kỹ thuật nhận phát hiện sản phẩm biến đổi gen

www.themegallery.com Company LogoNội dung Kết luận Kỹ thuật nhận phát hiện GMO Thực trang GMO ở Thế Giới và Việt Nam Ưu – Nhược điểm và hạn chế của GMO Tổng quan về sản phẩm biến đổi ge

Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội Viện Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm

Môn : Thực phẩm biến đổi gen

Đề tài : Kỹ thuật nhận phát hiện sản phẩm biến đổi gen

GVHD: PGS TS Khuất Hữu Thanh SVTH: Phạm Thị Tho 20103355 Nguyễn Thị Liên 20103211 Nguyễn Xuân Trường 20103401

Nguyễn Thị Bích Ngọc 20103267 Trần Thị Huyền Trang 20103389 Phạm Thị Hải Yến 20149542

MỞ ĐẦU

 Dân số ngày càng tăng lên mà lương thực thì có nguy cơ thiếu do đó các nhà khoa học đã nghiên

cứu ra các loại giống cây trồng vật nuôi có đặc tính ưu việt có khả năng cung cấp đủ thức ăn :như

là nghiên cứu ra các cây trồng có khả năng chịu hạn tốt, chịu sâu bệnh ,

 Ngoài ra người ta còn sử dụng thực phẩm chuyển gen nhằm tạo ra những thực phẩm có một đặc

tính dinh dưỡng , các chế phẩm sinh học hay thuốc dùng trong điều trị bệnh

Phát triển diện tích cây trồng GM trên thế giới theo đặc điểm

www.themegallery.com Company Logo

Nội dung

Kết luận

Kỹ thuật nhận phát hiện GMO

Thực trang GMO ở Thế Giới và Việt Nam

Ưu – Nhược điểm và hạn chế của GMO

Tổng quan về sản phẩm biến đổi gen

1 TỔNG QUAN VỀ GMO

 Khái niệm:

Thực phẩm biến đổi gen -GMO (Genetically Modified Orangnism )được dùng để chỉ các loại thực

phẩm có thành phần từ cây trồng chuyển gen – hay còn gọi là cây trồng GM, cây trồng biến đổi gen,cây trồng công nghệ sinh học

1 TỔNG QUAN VỀ GMO

 Đặc điểm:

- Thực phẩm giàu đạm hơn so với thực phẩm truyền thống

 Các chất đạm lại đóng vai trò quan trọng đối với sức khỏe con người và các loại vật nói chung

 giống Gạo vàng 2 (cung cấp tiền sinh tố A để khắc phục tình trạng thiếu vi-ta-min A ở nhóm dân

số tiêu dùng gạo), Ngô Lysine (cung cấp chất lyzin chức năng cho thức ăn chăn nuôi lợn và gia cầm), và đậu nành SDA (có chứa dầu đậu này bổ sung hàm lượng a-xít béo Omega-3 tốt cho tim mạch)

2 Ưu - Nhược điểm và hạn chế của GMO

Ưu điểm

• Tạo các giống cây có năng suất cao,

chất lượng tốt, bảo đảm an toàn nguồn

lương thực, thực phẩm trong toàn cầu

• Đảm bảo ổn định đa dạng sinh học

• Tạo lợi nhuận kinh tế và xã hội, giảmbớt đói nghèo ở các nước đa

ng phát

triển

• Cải thiện chất lượng thực phẩm, làm

tăng giá trị dinh dưỡng hoặc có những

 Nhược điểm:

1 Đe dọa đến thế giới sinh vật

2 Không có giá trị về kinh tế

3 Tác hại về sức khỏe con người gia tăng

- Thực phẩm biến đổi gen gây dị ứng

- Và những hậu quả tiềm ẩn

 Phát huy:

 Tăng cường áp dụng các quy trình đánh giá thẩm định kĩ lưỡng trước khi cho các sản phẩm biến

đổi gen

 Quản lý, giám sát an toàn vệ sinh sinh học, thực phẩm chặt chẽ của các thực phẩm biến đổi gen.

 Đảm bảo chất lương đầu ra của các thực phẩm biến đổi gen Đảm bảo sức khỏe người tiêu dùng.

 Nâng cao năng lực quản lý của các giới chuyên môn về thực phẩm biến đổi gen.

 Tăng cường nghiên cứu các thực phẩm biến đổi gen có lợi cho người tiêu dùng, cho môi trường

và năng suất cây trồng

 Hạn chế:

 Các công ty trong nước chỉ quen với việc sản xuất các thực phẩm như F1, lai tạo cho nên việc việc áp dụng sản xuất các thực phẩm biến đổi gen sẽ gặp khó khăn

 Việc áp dụng phân phối biến đổi gen gắn liền với nhiều rủi ro

 Cạnh tranh với thực phẩm không biến đổi gen

 Sử dụng hạn chế các thực phẩm biến đổi gen vì lí do sức khỏe

 Người tiêu dùng vẫn thích dùng các thực phẩm tự nhiên hơn

2 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG GMO

Diện tích trồng GMO các nước trên thế giới

2.1 Trên thế giới

- Năm 1996 đạt 1,7 triệu ha

- Năm 2013 tăng đến 175 triệu ha và tiếp tục tăng

- Có 27 nước đưa vào canh tác : Nam Mỹ chiếm 41%, châu Á 11%, Châu Phi chiếm 2% diện tích toàn cầu

Phát triển diện tích cây trồng GM ở 5 nước dẫn đầu

Lợi ích kinh tế ròng ở cấp độ trang trại

trong năm 2011 là 19,8 tỷ USD, tương

đương với mức tăng trung bình 133

USD/ha Trong vòng 16 năm (1996 -

2011), tổng mức tăng lên của thu nhập

trang trại toàn cầu nhờ ứng dụng cây trồng

GM là 98,2 tỷ USD

Biểu đồ sử dụng thực phẩm GOM trên thế giới

2.2 Tình hình sử dụng GMO ở Việt Nam

 GMO đang nghiên cứu trên PTN và thử nghiệm ở quy mô nhỏ , chưa có GMO sản xuất đại trà

 Một số đề tài , khcn cấp nhà nước nghiên cứu cây chuyển đổi gen:KC08(1991-1995).

 Tại Việt Nam nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ ,kháng bệnh sâu vằn vào giống lúa DT…

 19/1/2004 chính phủ phê chuẩn Việt Nam là thành viên chính thức của nghị định thư Catagena.

 26/8/2005 chính phủ ban hành quy chế quản lý an toàn sinh học đối với sinh vật biến đổ gen ,sản

phẩm, hành hóa có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen

• Nhập khẩu đậu tương : 90% GMO, 6 tháng đầu năm 2014 nhập 2 – 3 tiệu tấn ngô GMO

• 11/8/2014 Bộ NN-PTNT phê duyệt 4 loại ngô GMO làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi gồm :

+ Bt11 và MIT162 của công ty TNHH Syngenta VN

+ MON89034 và NK603 của công ty TNHH Dekab VN (Monsanto)

3 Kỹ thuật nhận biết GMO

1 Kỹ thuật khuếch đại dựa trên cơ sở nucleotid: +PP dựa trên cơ sở AND

+PP dựa trên cơ sở ARN

2 Kỹ thuật dựa trên cơ sở protein

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 7608 : 2007

Quy trình kỹ thuật nhận biết GMO bằng phương pháp xác định DNA

Tách DNA

Đánh giá DNA Định tính DNA Định lượng DNA

1.DNA thực vật dựa CTAB

1.PP điệndi (gel agarose)

Các phương pháp trong kỹ thuật PCR

PCR

PP nhận dạng cấu trúc đặc thù: phát hiện sự tổ hợp của các trình

tự ADN được đưa vào hệ gen vật chủ

PP sàng lọc PCR: phát hiện yếu tố di truyền dựa vào các cặp

mồi đặc hiệu cho vùng ptomoter và terminator

PP đặc hiệu Taxon – đích: taxon đích là đơn vị phân loại GMO, đánh

giá sự có mặt, chất lượng và số lượng DNA

Phương pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction)

 Công bố 10/1985 bởi Kary Mullis

 Phản ứng chuỗi trùng hợp/phản ứng khuếch đại

 Nguyên tắc: dựa trên tính biến tính, hồi tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA

 Trình tự:DNA khuôn => đoạn mồi ( primer) => Nucleotid tự do => E Polymerase

Máy PCR

Chu kỳ PCR

Phương pháp PCR

1 Giaiđoạnbiếntính: T= 90 - 95 , = 1 – 2 phútđứtliênkết H, tách 2 mạch DNA.

2 Giaiđoạngắnmồi : T= 55 - 65, = 30 – 60 giây, mồibắtcạpvớicácmạchđơn DNA khuônđầu 3’.

3 Giaiđoạntổnghợp: T = 70 - 72 , = 30s – vàichụcphút, E Polymerase hoạtđộnggắnthêmnucleotidvàocuốiđoạnmồi, cácmồikéodàibắtcặpmạchkhuôntạomạchđơn DNA mới

  

Các yếu tố cần thiết trong phản ứng PCR

Ưu – nhược điểm của phương pháp PCR

 Ưu điểm :

+ thời gian thực hiện nhanh

+ đơn giản và ít tốn kém

+ độ tinh sạch của mẫu không cần cao

+ Có thể nhận biết được gen đột biến do mất đoạn, thêm đoạn, hay đột biến điểm.

 Nhược điểm:

+không hoạt động vơí những phân tử DNA có kích thước lớn hơn 3kb

+ dễ bị ngoại nhiễm: mở nắp ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại

+ sự sao chép do Tap polymerase tỷ lệ sai sót khá cao(10000nu E gắn sai 1 nu)

Phương pháp dựa trên cơ sở protein

 Nguyên tắc : Protein có thể phát hiện được bằng cách ứng dụng các kháng thể đặc thù Trong trường hợp

này, một kháng thể đặc thù thường được tạo ra để phát hiện một protein

 Hạn chế : không thể thực hiện được chính xác nếu có nhiều hơn một sinh vật biến đổi gen có biểu hiện

cùng một protein

Kit Bt- express

 Cấu tạo: strip test là màng nitrocellulose bao phủ bởi 1 đầu là wickinh pad và sample pad với 2 line:control

line và test line

Kháng th test line không liên k t v i ph c không b ể ở ế ớ ứ ị

gi l i s chuy n d ch lên control line b gi l i làm xu t ữ ạ ẽ ể ị ị ữ ạ ấ

hi n v ch 2-control line ệ ạ

Khi đi qua K1 không t o ph c ạ ứ

Dòng qua test line c ng không t o ph c và không ũ ạ ứ

đ ượ c gi u l i –không xu t hi n v ch test line ữ ạ ấ ệ ạ

Xu t hi n v ch control line do kháng th test ấ ệ ạ ở ể ở line b c đ nh b i kháng th c a control line ị ố ị ở ể ủ

Ph ươ ng pháp Elisa

 Nguyên tắc : ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất

Ph ươ ng pháp Elisa

Thực hiện qua hai bước:

- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm

Phân loại Elisa

1. Direct elisa : kháng nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ được phát hiện

bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn enzyme)

Ph ươ ng pháp Direct elisa

Phân loại Elisa

2 Indirect ELISA: Phương pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không được gắn enzyme mà

nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể được gắn với enzyme)

Nhanh chóng, đơn giản -Thường sử dụng kiểm tra hạt giống trước khi đưa vào sản xuất

Được sử dụng rộng rãi do có độ nhạy cao 0,01% và có tính đặc hiệu cao

Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau Cần phải thử nhiệm nhiều lần với nhiều kháng huyết thanh khác nhau

-Không có sẵn cho tất cả các GMOs thương mại hóa

-Độ nhạy cảm không lớn Dưới hạn phát hiện 0,1-1%

-kháng thể trên dải không thích hợp với nhiệt,các protein bị biến tính quá nhiều sẽ phá hủy các vị trí gắn kháng thể

-Phức tạp

-Không dùng cho thực phẩm đã chế biến ở mức độ cao làm AND bị gãy thành mảnh nhỏ.

Ví dụ: Phát hiện đậu tương biến đổi gen (kháng ROUNDUP READY)

 Thông qua CNSH hiện đại người ta đã đưa 1 loại

gen Cp4 epsps (là gen kháng thuốc diệt cỏ

glyphosate) vào đậu tương

 Protein CP4 EPSPS có thể được phát hiện bằng

cách sử dụng các kháng thể đặc hiệu

Sơ đồ quy trình PCR xác định GMO

Thu thập mẫu (Nghi có GMO)

Các giai đoạn trong một chu kì PCR

NGUYÊN LIỆU

 Mẫu: Đậu tương biến đổi gen

kháng ROUNDUP READY

Nghiền đậu tương

Tách DNA và loại bỏ protein

Kết tủa CTAB và DNA

Tách tủa CTAB và làm sạch

DNA Tách chiết DNA theo phương pháp CTAB

Thuy t minh quy trình ế

Nghiền đậu tương

-Nghiền mịn đậu tương bằng máy xay sinh tố.

Tách DNA và protein

-Sử dụng dung dịch đệm CTAB

-chloroform:isoamyalcoho=24:1, rồi đem ly tâm dịch chiết thu dịch lỏng

Kết tủa CTAB và DNA

-Cho dung dịch đệm kết tủa CTAB vào dịch chiết đến khi xuất hiện lớp DNA màu trắng nổi

-Đem ly tâm thu phần rắn

Loại bỏ CTAB và làm sạch DNA

-Cho phần rắn thu được ở trên vào dung dịch muối NaCl và dung dịch chứa enzyme Rnase

-Cho cồn để kết tủa DNA và đem ly tâm lấy phần rắn

-Hòa tan DNA vào dung dịch đệm TE, bảo quản ở -20oC

M i ồ

Mẫu đối chứng

 Enzyme DNA polymerase bao gồm: T4 DNA polymerase, Taq DNA polymerase, Vent DNA polymerase,

Tth DNA polymerase, Pfu DNA polymerase…

 Dung dịch đệm cho phản ứng: MgCl2, KCl,Tris… Trong dung dịch đệm, ion Mg2+ ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp và gắn các mồi với mạch khuôn

 Nhiệt độ thích hợp: Chế độ nhiệt của các chu kì không thích hợp sẽ khiến hiệu quả nhân gen PCR kém.

 Qui trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi 35S1 và 35S2

Khuếch đại và biến tính ban đầu 950C/ 10 phút

Chu trình nhiệt 2 với 40 chu trình 940C/20 giây

540C/40 giây720C/60 giây

Sản phẩm PCR bảo quản ở -200C cho đến khi điện di

 Sản phẩm sau phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 2% có bổ sung ethidium bromide 8µl (dung dịch ethidium bromide 5mg/ml) Điện di ở điện thế 135V trong 25 phút

 Sau đó quan sát kết quả trên máy chụp hình điện di bằng tia UV có bước sóng 312nm Nếu xuất hiện vạch tương ứng khoảng 195bp thì xem là sản phẩm có biến đổi gen và phải tiến hành khẳng định sản phẩm đó

-Qui trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi HA-nos 118-f và HA-nos118-r

 Sản phẩm sau phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 2% có bổ sung ethidium bromide 8µl (dung dịch

ethidium bromide 5mg/ml) Điện di ở điện thế135V trong 25 phút

 Sau đó quan sát kết quả trên máy chụp hình điện di bằng tia UV có bước sóng 312nm

 Nếu xuất hiện vạch tương ứng khoảng 118bp thì xem là sản phẩm có biến đổi gen và phải tiến hành khẳng

định sản phẩm đó

Khuếch đại và biến tính ban đầu 950C/ 10 phút

Chu trình nhiệt 2 với 50 chu trình 940C/25 giây

620C/30 giây720C/45 giây

Sản phẩm PCR bảo quản ở -200C cho đến khi điện di

Thuốc thử đi kèm bộ thử bao gồm:

 dd đệm tách chiết đậu tương: đệm natri borat, pH 7,5.

 dd đệm cho đậu tương: PBS, Tween 20, albumin huyết thanh bò, pH 7,4.

 Hàng giếng đã phủ, 12 hàng, mỗi hàng 8 giếng được phủ kháng thể đơn dòng và một giá đỡ.

 Protein thỏ kháng CP4 EPSPS cộng hợp với peroxidaza cải ngựa (HRP), đông khô.

 Dung dịch đệm pha loãng cộng hợp, 10 % huyết thanh chuột đã vô hoạt bằng nhiệt.

 Cơ chất màu, Blue-K [Tetramethylbenzindin (TMB), hydro peroxit, dimethylformamid 5 % làm dung môi].

 Dung dịch hãm, 0,5 % axit sulfuric.

 Dung dịch đệm rửa đậm đặc 10 lần, PBS, Tween 20, pH 7,1.

 Các chuẩn đối chứng dương và đối chứng âm phù hợp với chất nền, vd: 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 % và 5 % w/w.

Đánh giá

Chuẩn bị dung dịch đệm rửa

Pha loãng dung dịch đệm rửa đậm đặc bằng nước để được dung dịch tỷ lệ1:10

 Lấy 2000g đậu tương nghiền nhỏ

 Để phân tích định lượng cỡ hạt nghiền phải nhỏ hơn 150 micromet,phân tích định tính phải nhỏ hơn 450micromet

Quy trình tách chiết mẫu thử và chuẩn đối chứng

Cân 0,5g Cân mẫu phân tích, mẫu trắng, mẫu chuẩn đỗi chứng.

Thêm 4,5ml Thêm dung dịch đệm tách chiết

Trộn Trộn mẫu thử với dd đệm chiết cho đồng nhất, đối với bột chưa tách chất béo thì thời

gian trên sẽ nhỏ hơn 5 phút, đối với bột tách chất béo, mẫu protein thì nhiều hơn 15 phút

Ly tâm ở 5000vòng/phút Ly tâm mẫu ở 5000vòng/phút trong 15 phút ở 4 oC Loại bỏ phần nổi phía trên và

cho vào ống sạch.

Độ pha loãng: 1:300 hoặc 1:10 tùy thuộc theo

nguyên liệu được nghiên cứu.

Pha loãng dung dịch mẫu thử tạo thành, phân tích mẫu trắng và các chuẩn đối chứng

Quy trình phân tích bằng PP ELISA

Kết luận

1 Thực phẩm biến đổi gen tốt hay không tốt còn tùy thuộc vào từng loại và mục đích

sử dụng

2 Xác định thực phẩm biến đổi gen là điều hết sức quan trọng góp phần đánh giá mặt

lợi,hại của loại thực phẩm đó.

3 Sử dụng các phương pháp xác định phải phù hợp với yêu cầu và tính đặc trưng của

từng loại sản phẩm.

Tài li u tham kh o ệ ả

SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN – PHƯƠNG PHÁP DỰA TRÊN PROTEIN

SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN - YÊU CẦU CHUNG VÀ ĐỊNH NGHĨA

3. Bài báo khoa học: Detection of genetically modified soybeans by PCR method and immunoassay kits _ writed by

jin-wen chiang and daniel yang- chin shin

4. Kỹ thuật gen nguyên liệu và ứng dụng PGS.TS Khuất Hữu Thanh

5. http://luanvan.co/luan-van/thi-nghiem-cong-nghe-sinh-hoc-2197/

Cảm ơn thầy và các bạn đã lắng nghe