Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người để điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm

Các tấm tế bào da nuôi cấy hoặc vật liệu tương đương da chế tạo từ tế bào da nuôi cấy đã được ứng dụng trong điều trị bỏng, vết thương mạn tính [6],[17],[18]… Mặc dù hạn chế được nguy cơ

ĐẶT VẤN ĐỀ

Da là cơ quan lớn nhất của cơ thể có chức năng bảo vệ Mặc dù chỉ gồm 2 lớp mô chuyên biệt với hai loại tế bào chủ yếu là nguyên bào sợi và tế bào sừng nhưng việc tái tạo khi da bị tổn thương vẫn còn là một thách thức [2],[8] Các tấm tế bào da nuôi cấy hoặc vật liệu tương đương da chế tạo từ tế bào da nuôi cấy đã được ứng dụng trong điều trị bỏng, vết thương mạn tính [6],[17],[18]… Mặc dù hạn chế được nguy cơ lây nhiễm nhưng do khả năng tăng sinh có hạn và tính kích thích đào thải miễn dịch của tế bào cao nên chi phí giá thành vật liệu lớn làm hạn chế khả năng phổ biến ứng dụng trong điều trị Hơn nữa, thành phần các loại vật liệu chỉ là nguyên bào sợi hoặc tế bào sừng nên còn thiếu rất nhiều các thành phần phụ của da như tế bào sắc tố, tế bào nang lông, tế bào tuyến bã Việc khắc phục các hạn chế trên đang được

kỳ vọng vào vai trò tác dụng của các tế bào gốc bởi chúng là những tế bào chưa có chức năng chuyên biệt, chúng có tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau và có khả năng tự thay mới

Tế bào gốc trung mô tồn tại trong tủy xương, máu cuống rốn, dây rốn,

mô liên kết của cơ thể và ở các khoảng kẽ của nhiều cơ quan [14],[42] Các tế

bào này có thể được nuôi cấy và nhân lên in vitro và dưới các điều kiện thích

hợp chúng có thể cảm ứng biệt hóa thành các tế bào xương, sụn, cơ và mỡ Hiện nay, tế bào gốc trung mô được coi là dạng tế bào quan trọng cho công nghệ mô [26],[43] Trong liền vết thương, tế bào gốc trung mô được xác định

là chúng biệt hóa thành các dạng tế bào da khác nhau Tủy xương là nguồn chính của tế bào gốc trung mô nhưng vấn đề thu tủy xương gặp khó khăn và

số lượng ngưới cho tủy xương cũng hạn chế [14],[52] Do sự tăng lên về tuổi tác, khả năng tăng sinh và biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau của tế bào gốc trung mô tủy xương bị giảm đi và các tế bào cũng đặt ra câu hỏi về

nguy cơ nhiễm virus [44] Những vấn đề cần cân nhắc này đã hạn chế các ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc trung mô tủy xưong Hơn nữa, cùng với sự tăng lên về tuổi tác của người cho, số lượng tế bào gốc trung mô trưởng thành trong đó các tế bào gốc trung mô tủy xương cũng bị giảm đi đáng kể Các dữ liệu trước đây đã chỉ ra rằng số lượng tế bào gốc trung mô tủy xương ở người

80 tuổi giảm đi 200 lần so với trẻ mới sinh [45],[63]

Việc tìm kiếm các tế bào gốc trung mô từ nguồn mô khác đã được quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây Dây rốn là mô mềm có chiều dài lớn và là cầu nối giữa thai và bánh nhau để trao đổi oxy, dinh dưỡng…cho thai Tế bào gốc đa năng đã được phát hiện và tách từ những phần khác nhau của dây rốn Các nghiên cứu phôi thai học và kháng nguyên bạch cầu người (Human Leukocyte Antigen – HLA) của các tế bào từ dây rốn cho thấy chúng

có nguồn gốc từ thai nhi chứ không phải từ người mẹ [1],[57]

Mô dây rốn là sản phẩm thải sau khi sinh và là một nguồn tương đối dư thừa Sự thu hồi mô cũng dễ dàng và không bị ảnh hưởng cúa các vấn đề về đạo đức và luật pháp [14],[109] Năm 2004, tế bào gốc trung mô phân lập được từ màng dây rốn Các tế bào này sau khi phân lập và nuôi cấy duy trì, cấy chuyền 3 đến 5 lần trong môi trường nuôi cấy đặc trưng chưa hề bị biệt hoá, vẫn giữ được đầy đủ đặc tính của TBG ban đầu mới phân lập [58],[59], [60],[61]

Từ những cơ sở lý luận trên, cùng với nhu cầu thực tiễn điều trị bỏng - vết thương, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm các mục tiêu:

1 Đánh giá một số đặc điểm phân lập nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn

2 Đánh giá hiệu quả ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 QUÁ TRÌNH LIỀN VẾT THƯƠNG, VẾT BỎNG

1.1.1 Diễn biến lâm sàng vết thương, vết bỏng sâu

Diễn biến vết thương nói chung đều trải qua các giai đoạn viêm, tăng sinh, tái lập mô và liền sẹo Thông thường, các vết thương liền trong vòng 4 –

6 tuần [2],[8],[53] Các vết thương khuyết da hoặc bỏng sâu toàn bộ lớp da thì quá trình liền vết thương đều phải trải qua quá trình hình thành mô hạt Khi vết thương có mô hạt tốt thì các tế bào biểu mô từ bờ mép vết thương mới tăng sinh và di cư vào phía trung tâm vết thương để làm lành hoàn toàn vết thương hoặc phải ghép da nếu đường kính tổn thương trên 5 cm Thông thường vết bỏng sâu hoặc vết thương mất da sẽ có tổ chức hạt tốt sau 10-15 ngày nếu vết thương không bị nhiễm khuẩn và sạch hoại tử Hình thành mô hạt sớm sẽ tạo điều kiện để ghép da tự thân sớm, che phủ đóng kín vết thương,

hạn chế các biến chứng như suy mòn, nhiễm khuẩn [3],[7],[53]

Tùy thuộc vào diện tích, độ sâu của vết bỏng, sức đề kháng của cơ thể, vết bỏng cơ bản tiến triển theo ba giai đoạn đan xen và kế tiếp nhau là: Giai đoạn cấp tính, giai đoạn tái tạo và giai đoạn hình thành sẹo [53],[85]

Giai đoạn cấp tính với biểu hiện viêm cấp, xuất tiết, viêm nhiễm mủ,

rụng hoại tử và làm sạch vết bỏng

Giai đoạn này khởi đầu ngay sau bỏng và bắt đầu bằng đáp ứng tuần hoàn, thể hiện ở phản ứng vi mạch: sung huyết, giãn mạch, tăng tính thấm dẫn tới thoát dịch rỉ viêm và tạo phù nề

Tại vùng bỏng có sự đáp ứng của tế bào viêm: bạch cầu đa nhân trung tính, tiếp theo là đại thực bào, muộn hơn là lympho bào Tế bào viêm có nhiệm

vụ loại bỏ hoại tử, diệt vi khuẩn, khởi động và điều hòa sự liền vết thương

Giai đoạn viêm, tùy theo diện tích và độ sâu của tổn thương bỏng mà

có thể kéo dài 3 – 7 ngày hoặc chồng lấn giai đoạn tái tạo

Giai đoạn tái tạo: Đặc trưng giai đoạn tái tạo là sự tăng sinh của các tế

bào liền vết thương như nguyên bào sợi và tế bào sừng Biểu hiện lâm sàng

của giai đoạn này là hình thành mô hạt, biểu mô hóa từ bờ mép hoặc từ đáy vết thương

- Bỏng biểu bì tự liền bằng quá trình tái sinh biểu bì, bắt nguồn từ tế bào mầm Sự tái tạo bỏng trung bì bắt nguồn từ các tế bào biểu mô còn sót lại

ở các phần phụ của da, kết hợp biểu mô hóa từ bờ mép để phủ kín vết bỏng

- Với bỏng sâu toàn bộ da, sự tái tạo sau khi hoại tử rụng, các quá trình cơ bản là hình thành mô hạt và theo sau là biểu mô hóa từ bờ mép vết thương hoặc phủ kín mô hạt bằng các mảnh da ghép Tạo mô hạt thường bắt đầu từ ngày thứ

3 – 4, hoàn thành vào ngày 21 sau bỏng [13] Mô hạt gồm có các tân mạch, các

tế bào mới và chất nền Trong quá trình liền vết thương, nguyên bào sợi (fibroblasts) được hoạt hóa, tăng sinh và tái tổng hợp fibronectin, tiếp đó là các protein ngoại bào gồm có collagen, elastin và các glycosaminoglycan Mô hạt là

tổ chức liên kết tân tạo, là cơ sở cho quá trình biểu mô hóa Biểu mô hóa phủ kín lớp mô hạt sẽ kết thúc quá trình tái tạo Tuy nhiên, chỉ có các vết thương nhỏ thì cơ thể mới tự làm liền hoàn toàn vết thương Đối với vết bỏng sâu có đường kính tổn thương > 5cm thì việc liền vết thương cần phải ghép da tự thân để che phủ kín tổn thương Các trường hợp tổn khuyết quá rộng, không

đủ da ghép vẫn đang là những thách thức lớn trong việc cứu sống tính mạng bệnh nhân đòi hỏi có những phương pháp khác thay thế như ghép vật liệu thay thế da hay ghép tế bào

Giai đoạn hình thành sẹo: Đây là giai đoạn kéo dài nhất của quá trình

liền vết bỏng: bắt đầu từ khi liền sẹo, kéo dài 12 – 24 tháng hoặc hơn Bỏng biểu bì chủ yếu để lại rối loạn sắc tố, bỏng trung bì thường để lại sẹo nhưng

mềm mại, bỏng toàn bộ da hoặc sâu hơn để lại các hình thái sẹo khác nhau [12], [13]

1.1.2 Các tế bào chủ yếu tham gia liền vết thương

Quá trình liền vết thương có nhiều cơ chế phức tạp nhưng kết quả cuối cùng là tái lập lại các mô tế bào đã bị tổn thương Do đó quan niệm mới trong điều trị các tổn thương ở bất cứ cơ quan nào trong cơ thể là các tế bào tổn thương phải được thay thế bằng các tế bào khoẻ mạnh

Để duy trì chức năng bảo vệ cơ thể, con người cần có da Thành phần tế bào da người chủ yếu gồm 2 loại là nguyên bào sợi và tế bào sừng Nguyên bào sợi là tế bào tạo lớp trung bì còn tế bào sừng tạo ra lớp biểu bì Hai loại tế bào này có những chức năng khác nhau nhưng lại tương tác, kết hợp với nhau

để tạo ra cấu trúc da hoàn chỉnh Hai loại tế bào này cũng là những tế bào chủ yếu làm lành các tổn thương da Khi da bị tổn thương, nguyên bào sợi là tế bào tổng hợp nên đệm gian bào, tiết các yếu tố tăng trưởng tạo điều kiện để tế bào sừng từ bờ mép vết thương tăng sinh che phủ bề mặt làm lành vết thương [6],[7],[8],[85]

1.1.2.1 Nguyên bào sợi, vai trò của nguyên bào sợi trong liền vết thương

Nguyên bào sợi là tế bào có các nét đặc trưng tương tự nhau về hình

thái, về các dấu ấn sợi trung gian trung mô, về vimentin [112],[113] Tuy nhiên, khi phân tích ADN thì các nghiên cứu đều cho thấy các nguyên bào sợi khác nhau đều có các biểu hiện gen của nó, các đặc tính phenotyp, các protein đệm gian bào và các cytokin mang tính đặc thù khu vực [112],[114]

Nguyên bào sợi được tạo ra từ các tế bào trung mô nguyên thủy type 1

có thể biệt hóa thành dạng tế bào nội mạch và quanh mạch [115],[116] Trong những tuần đầu tiên của sự phát triển da thai kỳ, trung bì bao gồm mạng lưới dày đặc các tế bào trung mô cho thấy nhiều sự tương tác giữa các tế bào tiếp xúc gần nhau để tạo ra các tín hiệu giữa các tế bào và ảnh hưởng tới sự biệt

hóa tế bào [117] Từ tuần thứ 14-21 của thai, sự tiếp xúc giữa các tế bào gần nhau làm cho nguyên bào sợi mất dần các tua nhánh bào tương và nguyên bào sợi khi đó giống như nguyên bào sợi da trẻ sơ sinh, đó là các tế bào có dạng hình thoi và lưới nội bào lồi lõm cùng với nhân hình elip Ở giữa trung bì da trẻ sơ sinh, mật độ nguyên bào sợi từ 2.100 đến 4.100 cho mỗi mm3 mô, khả năng sao chép đạt 50 - 100 lần phân chia tế bào [118],[124]

Nguyên bào sợi trong lớp nhú hay lớp lưới của trung bì hoặc gần vùng nang lông đều không phân biệt được trên in vivo nhưng khi nuôi cấy chúng biểu hiện sự khác nhau đáng kể về khả năng tăng trưởng, hình thái tế bào, sự tổng hợp protein đệm gian bào và sự giải phóng cytokine [107] Đáng chú ý là nguyên bào sợi từ lớp nhú trung bì xuất hiện nhỏ hơn, phát triển nhanh hơn,

có số lần phân chia nhiều hơn và ít có dấu hiệu bị ức chế tiếp xúc do mật độ tế bào tăng lên [8],[96] Khi đồng nuôi cấy với tế bào sừng, nguyên bào sợi lớp nhú trung bì tạo ra trung bì có cấu trúc tổ chức và chuyên biệt hơn cùng với việc tạo ra sự kết nối hoàn chỉnh giữa trung bì và biểu bì Nguyên bào sợi lớp nhú cũng tạo ra nhiều yếu tố kích thích dòng đại thực bào mô hạt (GM-CSF) hơn và ít liên quan tới yếu tố tăng trưởng tế bào sừng (KGF) hơn các nguyên bào sợi ở lớp lưới trung bì [131],[132] Hơn nữa, chúng cũng có sự khác nhau trong việc tổng hợp các thành phần đệm gian bào như decorin [109] [111],[112]

Nguyên bào sợi từ lớp nhú và mô trung bì gần nang lông cũng có một số nét phân biệt với nhau nhưng khi trong quá trình liền vết thương chúng có thể giống như nguyên bào sợi cơ [111] Nguyên bào sợi cơ (myofibroblasts) là một dạng đặc biệt của nguyên bào sợi được tìm thấy tại mô hạt và có vai trò rất quan trọng trong quá trình co rút vết thương Chúng có sự khác biệt về chức năng so với các nguyên bào sợi khác là do chúng có các đặc tính sinh lý, hóa học và siêu cấu trúc giống như tế bào cơ trơn [113],[115] Hơn nữa, nguyên bào sợi cơ cũng

được đặc trưng bởi sự có mặt trong bào tương lượng lớn alpha smooth muscle actin là các sợi đồng dạng với sợi actin trong tế bào cơ trơn [18],[22]

Trong quá trình liền vết thương, nguyên bào sợi là tế bào chủ chốt của

phase tăng sinh tái tạo mô Khi da bị thương, nguyên bào sợi được kích hoạt

để tăng sinh, di cư và biệt hóa Sau khi bị thương, các tế bào đầu dòng của tế bào sợi từ tủy xương có thể di cư tới vùng thương tổn mặc dù nguồn chính của nguyên bào sợi vết thương là được di cư từ các nguyên bào sợi ở vùng da lành quanh vết thương [8],[20],[25] Các yếu tố hấp dẫn sự dịch chuyển của tế bào được dẫn dắt bởi thành phần đệm riêng biệt Ví dụ như đệm vết thương tạm thời là thành phần giàu fibrin, fibronectin, acid hyaluronic và sự tồn tại của một số ít collgen Với sự có mặt của PDGF và môi trường đệm tạm thời, thụ thể alpha5 beta1 intergrin được điều chỉnh trên bề mặt nguyên bào sợi để cho phép chúng kết dính với fibronectin và sau đó di cư đến vết thương [13],[15]

Khi nguyên bào sợi lấp đầy tổn thương, chúng thay thế đệm tạm thời bằng tổ chức hạt và cùng với sự có mặt của môi trường giàu collgen, có sự biểu hiện tăng lên thụ thể alpha2 beta1 và giảm thụ thể alpha5 beta1 [13] Theo tuần tự như thế, nguyên bào sợi gắn với collagen và không di chuyển nữa diễn ra thông qua sự ảnh hưởng của yếu tố hấp dẫn fibronectin Hơn nữa, để quá trình di cư tế bào diễn ra, sự giáng hóa đệm gian bào được yêu cầu thông qua sự giải phóng các enzym giáng hóa protein, như các metalloproteinases đệm và cystein proteinases từ tế bào sừng, nguyên bào sợi và đại thực bào, các yếu tố này bị ảnh hưởng bởi các cytokin như interleukin-1 (IL-1), PDGF, TGF-beta và

sự tiếp xúc của tế bào sau đó với các thành phần đệm gian bào bao gồm fibronectin hoặc các mảnh vỡ fibronectin [50],[51],[52]

Nguyên bào sợi tạo ra các thành phần đệm gian bào làm nền cho quá trình biểu mô hóa và cung cấp các sợi laminin, decorin, elastin, fibronectin để

tế bào biểu mô bám và trượt trên đó, giúp tăng nhanh quá trình biểu mô hóa che phủ vết thương Chúng tạo ra protein đệm mà trong đó collagen tạo nên

sự bền vững và toàn vẹn của mô Đồng thời nguyên bào sợi là nguồn cung cấp

quan trọng một số yếu tố tăng trưởng (growth factors - GF) kích thích liền vết

thương như TGF, PDGF, KGF [53],[54],[61] Hơn nữa, nguyên bào sợi chuyển dạng thành myofibroblasts tạo nên sự co rút và liền vết thương nhanh hơn Nguyên bào sợi còn tham gia vào giai đoạn sửa chữa sẹo diễn ra trong nhiều năm sau khi vết thương đó liền [8],[17]

Nguyên bào sợi giải phóng ra các cytokin và các yếu tố tăng trưởng mà

có tác dụng như yếu tố tác động nội lai (autocrine) hay ngoại lai của tế bào (paracrine) Tác động nội lai ảnh hưởng đến sự tổng hợp TGF-beta và tiết yếu

tố tăng trưởng mô liên kết vốn có tác dụng thúc đẩy tổng hợp collagen và cả

sự tăng sinh nguyên bào sợi [62],[67] Tác động ngoại lai ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào sừng đặc biệt thông qua một số chất tiết của nguyên bào sợi như KGF, IL-6 và FGF-10 [69] Đáp lại ảnh hưởng này, tế bào sừng tổng hợp IL-1 và hormone kích thích ngược trở lại nguyên bào sợi sản xuất KGF và như vậy tồn tại 2 vòng tác động ngoại lai [69],[85],[86] Nguyên bào sợi cũng chịu trách nhiệm tạo ra màng nền bởi sự tổng hợp collagen type IV và VII, laminin 5 và nidogen, cũng thông qua sự tiết cytokin (ví dụ TGF-beta) để kích thích tế bào sừng sản xuất các thành phần của màng nền [19],[31] Hơn nữa, nguyên bào sợi còn chịu trách nhiệm đối với việc hình thành các mạch tân tạo và các bạch mạch mới bởi sự tổng hợp các yếu tố thuộc họ tăng trưởng tế bào nội mạch (VEGF) -A, -B, -C và –D [52],[124], [126] Cũng có chứng cớ cho rằng TGF-β1 có thể kích thích tổng hợp mới các VEGF-B, C và-D trên in vivo và như vậy nguyên bào sợi có vai trò tác động ngoại lai quan trọng với các tế bào lympho và nội mạch để duy trì tính hằng định nội mô của da [118],[119]

Một tuần sau khi cắt tạo vết thương da, nguyên bào sợi cơ chiếm ưu thế trong vết thương và có hình dạng khác so với nguyên bào sợi bình thường Ngoài sợi alpha smooth muscle actin, nguyên bào sợi cơ còn phát triển những nếp gấp sâu trong màng nhân và có nhiều kết nối tế bào, các đặc tính này hỗ trợ cho việc các tế bào thực hiện co rút vêt thương [8],[39],[40] Sự biệt hóa thành nguyên bào sợi cơ được cho là kết quả của sự kết hợp các lực cơ học được sinh ra do sự di cư nguyên bào sợi và sự có mặt của TGF-β cũng như fibronectin [8],[126] Tiếp sau quá trình tái biểu mô hóa, nguyên bào sợi cơ có thể trải qua quá trình tự chết hoặc quay trở lại dạng tế bào không co rút [8],[31]

Trong quá trình liền vết thương, đệm ban đầu chứa fibronectin và acid hyaluronic dần được thay thế bởi các collagen khoảng kẽ gồm type I và type III, quá trình này được kiểm soát thông qua sự ảnh hưởng của các cytokin như TGF-beta, IL-1, và các sản phẩm giáng hóa trong sự tương tác với nguyên bào sợi [47],[62],[64] Các collagen khoảng kẽ được tổng hợp bởi nguyên bào sợi tạo ra các đa peptid procollagen được trùng hợp sau khi được tiết ra khỏi

tế bào Các nguyên bào sợi còn sản xuất ra các sợi chun và các glycosaminiglycan Trong giai đoạn sớm của quá trình sửa chữa vết thương, acid hyaluronic chiếm ưu thế ban đầu nhưng sau dần được thay thế bởi các glycosaminoglycan sulphat, decorin và versican Sự thay đổi này tương phản với sự phát hiện rằng da bào thai khi bị thương thì không tạo sẹo vấn đề được cho là có liên quan chặt chẽ đến tỷ lệ collagen type I:III thấp hơn dẫn đến đệm

có tính đàn hồi linh hoạt hơn và mức acid hyaluronic được nâng lên làm hạn chế tối đa sự ức chế tiếp xúc giữa các nguyên bào sợi đang tăng sinh [62],[69],[71]

Để chuyển tổ chức mô hạt thành sẹo ổn định, nguyên bào sợi tổng hợp protein đệm cũng như các enzym metalloproteinase Cả hai đều quan trọng với quá trình tái lập mô và cung cấp sự cân bằng giữa tạo mô và hủy mô Sự

điều tiết các hoạt động của chúng bị ảnh hưởng bởi vi môi trường vết thương, các nghiên cứu đều chỉ ra các nét biểu hiện tương đồng trong các giai đoạn liền vết thương [69],[85]

Nhờ có đặc tính tăng sinh, tạo cấu trúc trung bì và liền vết thương, nguyên bào sợi là một trong dạng tế bào được ứng dụng phổ biến trong chế tạo vật liệu thay thế trung bì, hỗ trợ trong nuôi cấy tế bào sừng để chế tạo tấm biểu bì cũng như trong chế tạo da hai lớp

1.1.2.2 Tế bào sừng

Tế bào sừng tạo nên lớp biểu bì bảo vệ cơ thể, gồm nhiều lớp tế bào sắp xếp chặt chẽ với nhau Lớp mầm hay cũng gọi là lớp đáy chứa các tế bào gốc biểu bì có khả năng tự tồn tại, tự tái sinh nhiều lần và nhanh trong suốt cuộc sống của con người Giữa các tế bào sừng có các cầu nối gian bào (desmosome) làm kết nối chặt chẽ giữa chúng với nhau Các tế bào lớp đáy có cấu trúc cầu nối khác với các lớp ở trên, chúng có thể dễ dàng bị xoá bỏ và cũng tự tái tạo lại để các tế bào sừng mới sinh ra di chuyển lên trên tạo ra các lớp tế bào biệt hoá ở phía trên Trong các tế bào của lớp mầm biểu bì thì chỉ có 10% là tế bào mầm biểu bì, còn lại là các tế bào đang ở các giai đoạn gián phân

Bình thường, sự phân chia tế bào sừng lớp mầm cân bằng với sự sừng hoá bong vảy của biểu bì nhưng khi da bị tổn thương thì chúng tăng cường phân chia để tạo ra nhiều tế bào biểu mô Các tế bào biểu mô sẽ di cư vào trung tâm của vết thương ở dạng đơn lớp cho đến khi các tế bào tiếp xúc trực tiếp với nhau thì tốc độ phân chia chậm lại và biệt hoá thành các lớp gai, lớp hạt, lớp sừng ở phía trên để thực hiện chức năng bảo vệ của biểu bì Trong quá trình di cư, chúng cần đệm gian bào đủ chất lượng như trung bì, chúng cần có các sợi decorin, laminin…để bám vào và trượt dọc theo các sợi đó để

di chuyển vào trung tâm vết thương Trong trường hợp các vết thương mạn tính, cấu trúc đệm gian bào bị tổn thương không hồi phục, vết thương trở nên

xơ sợi, các nguyên bào sợi nghèo nàn hoặc không thể thực hiện đầy đủ chức năng nên các tế bào biểu mô không thể phân chia hay di cư vào vết thương Những trường hợp này dù có được ghép da hay ghép tế bào biểu mô thì nguy

cơ thất bại rất cao

Chính các mối tương tác chặt chẽ giữa hai loại tế bào trên mà trong điều trị cần chú ý tới các điều kiện để cả hai cùng tăng sinh, cùng biệt hoá, cùng thực hiện chức năng liền vết thương thì vết thương mới nhanh liền

Hình 1.1: Sự tăng sinh của nguyên bào sợi trong các giai đoạn khác nhau

của quá trình liền vết thương

*(Nguồn: Werner S et al (2003), Physiol Re;83:835-870), [54]

A 12-24 giờ sau bị thương, nguyên bào sợi quanh tổn thương được kích hoạt

B Từ 3-7 ngày sau bị thương, nguyên bào sợi di cư và vùng tổn thương, tăng sinh và tổng hợp đệm gian bào

C Từ 1-2 tuần sau bị thương, mô hạt hình thành, nguyên bào sợi chuyển dạng thành myofibroblast gây co hẹp vết thương và tiết collagen

1.2 GHÉP TẾ BÀO ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG

Do có vai trò quan trọng quyết định trực tiếp tới quá trinh liền vết thương nên nguyên bào sợi và tế bào sừng cũng là những tế bào được nuôi cấy để ghép trong điều trị vết thương Với mẩu da sinh thiết nhỏ, các tế bào này được phân lập, tăng sinh nhân rộng số lượng và ghép trở lại vết thương

Có nhiều cách thức ghép các tế bào này để điều trị vết thương từ đơn giản đến phức tạp như: phun lên bề mặt vết thương, tiêm vào mô vết thương hoặc nuôi cấy trên giá đỡ để tạo ra tấm tế bào Trong đó, cách thức tạo ra các tấm tế bào được báo cáo là có hiệu quả và ứng dụng rộng rãi hơn cả Các tấm tế bào có thể được gọi là vật liệu tương đương trung bì, tương đương biểu bì hoặc phối hợp cả hai loại tế bào thành vật liệu tương đương da hai lớp [142],[143]

1.2.1 Vật liệu tương đương trung bì có tế bào

Vật liệu thay thế trung bì có tế bào là vật liệu dùng nguyên bào sợi để tạo một cấu trúc tái sinh trên giá đỡ làm từ một số nguyên liệu khác nhau Cấu trúc này được cấy nguyên bào sợi để tổng hợp các protein và các thành phần khác của đệm gian bào mà có tác dụng kích thích những tế bào tại vết thương của người bệnh tăng cường hoạt động để làm nhanh liền vết thương

* TransCyte TransCyte là sản phẩm tạo thành từ việc cấy nguyên bào

sợi từ trẻ sơ sinh trên một lưới nylon đã được phủ collagen trung bì da lợn (tương tự như Biobrane) Những tế bào này tăng sinh và tổng hợp fibronectin, collagen type I, proteoglycans và các yếu tố tăng trưởng trong 17 ngày Nguyên bào sợi này sau đó được bảo quản lạnh cùng với việc bảo quản các thành phần ngoại bào và các yếu tố tăng trưởng mới tổng hợp Vì dùng collagen lợn và protein bò trong môi trường nuôi cấy nên sản phẩm có chống chỉ định đối với các trường hợp quá mẫn Những tiến bộ của TransCyte được chỉ ra trong rất nhiều nghiên cứu, khi sử dụng nó như vật liệu che phủ tạm thời trước khi ghép da, nó rất dễ để tháo bỏ và ít gây chảy máu hơn so với

ghép da đồng loại nhưng vẫn đảm bảo khả năng sống của da ghép ngang bằng

so với ghép da đồng loại [55],[56]

* Dermagraft Dermagraft là vật liệu thay thế trung bì có tế bào sống từ

nguyên bào sợi trẻ sơ sinh được cấy trên giá đỡ polymer polyglactin có khả năng tự giáng hóa Các nguyên bào sợi tiết ra những yếu tố tăng trưởng, bao gồm collagen, tenascin, citronectin và glycosaminoglycan [52] Nhờ tế bào sống trong sản phẩm sau khi vết thương được cấy ghép, nguyên bào sợi tiếp tục tiết ra các yếu tố tăng trưởng và hỗ trợ tế bào chủ đến khi mô sợi có tuần hoàn trưởng thành thay thế những tế bào và mô đã ghép

1.2.2 Vật liệu tương đương biểu bì có tế bào

* Epicel Epicel là một sản phẩm nuôi cấy tế bào sừng tự thân được chỉ

định cho bỏng trung bì sâu hoặc bỏng sâu trên 30% diện tích cơ thể và phẫu thuật cắt các “bớt” bẩm sinh rộng Tế bào sừng được phân lập từ một mảnh da sinh thiết (2x6cm) từ bệnh nhân Sau khi phân lập, tế bào sừng được nhân rộng bằng phương pháp đồng nuôi cấy nguyên bào sợi của chuột và tạo ra tấm vật liệu tương đương biểu bì để ghép Ưu điểm của Epicel là khả năng che phủ bằng mô tự thân chỉ từ một lượng nhỏ mô hiến Đây là một lý thuyết lý tưởng cho những bệnh nhân có diện tích bị thương rộng, có ít hoặc không đủ

da để ghép Nhược điểm của Epicel là chi phí tương đối cao, thời gian để chuẩn bị dài, sự mỏng manh của lớp da do mô ghép biểu bì mỏng nên dễ bị trày xước [12],[72],[73]

* Laserskin Laserskin là một dạng vật liệu ghép biểu bì tự thân có sử

dụng tế bào sừng tự thân từ bệnh nhân được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm

Tế bào sừng sau đó được cấy trên màng có hyaluronic acid este hoá 100% đã được đục lỗ nhỏ bằng laser Trong một nghiên cứu sử dụng Laserskin trên những vết loét bàn chân mạn tính do đái tháo đường, các tác giả đã báo cáo 11 trong 14 trường hợp vết loét liền hoàn toàn sau 64 ngày Tuy nhiên, nghiên

cứu này sơ bộ, không có lô đối chứng hoặc vùng đối chứng và không có theo dõi dài hạn Một nghiên cứu quy mô đa trung tâm mang tính hồi cứu không đối chứng được thực hiện bởi Uccioli tại Italy đã đánh giá hệ thống công nghệ

mô ghép tự thân bao gồm kết hợp giữa nuôi cấy nguyên bào sợi tự thân trong môi trường acid hyaluronic với Laserskin [42],[46],[75]

1.2.3 Vật liệu tương đương da hai lớp có tế bào

Vật liệu tương đương da hai lớp gồm biểu bì và trung bì là sản phẩm mới và phức tạp nhất hiện nay về cấu trúc Vật liệu được tạo ra bởi nuôi cấy nguyên bào sợi và tế bào sừng trên nền là giá thể collagen và cơ chất lycosaminoglycan…[42],[43],[44] Các tế bào sắc tố cũng có thể có mặt trong nuôi cấy, những báo cáo chỉ ra rằng những thay đổi về sắc tố da vùng ghép vật liệu này cũng không ổn định và khó có thể đoán trước Vật liệu này có khả năng tạo ra diện tích che phủ gấp 60 - 70 lần so với mẩu da sinh thiết ban đầu Mặc dù sản phẩm này chưa phổ biến trên thị trường nhưng đây vẫn là tiến bộ

có ý nghĩa nhất trong kỹ thuật ghép da tự thân nuôi cấy

Vật liệu tương đương da đồng loại là sản phẩm mới nhất và tiến bộ nhất gần đây, chúng đang được lưu hành trên thị trường Hai sản phẩm nguyên mẫu của dạng này là Apligraf và Orcel Mặc dù có cấu trúc hai lớp phức tạp bắt chước da thay thế cả biểu bì và trung bì nhưng các vật liệu này vẫn chỉ được coi là thay thế da tạm thời [44] Vật liêu tương đương da hai lớp cung cấp các yếu tố tăng trưởng, các cytokines và đệm gian bào cho các tế bào của người nhận khởi động và điều khiển quá trình liền vết thương, ngoài ra chúng cũng có tác dụng che phủ để giảm đau

Apligraf là một sản phẩm hai lớp phức hợp bởi sự kết hợp của lớp

trung bì tạo bởi gel collagen type I của bò và nguyên bào sợi trẻ sơ sinh tương đương như thành phần của trung bì da với một lớp biểu bì đã sừng hoá tạo thành bởi tế bào sừng trẻ sơ sinh Sản phẩm hiện đang sẵn có và có thời hạn

sử dụng 5 ngày Cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc Hoa Kỳ đã phê chuẩn cho dùng Apligraft điều trị các vết loét tĩnh mạch mạn tính tồn tại trên 1 tháng

và vết loét chi dưới do đái tháo đường thời gian trên 3 tuần Nó cũng có thể được dùng với ghép da mắt lưới mảnh mỏng Apligraf có thể được áp dụng mỗi 4 đến 6 tuần, và tuỳ theo kinh nghiệm của bác sỹ, loại và vị trí vết thương

mà sử dụng số sản phẩm dùng điều trị khác nhau [53]

OrCel là một sản phẩm hỗn hợp 2 lớp trong đó tế bào sừng trẻ sơ sinh

được cấy trên mặt không có lỗ của giá đỡ là miếng collagen type I của bò Nguyên bào sợi trẻ sơ sinh cũng được cấy trên mặt xốp còn lại của miếng collagen Phức hợp 2 lớp này phục vụ như một môi trường hấp thu, cùng với những cytokine và các yếu tố tăng trưởng được tiết ra bởi nguyên bào sợi đồng loại Nhà sản xuất đòi hỏi không có DNA đồng loại có mặt trong vết thương được cấy ghép sau 3 tuần Ít nhiều các dữ liệu cho thấy có thể sử dụng sản phẩm này dù nó được mô tả để sử dụng trong liền vết thương ở những vị trí mô ghép da mảnh [44],[45]

Mặc dù nguyên bào sợi và tế bào sừng là hai loại tế bào chủ yếu của da

và của quá trình liền vết thương nhưng với các vết thương rộng hoặc mạn tính thì chúng cũng vẫn không đủ khả năng làm liền vết thương một cách hoàn chỉnh Việc thay thế các tế bào này bằng các nguyên bào sợi hay tế bào sừng nuôi cấy đã góp phần cải thiện tình trạng này nhưng vẫn còn đó những hạn chế như khả năng tăng sinh yếu khi lấy tế bào ở người có tuổi, hoặc khả năng đào thải miễn dịch mạnh khi ghép đồng loài Do đó, tế bào gốc và các vật liệu hay thuốc điều trị vết thương từ tế bào gốc đang được kỳ vọng trong thế kỷ 21

để giải quyết các vấn đề nan giải của điều trị vết thương nhất là các vết thương diện tích rộng hay vết thương mạn tính [94],[95]

1.3 TẾ BÀO GỐC, TIỀM NĂNG VÀ ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC 1.3.1 Tế bào gốc, đặc tính và phân loại tế bào gốc

Tế bào gốc là những tế bào chưa có chức năng chuyên biệt, chúng có tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau và có khả năng tự thay mới Đây là các tế bào còn chưa hay rất ít biệt hoá nên chúng có khả năng biệt hoá theo nhiều hướng và tạo ra nhiều loại tế bào khác nhau Ngoài ra, chúng cũng có khả năng tự sinh ra các tế bào giống hệt nó

Thông thường các tế bào phân chia theo phương thức nhân đôi đối xứng tạo ra hai tế bào giống hệt nhau về mức độ biệt hoá Tế bào gốc không chỉ có khả năng phân chia đối xứng mà còn có khả năng phân chia không đối xứng thành hai tế bào khác nhau, trong đó một tế bào giữ nguyên mức độ biệt hoá cũng như giữ nguyên vai trò là tế bào gốc và một tế bào thứ hai đã biệt hoá hơn, chúng sẽ tiếp tục biệt hoá thành các tế bào tiền thân để sau đó phát triển thành tế bào chuyên biệt tham gia vào cấu trúc và chức năng của mô, cơ quan Nhờ đó mà số lượng tế bào gốc được duy trì hoặc tăng lên chứ không mất đi do quá trình biệt hoá tế bào Nhờ những đặc điểm này mà TBG đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu ứng dụng để chữa một số bệnh của cơ quan tạo máu, một số bệnh di truyền bẩm sinh liên quan đến chuyển hoá và suy giảm miễn dịch, ung thư máu, và có nhiều hứa hẹn dùng để chữa được nhiều bệnh nan y như tiểu đường, liệt do chấn tương tuỷ sống, suy tim do tổn thương cơ tim, một số bệnh ung thư và bệnh lý gen [16],[17],[18],[19],[20], [114],[115]

Để có thể sử dụng tế bào gốc trong điều trị bệnh, cần phải tiến hành các bước như sau:

- Phân lập, bảo quản tế bào gốc, tăng sinh nhân rộng số lượng tế bào gốc

- Biệt hoá hoặc định hướng biệt hóa tế bào gốc thành một số loại tế bào chức năng tương thích với cơ quan cần ghép

- Chế tạo tế bào gốc thành một số loại chế phẩm tế bào đã biệt hoá có hình thái và chức năng khác nhau

- Cuối cùng là bước ứng dụng tế bào gốc và các tế bào biệt hoá hoặc các chế phẩm vào nghiên cứu cơ bản trong y học, phát triển thuốc và cấy ghép

Dựa theo nguồn gốc hoặc thời điểm phân lập, có thể phân loại các tế bào gốc thành các nhóm sau [6],[12],[63],[73],[76]:

- Tế bào gốc phôi (embryonic stem cell): là các tế bào được phân lập từ phôi Tế bào này có tiềm năng biệt hóa thành hầu hết các cơ quan của cơ thể nhưng bị hạn chế trong nghiên cứu và ứng dụng về khía cạnh đạo đức

- Tế bào gốc thai (fetal stem cell): là tế bào gốc phân lập từ các thai sau nạo phá thai Nguồn này cũng không sẵn có về lâu dài và ổn định

- Tế bào gốc nhũ nhi (infant stem cell): các tế bào được phân lập từ trẻ

sơ sinh hoặc từ dây rốn và nhau thai, đây là nguồn mô sẵn có

- Tế bào gốc trưởng thành (adult stem cell): tế bào được phân lập từ các

mô của người trưởng thành Chúng được ứng dụng chủ yếu trong lâm sàng hiện nay nhưng bị hạn chế bởi khả năng tăng sinh và phân lập nhất là khi tuổi của bệnh nhân cao

- Tế bào vạn tiềm năng do cảm ứng (induced pluripotent stem cell - iPS): được tạo ra bằng cách cảm ứng các tế bào đã biệt hoá của cơ thể trở lại trạng thái giống như tế bào gốc phôi Chúng có tiềm năng lớn thay thế tế bào gốc phôi nhưng hiện tại chưa chứng minh được tính an toàn khi cấy ghép

Hình 1.2: Các loại tế bào gốc theo nguồn gốc và thời điểm phân lập

Mỗi loại tế bào gốc có tiềm năng biệt hoá khác nhau và do vậy triển vọng ứng dụng khác nhau Việc phân lập và duy trì mỗi loại cũng đòi hỏi những kỹ thuật và công nghệ khác nhau Do đó, mỗi loại tế bào gốc đều có những ưu điểm và hạn chế nhất định Việc lựa chọn loại tế bào gốc để nghiên cứu quyết định bởi mục tiêu sử dụng [6],[17],[18],[19],[115]

Trên phương diện Miễn dịch, cho dù các chế phẩm TBG có được chế tạo hoàn hảo đến đâu, kỹ thuật cấy ghép có thuần thục đến mấy, nhưng nếu các tế bào đó là của người khác thì khi cấy ghép vào cơ thể người nhận có đặc điểm di truyền khác với của các TBG người cho đều xảy ra quá trình nhận diện và tấn công miễn dịch theo hướng cơ thể người nhận phát hiện và loại bỏ

tế bào ghép (đáp ứng thải ghép) hoặc các TBG được ghép vào tạo ra các tế bào miễn dịch mới tấn công cơ thể người nhận (bệnh mô ghép chống túc chủ)

Mức độ khốc liệt của quá trình tấn công miễn dịch này tỷ lệ thuận với mức độ khác biệt về di truyền giữa chủ nhân sinh học của các TBG và người được cấy ghép TBG Vì thế việc cấy ghép mô và tế bào nói chung, TBG nói riêng, luôn mong muốn có được các tế bào có nguồn gốc từ chính cơ thể người nhận hoặc người có đặc điểm di truyền giống với người nhận Để đạt được điều này thì cần phải lấy các TBG ra khỏi cơ thể (đặc biệt là lấy ngay từ khi còn trẻ và chưa bị bệnh) đem bảo quản trong những điều kiện đặc biệt, duy trì chúng là các tế bào sống và không bị thay đổi theo thời gian bảo quản dưới dạng ngân hàng TBG Các tế bào này khi cần có thể lấy ra để điều trị cho chính chủ nhân sinh học của các TBG đó hoặc những người khác trong gia đình và cộng đồng

có đặc điểm di truyền phù hợp [6],[19],[104],[105],[106]

1.3.2 Ứng dụng tế bào gốc trong điều trị bệnh

Tế bào gốc máu dây rốn được phát hiện, phân lập năm 1998, loại tế bào này biệt hoá được thành tế bào sụn trong điều kiện nuôi cấy Năm 2003-2004 biệt hoá tế bào gốc trung mô thành tế bào sụn, tế bào thần kinh , thử nghiệm trên động vật an toàn [23],[7]

Tế bào gốc bào thai (Fetal Stem cell) ghép đồng loại sử dụng điều trị viêm tuỷ, liệt thần kinh [3],[15]

Tế bào gốc nhũ nhi (Infant Stem cell: Cord blood, Wharton’s Jelly, Placental SC, Cord Lining) máu cuống rốn được ghép đồng loại sử dụng trong điều trị bệnh máu: Leukemia, Lymphomia, thiếu máu, điều trị nhồi máu cơ tim và tổn thương thần kinh cột sống ở Hàn Quốc, Thái Lan, Trung Quốc [11]

Gần đây nghiên cứu TBG mới được biết đến ở Việt Nam Năm 1995 lần đầu sử dụng TBG tủy xương ( thực chất là liệu pháp TBG tạo máu) ghép điều trị cho 1 bệnh nhân bạch cầu mạn tại bệnh viện Huyết học và truyền máu TPHCM Năm 1996, các nhà khoa học đó thực hiện ghép TBG máu ngoại vi

tự thân, năm 2002 tiến hành ghép TBG máu cuống rốn điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho Năm 2003, việc ghép tủy xương, máu cuống rốn, máu

ngoại vi để điều trị bệnh suy tủy, một số bệnh lý máu ác tính đó thực hiện tại Viện Huyết Học Truyền Máu Trung ương [4]

Năm 1996, Viện Bỏng Quốc Gia, Học viện Quân y đã thành công trong việc cấy ghép tế bào sừng (Keratinocyte), tiếp thu và ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào sợi (nguyên bào sợi - fibroblast) của người Trên các cơ sở đó, Học viện Quân y đã tiến tới tiếp nhận và phát triển công nghệ mô (trong đó có việc làm da nhân tạo) và dần tiến tới công nghệ tạo các cơ quan phục vụ cho ghép mô, tạng

Tháng 4/2005, trung tâm nghiên cứu công nghệ phôi đầu tiên của Việt Nam do Học viện Quân y quản lý được thành lập, có nhiệm vụ nghiên cứu phôi hỗ trợ sinh sản Nuôi cấy tế bào gốc dây rốn thực hiện tại Labo ứng dụng

và nghiên cứu điều trị bỏng, Viện Bỏng Quốc Gia, Bệnh viện Y học cổ truyền Trung ương từ cuối tháng 5/2005

Vào ngày 15/2/2009, Mekostem - Ngân hàng Tế bào gốc đầu tiên của Việt Nam đươc khai trương [14]

Ngày 18/12/2009 hội thảo “Chia sẻ thông tin và kinh nghiệm nghiên cứu tế bào gốc” tại Hà Nội do Bộ Khoa học công nghệ phối hợp với ban điều phối nhiệm vụ khoa học công nghệ cấp nhà nước về “Xây dựng hệ thống ngân hàng tế bào gốc và ứng dụng trong y sinh học” đã có một số nghiên cứu như sau:

Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc – Trung tâm công nghệ sinh học TP Hồ Chí Minh

Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc thần kinh, máu, mắt, răng…- Phòng thí nghiệm tế bào gốc – Đại học khoa học tự nhiên, TPHCM [20]

Biệt hóa tế bào gốc màng dây rốn thành tế bào gan – BV Nhi Trung Ương [20]

Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc máu cuống rốn người thành nguyên bào xương, tế bào sừng, tạo tấm tế bào sừng, tạo tấm tế bào rìa giác mạc ứng dụng điều trị - Bộ Môn di truyền – Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch, TPHCM [20]

“Điều trị thử nghiệm tế bào gốc tự thân từ tủy xương cho bệnh nhân suy tim nặng sau nhồi máu cơ tim” thấy triệu chứng lâm sang sau 1 năm cải thiện phân số tống máu trên siêu âm tim, EF tăng trung bình 9%, cải thiện EF trên buồng tim trung bình 15% - Viện Tim mạch – BV 108 – Tháng 12/2008 [20]

“Ứng dụng tế bào gốc điều trị bệnh lý bề mặt nhãn cầu” – Ghép tế bào gốc tự thân điều trị nhãn cầu tổn thương thấy bề mặt nhãn cầu ổn định, thị lực được cải thiện – Bv Mắt TPHCM [20]

“Đánh giá hiệu quả ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm” – Viện Bỏng Quốc Gia [20]

“Đánh giá hiệu quả điều trị tế bào gốc trung mô, biểu mô màng dây rốn trong điều trị vết thương mất da trên chuột tăng đường máu” – Bệnh Viện Y học cổ truyền Trung ương năm 2008 [20]

1.3.3 Các tiềm năng ứng dụng tế bào gốc

Hình 1.3: Khả năng nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc

Hình 1.4: Khả năng ứng dụng trị liệu tế bào gốc

Tế bào gốc phôi:

- Tạo động vật chuyển gen mong muốn

- Tạo các sản phẩm protein mong muốn

- Sửa chữa 1 số bệnh nan y: sử dụng trực tiếp hoặc phối hợp trong trị liệu gen [8]

Tế bào gốc từ mô thai nhi:

- Sử dụng để tạo ra các chế phẩm có nguồn gốc tế bào gốc

Tế bào gốc trưởng thành: tủy xương, máu ngoại vi, da, cơ , mỡ

- Tế bào gốc từ tủy xương

Hình 1.5: Khả năng biệt hóa của tế bào gốc tủy xương

- Tế bào gốc từ mỡ

Hình 1.6: Khả năng ứng dụng trị liệu của tế bào gốc mỡ

1.3.4 Biệt hóa tế bào gốc thành các tế bào da dùng trong điều trị vết thương

Tuỷ xương, máu ngoại vi, máu cuống rốn đều đã được sử dụng điều trị vết thương mãn tính để thúc đẩy các đáp ứng liền vết thương Tuy viễn cảnh mang lại nhiều hứa hẹn nhưng kết quả nghiên cứu hiện nay còn hạn chế và cách thức sử dụng kết hợp mô có nguồn gốc từ tế bào gốc vẫn còn chưa được khẳng định một cách chắc chắn [30],[37] Các mô hình nghiên cứu ứng dụng

tế bào gốc vẫn mong muốn biệt hóa chúng thành các tế bào chức năng trước khi ghép trở lại cơ thể

Để sử dụng tế bào gốc trong ghép da và công nghệ mô, cần phát triển quy trình nuôi cấy có hiệu quả và ổn định để định hướng tế bào gốc thành dòng tế bào da in vitro Điều này sẽ làm giảm sự biệt hóa tự phát của tế bào gốc thành các dòng không mong muốn ở tại vùng được ghép [121],[122],[126] Ghép tế bào gốc mà đã được biệt hóa thành tế bào sừng sẽ dẫn đến hiệu quả ghép tốt hơn và có sự tích hợp tốt hơn trên bề mặt da vốn đã bị hủy hoại Hơn nữa, hầu hết các tiến bộ trong lĩnh vực công nghệ mô đều cần có các tế bào sừng biệt hóa hoặc là các tế bào đầu dòng của tế bào sừng hơn là các tế bào gốc chưa biệt hóa để có thể cấy và tế bào bám dính được vào các loại đệm tổng hợp nhân tạo [101],[102]

1.3.4.1 Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành nguyên bào sợi

Tế bào gốc trung mô sở hữu khả năng tự đổi mới và biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau và có mặt trong nhiều nguồn mô cung cấp sẵn có Chúng tồn tại chủ yếu trong tủy xương, máu cuống rốn, dây rốn, mô liên kết của cơ thể và ở các khoảng kẽ của nhiều cơ quan [57],[60],[62] Các tế bào này có thể được nuôi cấy và nhân lên in vitro và dưới các điều kiện thích hợp chúng có thể bị cảm ứng biệt hóa thành các tế bào xương, sụn, cơ và mỡ Hơn nữa, tế bào gốc trung mô được coi là dạng tế bào quan trọng cho công nghệ

mô [68],[70]

Trong liền vết thương, tế bào gốc trung mô được xác định là chúng biệt hóa thành các dạng tế bào da khác nhau [78],[79],[82] Người ta thấy nguyên bào sợi có thể được biệt hóa từ tế bào trung mô tủy xương, các quần thể riêng biệt của các tế bào đầu dòng sợi có nguồn gốc từ tủy xương tồn tại trong máu ngoại vi và biệt hóa thành các nguyên bào sợi, điều này ít nhất cũng đã được chứng minh trong trường hợp nuôi cấy tế bào này với sự có mặt của FGF-2 liều thấp (3 nanogram/ml) [77],[83],[87] Mặc dù tủy xương là nguồn chính của tế bào gốc trung mô nhưng vấn đề thu tủy xương gặp khó khăn và số lượng người cho tủy xương cũng hạn chế Do sự tăng lên về tuổi tác, khả năng tăng sinh và biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau của tế bào gốc trung mô tủy xương bị giảm đi và các tế bào cũng đặt ra câu hỏi về nguy cơ nhiễm virus [86],[88] Những vấn đề cần cân nhắc này đã hạn chế các ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc trung mô tủy xương Hơn nữa, cùng với sự tăng lên về tuổi tác của người cho, số lượng tế bào gốc trung mô trưởng thành trong đó các tế bào gốc trung mô tủy xương cũng bị giảm đi đáng kể Các dữ liệu trước đây đã chỉ ra rằng số lượng tế bào gốc trung mô tủy xương ở người

80 tuổi giảm đi 200 lần so với trẻ mới sinh [77],[118]

Tế bào gốc trung mô thu được từ máu cuống rốn [119] và mô dây rốn vốn là sản phẩm rác thải sau khi sinh và là một nguồn tương đối dư thừa nên rất sẵn có Thêm vào đó mô này có tính sinh miễn dịch thấp và có thể dung nạp tốt hơn trong trường hợp ghép không phù hợp HLA Sự thu hồi mô cũng

dễ dàng và không bị ảnh hưởng của các vấn đề về đạo đức và luật pháp [14],[119],[128] Các tế bào gốc trung mô có thể được phân lập từ các phần khác nhau của dây rốn, bao gồm nội mạch rốn, mô dưới lớp tế bào nội mạch, lớp thạch, mạch máu và mô quanh mạch [90],[119],[122],[138],[141] Nhưng các nghiên cứu về cảm ứng biệt hóa tế bào gốc trung mô dây rốn thành nguyên bào sợi da còn ít

1.3.4.2 Biệt hóa tế bào gốc thành tế bào sừng

Một tiến bộ đạt được trong việc chuyển tế bào gốc phôi và tế bào gốc trưởng thành không có nguồn gốc biểu bì thành dòng tế bào sừng in vitro là

để các tế bào tiếp xúc với hỗn hợp các cytokin, yếu tố tăng trưởng, hóa chất ngoại lai và đệm gian bào qua một thời gian dài trong điều kiện nuôi cấy in vitro Dựa trên tiến bộ này, Coraux và cộng sự năm 2003 đã tiến hành và đạt được sử chuyển hướng biệt hóa tế bào gốc phôi thành dòng tế bào sừng, với

sự có mặt của protein hình thái xương - 4 (bone morphogenic protein 4), ascorbate, và đệm gian bào được tạo ra từ nguyên bào sợi bình thường của người và tế bào 3T3 [11],[78],[129] Các tác giả cho thấy có tỷ lệ (khoảng 80%) sự biệt hóa không đặc trưng thành nhiều các dòng tế bào không rõ đặc tính và cũng không có cố gắng nào để tinh lọc các tế bào sừng đã biệt hóa hoặc các tế bào đầu dòng tế bào sừng trong hỗn hợp các dòng tế bào từ các tế bào gốc phôi [6][80][81] Một nghiên cứu khác của Bagutti và cộng sự năm

4-BMP-2001 cũng báo cáo rằng việc đồng nuôi cấy với nguyên bào sợi da người và

cả dịch nổi nuôi cấy nguyên bào sợi da người có thể cảm ứng các tế bào gốc phôi thiếu hụt intergrin để chuyển hướng và biệt hóa thành dòng tế bào sừng [39] Tuy nhiên, với nghiên cứu của Coraux và cộng sự, các tế bào sừng cũng được nằm rải rác cùng với các dòng tế bào khác Việc biệt hóa các tế bào gốc phôi người thành dòng tế bào sừng cũng được báo cáo bởi nhóm tác giả Green vào năm 2003 [32],[33] Tuy nhiên nghiên cứu này tiến hành dựa trên việc tạo ra u quái in vitro trên mẫu chuột SCID và từ đó đến nay không có các nghiên cứu in vitro tương tự được báo cáo

Với các tế bào gốc trưởng thành không có nguồn gốc biểu mô cũng có một số ít các nghiên cứu đạt được những thành công trong việc tái chuyển hướng và biệt hóa thành dòng tế bào sừng [134],[135],[136] Từ những nghiên cứu ít ỏi này đã đặt cơ sở ban đầu về cấy chuyển các tế bào gốc không

biệt hóa trên in vivo với sự chuyển biệt hóa được quan sát thấy diễn ra một cách rời rạc và ở tần số hoàn toàn thấp Hơn nữa, giá trị của các dữ liệu thí nghiệm này bị che phủ bởi tranh luận bởi sự giả mạo về tính hợp nhất của các

tế bào gốc in vivo [129],[130] Cho đến nay, không còn các nghiên cứu in vitro tương tự đạt được việc tái chuyển hướng và biệt hóa các tế bào gốc trưởng thành không có nguồn gốc biểu mô thành dòng tế bào sừng

Điều đó có thể được phỏng đoán rằng việc sử dụng các cytokin, yếu tố tăng trưởng, hóa chất ngoại lai và đệm gian bào để cảm ứng tế bào gốc phôi

và tế bào gốc trưởng thành không có nguồn gốc biểu mô chuyển thành dòng

tế bào sừng là không có hiệu quả rõ rệt và mất thời gian cũng như sức lực vốn đòi hỏi sự lựa chọn tích cực và tinh lọc các tế bào đầu dòng tế bào sừng Hơn nữa, đó cũng là những thách thức về mặt kỹ thuật trong việc ứng dụng nó trên lâm sàng

Một chiến lược hiệu quả hơn trong việc cảm ứng tế bào gốc phôi và tế bào gốc trưởng thành không có nguồn gốc biểu mô chuyển thành tế bào dòng

tế bào sừng là thông qua việc chuyển gen Điều này đạt được bằng cách chuyển ADN tái tổ hợp đã mã hóa cho các protein tín hiệu xúc tiến việc chuyển thành dòng tế bào sừng Sự có mặt của P63 [130] và c-Myc [133] được báo cáo là thúc đẩy sự chuyển dạng và biệt hóa thành dòng tế bào sừng

Bất lợi của việc định hướng biệt hóa thông qua chuyển gen là ở nguy

cơ tiềm ẩn của việc sử dụng ADN tái tổ hợp trên lâm sàng Ví dụ, việc có mặt quá mức của bất cứ một protein nào trong khi chuyển dạng tế bào gốc cũng chắc chắn có những tác động sinh lý học trong việc cấy ghép in vivo Các tế bào gốc bắt chước hệ gen cũng tồn tại nguy cơ trở thành ác tính cho người nhận ghép Hơn nữa, ngày càng có mối quan tâm về sự an toàn trong việc sử dụng các yếu tố dựa trên sự tái tổ hợp của virus trong các thao tác gen trên tế bào gốc [132],[139]

1.4 DÂY RỐN VÀ TẾ BÀO GỐC PHÂN LẬP TỪ MÀNG DÂY RỐN

Dây rốn dài khoảng 40 tới 60 cm, đảm bảo quá trình trao đổi chất giữa thai nhi và cơ thể mẹ Nghiên cứu phôi thai học và HLA cho thấy các tế bào của dây rốn có nguồn gốc từ thai nhi chứ không phải từ người mẹ [1],[57],[119]

Máu dây rốn đã được nghiên cứu và phát hiện thấy có nhiều TBG tạo máu tương tự như ở tuỷ xương Máu dây rốn đã được sử dụng để điều trị hàng loạt bệnh về cơ quan tạo máu và bệnh di truyền bẩm sinh có liên quan đến chuyển hoá và thiếu hụt miễn dịch Máu dây rốn đã trở thành một trong ba nguồn cung cấp TBG tạo máu chính đang được sử dụng rộng rãi trên lâm sàng [1],[21],[22],[23],[26],[57]

Hình 1.7 Dây rốn, mô kết nối người mẹ và thai nhi

Sau các nghiên cứu về TBG tạo máu trong máu dây rốn, các nghiên cứu khác cũng đã phát hiện và phân lập được các TBG trung mô từ máu dây rốn [1],[21],[32], từ màng ối từ lớp thạch (Wharton' jelly) [28],[126],[127]

Năm 2004, nhóm nghiên cứu tại Đại học Quốc gia Singapore đã thành công trong việc xác định và phân lập được các TBG biểu mô và TBG trung

mô từ màng dây rốn Theo nhóm tác giả này, ưu điểm chính của việc phân lập

TBG từ màng dây rốn so với các phần khác của bánh nhau và dây rốn là thao tác kỹ thuật thuận tiện hơn, đồng thời thu được các TBG phong phú hơn cả về

số lượng và chủng loại tế bào Các tế bào này sau khi phân lập và nuôi cấy duy trì, cấy chuyền 3 đến 5 lần trong môi trường nuôi cấy đặc trưng chưa hề bị biệt hoá, vẫn giữ được đầy đủ đặc tính của TBG ban đầu mới phân lập [119],[138]

Lợi thế của nguồn tế bào gốc từ màng dây rốn là đáp ứng được cả hai yêu cầu là số lượng tế bào và không vi phạm y đức Mỗi dây rốn có đường kính 1 cm và dài 55 cm thì diện tích bề mặt tương đương 330 cm2 với số lượng

tế bào được phân lập trong 3 tuần sẽ đạt được 6 tỷ tế bào, đây thực sự là số lượng lý tưởng cho các ứng dụng khác nhau trong y học tái tạo và công nghệ

mô Điều quan trọng nữa của công nghệ này liên quan đến chuyên ngành vết thương và vật liệu thay thế da là ở chỗ các tế bào gốc từ màng dây rốn bao gồm tế bào gốc trung mô và tế bào gốc biểu mô tương đương với thành phần của da là tế bào lớp trung bì và tế bào lớp biểu bì [119]

Cả hai loại tế bào gốc biểu mô và trung mô màng dây rốn đều có 2 loại marker là: Oct 4 (Octamer 4) và Nanog (Pluripotency Sustaining ES Cell Factor) Đây là các yếu tố cần thiết duy trì tế bào gốc phôi ở tình trạng không biệt hoá Các marker này không biểu hiện ở các tế bào gốc tủy xương, da, mỡ

và máu cuống rốn Điều này gợi ý cho thấy tính gốc của cả hai loại tế bào này cao hơn so với tính gốc của tế bào tuỷ xương, máu cuống rốn hay các tế bào gốc trưởng thành khác Ngoài ra, tế bào gốc màng dây rốn cũng có các marker như: ABCG2 (ATP biding cassette, sub family G, member 2) CEA (Carcinoembryonic Antigen) AFP (Alpha Feto Protein) Đây là các protein liên quan sự phát triển của tế bào gốc phôi [119],[138],[143]

Các tế bào gốc màng dây rốn có tính sinh miễn dịch thấp [6],[12],[119] Các nghiên cứu miễn dịch về các marker bề mặt tế bào và HLA của tế bào gốc màng dây rốn cho thấy chúng có nguồn gốc từ thai nhi chứ không phải từ

người mẹ Ngoài việc tế bào gốc có ít kháng nguyên HLA lớp II, các tế bào gốc màng dây rốn còn bộc lộ HLA-G là loại kháng nguyên hoà hợp tổ chức

có chức năng sinh lý là ức chế miễn dịch giúp cho thai nhi không bị phản ứng thải bỏ miễn dịch từ người mẹ (bản chất thai nhi khi nằm trong bụng mẹ cũng

là một mô ghép khác gen đồng loài) Việc HLA-G bộc lộ trên bề mặt tế bào gốc phân lập từ màng dây rốn đã giúp cho chúng dễ được chấp nhận ở một cơ thể khác, vì thế tế bào gốc màng dây rốn có ưu điểm hơn các loại tế bào gốc khác khi ghép cho một cơ thể khác [119],[138]

Như vậy, về khía cạnh miễn dịch ghép các vật liệu thay thế da được chế tạo từ các nguồn tế bào gốc màng dây rốn sẽ có ưu điểm nổi trội hơn rất nhiều

so với các vật liệu thay thế da được chế tạo từ các tế bào da đồng loài đang được dùng hiện nay Do tế bào da đồng loài, nhất là tế bào sừng, có khả năng kích thích sinh miễn dịch thải ghép rất mạnh nên thông thường việc ghép vật liệu thay thế da bằng các nguồn tế bào này hoặc thậm chí ghép da đồng loài thì khả năng tồn tại của mảnh ghép đó trên vết thương cũng chỉ trong vòng 2-

3 tuần và các lần ghép sau thì thời gian tồn tại trên vết thương càng ngắn

Hình 1.8 Nguồn lấy tế bào gốc dây rốn

Các TBG trung mô màng dây rốn được khảo sát với một panel các dấu

ấn bề mặt khác nhau bằng kỹ thuật flowcytometry với kháng thể đặc hiệu Kết quả phân tích định tính cho thấy TBG trung mô màng dây rốn âm tính với các dấu ấn CD14, CD34, CD45 và HLA-DR; dương tính với các dấu ấn CD13, CD44, CD90 và CD166 [4],[119] Đây là kiểu hình chung cho nhiều TBG trung mô đã được phân lập từ máu dây rốn, tủy xương [75],[138],[133], [137],[140],[141] Đặc trưng của tế bào gốc tủy xương là CD23 và STRO-1 [35],[55],[120] nhưng Phan TT và cộng sự thấy tế bào gốc dây rốn có CD23 nhưng không có STRO-1 [120],[139]

Tác giả Troyer và Weiss đã đề cập đến nhiều dấu ấn tế bào qua công trình đã xuất bản về loại tế bào dạng này thu được từ dây rốn, nghiên cứu này cũng đã xác định tính đa tiềm năng của tế bào trung mô dây rốn [29],[35] Tổng hợp lại từ các công trình đó thấy rằng đã có rất nhiều chỉ tiêu xét nghiệm dấu ấn tế bào để khẳng định tính gốc của tế bào trung mô dây rốn trong đó có cả các dấu ấn mang tính đặc thù của tế bào gốc nói chung như OCT3/4, Nanog Do đó có thể nói tế bào gốc trung mô này thực sự là loại tế bào trung mô đa tiềm năng (multipotent mesenchymal stroma cells) [119] Tế bào gốc trung mô dây rốn có các biểu hiện đặc thù của các tế bào gốc trung

mô về hàng loạt các đấu ấn thể hiện tính gốc đã được mô tả ở tế bào thu được tại một số loại mô khác của cơ thể Tế bào gốc dây rốn có nhiều dấu ấn mà các tế bào gốc trung mô ở mô khác không có [121],[123],[139] OCT4 và Nanog được mọi người chấp nhận là những phân tử thể hiện tính gốc rõ rệt của tế bào [119],[138] Cả hai phân tử này cũng đều biểu hiện ở tế bào gốc trung mô màng dây rốn [16],[70] và đây cũng là cơ sở khẳng định tế bào này

có tính gốc mạnh hơn so với các tế bào trung mô khác

Từ những ưu điểm của tế bào gốc trung mô dây rốn, cùng với nhu cầu điều trị vết thương vết bỏng, chúng tôi tiến hành đề tài để khảo sát một số đặc

điểm của tế bào gốc trung mô có liên quan đến liền vết thương Với những kết quả khảo sát đó, chúng tôi hy vọng sẽ có những định hướng tích cực trong việc cấy ghép tế bào gốc trung mô hoặc chế tạo vật liệu thay thế da từ tế bào gốc trung mô nhằm cải thiện và nâng cao chất lượng điều trị vết thương vết bỏng hiện nay

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Thỏ thí nghiệm bao gồm 02 lô:

Lô 1, gồm 15 thỏ dùng để đánh giá tính sinh miễn dịch của tế bào gốc trung mô màng dây rốn người khi ghép dị loại

Lô 2, gồm 30 thỏ dùng để đánh giá hiệu quả ghép tấm tế bào gốc trung

mô điều trị vết bỏng nhiệt thực nghiệm

Thỏ thí nghiệm đều đã trưởng thành từ 10-12 tháng tuổi, do Ban chăn nuôi động vật thí nghiệm, Học viện Quân y, Bộ Quốc Phòng cung cấp

Trước khi thí nghiệm thỏ được theo dõi từ 2-3 ngày, lựa chọn theo tiêu chuẩn: Khỏe mạnh, nhanh nhẹn, mắt sáng, lông mượt, không có bệnh ngoài

da, không có bệnh đường ruột, cân nặng từ 2 kg - 2,5 kg

Nuôi đảm bảo tiêu chuẩn thực nghiệm

Trong thời gian thực nghiệm thỏ được nhốt riêng mỗi con một chuồng,

có đánh số để theo dõi, chế độ ăn uống được bảo đảm giống nhau gồm cơm

và rau tươi

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.2.1 Mẫu mô dây rốn

Mô dây rốn thu từ sản phụ ngay sau khi sinh với các tiêu chuẩn nguồn

mô như sau:

- Tiêu chuẩn y đức về nguồn cung cấp mô: Sản phụ đồng ý cung cấp dây rốn phục vụ nghiên cứu Sản phụ được thông báo bởi nhóm nghiên cứu

về mục đích sử dụng mô dây rốn do sản phụ cung cấp Mô dây rốn chỉ phục

vụ cho mục đích nghiên cứu điều trị vết thương, vết bỏng mà không nhằm

mục đích thương mại hóa Sản phụ đồng ý cung cấp miễn phí dây rốn mà không đòi hỏi về lợi ích kinh tế

- Tiêu chuẩn sàng lọc: Người hiến mô dây rốn đạt tiêu chuẩn người hiến mô nói chung theo quy định Luật hiến mô của Quốc Hội nước cộng hòa

xã hội chủ nghĩa Việt Nam, Nghị định của chính phủ hướng dẫn thực hiện việc hiến và ghép mô và danh mục của Bộ y tế về tiêu chuẩn bệnh lý của người hiến mô

- Người hiến dây rốn thử máu âm tính với các bệnh truyền nhiễm sau:

- Tính pháp lý của nguồn mô nghiên cứu

Mỗi nguồn cung cấp mô đều có các hồ sơ cung cấp mô gồm, họ tên sản phụ, địa chỉ liên lạc, ý kiến đồng ý cung cấp mô và kết quả xét nghiệm hoặc thăm khám trước sinh, hồ sơ các xét nghiệm sàng lọc Hai loại hồ sơ này được lưu trữ tại khoa Labo nghiên cứu ứng dụng điều trị bỏng- Viện Bỏng Quốc Gia

2.2.2 Hóa chất chủ yếu dùng trong nghiên cứu

DMEM high glucose (Dulbeco’s Modified Eagle Media);

DMEM-F12(Dulbeco’s Modified Eagle Media – F12)

PBS (Phosphate – Buffered Salines);

Trypsin – EDTA (0,005% Trypsin, 0,53mM EDTA Na): dung dịch gồm 0,5g/L trypsin và 0,2g/L EDTA.4Na trong dung dịch Hanks’ không có CaCl2

;

Môi trường nuôi cấy tế bào gốc trung mô

FBS (Fetal Bovine Serum);

DMSO (dimethyl sulfoxide);

L-Glutamin

Vitamin C

TGF-beta,

Insulin-like growth factor (IGF)-II

EGF (Epidermal Growth Factor)

Insulin,

Dung dịch Trypsin 0,05% và EDTA 0,53 mM trong dung dịch PBS Các hoá chất và vật tư nuôi cấy do hãng Invitrogen và PAAcung cấp, đều đạt tiêu chuẩn quốc tế an toàn về độc tính, vi khuẩn, mycoplasma và vi rút

Môi trường nuôi cấy tế bào trung mô do Ngân hàng tế bào gốc Mekostem (Việt Nam) cung cấp theo bản quyền chuyển nhượng của công ty CRC (Singapore)

2.2.3 Các vật tư tiêu hao chủ yếu

Flash nuôi cấy tế bào loại 75cm2

và 25cm2 Đĩa petri loại D30, D60, D100;

Đĩa nuôi cấy 6 giếng, 12 giếng

2.2.5 Các giá đỡ để tạo tấm vật liệu tương đương trung bì

Màng Tegaderm chất liệu polyurethane do hãng 3M Health Care, USA cung cấp được dùng để làm giá đỡ tế bào

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Các phương pháp nghiên cứu trong phân lập, nuôi cấy và biệt hóa

tế bào

2.3.1.1 Phân lập tế bào gốc trung mô

Tại Labo nuôi cấy, dây rốn được xử lý theo quy trình vô trùng Rửa mô dây rốn bằng Betadin scrup nếu mô thu theo đường đẻ tự nhiên Cắt lọc dây rốn, loại bỏ lớp thạch và các mạch máu của dây rốn Sát trùng màng dây rốn bằng cồn 70% thể tích Rửa sạch mô bằng PBS để loại bỏ cồn và máu

Các mẩu mô sau đó được đặt vào đĩa hoặc chai nuôi cấy nhựa với mật

độ khoảng 1mẩu mô/5cm2

bề mặt nuôi cấy Bổ sung môi trường nuôi cấy vào đĩa nuôi, đây là môi trường nuôi cấy tế bào gốc trung mô chuyên biệt do Mekostem cung cấp được nhượng quyền của công ty CRC Singapore

Đặt đĩa nuôi trong tủ ấm và ẩm với 5% CO2 ở 370C Thay môi trường sau mỗi 2-3 ngày và theo dõi dưới kính hiển vi đảo ngược cho đến khi thấy tế bào hình sao, hình thoi mọc ra khỏi mẩu mô Khi số lượng tế bào đạt khoảng 50% độ che phủ bề mặt nuôi cấy thì tách tế bào bằng quy trình trypsin Các tế bào được theo dõi dưới kính hiển vi và được cấy chuyển sang đĩa khác ở mật

độ 8000 tế bào/cm2 Sau đó tế bào được bảo quản lạnh sâu hoặc nhân rộng để làm các thí nghiệm hoặc ứng dụng tiếp theo

Trong quá trình nuôi cấy mô, hàng ngày theo dõi dưới kính hiển vi đảo ngược về: Thời gian tế bào tách khỏi mẫu mô, hình thái tế bào mới tách

Sau khi cắt nhỏ thành các mẩu có kích thước 0,2 x 0,2 cm, đặt các mẩu

mô trong đĩa nuôi cấy nhựa và bổ sung môi trường chuyên biệt được cung cấp

từ Ngân hàng tế bào gốc Mekostem, đặt các đĩa mô vào tủ ấm 370C với 5%

CO2 Thay môi trường nuôi cấy từ 2-3 lần/ tuần và theo dõi đến khi các tế bào hình sao hay hình thoi tách ra khỏi mẫu mô và phát triển đạt 50%-70% bề mặt đĩa thì tiến hành tách tế bào bằng quy trình sử dụng trypsin Các tế bào được nhân lên đến thế hệ cấy chuyển thứ 3-4 dùng vào nghiên cứu chế tạo tấm vật liệu tương đương trung bì

Hình 2.1 Cấu trúc mô dây rốn Lớp tế bào biểu mô tương tự màng ối (1); lớp tế bào gốc trung mô màng dây

rốn (2); lớp tế bào gốc trung mô lớp Wharton’ jelly (3) Các tế bào được sử

dụng trong nghiên cứu này thuộc vị trí số 2

* Nguồn: theo Katsuhiro Kita và Cs (2009) [90]

2.3.1.2 Cấy chuyển nhân rộng số lượng tế bào gốc trung mô dây rốn

Tách và nhân rộng số lượng tế bào được áp dụng theo quy trình cấy chuyển có sử dụng trypsin, các bước nhân rộng được mô tả chi tiết như sau:

Kiểm tra cẩn thận tình trạng tế bào nuôi cấy để phát hiện các dấu hiệu

bị ô nhiễm Đánh giá sơ bộ mật độ tế bào bằng mức độ phủ kín bề mặt (confluence), pH môi trường trước khi tiến hành cấy chuyển

Hút bỏ dịch nổi trong chai nuôi cấy Rửa bề mặt đĩa nuôi cấy tế bào bằng dung dịch đệm PBS với số lượng 0,2 ml/cm2

Thêm dung dịch Trypsin/EDTA với số lượng 0,1mL/cm2 Đặt chai hoặc đĩa nuôi cấy vào tủ ấm theo dõi 5-10 phút, cho thêm 0,1 – 0,2 mL/cm2

môi trường nuôi cấy, thu tế bào vào ống ly tâm, đếm số lượng tế bào

Ly tâm ở tốc độ 1200 vòng/phút trong khoảng thời gian 10 phút Hút bỏ dịch nổi sau ly tâm, cho thêm môi trường nuôi cấy

Khối tế bào thu được sẽ được dùng vào các thí nghiệm tiếp theo hoặc cấy chuyển sang chai khác mật độ 5000 TB/cm2

hoặc được bảo quản lạnh sâu

2.3.1.3 Đánh giá khả năng tạo colony của tế bào

Khả năng tạo colony của tế bào mới tách được đánh giá như sau:

- Tế bào mới tách ra khỏi mẫu mô, mật độ tế bào đạt khoảng 50% độ che phủ

- Tách tế bào bằng quy trình sử dụng trypsin

- Hỗn dịch các tế bào đơn lẻ được chuẩn bị và cấy trong đĩa nuôi cấy nhựa có đường kính 60mm ở mật độ là 50 tế bào /cm2 Đĩa nuôi cấy sau đó được duy trì trong 2-3 tuần để theo dõi sự phát triển của các colony Đĩa tế bào nuôi cấy sau đó được cố định bằng cồn tuyệt đối và nhuộm giemsa, một nhóm tế bào được xác định là đơn vị colony khi có ít nhất là 50 tế bào Khả năng tạo colony (CF – E) được tính toán theo tỷ lệ % số colony đạt được so với số tế bào được cấy Cụ thể các bước tiến hành như sau:

B1/ Cấy tế bào cần làm thí nghiệm trong đĩa d=60mm với mật độ tế bào

50TB/cm2, mỗi đĩa cho 4ml môi trường nuôi cấy, thay môi trường sau mỗi 3 ngày

B2/ Theo dõi tạo colony trong 3 tuần, ghi chép số liệu 5 ngày/ lần về:

- Hình thành colony chưa?

- Mỗi colony có khoảng mấy tế bào?

- Hình thái tế bào?

B3/ Nhuộm giemsa sau 3 tuần

B4/ Tính tỷ lệ % số colony/số tế bào được cấy, mỗi colony khi đó được xác định là có từ 50 tế bào trở lên

2.3.1.4 Xác định số lượng tế bào trong nuôi cấy

Nhằm xác định số lượng tế bào thu được từ mô và để cấy chuyển theo đúng tỷ lệ và đánh giá được khả năng nhân lên của TB

Phương pháp tiến hành trong buồng đếm Neubauer

Tiến hành trypsin, lấy vào ống nghiệm 1ml hỗn dịch tế bào đã trypsin Lấy hỗn dịch TB bằng đầu pipet pasteur, bơm nhẹ hỗn dịch TB vào mép buồng đếm và để hỗn dịch tự chảy đầy vào buồng đếm Đếm số lượng tế bào dưới kính hiển vi trên đơn vị diện tích bằng 1mm2

Số lượng TB được tính theo công thức: C = n/v (n: số lượng TB đã đếm được trong buồng đếm, v: thể tích đếm (ml), C: mật độ TB (TB/ml) Trong buồng đếm Neubaeur có thể tích 0,1mm3

= 1.10-4 ml do đó công thức tính là:

C = n x 10 4 /ml

2.3.1.5 Đánh giá hình thái tế bào

Hàng ngày quan sát các đĩa tế bào nuôi cấy hay thí nghiệm dưới kính hiển vi đảo ngược để đanh giá sự tăng trưởng của tế bào và hình dạng của chúng Ngoài ra, các phương pháp nghiên cứu hỗ trợ để đánh giá hình thái và siêu cấu trúc như sau:

Đánh giá hình thái tế bào bằng phương pháp nhuộm giemsa

Các mẫu tế bào nuôi cấy hay thí nghiệm theo tiến độ khi cần đánh giá hình thái thì tiến hành hút bỏ môi trường nuôi cấy Rửa tế bào 3 lần bằng dung dịch PBS loại 1X

Cố định tế bào bằng cồn tuyệt đối trong 10 phút và để khô trong điều kiện phòng

Nhuộm tế bào bằng dung dịch Giemsa trong 10 phút, rửa nước và để khô sau đó đánh giá hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học

Các hình ảnh theo dõi được chụp lại để phân tích so sánh