỉ trong 30 giây

Theo Horváth và Urbanyi (2000) [62], tinh trùng cá trê (Clarias gariepinus) đã

được bảo quản thành công trong nitơ lỏng Tinh được thu bằng cách giết cá đực, dung dịch bảo quản gồm 6% đường fructose và 10% DMSO, pH được điều chỉnh bằng dung dịch đệm NaHCO3 0,1N Tinh sau khi pha loãng với dung dịch theo tỉ lệ 1:1, được cân bằng ở nhiệt độ 3oC trong 10 phút Sau đó chuyển tinh vào cọng rạ thể tích 0,25 ml và làm lạnh theo chương trình chạy nhiệt áp dụng theo Magyary và ctv[81].Phương pháp rã đông nhanh (trong thời gian 5 giây) ở nhiệt độ trong tủ ấm 40oC Kết quả thụ tinh là 90,0-95,0% so với đối chứng hoạt lực tinh trùng sau khi rã đông là 50,0%

Kết quả về bảo quản tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng đã được Horváth và ctv công

bố năm 2007 Sử dụng 5 chất bảo quản khác nhau gồm: sucrose, glucose, fructose, KCl

và dung dịch muối đẳng trương và 2 chất chống đông được sử dụng: DMSO và Methanol với nồng độ 10% Kết quả đạt được cao nhất khi sử dụng glucose và fructose kết hợp với 10% Methanol là dung dịch bảo quản (tỉ lệ thụ tinh lần lượt là: 74,0±15,0% và 71,0±12,0%) [62]

Năm 2009, Yasui và ctv [124] đã công bố kết quả về ảnh hưởng của phương pháp rã

đông lên hoạt lực của tinh trùng cá trắm cỏ Ctenophayryngodon idella sau khi bảo quản

trong nitơ lỏng bằng các cách rã đông khác nhau, kết quả là rã đông các cọng rạ ở nhiệt độ

35◦C trong 30 giây cho phần trăm hoạt lực cao nhất 83,4±2,1%

Tinh trùng của một số loài thuộc họ cá tầm như cá tầm Sterlet (Acipenser ruthenus), cá tầm Beluga (Huso huso) hay cá tầm (Scaphirhynchus albus) đã được nghiên cứu bảo quản

trong nitơ lỏng bằng cách pha loãng tinh trùng ở tỉ lệ 1:1, trong đó dung dịch bảo quản gồm

chất bảo quản mT (modified Tsvetkova’s) với thành phần (23,4 mM sucrose; 0,25 mM KCl;

30 mM Tris và pH được điều chỉnh đạt đến 8) và chất chống đông được sử dụng là Methanol 5% và 10% Tỉ lệ thụ tinh và tỉ lệ nở của tinh trùng sau khi rã đông là cao nhất khi sử dụng 5% Methanol (39±11% và 32±12%) [65]

Đối với các loài cá nước mặn lợ: Năm 1953, Blaxter là người đầu tiên nghiên cứu

bảo quản thành công tinh trùng cá trích (Lupea herenffus) với thời gian bảo quản là sáu

tháng ở nhiệt độ - 70oC trong dung dịch nước biển với nồng độ 0,34% và chất chống đông Glycerol 12,5%, tinh trùng được pha loãng ở tỉ lệ 1:4 Kết quả thu được là 80-85,0% trứng thụ tinh với tinh trùng được bảo quản sau khi rã đông và cho thụ tinh

Cho đến nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng ở các đối tượng cá biển, có khoảng 30 loài đã và đang được nghiên cứu[110], nhiều nhất là

ở cá song (Epinephlus taurina) Theo nghiên cứu của Withler và ctv [121] ở tinh trùng cá

song, hai chất bảo quản được sử dụng có thành phần (chất bảo quản 1 gồm 7,65 mg NaCl, 4,5 mg NaHCO3, 251 mg buffer hòa trong 1000 ml nước cất, chất bảo quản 2 bao gồm 6,57 mg NaCl, 4,5 mg NaHCO3, 251 mg buffer hòa trong 1000 ml nước cất) Chất chống đông là DMSO 10% Sau khi cân bằng ở 5-10oC tinh được chuyển vào trong các cọng rạ có thể tích 1 ml và lạm lạnh trong hơi nitơ lỏng Nhiệt độ rã đông ở 21-26oC trong tủ ấm Kết quả thu được là khoảng 50-75% tinh trùng có hoạt lực sau khi rã đông Artificial seminal plasma (ASP) và 10% ethylene glycol (EG) là chất bảo quản và chất chống đông tối ưu cho bảo quản tinh trùng cá đù vàng trong nitơ lỏng Với quy trình làm lạnh được thực hiện bằng cách hạ nhiệt độ từ nhiệt độ ban đầu xuống -76oC sau đó cho vào nitơ lỏng ở -196oC, tinh trùng được pha loãng ở tỉ lệ 1:3 và được bảo quản trong cọng rạ 0,25ml Sau đó, các cọng rạ được rã đông ở nước ấm (37oC) Kết quả thu được là

tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở sau 1 tuần và 1 năm rã đông lần lượt là 45,7±3,2%, 27,2±5,0%

và 37,5±4,4% 27,2±5,0% [75]

Cùng trên một đối tượng, nhưng ở trong từng điều kiện cụ thể sẽ có một quy trình bảo quản lạnh khác nhau Ví dụ như cùng trên một đối tượng là cá hồi, Stein và Bayrle [108] đã bảo quản tinh trùng các loài cá hồi nước ngọt theo phương pháp của Nagase Sau 7 ngày bảo quản, tinh được rã đông nhanh trong 10 ml dung dịch NaHCO3 1% Hơn

70,0% tinh trùng hoạt động sau khi rã đông, thời gian hoạt động của tinh trùng 30 giây Trong khi đó, Cabrita và ctv [33] đã tiến hành nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá hồi vân trong cọng rạ có thể tích lớn 0,5 ml, 1,8 ml và 5 ml Tỷ lệ pha loãng tinh dịch là 1:3 trong dung dịch theo Erdahl và Graham với 7% DMSO, 10% lòng đỏ trứng và 7,5 mg/ml promine Kết quả là tỷ lệ thụ tinh ở cọng rạ 0,5 ml là 84,0%, cọng rạ 1,8 ml là 73,2%, cọng rạ 5 ml là 73,0%

1.3.2 Ở Việt Nam:

Quy trình bảo quản tinh trùng cũng đã được nghiên cứu ở Việt Nam, song chủ yếu

là trên các đối tượng là gia súc Tuy nhiên chủ yếu là bảo quản tinh trùng trong thời gian ngắn, tinh dịch được lưu giữ ở nhiệt độ thấp khả năng thụ tinh có thể duy trì trong thời gian 1 đến 2 tuần [14] Các nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá mới được thực hiện từ những năm 2000, nhưng phần lớn cũng chỉ bảo quản trong thời gian ngắn, khoảng một vài ngày

Một số loài cá nước ngọt như cá chép, trắm cỏ, Mrigan, cá bỗng đã được nghiên cứu bảo quản tinh thành công, kết quả đạt được: tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng cá chép đạt đến 81,7%, tỷ lệ nở cá con là 75,0%; cá Trắm cỏ có tỉ lệ từ 47,3% đến 97,4%, tỷ lệ nở cá con là 77,0%; cá bỗng tỷ lệ thụ tinh từ 34,7% đến 51,7%, tỷ lệ nở cá con là 74,0% [2] Năm 2003, Nguyễn Minh Thành và ctv [11] đã công bố kết quả đề tài nghiên cứu

bảo quản tinh cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) trong nitơ lỏng Nghiên cứu sử

dụng hai chất bảo quản là Hanks và Hanks không canxi, chất chống đông là DMSO 10%, tỷ lệ pha loãng là 1:6 và 1:9 Tinh dịch pha loãng được làm đông trong máy đông tinh Ncool LM10, sau đó nhúng thẳng vào nitơ lỏng Các cọng rạ chứa tinh đông được rã đông sau thời gian bảo quản từ 7 ngày đến 3 tháng trong nitơ lỏng Các cọng

rạ được nhúng trong nước ấm 40◦C trong 10 giây để rã đông được kiểm tra hoạt lực và thụ tinh với trứng ngay sau khi rã đông Tỷ lệ thụ tinh trung bình là 30,3% đối với dung dịch Hanks và 44,5% đối với dung dịch Hanks không canxi

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm nghiên cứu:

Nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Sinh lý của Viện Nuôi Trồng Thủy Sản – trường Đại học Nha Trang

2.2 Thời gian nghiên cứu:

Từ 6/12/2013 đến 6/6/2014

2.3 Đối tượng nghiên cứu:

Cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Chọn cá đực và thu tinh

2.4.1.1 Chọn cá đực

Chọn cá đực thành thục tốt, màu sắc tươi sáng, hoạt động tốt không bị bệnh hoặc xây sát, dị tật Vuốt nhẹ bụng cá thấy tinh dịch màu trắng sữa chảy ra

2.4.1.2 Vuốt và thu tinh:

Dùng khăn lau sạch xung quanh lỗ sinh dục giúp tránh việc lẫn tạp, nhằm thu mẫu đạt chất lượng Sau đó, vuốt nhẹ bụng cá từ từ cho tinh dịch chảy vào eppendorf tube 1,5ml khô và đã được vô trùng trước đó Chú ý, khi vuốt không để phân, nước tiểu, máu

và nước lẫn vào làm ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng Nên lấy tinh vào buổi sáng lúc trời mát nhằm thu được tinh không bị biến chất, không nên lấy tinh dưới ánh sáng mặt trời để tránh tinh trùng bị tổn thương Tinh dịch sau khi thu xong được giữ lạnh trên đá bào và tiến hành nghiên cứu tại phòng thí nghiệm

2.4.2 Một số đặc điểm của tinh dịch cá chẽm mõm nhọn đưa vào nghiên cứu:

2.4.2.1 Màu sắc tinh dịch

Màu sắc tinh dịch cũng là một trong các yếu tố để đánh giá chất lượng tinh Tinh có chất lượng tốt thường có màu trắng sữa hoặc trắng ngà Trong quá trình thu mẫu để nghiên cứu, tinh dịch được quan sát chủ yếu có màu trắng sữa Trong quá trình lấy tinh

để bảo quản, những mẫu tinh dịch có lẫn máu, tạp chất hay tinh dịch bị loãng thì được loại bỏ

2.4.2.2 Dung lượng tinh dịch

Cá có kích thước, khối lượng, độ tuổi khác nhau nên dung lượng tinh dịch thu được không đồng đều ở mỗi cá thể Lượng tinh thu được dao động từ 1,10 – 1,50 ml/cá thể

2.4.2.3Mật độ tinh trùng

Một số nghiên cứu cho rằng mật độ tinh trùng có quan hệ mật thiết với thời gian bảo quản Mật độ tinh trùng thấp có thời gian bảo quản ngắn hơn so với tinh dịch có mật độ tinh trùng cao hơn ở cùng điều kiện bảo quản Để bảo quản tinh trùng được thời gian dài thì khi chọn mẫu tinh bảo quản ta nên chọn tinh có chất lượng tốt, mật độ tinh trùng cao Chất lượng tinh phụ thuộc vào độ tuổi và mùa vụ sinh sản của cá [17]

Mật độ tinh trùng được xác định bằng buồng đếm hồng cầu Haematocymetes (MARIENFIELD, Germany) trên kính hiển vi có độ phóng đại 400X Tinh dịch được pha loãng trong tube với tỷ lệ pha loãng là 1:1000 (hút 1μl tinh dịch cho vào 1000μl 0,9% NaCl), lắc đều sau đó hút tinh dịch đã pha loãng cho một ít lên buồng đếm hồng cầu đã chuẩn bị sẵn Đếm tinh trùng trong các ô đếm hồng cầu (đếm tổng số tinh trùng trong 4 ô đếm ở 4 góc và 1 ô ở giữa) Mật độ tinh trùng được xác định theo công thức:

M = A x 4000 x R x 1000

80 Trong đó: M: Mật độ tinh trùng trong 1 ml tinh dịch (TB/ml)

A: Tổng số tinh trùng trong 80 ô đếm R: Độ pha loãng

1000: Hệ số pha loãng 80: Tổng số ô đếm 4000: Số nghịch đảo thể tích dung dịch của 1 ô

2.4.2.4 Hoạt lực của tinh trùng

Tinh trùng được pha loãng trong nước cất với tỷ lệ 1:100 (hút 1μl tinh dịch cho vào

99 μl nước cất), sau đó hút 1 μl tinh đã được pha loãng cho lên lamel và quan sát sự vận động của tinh trùng dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400X.Những mẫu có tinh trùng hoạt lực trên 90% được đưa vào nghiên cứu

Bảng 2.1 Một số đặc điểm lý học của tinh dịch cá chẽm mõm nhọn [8]

2.4.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chẽm mõm nhọn trong nitơ lỏng được trình bày

1:1, 1:3, 1:5,

1:10

4 chất chống đông khác nhau

3 quy trình bảo quản khác nhau

Đánh giá các điều kiện tối ưu cho bảo quản tinh trùng trong ni tơ lỏng

Thí nghiệm xác định chất bảo quản:

Tiến hành pha loãng tinh dịchtrong 4 chất bảo quản (RSW, RFW, M-Her, ASP) ở tỷ lệ 1:3 (tinh dịch: chất bảo quản).Tinh dịch pha loãng được hút vào các cọng rạ có thể tích 0,25

ml và bảo quản trong nitơ lỏng Mỗi thí nghiệm được lặp lại 4 lần

Thí nghiệm xác định chất chống đông:

Tinh dịch được pha loãng ở tỷ lệ 1:3, sử dụng ASP là chất bảo quản cùng với 4 chất chống đông khác nhau (DMSO, methanol, glycerol, ethylene glycol) ở 4 nồng độ 5%, 10%, 15% và 20% trong các cọng ra 0,25ml Mỗi thí nghiệm được lặp lại 4 lần

Thí nghiệm xác định quy trình bảo quản:

Tinh dịch pha loãng được làm lạnh bằng các quy trình bảo quản khác nhau Thứ nhất, nhúng trực tiếp các cọng rạ chứa mẫu vào nitơ lỏng Quy trình thứ hai là sử dụng phương pháp hạ nhiệt độ từ từ 10oC/phút từ 25oC xuống - 40oC sau đó hạ xuống -180oC và cuối cùng cho xuống nitơ lỏng để bảo quản Quy trình làm lạnh thứ ba là quy trình làm lạnh gồm 2 bước: tiến hành hạ nhiệt độ cọng rạ xuống -76oC rồi cho xuống nitơ lỏng Quy trình 4: tiến hành đặt các cọng rạ ở các độ cao 2, 4 và 6 cm trên bề mặt nitơ lỏng Ở mỗi độ cao, các cọng

rạ được đặt trên các giá trong thời gian làm lạnh trên hơi nitơ lỏng trong vòng 5 phút trước khi nhúng vào nitơ lỏng Sau khi bảo quản, tiến hành rã đông mẫu để đánh giá hoạt lực của tinh trùng sau 1 tuần, 1 tháng và 1 năm

Thành phần của các chất bảo quản được sử dụng trong thí nghiệm được thể hiện ở Bảng 2.2