Nghiên cứu cấu trúc và khảo sát hoạt tính sinh học của fucoidan và alginate từ hai loài rong nâu sargassum henslowianum và sargassum swartzii của việt nam (tt)

Hoạt tớnh sinh học của ionic polysaccharide phụ thuộc nhiều vào trọng lượng phõn tử, sự phõn bố trọng lượng phõn tử, cấu trỳc và thành phần húa học, đặc biệt phụ thuộc vào vị trớ và hàm

I Giới thiệu luận án

1 Đặt vấn đề

Polysaccharide là cỏc polymer sinh học tỡm thấy trong tự nhiờn trờn cả thực vật và động vật, cả trờn cạn và dưới nước, trong đú rong biển được xem là một nguồn cung cấp polysaccharide rất phong phỳ và

đa dạng Trong phõn tử của polysaccharide từ rong biển thường cú chứa cỏc nhúm chức như carboxyl, sulfate hoặc amino nờn phõn tử chỳng mang điện và được gọi là cỏc ionic polysaccharide Nhiều ionic polysaccharide từ rong biển cú hoạt tớnh sinh học quớ bỏu hay tớnh chất

lý thỳ như khả năng tồn tại ở trạng thỏi gel trong mụi trường nước Chớnh vỡ vậy mà chỳng được sử dụng nhiều trong cụng nghiệp dược phẩm, húa mỹ phẩm và thực phẩm

Rong biển là một nguồn cung cấp phong phỳ polysaccharide núi chung và cỏc ionic polysaccharide núi riờng Trờn thế giới cú khoảng

6000 loài rong biển đó được xỏc định và chia làm 03 ngành rong chớnh

dựa trờn sắc tố của chỳng là rong lục (Chlorophytes), rong nõu (Pheophytes) và rong đỏ (Rhodophytes) Bờn cạnh khả năng cung cấp

cỏc hợp chất cú hoạt tớnh sinh học quý bỏu như cỏc polymer sinh học (fucoidan, laminaran, alginate), rong biển cũn cung cấp cỏc chất chuyển húa thứ cấp như alkaloid, phlorotannin, acetogenin và terpene

Hoạt tớnh sinh học của ionic polysaccharide phụ thuộc nhiều vào trọng lượng phõn tử, sự phõn bố trọng lượng phõn tử, cấu trỳc và thành phần húa học, đặc biệt phụ thuộc vào vị trớ và hàm lượng của cỏc nhúm chức trong phõn tử của chỳng Cỏc ionic polysaccharide cú khả năng tạo thành cỏc dạng cấu trỳc khỏc nhau Từ một monosaccharide cú thể tạo nờn nhiều loại polysaccharide bởi cỏc kiểu liờn kết glycoside khỏc nhau dẫn tới tớnh chất của cỏc polysaccharide khỏc nhau và tạo nhiều hoạt tớnh sinh học, ứng dụng trong cỏc lĩnh vực khỏc nhau Hoạt tớnh sinh học của polysaccharide cũn phụ thuộc vào nguồn gốc địa lý của rong biển Cựng một loại rong biển, cựng một loại polysaccharide nhưng thu thập ở cỏc vị trớ địa lý khỏc nhau sẽ cho cỏc polysaccharide cú cỏc tớnh chất và hoạt tớnh sinh học khỏc nhau

Ở Việt Nam, cỏc nghiờn cứu về polysaccharide từ rong biển đó được một số nhà khoa học tiến hành Cỏc nghiờn cứu này tập trung theo hướng khai thỏc rong, chiết tỏch cỏc polysaccharide từ cỏc rong thu được, xỏc định thành phần, cấu trỳc húa học và đỏnh giỏ hoạt tớnh sinh học của chỳng Tuy vậy, cỏc nghiờn cứu về cấu trỳc húa học của cỏc ionic polysaccharide cú hoạt tớnh sinh học chiết tỏch từ nguồn rong biển Việt Nam vẫn cũn chưa nhiều Nh m gúp phần đi sõu vào việc nghiờn cứu về

thành phần húa học, cấu trỳc và hoạt tớnh sinh học của cỏc ionic polysaccharide để mở rộng khả năng ứng dụng của nguồn rong biển Việt

Nam, chỳng tụi chọn đề tài luận ỏn là “N u u tr v s t

t t s u v t t r u

S r ssu s w u v S r ssu sw rtz t N ”

Những nội dung chớnh của luận ỏn là:

- Thu thập hai loài rong nõu Sargassum henslowianum và Sargassum swartzii ở cỏc vựng biển của Việt Nam

- Xõy dựng quy trỡnh chiết tỏch fucoidan và alginate từ cỏc loài rong này

- Xỏc định thành phần húa học của cỏc fucoidan và alginate

- Xỏc định cấu trỳc bao gồm cả cấu trỳc húa học và cấu trỳc khụng gian của fucoidan và alginate

- Khảo sỏt hoạt tớnh sinh học của fucoidan phõn lập được từ hai loài rong này

2 Đối t-ợng nghiên cứu của luận án

Đối tượng nghiờn cứu của đề tài là fucoidan và alginate phõn lập được từ cỏc mẫu rong thu thập tại cỏc vựng biển của Việt Nam

3 Những đóng góp mới của luận án

3.1 Lần đầu tiờn cấu trỳc của fucoidan chiết tỏch từ rong nõu

Sargassum henslowianum đó được xỏc định với thành phần đường

chớnh là fucose và glucose Cấu trỳc húa học của fucoidan này cú mạch

chớnh tạo thành từ α(1→3)-L-fucose và bị sulfate húa chủ yếu ở vị trớ

C-2, C-4 và một phần của C-3 của fucose Glucose bị sulfate húa tại vị trớ

C-4 và liờn kết với mạch chớnh qua liờn kết glycoside (1-4) Đõy là một fucoidan cú cấu trỳc mới vỡ đa số cỏc fucoidan chỉ bị sulfate húa ở 1 hoặc 2 vị trớ của fucose, trong khi fucoidan này cả 3 vị trớ C-2, C-3 và C-4 đều bị sulafte húa

3.2 B ng cỏch sử dụng cựng cỏc phương phỏp hiện đại như tỏn xạ ỏnh sỏng (LS) và tỏn xạ tia X gúc nhỏ (SAXS), cả cấu trỳc húa học và cấu trỳc khụng gian của ionic polysaccharide được nghiờn cứu Kết quả này

gúp phần nõng cỏc nghiờn cứu về polysaccharide cú nguồn gốc từ rong biển Việt Nam lờn một bước cao hơn và sõu hơn

3.3 Lần đầu tiờn ở Việt Nam hoạt tớnh sinh học in vivo của fucoidan

từ rong nõu Sargassum henslowianum và rong nõu Sargassum swartzii

đó được nghiờn cứu

4 Bố cục của luận án

Luận ỏn gồm 128 trang với 24 bảng số liệu, 29 hỡnh,7 sơ đồ, 144 tài liệu tham khảo và 15 phụ lục Bố cục của luận ỏn: Đặt vấn đề (2 trang),

Chương 1: Tổng quan tài liệu (41 trang), Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (12 trang), Chương 3: Thực nghiệm (19 trang), Chương 4: Kết quả và Thảo luận (37 trang), Kết luận (2 trang), kiến nghị (1 trang), Các công trình đã công bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (12 trang), Danh mục các phụ lục (1 trang)

II NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN

 Các ionic polysaccharide có trong rong biển

 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới liên quan đến nội dung nghiên cứu của luận án

Ch-¬ng 2 ĐỐI TƯỢNG vµ Ph-¬ng ph¸p nghiªn cøu

Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng là:

 Chiết tách các ionic polysaccharide từ rong biển b ng các phương pháp chiết tách thông thường, tham khảo các công bố trên thế giới để đưa ra một phương pháp chiết tách tối ưu, phù hợp với đối tượng và mục đích nghiên cứu của đề tài

 Phương pháp chính để xác định thành phần và cấu trúc hóa học của các ionic polysaccharide là kết hợp các phương pháp sắc ký (GC, LC), phương pháp hóa học và phổ hiện đại (IR, NMR, MS,

LS, SAXS)

 Thử hoạt tính sinh học: khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật, hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính hạ mỡ máu của ionic polysaccharide chiết tách được b ng cách tham khảo các phương pháp đã công bố trên thế giới và quy trình cụ thể tại Việt Nam

Kết hợp giữa con đường nghiên cứu b ng phương pháp hóa học với sự phát triển hiện nay của các phương pháp hoá lý trong nghiên cứu cấu trúc, việc phân tích cấu trúc của các polysaccharide bao gồm các bước chủ yếu:

1 Xác định thành phần monosaccharide b ng con đường thuỷ phân mạch cacbohydrat để cắt các liên kết glycoside Vị trí các nhóm thế

có trong mạch được xác định b ng phổ hồng ngoại (IR)

2 Ghi dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

3 Xác định trật tự liên kết glycoside và các vị trí nhóm thế b ng phương pháp phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ hồng ngoại kết hợp với phương pháp phân tích hóa học

4 Nghiên cứu cấu trúc không gian b ng phương pháp tán xạ ánh sáng (Light scattering-LS) và tán xạ tia X góc nhỏ (Small angel X-ray scattering-SAXS)

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

Trong luận án này, các chất phân lập được thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, hoạt tính hạ mỡ máu và hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư KB, LU, MCF-7, SK-Mel 2 và dòng tế bào thường NIH/3T3

Ch-¬ng 3: Thùc nghiÖm 3.1 Thu thập và phân loại rong biển

Hai mẫu rong thu thập được bao gồm:

Rong nâu Sargassum henslowianum dùng để chiết fucoidan, thu

hái ở bán đảo Sơn Trà – Thừa Thiên Huế, tháng 8 năm 2011

Rong nâu Sargassum swartzii dùng để chiết alginate và

fucoidan, thu hái ở Nha Trang – Khánh Hòa, tháng 3 năm 2011

Các mẫu rong được giám định và xác định tên khoa học bởi TS

Lê Như Hậu (Viện nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ Nha Trang) Sau khi thu hái, mẫu được rửa dưới vòi nước máy để loại muối, cát và phơi trong bóng râm Rong được sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 40-50oC, cắt nhỏ, nghiền thành bột và bảo quản ở nhiệt độ phòng

3.2 Xác định thành phần hóa học của rong

Phân tích protein thô, chất béo thô theo AOAC

3.3 Chiết tách các ionic polysaccharide

Chúng tôi đã chọn lựa được phương pháp thích hợp để chiết fucoidan và alginate phù hợp cho việc phân tích cấu trúc và cho hiệu suất cao

3.4 Xác định thành phần hóa học của ionic polysaccharide

3.4.1 Xác định hàm lượng sulfate

Xác định hàm lượng sulfate b ng phương pháp đo độ đục

3.4.2 Xác định hàm lượng acid uronic

Xác định hàm lượng acid uronic b ng phương pháp carbazole

đo tán xạ ánh sáng tiến hành trên máy ALV 5000 tại Đại học công nghệ Kyoto, Nhật Bản, Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ được được tiến hành tại BL-10C, Photon Factory, Tsukuba, Nhật Bản

3.6 Thử hoạt tính sinh học

Các phép thử hoạt tính sinh học đều được thực hiện tại Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Ch-¬ng 4 kÕt qu¶ vµ th¶o luËn 4.1 Thành phần hóa học của rong

Thành phần hóa học chính của rong bao gồm protein, lipid, sulfate, alginate, laminaran, fucoidan bị ảnh hưởng rất lớn bởi môi trường Kết quả

nghiên cứu về thành phần chính của 2 loại rong Sargassum henslowianum và Sargassum swartzii được tóm tắt trong Bảng 4.1

Thành phần polysaccharide chủ yếu trong rong nâu bao gồm alginate, laminaran và fucoidan Trong 2 mẫu rong mà chúng tôi nghiên cứu có chứa alginate (từ 29,5 đến 35,8%), laminaran < 0,5% và fucoidan

chứa từ 0,82% (Sargassum swartzii) đến 2,2% (Sargassum henslowianum) So sánh với kết quả phân tích hàm lượng polysaccharide trong một số loài rong trên thế giới thì 2 loài rong Sargassum swartzii và Sargassum henslowianum sinh trưởng ở bờ biển Việt Nam có hàm lượng

laminaran thấp hơn, fucoidan là tương đương và hàm lượng alginate là tương đối cao Điều này một lần nữa khẳng định các yếu tố địa lý nơi cây rong sinh trưởng như ánh sáng, nhiệt độ, độ muối đã ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp polysaccharide của rong

4.2 Cấu trúc hóa học của fucoidan từ rong nâu Sargassum

henslowianum

Kết quả xác định thành phần hóa học của fucoidan được đưa ra trên Bảng 4.2 Giống như các fucoidan khác, fucoidan từ rong nâu

Sargassum henslowianum có thành phần bao gồm 4 loại đường trong đó

chủ yếu là 2 loại fucose và glucose Hàm lượng sulfate khá cao hứa hẹn

mẫu fucoidan sẽ có các hoạt tính tốt

Uronic acid (% khối lượng)

Hàm lượng Sulfate (% khối lượng) Fuc Man Gal Xyl Glc

1,8 1 0,05 0,05 0,38 0,92 5,8 25,20

Vị trí của nhóm sulfate gắn vào fucoidan được xác định b ng phổ

IR của mẫu fucoidan (Hình 4.1) Dải hấp thụ tại 3423 cm-1

là của nhóm OH, dải hấp thụ tại 1235 cm-1

(S=O) là đặc trưng cho các sulfate ester Dải hấp thụ ở 1628 cm−1

xác nhận sự có mặt của uronic acid Dải hấp thụ tại 842

cm-1 là do nhóm sulfate tại vị trí C-4 của vòng fucopyranose Bên cạnh đó, trên phổ xuất hiện 1 vai tại khoảng 820cm-1

chứng tỏ sự có mặt của nhóm sulfate tại vị trí C-2/C-3 của vòng fucose

Mẫu fucoidan được thủy phân nhẹ b ng cách sử dụng TFA 0,75M

ở nhiệt độ 60ºC trong thời gian là 60 phút Kết quả thu được mẫu oligosaccharide (ký hiệu HF) để có thể nghiên cứu cấu trúc b ng phương pháp phổ NMR và ESIMS

Hình 4.1 P ổ IR u p ập t r u S henslowianum

Phổ 1

H, 13C-NMR của fucoidan tách chiết từ rong nâu

Sargassum henslowianum lần lượt được đưa ra ở Hình 4.2 và Hình 4.3

Trên phổ 1

H-NMR cho thấy phổ rất phức tạp với độ rộng vạch lớn và trùng chập, điển hình cho mẫu polymer có cấu trúc phức tạp Vùng phổ trong khoảng từ 5,0-5,5ppm là đặc trưng cho proton , khẳng định sự có mặt của -fucopyranosyl Tín hiệu tại 1,3 và 1,2ppm được gán cho C-6 ứng với nhóm CH3 của L-fucopyranose

Trong khi phổ 1

H-NMR có độ phân giải kém thì phổ 13C-NMR (Hình 4.3) có độ phân giải tương đối tốt, các vạch được tách ra khỏi nhau 2 tín hiện ở vùng carbon anomeric 99,0 và 95,0 ppm và 3 tín hiệu

18,64, 18,22 và 17,68ppm ở trường cao, điển hình của nhóm fucopyranoside Tín hiệu tại 99,0ppm và 18,64 được gán cho α(1→3)-L- fucopyranose Tín hiệu tại 95,0 và 17,68 ứng với α(1→4)- L-

α-L-fucopyranose Kết hợp với kết quả phân tích thành phần đường, tín hiệu

tại 102,4 được gán cho α-D-glucopyranosyl Tín hiệu tại 102,4ppm ứng với α-D-glucopyranosyl Kết hợp với phổ ESI-MS sẽ được trình bày

dưới đây, chúng tôi cho r ng tín hiệu yếu ở 18,22ppm thể hiện cho

α(1→3, 4)- L-fucopyranose

Hì 4.2 P ổ 1

H-NMR u t S r ssu s w u

C-NMR u t S r ssu s w u

Phổ ESI-MS của HF được đưa ra trên Hình 4.4 Pic cơ sở tại

m/z 243 là của monosulfate fucose [FucSO3]- Tín hiệu tại m/z 225

đươc gán cho [FucSO3-H2O]- Tín hiệu tại m/z 389 là của [Fuc2SO3]-

Tín hiệu tại m/z 549 gán cho[Fuc2(SO3)3]- Hai tín hiệu ở m/z 405 và

507 là của [FucGluSO3]− và [FucGlu(SO3)2]−

Phổ ESI-MS/MS của ion tại m/z 243 đưa ra trên Hình 4.5

Bérangère Tissot và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của vị trí

nhóm sulfate lên phổ MS, các tín hiệu tại m/z 183 chỉ ra sự có mặt của nhóm sulfate ở vị trí C-4 và tín hiệu tại m/z 139 là do nhóm sulfate tại vị trí C-2 của α-L-Fucose Một tín hiệu có cường độ yếu tại tại m/z 169 là minh chứng r ng fucoidan bị sulfate hóa tại vị trí số

3 của fucose Đây là một đặc trưng riêng chỉ có ở fucoidan đang nghiên cứu vì hầu hết các nghiên cứu về fucoidan đã được công bố thì chỉ có nhóm sulfate tại 1 hoặc 2 vị trí của fucose

Phổ ESI-MS/MS của mảnh tại m/z 389 được đưa ra trên Hình 4.6

Mảnh 243 hình thành do sự cắt liên kết glycoside (dạng Y) có cường độ

mạnh Hai mảnh khác cũng có cường độ mạnh tại m/z 139 (0,2

rong nâu Ascophyllum nodosum và Fucus evanescens

Phổ ESI-MS/MS của ion [FucGluSO3]- tại m/z 405 (Hình 4.7) là

rất phức tạp Các tín hiệu mạnh nhất là sự cắt mạch Y1 tại m/z 243 và 259 từ

phân cắt của fucose monosulfate và glucose Ion dạng B1 tại m/z 225 là do

sự mất nước của monosulfate α-L-Fucp và tại m/z 241 từ sự mất nước của

monosulfate glucose, cả 2 tín hiệu này đều có cường độ khá mạnh Liên quan đến các nghiên cứu về liên kết glycoside, một nghiên cứu trước đây của các phân mảnh của disaccharide của heparin cho thấy cơ chế hình thành các ion 0,2A2 yêu cầu hydro tự do ở nhóm hydroxyl C-3, để hỗ trợ việc cắt mạch tại liên kết C-2-C-3 Bên cạnh đó ion 0,2

A2 tại m/z 345 và 0,2X0 ion có cường độ lớn có thể là b ng chứng của liên kết (1-4) Các ion dạng 0,2

A1 và 3,5

A1 tại m/z 199 và 153, có thể là do sulfate tại vị trí số 4 của glucose

Các kết quả này cũng phù hợp với các thông tin thu được qua phân tích phổ IR và NMR ở trên

Hì 4.4 P ổ ESI-MS sulfate s r s t y p

u t S r ssu s w u

Hì 4.7 P ổ ESI-MS/MS [Fu GluSO 3 ] - t /z 405

Hì 4.8 Sự p u t r u S henslowianum

ự v p ổ ESI-MS/MS

Phổ ESI-MS với kỹ thuật ion hóa nhiều lần là một phương pháp hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc của ionic polysaccharide nói chung và fucoidan nói riêng Các kết quả từ phổ MS cho phép kết luận r ng

fucoidan chiết tách từ rong nâu Sargassum henslowianum thu thập tại

bán đảo Sơn Trà, Thừa Thiên-Huế có mạch chính tạo thành từ

α(1→3)-L-fucose và bị sulfate hóa chủ yếu ở vị trí C-2, C-4 và một

phần của C-3 của fucose Glucose bị sulfate hóa tại vị trí C-4 và liên kết với mạch chính qua liên kết (1-4)

4.3 Cấu trúc không gian của fucoidan từ rong nâu Sargassum

swartzii và phức của nó với protein (Bovine Serum Albumin BSA)

Hoạt tính sinh học của fucoidan không những bị ảnh hưởng bởi cấu trúc hóa học mà còn quyết định bởi cấu trúc không gian của phân tử

Trong số các loài rong nâu, Sargassum swartzii là một trong các loài

rong có sản lượng lớn nhất ở nước ta Đã có các công trình khác nghiên cứu về thành phần, cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của fucoidan chiết tách từ loài rong này Nh m có các nghiên cứu đầy đủ hơn về fucoidan từ loài rong nâu có sản lượng lớn này, trong luận án, cấu trúc

không gian của fucoidan được chiết tách từ rong nâu Sargassum swartzii

thu thập ở biển Nha Trang, ký hiệu FSW được nghiên cứu Chúng tôi tiến hành chiết tách và làm sạch fucoidan ở đây như quy trình tách chiết và

làm sạch fucoidan từ rong nâu Sargassum henslowianum ở trên Kết quả phân tích thành phần hóa học của fucoidan từ rong nâu Sargassum swartzii được đưa ra ở Bảng 4.4

B 4.4 T p ầ ó fucoidan t ết t r u

Sargassum swartzii

Thành phần đường (% mol)

Uronic acid

% khối lượng

Hàm lượng Sulfate

% khối lượng Fucose Galactose Mannose Xylose Glucose