quá trình nghiên cứu cơ bản streptomyces 40 16

Tại bộ môn Vi sinh và Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội, chúng tôi tiến hành phân lập và nghiên cứu về chủng Streptomyces 40.16 với các mục đích sau: + Từ chủng Streptomyces đã được ph

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới thầy

hướng dẫn PGS.TS Cao Văn Thu, người đã hướng tận tình và giúp đỡ tôi

hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này Đồng cảm ơn các thầy cô giảng dạy tạiKhoa Công nghệ Sinh học - Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi trongsuốt quá trình học tập

Xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè và những người đã giúp đỡ và động viêntôi trong thời gian qua Với khát vọng thì nhiều nhưng thời gian và kiến thứccủa bản thân có hạn nên đề tài khó tránh khỏi những sai sót Tôi rất mong sựchỉ bảo của thầy cô và sự góp ý của các bạn Tôi xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2006

Sinh viên

CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

ADN : axit Deoxyribonucleic

B.cereus : Bacillus cereus ATCC 9946

B.pumilus : Bacillus pumilus ATCC 10441

B.subtilis : Bacillus subtilis ATCC 6633

E.Coli : Escheriachia Coli ATCC 25922

P.aeruginosa: Pseudomonas Nhiễm sắc thể aeruginosa VM 201

P.mirabilis : Proteus mirabilis BV 108

S(Spiral) : Xoắn lò xo

S.typhi : Salmonella typhi DT220

S.flexneri : Shigella flexneri DT 122

S.lutea : Sarcina lutea ATCC 9314

Từ những phương pháp sinh tổng hợp và bán tổng hợp thì công nghệ visinh sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò của mình Trong sốhơn 10.000 chất kháng sinh được tìm ra thì có khoảng 2.000 chất do thực vậttạo ra còn khoảng 8.000 chất là kháng sinh do vi sinh vật tổng hợp, trong đó xạkhuẩn tổng hợp hơn 60% Các công trình nghiên cứu đã chứng minh

Streptomyces là một chi xạ khuẩn gồm nhiều loài có khả năng sinh tổng hợp

kháng sinh đa dạng về cấu trúc và đặc điểm kháng khuẩn Đặc biệt một số loàitrong chi này có khả năng tổng hợp các chất chống ung thư và điều trị HIV-AIDS

Tuy nhiên có một vấn đề gây lo âu lớn đối với các nhà nghiên cứu, đó là

sự xuất hiện của các vi sinh vật kháng kháng sinh và các chất hóa trị liệu khác

Do đó các nhà khoa học và các chuyên gia y tế đã không ngừng tìm kiếmnhững phương sách để chống lại hiện tượng này

Tại bộ môn Vi sinh và Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội, chúng tôi tiến

hành phân lập và nghiên cứu về chủng Streptomyces 40.16 với các mục đích sau:

+ Từ chủng Streptomyces đã được phân lập, chọn giống sinh tổng hợp

kháng sinh tốt nhất bằng chọn lọc ngẫu nhiên và đột biến,

+ Nghiên cứu môi trường nuôi cấy và điều kiện lên men tối ưu,

+ Nghiên cứu đặc điểm, hình thái và sinh lý nhằm xác định tên khoa học

của chủng Streptomyces 40.16 theo khóa phân loại ISP,

+ Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết, tách sản phẩm và các đặc tính

của kháng sinh do xạ khuẩn Streptomyces 40.16 tổng hợp lên.

PHẦN 1 TỔNG QUAN

1.1 VÀI NẪT VỀ KHÁNG SINH [5][6][8][11]

1.1.1.LỊCH SỬ

Năm 1928, nhà vi khuẩn học người Anh Alexander Fleming trong khinghiên cứu tụ cầu khuẩn ông nhận thấy xung quanh khuẩn lạc mốc xanh nhiễmvào hộp peptri nuôi tụ CẦU TẠO THàNH VŨNG VỤ KHUẨN HIỆN Tượng

kỠ LẠ NàY đÓ được Fleming nghiên cứu và phân lập thuần khiết và xác địnhđược mốc xanh đó là Penicillium notatum một chủng tạo ra penixilin

Năm 1941 penixilin được nghiên cứu sản xuất phục vụ điều trị chothương binh trong đại chiến thế giới thứ II và kỷ nguyên của chất kháng sinhđược thừa nhận Cho đến nay người ta đÓ PHỎT HIỆN Và MỤ TẢ KHOẢNGHơn 8000 chất kháng sinh khác nhau có nguồn gốc từ nấm mốc, xạ khuẩn và vikhuẩn Thuật ngữ kháng sinh (antibiotic) được Waksman N.A gọi từ 1944 KHIỤNG PHỎT MINH RA STREPTOMYCIN TỪ MỤI trường nuôi cấy

STREPTOMYCES GRISEUS

1.1.2 Định nghĩa

KHỎNG SINH Là NHỮNG HỢP CHẤT HOỎ HỌC DO VI SINH VẬTTIẾT RA CÚ TỎC DỤNG ỨC CHẾ SỰ PHỎT TRIỂN HAY TIỜU DIỆTMỘT CỎCH CHọn lọc một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, xạkhuẩn, protozoa, virus) hay cả tế bào ung thư ở nồng độ thấp

1.1.3.Cơ chế tác dụng của kháng sinh.

Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợprất khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh Chúng liên kết vào các vị tríchính xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật mà tạo ra các phản ứngtrao đổi chất Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiêntrong nhiều trường hợp người ta vẫn chưa biết được chính xác hết Có 6 mứctác dụng khác nhau đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm: Tác dụng LỜN THàNH

TẾ BàO, TỎC DỤNG LỜN MàNG NGUYỜN SINH CHẤT, TỎC DỤNGLỜN QUỎ TRỠNH TỔNG HỢP ADN, TỎC DỤNG LỜN QUỎ TRỠNHTỔNG HỢP PROTEIN, TỎC DỤNG LỜN SỰ TRAO đổi chất hô hấp và cuốicùng là tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian

1.1.4.PHÕN LOẠI KHỎNG SINH

PHân loại kháng sinh có thể theo nhiều cách, nhưng theo cấu trúc hóahọc là khoa học nhất.Bảng 1 giới thiệu một số nhóm kháng sinh quan trọng

Bảng 1: Các chất kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hoá học

THỂ

1 Các kháng sinh có chứa

đường trong phân tử

AMINOGLYCOSIDORRTHSOMYCINN-GLYCOSIDC-GLYCOSIDGLYCOLIPID

STREPTOMYCIN, NEOMYCIN

EVERNINOMYCINSTREPTOTHRICINVANCOMYCINMOENOMYCIN

MACROTETROLID

ERYTHROMYCINCANDICIDIN, NISTATINRIFAMICINTETRANACTIN

3 QUINON Và CỎC

KHỎNG SINH CỰNG

HỌ

ANTHRACYCLINNAPHTHOQUINONBENZOQUINONCỎC TETRACYCLIN

ADRIAMYCINACTINORHODINMITOMYCINTETRACYCLIN, TERAMYCIN

4 CỎC KHỎNG SINH

AMINOACID Và

PEPTID

DẪN XUẤT AMINOACIDKHỎNG SINH

BETALACTAMKHỎNG SINH PEPTIDCHROMOPEPTID

DEPSIPEPTID

CYCLOSERINPENICILIN, CEPHALOSPORINBACITRAXIN, POLYMYCINACTINOMYCINVALINOMYCIN

5 KHỎNG SINH DỊ

VŨNG CHỨA NITơ

CỎC KHỎNG SINH NUCLEOSID

POLYOXIN

6.KHỎNG SINH DỊ

VŨNG CHỨA OXY

CỎC KHỎNG SINH POLYETHER

1.1.5 KHỎI NIỆM VỀ KHỎNG KHỎNG SINH

Kháng kháng sinh là hiện tượng VSV mất đi tính nhậy cảm ban đầu của

nó trong một thời gian vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hoá trị liệu

Kháng sinh chủ yếu mất tác dụng theo 3 cơ chế: Thay đổi vị trí đích,giảm tính thấm của thuốc hoặc do tác động của eNZYM LàM MẤT HOẠTTỚNH CỦA KHỎNG sinh Tính kháng kháng sinh được di truyền cho các thế

hệ tiếp theo Bản chất di truyền tính kháng thuốc được khẳng định nhờ tác nhân

gây đột biến và plasmid CỎC QUỎ TRỠNH NàY lan truyền tính kháng thuốcngoài nhiễm sắc thể xảy ra ở mức độ phân tử, tải nạP NHỜbACTERIOPHAGE Và BIẾN NẠP VàO VI KHUẨN và tiếp hợp.

1.1.6 Sơ đồ mô tả quy trỠNH SẢN XUẤT KHỎNG SINH

1.1.7 ỨNG DỤNG CỦA KHỎNG SINH

Kháng sinh được sử dụng trong y học từ 1940 (penixilin) sau đó một loạtcác chất kháng sinh khác từ xạ khuẩn được phát minh ra và nhanh chóng được

sử dụng để diều trị bệnh nhiễm trùng hiểm nghèo

BẢNG 2 :MỘT VàI KHỎNG SINH QUAN TRỌNG CÚ GIỎ TRỊ KINH

CEPHALOSPORIN C CEPHALOSPORIUM

ACREMONIUM

KHỎNG KHUẨN

POLYMYXIN B BACILLUS POLYMYXA KHỎNG KHUẨN

KHỎNG SINH CŨN được ứng dụng trong nông nghiệp trước hết để tiêudiệt các nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng như các bệnh khô vằn, vànglụi ở lúa (validamyin, blasticidin S, kasugamyxin, v.v…), bệnh thối cổ rễ ở cáccây có củ,v.v…Kháng sinh cŨN KỚCH THỚCH NẨY MẦM CỦA HẠT.THường ngâm hạt trong dung dịch kháng sinh trước khi gieo vừa để kích thíchnẩy mầm, vừa tiêu diệt mầm bệnh trong đất

KHỎNG SINH CŨN được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm để bảoquản thực phẩm đóng hộp.Nếu dùng kháng sinh thực phẩm đóng hộp sẽ bảoquản được lâu hơn, khử trùng ở nhiệt độ thấp hơn nên chất lượng thực phẩmgiữ được tốt hơn(ví dụ NIZIN)

1.2.ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN [1][9][11][14][15]

1.2.1 Đặc điểm của xạ khuẩn

* Đặc điểm chung của xạ khuẩn: (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩnthật (Eubacteria) có cấu tạo sợi như nấm (nấm tia) nhưng lại có khích thước vàcấu tạo tế bào gần giống vi khuẩn, chúng phân bố rộng rÓI TRONG TỰNHIỜN: TRONG đất, nước và trong các chất hữu cơ

- Những đặc điểm đặc trưng của xạ khuẩn :

+ Kích thước của xạ khuẩn nhỏ bé tương tự như vi kích thước vi khuẩn+ NHÕN CỦA XẠ KHUẨN là nhân không điển hình

+ MàNG TẾ BàO XẠ KHUẨN KHỤNG CHỨA XENLULO Và KITIN+ SỰ PHÕN CHIA TẾ BàO CỦA XẠ KHUẨN THEO KIỂU CỦA VIKHUẨN

+ XẠ KHUẨN KHỤNG CÚ GIỚI TỚNH

- TUY VẬY XẠ KHUẨN LẠI CÚ HỠNH thái, cẤu TẠO SỢI, PHỎTTRIỂN BẰNG PHÕN NHỎNH THàNH NHỮNG SỢI NHỎ, DàI GỌI LàKHUẨN TI (HIPHA), MỖI KHUẨN TI DO MỘT TẾ BàO HỠNH THàNH,TẬP HỢP CỦA CỎC KHUẨN TI NàY GỌI Là HỆ KHUẨN TI

* Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn :

- Đường kính khuẩn ti xạ khuẩn khoảng 0,2 - 3,0 μM

- MàU SẮC CỦA KHUẨN TI khí sinh rất phong phú: màu trắng, vàng,

đỏ, lục, tía, nâu, đen…

- THàNH TẾ BàO DàY TỪ 7,5-10,0 NM, KHỤNG CÚ XENLULO VàKITIN

- PHÕN CHIA TẾ BàO THEO KIỂU PHÕN BàO VỤ TỚNH

1.2.2.Đặc điểm hỠNH THỎI Và SINH LỚ CỦA XẠ KHUẨN chi

+ Bào tử trần: được hỠNH THàNH DO SỰ PHÕN CẮT CỦA SỢI BàO

TỬ, Là Cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn Bào tử trần có thể hỠNHCẦU, HỠNH ELIPSOID, HỠNH QUE, HỠNH TRỤ CỎC BàO TỬ TẬPHỢP VỚI NHAU THàNH CHUỖI 3- 50 BàO TỬ HOẶC NHIỀU Hơn Bề mặtcủa bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (SM), XỰ XỠ (WA), CÚ GAI (SP),HOẶC CÚ TÚC (HA)

* Đặc điểm sinh lý:

- STREPTOMYCES là vi sinh vật dị dưỡng, có tính oxy hoá cao Để phát

triển chúng phân giải các hydrat cacbon làm nguồn thức ăn cung cấp vật chất

và nguồn năng lượng đồng thời thuỷ phân các hợp chất như gelatin, casein, tinhbột Chúng cũng có thể khử nitrat thành nitrit.

- STREPTOMYCES Là VI SINH VẬT CÚ THàNH TẾ BàO KIỂU CW1

CÚ CHỨA L-DAP (DIAMINOPIMELAT) Và GLYCIN

- STREPTOMYCES Là LOàI XẠ KHUẨN HỤ hấp hiếu khí Nhiệt độ tối

ưu của chúng thường là 25-300C, một vài loài có thể mọc ở nhiệt độ cao hơn,

pH tối ưu thường từ 6,8-7,5

- Khả năng tạo sắc tố của STREPTOMYCES: SẮC TỐ TẠO THàNH TỪ

STREPTOMYCES được chia thành bốn loại: sắc tố hoà tan, sắc tố khuẩn ty cơ

chất, sắc tố melanoid, sắc tố khuẩn lạc

1.2.3.PHÕN LOẠI STREPTOMYCES

CHI STREPTOMYCES bao gồm một số lượng lớn các xạ khuẩn có khả

năng sinh tổng hợp ra các kháng sinh được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khácnhau Việc phân loại và xác định TỜN XẠ KHUẨN Là RẤT QUAN TRỌNG

CÚ RẤT NHIỀU KHOỎ PHÕN LOẠI STREPTOMYCES KHỎC NHAU:

PHÕN LOẠI THEO KRASILLKOW, WAKSMAN, GAUZE, SHIRLING &GOTTLIEB, NGOàI RA CŨN CÚ THỂ PHÕN LOẠI THEO KIỂU GEN HỘINGHỊ "VI SINH VẬT THẾ GIỚI LẦN X" (được tổ chức tại Mexico vào năm1970) chọn khoá phân loại của E.B.Shirling & Gottlieb làm khoá phân loại

chính để phân loại chi STREPTOMYCES và đặt tên quốc tế là International

STREPTOMYCES PROJECT (ISP)

Khoá phân loại dựa vào các đặc điểm:

- Đặc điểm hỠNH THỎI HỌC CỦA XẠ KHUẨN :

+ Màu sắc của khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí SINH,

+ Khả năng tạo sắc tố melanoid,

+ Khả năng sử dụng các nguồn đường của xạ khuẩn

1.2.4 Khả năng sINH TỔNG HỢP KHỎNG SINH CỦA

STREPTOMYCES

MỘT SỐ KHỎ LỚN KHỎNG SINH DO các LOàI STREPTOMYCES

SINH TỔNG HỢp, rất đa dạng, có trong hầu hết các nhóm phân loại khángsinh

1.3 CẢI TẠO GIỐNG VI SINH VẬT [1][5][8][10][11][15]

1.3.1.Mục đích

Trong thực tế không thể phân lập được từ tự nhiên một chủng VSV cókhả năng tạo chất kháng sinh mong muốn với hàm lượng đủ để thỏa mãn yêucầu của sản xuất công nghiệp Các VSV phân lập từ cơ chất tự nhiên thường cóhoạt tính thấp đồng thời trong quá trình nuôi cấy, hoạt tính của chúng thườnggiảm dần Vì vậy việc cải tạo giống VSV bằng nhiều biện pháp khác nhaunhằm thu được những chủng có hoạt tính cao, ổn định là một trong những điềukiện quan trọng và cần thiết ở quy mô phòng thí nghiệm trước khi đưa ra côngnghiệp hóa

1.3.2.Phân lập giống xạ khuẩn

Người ta thường lấy mẫu từ các nguồn cơ chất khác nhau: đất ruộng,bùn, nước cống… để phân lập xạ khuẩn sinh kháng sinh Từ các mẫu trên đemphân lập khiết những xạ khuẩn sinh kháng sinh bằng các phương pháp đặctrưng và trên các môi trường chọn lọc

Các phương pháp phân lập giống xạ khuẩn: phương pháp cấy dịch chiếttrên bề mặt thạch, phương pháp cấy đất trực tiếp trên bề mặt thạch đã chứa sẵnVSV kiểm định, phương pháp làm giàu đất, phương pháp thêm kháng sinh vàomôi trường phân lập, phân lập VSV sinh kháng sinh chống ung thư

1.3.3 Các phương pháp cải tạo giống

A Phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên:

Chọn lọc tự nhiên hay còn gọi là sàng lọc ngẫu nhiên là tuyển chọn lấynhững dạng chủng có những đặc tính sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất, xuấthiện ngẫu nhiên do sự tác động của các điều kiện ngoại cảnh

B.Đột biến nhân tạo

Đột biến nhân tạo là quá trình xử lý tế bào bằng các tác nhân gây độtbiến (lý, hóa, sinh học…) Các tác nhân này khi sử dụng với liều lượng thíchhợp sẽ giết chết hầu hết các VSV, những cá thể sống xót sẽ có sự biến đổi ởNST, gây ra đột biến gen liên quan đến cấu trúc gen làm thay đổi 1 hay nhiềunucleotit trong trình tự mã hóa gọi là đột biến điểm Đây là loại đột biến có ýnghĩa trong công nghiệp kháng sinh, làm thay đổi tính trạng cũng có thể dẫnđến làm mất khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm tính), hay tăng cường

*Ánh sáng UV khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào VSV có kíchthước nhỏ (0,3-3μm) thì nó có thể xuyên thấu tới nhân Vì vậy được dùng phốbiến trong đột biến cải tạo giống

*Cơ chế: Tia UV tác dụng lên ADN và mạnh nhất ở vùng 260nm gâydime hóa thymin (do làm đứt các liên kết hyđro trong mạch kép ADN của tếbào VSV) Mà thymin gần nhau liên kết cộng hóa trị với nhau ở C5 và C6 Hậu

quả là sao chép bị sai lầm vì ADN polymeraza dễ lắp 1 nucleotit không chínhxác vào vị trí trên Đồng thời trên sợi AND cũng xuất hiện một dimepyrimidinkhác gọi là quang sản phẩm 6-4 Ở đây C6 của 5’ (thymin hoặc cytozin) đượcliên kết với C4 của 3’ (thường là Cytozin) Các sản phẩm này là nguyên nhânchủ yếu của đột biến gây nên bởi ánh sáng UV.

*Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả gây chết vầ tần số phát sinh độtbiến:

-Liều lượng chiếu: Được đặc trưng bởi 3 yếu tố là thời gian chiếu,khoảng cách chiếu, độ pha loãng bào tử Thực nghiệm cho thấy những đột biếndương thường xuất hiện ở những liều lượng chiếu có độ sống sót bào tử từ 0,1-1%, còn đột biến âm thường xuất hiện ở liều lượng chiếu cao hơn

-Ánh sáng thường: Sau khi đột biến bằng tia tử ngoại, nếu đem chiếu ánhsáng thường (bước sóng =320-480nm) trở lại thì sẽ có khoảng 50-80% tế bàođược phục hồi do tác dụng của men photolyase Hiện tượng này gọi là quangphục hoạt

Ngoài ra, các yếu tố nhiệt độ, pH, môi trường nuôi cấy, trạng thái sinh lícủa vi sinh vật cũng ảnh hưởng đến hiệu quả đột biến của ánh sáng UV

1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn.

Các giống vi sinh vật rất rễ bị thoái hóa, nhầm lẫn, mất Vì vậy việc bảoquản giữ giống vi sinh vật là rất quan trọng không chỉ ở các trung tâm giữgiống quốc gia mà ngay cả ở phòng thí nghiệm cũng rất cần thiết

Nhiệm vụ của công tác giữ giống vi sinh vật là thực hiện các thao tác kĩthuật cần thiết để giữ cho giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính ditruyền ổn định và không bị tạp nhiễm bởi các VSV khác

Có rất nhiều phương pháp giữ giống VSV khác nhau Tùy vào loại VSV

để chúng ta chọn phương pháp giữ giống cho phù hợp Đối với giữ giống xạkhuẩn trong phòng thí nghiệm có thể sử dụng phương pháp giữ giống trên môitrường thạch nghiêng để trong tủ lạnh 20C

1.4 DINH DƯỠNG VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY [5]

Trong quá trình sống, tế bào VSV luôn luôn phải trao đổi chất với môitrường xung quanh Tế bào VSV tuy rất nhỏ nhưng vì hấp thu các chất dinhdưỡng và thải các sản phẩm chất qua toàn bộ bề mặt, cho nên cường độ trao đổichất của chúng là rất lớn Các chất dinh dưỡng qua màng vào tế bào và đượcchuyển hóa thành những chất riêng biệt cho việc xây dựng tế bào Nhờ quátrình đồng hóa và dị hóa các tế bào mới có thể phát triển, sinh trưởng, đồng thờitạo ra các sản phẩm trao đổi chất

Những VSV dùng trong công nghiệp vi sinh kháng sinh đều là các VSV

dị dưỡng Để phát triển VSV cần một lượng đầy đủ các nguyên tố C, H, O, N,P… và một trong những nguyên tố vi lượng là Mn, Mo, Zn, Cu… Môitrường dinh dưỡng phải chứa tất cả các nguyên tố cần thiết cho sinh trưởng vàtạo thành sản phẩm của VSV Thông thường các môi trường nuôi cấy sử dụngnước máy thì không cần phải bổ sung các nguyên tố vi lượng vì các chất này đã

có đủ trong các cơ chất dinh dưỡng ở dạng tạp chất Trong quá trình lên menngười ta có thể thêm một số nguyên tố vi lượng đặc biệt hoặc tiền chất là chấtđặc hiệu cho sản phẩm tạo thành như tiền chất axít phenoxyacetic trong quátrình lên men sản xuất penicillin V Ở đây cũng cần lưu ý, một môi trường nuôicấy thuận lợi cho sự phát triển của một VSV không nhất thiết sẽ là môi trườngđảm bảo cho sản xuất sản phẩm trao đổi chất tốt nhất Môi trường lên men tốtnhất phải là môi trường đảm bảo cho sản xuất tốt nhất với hiệu suất cao trongthời gian ngắn và chi phí thấp với chủng VSV cho trước

Thành phần môi trường và chế độ tối ưu hóa được xác định theo haicách: tối ưu hóa kinh điển và sử dụng phương pháp toán học quy hoạch thựcnghiệm

1.5 LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH [2][5][8]

1.5.1 Bản chất của quá trình lên men

Lên men thực chất là phản ứng ôxi hóa khử sinh học xảy ra nhờ xúc táccủa các enzim do VSV tự tổng hợp với mục đích cung cấp năng lượng và tạo racác sản phẩm trao đổi chất trong dịch lên men

1.5.2 Giống vi sinh vật

Trong lên men công nghiệp, kỹ thuật chỉ là công cụ tác động và điềukhiển lên quá trình sinh học còn giống vẫn là khâu quan trọng, quyết định giátrị kinh tế của quá trình sản xuất Giống VSV dùng trong quá trình lên menphải là các tế bào sinh dưỡng đang ở giai đoạn phát triển mạnh và có khả năngđồng hóa vật chất cao nhất Do đó trước khi lên men phải có giai đoạn tạogiống Giống VSV được tạo ra qua các cấp nhân giống kế tiếp nhau, trên máylắc tròn hoặc bình nón, rồi đến bình giống

1.5.3 Các phương pháp lên men

* Phương pháp lên men bề mặt:

Lên men bề mặt là quá trình nuôi cấy VSV trên bề mặt môi trường rắn,đặc hay lỏng VSV hấp thụ các chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng ôxikhông khí để hô hấp trên bề mặt môi trường dinh dưỡng Vì vậy yêu cầu củacông nghệ lên men bề mặt là bề mặt môi trường phải đủ rộng, lớp môi trườngkhông quá sâu (5-10cm), đồng thời phải giữ độ ẩm môi trường khoảng 60% (cótrường hợp 90- 100%) để tránh khô bề mặt môi trường

Lên men bề mặt có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư ban đầu thấp.Nhưng có nhược điểm là đòi hỏi mặt bằng lớn, hiệu xuất sử dụng thường thấp,khó cơ giới hóa và tự động hóa Chính vì lý do đó mà ngày nay, công nghiệpkháng sinh không áp dụng lên men bề mặt trong sản xuất mà chỉ áp dụng trongcác phòng thí nghiệm để chọn giống

* Phương pháp lên men chìm:

Phương pháp lên men chìm là kiểu lên men mà VSV phát triển trongkhông gian 3 chiều của môi trường lỏng

Trước khi lên men phải có giai đoạn tạo giống

- Giống cấp 1: Nuôi cấy trong bình nón trên máy lắc (100ml/500ml),

- Giống cấp 2: Nuôi cấy trong bình giống 80l,

- Giống cấp 3: Nuôi cấy trong bình 1-5m3

Tỷ lệ giống trong môi trường là 1-10% Tỷ lệ giống phụ thuộc vào quy

mô của bình lên men

Quá trình lên men có thể làm thay đổi các điều kiện ban đầu của môitrường: thay đổi pH, nồng độ các thành phần trong môi trường, các sản phẩmtrao đổi chất, tạo bọt trên bề mặt môi trường Để đảm bảo những điều kiện tối

ưu cho sự phát triển của VSV trong quá trình lên men người ta đã đưa ra một sốbiện pháp như: cho thêm các chất phá bọt (mỡ cá voi, dầu thực vật, chất điềuchỉnh pH hay dùng hệ đệm để ổn định pH) Cũng có thể lấy mẫu dịch lên menphân tích để đánh giá các tham số và có sự điều chỉnh (nếu cần) quá trình lênmen

- Ưu điểm của phương pháp lên men chìm là:

+ Sử dụng môi trường dinh dưỡng tối ưu, đáp ứng được nhu cầu sinh lýcủa VSV,

+ Hệ số sử dụng không gian cao (3 chiều), hiệu suất lên men cao,

+ Các thiết bị dễ cơ giới hóa, tự động hóa, tiết kiệm mặt bằng và tốn ítnhân công

- Nhược điểm:

Đòi hỏi phải có trang thiết bị chuyên dùng (thiết bị chịu áp lực, điều kiện

vô trùng tuyệt đối) do đó chi phí đầu tư lớn

Lên men chìm chia thành 4 kiểu chính:

- Lên men gián đoạn (lên men mẻ):

Quá trình lên men gián đoạn được xem như một hệ thống kín Trong suốtthời gian lên men không tác động hay bổ sung gì thêm vào môi trường lên men,trừ việc cung cấp ôxi (dưới dạng không khí nén), chất phá bọt (nếu cần), điềuchỉnh pH Trong quá trình lên men VSV phát triển qua 4 giai đoạn: Pha tiềmtàng, pha log (lũy thừa), pha dừng, pha suy tàn ( hình 3).

lnx

Pha dừng Pha log Pha suy tàn Pha

x: sinh khối khô VSV trong dịch lên men

t: thời gian lên men

Trong công nghiệp, quá trình lên men kết thúc phụ thuộc vào việc sinhtổng hợp hoạt chất dừng lại ở pha nào trong chu kì sinh trưởng của VSV hoặckhi việc sinh tổng hợp hoạt chất đã bị chậm lại, nếu tiếp tục lên men sẽ khôngmang lại hiệu quả kinh tế

- Lên men có bổ sung:

Lên men có bổ sung là biến tướng phát triển của lên men mẻ đống kín.Trong khi lên men, do nồng độ cao của một số chất (glucoza, các hợp chấtnitơ…) ức chế việc tạo ra sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Bởi vậy khi bắt đầu

lên men các thành phần đó được đưa vào với một nồng độ thấp và được bổsung vào hệ thống trong quá trình lên men.

- Lên men liên tục: quá trình lên men môi trường dinh dưỡng được bổsung liên tục vào bình lên men, đồng thời lúc đó lấy ra đồng thể tích dịch lênmen Quá trình này xem như một hệ mở

- Lên men bán liên tục: Trong quá trình lên men việc bổ sung thêm môitrường dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không xảy ra liên tục màđịnh kỳ sau những khoảng thời gian xác định

1.6 TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ [4][7]

Trong hầu hết các trường hợp thì sản phẩm đích (kháng sinh) chỉ là mộtlượng rất nhỏ trong tổng số dịch lên men (0,2-30g/l) Kháng sinh là sản phẩmtrao đổi chất thứ cấp, do đó kết thúc quá trình lên men kháng sinh có thể nằmtrong sinh khối (ví dụ: gramicidin, nystatin) hoặc trong dịch lọc (ví dụ:penixilin, streptomycin) tùy thuộc vào đặc điểm của loài Vì vậy phải chiết tách

để lấy kháng sinh Việc lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào bản chất củakháng sinh

Một số phương pháp tách chiết hay được sử dụng:

- Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ,

- Phương pháp kết tủa,

- Phương pháp dùng nhựa trao đổi ion

Dù lựa chọn phương pháp nào thì mục đích cuối cùng vẫn là thu đượcmột sản phẩm kháng sinh có độ tinh khiết cao Trong công nghiệp sản xuấtkháng sinh thường áp dụng một số phương pháp chiết tách và tinh chế như: lọc,chiết, hấp thụ và sắc ký

1.6.1 Chiết xuất

* Định nghĩa: Chiết là phương pháp dùng dung môi (đơn hay hỗn hợp)

không đồng tan để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiêncứu

* Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không đồng tan

* Định nghĩa: Là một nhóm các phương pháp hóa học, vật lý và hóa lý

nhằm đi từ một hỗn hợp phức tạp đến những hỗn hợp đơn giản và từ hỗn hợpđơn giản tách riêng từng chất

* Các phương pháp tách hỗn hợp đồng nhất hay được dùng:

- Phương pháp chia cắt pha: Là phương pháp đi từ hỗn hợp đồng nhất(một pha) tách thành hỗn hợp không đồng nhất (hai pha)

- Phương pháp chuyển pha: Trong nhóm này có các phương pháp như là:chiết, thẩm thấu, các phương pháp sắc ký

* Sắc ký:

Là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần củahỗn hợp Sự tách sắc kí được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chấtkhác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh

và một pha động

Các phương pháp sắc ký:

- Sắc ký lớp mỏng (SKLM):

Nguyên tắc: Là phương pháp tách các chất dựa trên khả năng bị hấp phụ(là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ), ởđây pha tĩnh là chất rắn, pha động là dung môi Chọn dung môi và chất hấp phụtùy thuộc vào chất cần xác định, nếu chất cần xác định không phân cực thì chọnchất hấp phụ có hoạt tính cao (hấp phụ mạnh) và dung môi là không hay ít phâncực Chất phân cực ta chọn ngược lại.

- Sắc ký trao đổi ion:

Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng trao đổi thuận nghịch giữa các ion trongdung dịch chất nghiên cứu với các ion trong một chất gọi chung là nhựa ionit.Nhựa có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, nhựa có khả năng trao đổianion gọi là anionit Quá trình trao đổi tuân theo định luật tác dụng khối lượng

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):

Nguyên tắc: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bốkhác nhau của các chất giữa hai pha Pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thànhtấm phim mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt nhỏ 10mm) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt phatĩnh

* Cô đặc: Sản phẩm trao đổi chất ở nồng độ thấp cần phải cô lại trongchân không trước khi kết tinh

* Kết tinh: Kết tinh ở nhiệt độ thấp trên cơ sở độ tan của các chất thườnggiảm theo nhiệt độ

* Sấy khô: Có nhiều phương pháp sấy trên cơ sở dùng nhiệt độ cao, độthoáng khí hoặc hút

* Nghiền vỡ tế bào VSV: Trường hợp kháng sinh là sản phẩm trao đổichất nội bào, để thu được kháng sinh cần phá vỡ tế bào VSV, có thể dùngphương pháp vật lý, hóa học hoặc sinh học

1.7 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU MỚI TRONG SẢN XUẤT KHÁNG SINH [12][13][16][17].

1.7.1 Kháng sinh Boromycin chống HIV từ xạ khuẩn

Boromycin là kháng sinh thuộc nhóm polyête-macrolit được STH từ

Streptomyces sp A-3376, là kháng sinh chống HIV Boromycin có khả năng

ngăn chặn sự phát triển HIV ở giai đoạn cuối và có thể ngăn cản quá trình saochép của phân tử HIV trong tiến trình trưởng thành

Trong lên men Streptomyces sp A-3376 tạo ra một chất ký hiệu là

TMC-25, sau khi nghiên cứu đã chứng minh được TMC-25 có cấu trúc giống hệt củaboromycin, kháng sinh có chứa một nguyên tử Bo Lên men STH TMC-25được tiến hành trên máy lắc ở 270C trong 5 ngày

Dịch lên men thu được lọc loại bỏ sinh khối sau đó chiết bằng n-butanol,dịch chiết được tinh chế bởi phân đoạn dung môi cho ta kháng sinh ở dạng tủathô, tiếp tục tinh chế nhờ sắc ký cột đảo pha trên silicagel ODS và SephadexLH-20 Sau đó sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để thu được TMC-25 dướidạng bột vô định hình màu trắng Cứ 24,5 lít dịch lên men đã loại bỏ sinh khốisau quá trình chiết xuất và tinh chế sẽ thu được 24,5mg TMC-25

1.7.2 Tinh chế và đặc trưng của serine proteinaza thuỷ phân Keratin từ

STREPTOMYCES ALBIDOFLAVUS.

Streptomyces albidoflavus là một chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng

hợp enzym serine proteinaza có tác dụng thuỷ phân keratin

Streptomyces albidoflavus khi nuôi cấy ở môi trường chứa thịt- da có thể

sinh ít nhất 6 loại proteinaza ngoại bào Dịch lên men chủng Streptomycesalbidoflavus được ly tâm, lọc sơ bộ để loại bỏ sinh khối, sau đó được lọc quamàng lọc có kích thước 0,45m( Milipore Corp., Bedford, Mass), rồi được côđặc 10 lần bằng máy cất đặc chủng Khi so sánh độ nhạy để ức chế enzym, cácđặc trưng cơ chất với Streptomyces griseus proteinaza B (SGPB) đã cho thấyđây là một enzym mới được đặt tên là SAKaza, khá tương đồng với SGPB

1.7.3 Sản xuất 8-Demethylgeldanamycin và 4,5-Epoxy-8-

demethylgeldanamycin có tác dụng điều trị ung thư vú từ Streptomyces hygroscopicus

Geldanamycin thuộc họ kháng sinh benzoquinon gần đây đã được sự thuhút bởi những đặc tính dược lý học của nó như: ức chế tạo thành tiểu cầu, ứcchế enzym sao mã ngược, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng ungthư… với nồng độ ức chế tối thiểu (IC50) là 13nM khi tiến hành test với dòng tếbào NCI Đặc tính kháng ung thư của geldanamycin do ức chế mạnh ATP, làmbất hoạt sinh tổng hợp protein của tế bào gây ung thư Các nghiên cứu cũng chothấy sử dụng geldanamycin để điều trị ung thư sẽ tăng tính hiệu quả của phư-ơng pháp điều trị đồng thời, ví dụ: xạ trị Hiện nay, gendanamycin đang ở tronggiai đoạn 2 giám sát lâm sàng

Gendanamycin được sinh tổng hợp bởi Streptomyces hygroscopicus

var.geldanus, trong quá trình sinh tổng hợp còn tạo ra 4,5-Epoxy-8-demethylgeldanamycin, được tinh chế từ dịch lên men bằng sắc ký cột và sắc ký lỏnghiệu năng cao

Streptomyces hygroscopicus var.geldanus được lên men trên môi trường

YPD, pH được điều chỉnh ở 6,5 bằng H2SO4 2,5N hoặc NaOH 2,5N, cấp khíbằng hỗn hợp khí chứa oxy hoà tan là 30%

Tinh chế hai thành phần trên bằng phơng pháp sắc ký cột HP20, dịch rửagiải là MeOH

Gendanamycin và 4,5-Epoxy-8-demethylgeldanamycin là những khángsinh có khả năng ứng dụng cao đối với mô hình bệnh tật hiện nay được sinhtổng hợp từ Streptomyces sp

1.7.4 Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym Lipoxygenase từ Streptomyces sp.

Nhóm các hoạt chất có tác dụng ức chế enzym Lipoxygenase gồmtetrapetalone B (2, C28H35NO9), C (3, C26H34NO8), D(4, C28H36NO10) từStreptomyces sp USF – 4227, một chủng đồng thời cũng sinh tổng hợptetrapetalone A HLO (Human Lipoxygenase) và COX (cyclooxygenase) lànhững enzym xúc tác đầu tiên tương ứng tạo acid arachidonic, là sản phẩm sinh

ra một loạt các chất gây bệnh cho người như leukotrien, lipoxin, prostaglandin.Nghiên cứu được tiến hành trên Lipoxygenase của đậu nành (SBL: SoybeanLipoxygenase)

Streptomyces sp USF – 4727 được nuôi cấy trong môi trường thích hợp,dịch lọc sau nuôi cấy 10 ngày ở 300C được tinh chế bằng cột Diaion HP20, rửagiải bằng MeOH và Aceton được gộp lại và làm bốc hơi dưới áp suất giảm, sau

đó tinh chế bằng sắc ký cột silicagel, dung môi rửa giả là n-hexan (1), n-hexan:ethylacetate =3:7 (2), n-hexan: acetone = 3:7 (3), và acetone (4)

Tetrapetalone B được tìm thấy ở phân đoạn dung môi (1) và (2) , sau đósắc khí trao đổi ion bằng cột Sephadex LH – 20, dung môi rửa giả là MeOH,tinh chế phân đoạn dung môi (1) thu được 10mg bột từ 7,2l môi trường

Tetrapetalone A có IC50 là 190 (μM)

PHẦN 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1.NGUYÊN LIỆU

2.1.1.Giống vi sinh vật

*Chủng xạ khuẩn:

Giống xạ khuẩn Streptomyces 40.16 phân lập và tuyển chọn có khả năng

sinh tổng hợp kháng sinh, phổ tác dụng rộng, đặc tính di truyền ổn định, dophòng thí nghiệm Vi sinh Kháng sinh bộ môn Vi sinh và Sinh học trường Đạihọc Dược Hà Nội cung cấp

*Chủng vi sinh vật kiểm định:

Giống VSV kiểm định do Bộ môn Vi sinh và sinh học trường Đại họcDược Hà Nội cung cấp:

-Vi khuẩn Gram (-):

Escherichia coli ATCC 25922 (E.coli)

Proteus mirabilis BV 108 (P.mirabilis)

Shigella flexneri DT 112 (S flexneri) Salmonella typhi DT220 (S.typhi)

Pseudomonas aeruginosa VM 201 (P.aeruginosa)

-Vi khuẩn Gram (+):

Staphylococcus aureus ATCC1128 (S.aureus)

Bacillus pumilus subtilis ATCC 10241 (B.pumilus)

Bacillus subtilis ATCC 6633 (B.subtilis)

Bacillus creus ATCC 9946 (B.creus)

Sarcina lutea ATCC 9341 (S.lutea)

-Các loại nấm mốc: Mốc đen 1, Mốc xanh 1, Cadida, Asp.niger

2.1.2.Các môi trường nuôi cấy

*Môi trường phân lập:

Chủng xạ khuẩn 40.16 được phân lập trên môi trường 1 (MT1): Tinh bộtkhoai tây 2g; K2HPO4 0,05g; MgSO4 0,05g; KNO3 0,1g; NaCl 0,05g; Thạch1,8g; Nước vừa đủ 100ml

*Môi trường nuôi cấy và khảo sát khả năng sinh tổng hợp kháng sinh:

+Môi trường 1 (MT1): Tinh bột khoai tây 2g; K2HPO4 0,05g; MgSO4

0,05g; KNO3 0,1g; NaCl 0,05g; Thạch 1,8g; Nước vừa đủ 100ml; pH=6,8-7,2

+Môi trường 2 (MT2): Tinh bột 2g; KCl 0,05g; NaNO3 0,2g; K2HPO4

0,1g; MgSO4,7H2O 0,01g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nước vừa đủ 100ml

+Môi trường3 (MT3): Lactoza 3g; CaCO3 0,4g; K2HPO4 0,5g; NH4NO3

0,2g; MgSO4,7H2O 0,01g; Na2SO4 0,05g; Cao ngô 0,5g; Thạch 1,8g; 7,2; Nước vừa đủ 100ml

pH=7,0-+Môi trường 4 (MT4): Glucoza 2g; Cao ngô 0,5g; NH4NO3 0,2g;CaCO3 0,4g; K2HPO4 0,5g; MgSO4,7H2O 0,15g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2;Nước vừa đủ 100ml

+Môi trường 5 (MT5): Bột đậu tương 1g; Cao thịt 2g; CaCO3 0,2g;(NH4)2SO4 0,2g; NaCl 0,1g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nước vừa đủ 100ml

+Môi trường 6 (MT6): Bột ngô 2g; CaCO3 0,2g; NaCl 0,1g; CoCl2,H2O0,002g; K2HPO4 0,05g; Bột đậu tương 1,5g; Cao nấm men 0,5g; Thạch 1,8g;pH=7,0-7,2; Nước vừa đủ 100ml

+Môi trường 7 (MT7): Sacaroza 3g; Bột đậu tương 1g; CaCO3 0,2g;CoCl2,H2O 0,002g; (NH4)2SO4 0,2g; NaCl 0,1g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nướcvừa đủ 100ml

*Môi trường lên men là các môi trường trên ở dạng dung dịch (không cóthạch), ví dụ MT1dd: Tinh bột khoai tây 2g; K2HPO4 0,05g; MgSO4 0,05g;KNO3 0,1g; NaCl 0,05g; Nước vừa đủ 100ml

*Các môi trường sử dụng nuôi cấy VSV kiểm định

Các môi trường sử dụng nuôi cấy VSV kiểm định được giới thiệu tạibảng sau:

Bảng các môi trường kiểm định Thành phần

Môi trường

NaCl(%)

Caothịt (%)

Pepton(%)

Glucoza(%)

ISP5: L-asparagin 1,0g; glyxerin 10,0g; K2HPO4 1,0g; dung dịch muối vilượng 1,0ml; thạch 20g; nước cất 1000ml; pH=7,0-7,4.dung dịch muối vi lượng1,0ml; thạch 20,0g; nước cất 1000ml; pH=7,0-7,4