PHƯƠNG PHÁP SINH LÝ SINH HÓA NUÔI CẤY VÀ PHẦN LẬP VI KHUẨN

Phương pháp sinh lý sinh hóa nuôi cấy,phân lập vi khuẩn : Các phương pháp dựa trên những đặc điểm dinh dưỡng, hô hấp, chuyển hoá và khả năng phản ứng với các chất hóa học để làm tăng số lượng,định danh vi khuẩn.

KHOA THỦY SẢN

Đề tài:

Phương pháp sinh lý sinh hóa nuôi cấy phân lập vi khuẩn.

GVHD : Lê Văn Bảo Duy Lớp : Ngư Y 46

SVTH : Huỳnh Văn Lâm Nguyễn Phương Nam

ĐẶT VẤN ĐỀ

B nh vi khu n gây ra ngày càng ph c t p và nghiêm tr ng ệ ẩ ứ ạ ọ

v i đ ng v t th y s n ớ ộ ậ ủ ả

N m đ c các quy trình ph ng pháp sinh lý sinh hóa trong ắ ượ ươ

nuôi c y phân l p vi khu n ấ ậ ẩ

C s quan tr ng cho vi c nghiên c u đ đ nh danh vi khu n ơ ở ọ ệ ứ ể ị ẩ tìm ra tác nhân gây b nh đ a ra nh ng bi n pháp phòng ch ng ệ ư ữ ệ ố

ĐỊNH NGHĨA

(*) Phân lo i môi tr ạ ườ ng:

(*) Phân lo i môi tr ạ ườ ng:

(+) Th : ể

(+) Th : ể

- L ng: Canh thang, n c pepton L ng: Canh thang, n c pepton ỏ ỏ ướ ướ

- Đ c: Có 1-2% th ch nh th ch th ng, Đ c: Có 1-2% th ch nh th ch th ng, ặ ặ ạ ạ ư ạ ư ạ ườ ườ

th ch máu… ạ

th ch máu… ạ

- Môi tr ng m m: Có 0,3-0,5% th ch Môi tr ng m m: Có 0,3-0,5% th ch ườ ườ ề ề ạ ạ

(*) D ng c c y ụ ụ ấ

+ Que c y : th ng, móc , vòng , trang ấ ẳ + ng hút th y tinh Ố ủ

+ Đĩa petri + Đèn c n ồ + Hóa ch t (ch t ch th ,ch t ph n ng…… ) ấ ấ ỉ ị ấ ả ứ

(+) M c đích s d ng: ụ ử ụ

(+) M c đích s d ng: ụ ử ụ

- C b n: n c th t,canh thang th ng… ơ ả ướ ị ườ

- C b n: n c th t,canh thang th ng… ơ ả ướ ị ườ

- Phân l p:th ch máu,… ậ ạ

- Phân l p:th ch máu,… ậ ạ

-Tính ch t sinh hóa:KIA,OF,… -Tính ch t sinh hóa:KIA,OF,… ấ ấ

(*) C y ria trên đĩa petri ấ

(*) C y ria trên đĩa petri ấ

Vô trùng

que c y vòngấ

L y vi khu nấ ẩ trên môi tr ng Ria que c y ườấ

thích h pợ

L t ng a đĩa ậ ử trong nhi t đ

th i gian thích h p ờ ợ

(*) C y trang: ấ

0,1 ml d ch ị

ch a vi khu nứ ẩ

Tr i đ u d ch ả ề ị lên m t th chặ ạ

Kh trùng ử

thanh g t ạ

Đ a vào c nư ồ

và h qua l aơ ử

L t ng a đĩa ậ ử trong nhi t đ

th i gian thích h p ờ ợ

(*) nuôi c y phân l p ấ ậ

L y b nhấ ệ

ph mẩ

B ngằ

que c yấ

vô trùng

C yấ

Vùng 1

H que c yơ ấ

=>Vùng 2

H que c yơ ấ

=> Vùng 3

nuôi

30 – 370C

24h

Căn cứ Màu s c, hình d ng,kích th cắ ạ ướ khu n l c => ẩ ạ

Ch n Khu n l c nghi ngọ ẩ ạ ờ ( u th s l ng) ư ế ố ượ

(*) C y chuy n C y chuy n ấ ấ ể ể

C y gi ngấ ố

t ng nghi mừ ố ệ

môi trường l ngỏ

sang

Môi trường l ngỏ

ng th ch nghiêng

ố ạ

C y b m t nghiêng b ng cách ấ ề ặ ằ

c y t đáy ng lên đ u trênấ ừ ố ầ theo đương zic z cắ

M đĩa có khu n l c ở ẩ ạ

nghi ng dờ ưới ng n ọ

đèn c n ho c phòng ồ ặ

vô trùng

Que c y vô trùngấ

L y khu n l cấ ẩ ạ Nghi ngờ

(thường vùng 3)

Đĩa th ch m iạ ớ

ho c th ch nghiêngặ ạ 30- 37oC trong 24 gi ờ

(*) Nuôi c y thu n ch ng: Nuôi c y thu n ch ng: ấ ấ ầ ầ ủ ủ

C yấ

(*) Nhu m vi khu n ộ ẩ

(*) Nhu m vi khu n ộ ẩ

Que vô trùng

L y vi khu nấ ẩ

T m u b nhừ ẫ ệ

dàn m t ộ

l p m ngớ ỏ trên t mấ lam s ch ạ

T khô nhi t đ phòng r iự ở ệ ộ ồ

h trên ng n l a đèn c n ơ ọ ử ồ

đ di t khu n g n Vk vàoể ệ ẩ ắ lam kính

Nhu mộ Gram

Dd Crystal, 30-60 giây

Dd Lugol

1 phút

C n-Acetoneồ Nghiêng lam

Đ ch y quaể ả

Ch ph tỗ ế

Đê t y màu ả

R a nhanh ử

V y khô ẩ

R a nhanh ử

V y khô ẩ

R a nhanh ử

V y khô ẩ

Dd Fuchsin 1-2 phút

R a n cử ướ Khô t nhiênự

Quan sát

D i kính ướ

Hi n viể

(+)Xanh tím

Th các ph n ng hóa h c ử ả ứ ọ

Th các ph n ng hóa h c ử ả ứ ọ

QUE

C YẤ

VÔ

TRÙNG

L YẤ

VI

KHU NẨ

TÁC

D NGỤ

V IỚ

gi y t m ấ ẩ Tetramethyl Phenylenediamine Edihydrochloride 1%

Vk có Enzyme

Cytochrom-Oxydase

H2 02 - oxy già (đ c vk)ộ

KL

Xanh tím

2 ng ch a mt OF(xanh)ố ứ

1 ng ph d u parafin ố ủ ầ

môi tr ng Tryptoneườ

KL có enzyme

Catalase

B tọ khí

O2

30-370C,

24h

có kn lên men

2 vàng lactic acid

Có kn oxy hóa

Ph d u xanhủ ầ Còn l i vàngạ

sinh Indol (C8H5-NH2)

ỏ ẫ

30-370C,

Mt KIA

(1)Rìa trênth ch nghêng ạ (2)Đâm th ng không ẳ

ch m đáy th ch đ ng ạ ạ ứ

30-37 0 C,

24 h

- Th ch đ ng => vàng ạ ứ

=>Lên men glucose

Th ch nghiêng => vàng ạ

=>lên men lactose

- C ng => vàng ả ố

=> Lên men c hai ả

Sinh h i ơ (+) n t ho c ứ ặ

đ y lên ẩ (+ H 2 S) màu đen

Th các ph n ng hóa h c ử ả ứ ọ

QUE

C YẤ

VÔ

TRÙNG

C YẤ

VI

KHU NẨ

C y th ng đ ngấ ẳ ứ

mt Manitol di đ ngộ

Mt màu vàng =>Lên men đ ng Mantiolườ

Di đ ng => m c thành độ ọ ường th ngẳ

môi tr ngườ Nitrate

môi tr ngườ Simoms Citrate Agar

(s d ng citrate mt) ử ụ

C y các đi m khác nhauấ ể

trên đĩa l ng ồ

mt NA + 2% tinh b t ộ

thu c th ố ử 1ml Acid Sulffalinic 1ml Naphthyllamine

1-2 P

30 - <35 0 C

24 h

30-37 0 C

24 h

30-37 0 C,

24 h

+

S n ph m chuy n hóa ả ẩ ể Làm môi tr ng ki m hóaườ ề Thay đ i màu ch thổ ỉ ị

4 ng ch a mtố ứ

Decarboxylase (s d ng a.a mt) ử ụ

+

- không thêm => đ i ch ng ố ứ

- 1% Arginine

- 1% Lysine

- 1% ornithin

- ph 0,5ml parafin 4 ng ủ ố

30-37 0 C

24 h -96 h

(+) ng nghi m khác v i ố ệ ớ màu ng đ i ch ngố ố ứ

30-37 0 C,

24 h Đ dd lugol lênổ

m t mtặ

(+) có vùng sáng xung quanh đi m c yể ấ

Th các ph n ng hóa h c ử ả ứ ọ

QUE

C YẤ

VÔ

TRÙNG

C YẤ

VI

KHU NẨ

mt MR-VP

Đ nh tính ị

5 gi i thu c th ọ ố ử Methyl Red

(+) đ pH < 4,2 , (-) vàng pH > 6 ,ỏ

(±) Cam 4,2 < pH <6

mt MR-VP

Voges - Proskauer test

Mt tryptone 1%

(nhu c u và ầ k.n ch u đ ng mu i) ị ự ố

1ml Alpha - Naphthol 10%

30 - 37 0 C

24 h – 48 h

B ổ sung (+) mt đ c đ uụ ề

Glucose; Arabinose

NaCl :1%, 2%, 3%

4%, 5%, 6%, 7%

(+) H ng => vàng (-) không đ iồ ổ

30 - 37 0 C

24 h – 48 h

(+) đ camỏ (-) xanh đ ngồ

30 - 37 0 C

24 h

30 - 37 0 C, 24 h

k.N nh y c m v i ks ạ ả ớ

Đĩa l ng ch a mt TSAồ ứ

Huy n phùề

vk Lên 1-2P

Đăt đĩa Kháng sinh

(+) vòng vô trùng quanh

PH ƯƠ NG PHÁP NUÔI C Y PHÂN L P VI KHU N Ấ Ậ Ẩ

(*) u đi mƯ ể

(*) u đi mƯ ể

- Đ chính xác caoĐ chính xác caoộộ

- Xác đ nh hình d ng, cách s p x p Xác đ nh hình d ng, cách s p x p ịị ạạ ắ ếắ ế

và đ c đi m sinh lý sinh hóa c a vi khu nặ ể ủ ẩ

và đ c đi m sinh lý sinh hóa c a vi khu nặ ể ủ ẩ

(*) H n chạ ế

(*) H n chạ ế

- C n nhi u th i gian đ đ a ra k t quC n nhi u th i gian đ đ a ra k t quầầ ềề ờờ ể ưể ư ếế ảả

- D b sinh v t ngo i nhi mD b sinh v t ngo i nhi mễ ịễ ị ậậ ạạ ễễ

- Qua nhi u công đo nQua nhi u công đo nềề ạạ

(*) ng d ng trong th y s nỨ ụ ủ ả

(*) ng d ng trong th y s nỨ ụ ủ ả

- Đ nh danh loài vi khu n nghiên c uĐ nh danh loài vi khu n nghiên c uịị ẩẩ ứứ

- C s cho vi c nghiên c u s n xu t thu c kháng sinhC s cho vi c nghiên c u s n xu t thu c kháng sinhơ ởơ ở ệệ ứ ảứ ả ấấ ốố

TRẢ LỜI CÂU HỎI

1) Môi trường và thành phần môi trường KIA?

- Kligler Iron Agar gồm 2 loại đường:Lactose và glucose, tỷ lệ 10/1 chỉ thị pH là đỏ phenol

2) Vì sao trong mt manitol dùng t0 30 - <350C

- Manitol mt thử khả năng di động vi khuẩn,khả năng này do vi khuẩn có tiêm mao,

mà tiêm mao cấu tạo protein mà t0 từ 35oC sẽ làm protein biến tính

3) Mt ODC là gì?

- Ornithin Decacboxylaza gồm Ornithine,Cao men,Glucose,Bromocresol purple (1,6g/100ml cồn),nước cất

4) Mt OF?

- Oxydative-Fermentative, xác định cách sử dụng cacbonhydrat là kiểu oxy hóa, lên men hay trơ

5) Nhiệt độ thời gian thích hợp của phương pháp nuôi cấy phân lập?

- Tùy thuộc vào loại vi khuẩn có khoảng nhiệt độ khác nhau

- Thông thường là từ 30 – 37 oC trong vòng 24h – 48h

6) Vì sao trong cấy thuần chủng lại thường lấy khuẩn lạc từ vùng cấy thứ 3?

- Vì ở vùng cấy thứ 3 sẽ có khuẩn lạc rời

7) Khi nào thì sử dụng que cấy vòng, móc,trang?

- Sử dụng que cấy phụ thuộc vào mục đích của việc cấy

Vd) muốn xác định tổng số vi khuẩn thì ta sử dụng cấy trang

còn khi muốn cấy để phần lập thì ta sử dụng cấy vòng