TUYỂN CHỌN CÁC GIỐNG LÚA THƠM ĐẠT TIÊU CHUẨN XUẤT KHẨU VỪA CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG RẦY NÂU TỐT PHÙ HỢP VỚI TỈNH HẬU GIANG

TUYỂN CHỌN CÁC GIỐNG LÚA THƠM ĐẠT TIÊU CHUẨN XUẤT KHẨU VỪA CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG RẦY NÂU TỐT PHÙ HỢP VỚI TỈNH HẬU GIANG TUYỂN CHỌN CÁC GIỐNG LÚA THƠM ĐẠT TIÊU CHUẨN XUẤT KHẨU VỪA CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG RẦY NÂU TỐT PHÙ HỢP VỚI TỈNH HẬU GIANG

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Kỹ thuật điện di SDS-PAGE protein dễ làm, rẻ tiền, thích hợp với các nước nghèo, đang phát triển như Việt Nam Kỹ thuật này cho phép thanh lọc chính xác, nhanh chóng các dòng bị thoái hóa giống nhờ cách lấy mẫu phân tích chỉ sử dụng ½ nội nhũ nên không ảnh hưởng tới mầm hạt lúa; đồng thời xác định được những dòng ưu tú có chất lượng gạo đáp ứng được các yêu cầu của xuất khẩu cũng như tiêu thụ nội địa theo ý muốn như: ngon cơm, hàm lượng amylose thấp,

hàm lượng protein cao (Võ công Thành và Yutaka Hirata, 2002) Vì vậy, việc “:

Lai chọn giống lúa ngắn ngày, năng suất cao, thơm, kháng rầy nâu và bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá ” là một giải pháp có tính chiến lược trong công tác chọn tạo giống lúa theo hướng nâng cao chất lượng dinh dưỡng của hạt gạo

2 Mục tiêu đề tài

Tuyển chọn 2-3 giống lúa thơm cao sản ngắn ngày, năng suất cao, có chất lượng tốt cho tỉnh Hậu Giang

3 Đối tượng và phạm vi của đề tài

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là một số giống/dòng lúa được chọn tạo, thanh lọc bằng kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE của Bộ môn Di Truyền Giống NN, Đại học Cần Thơ

Phạm vi nghiên cứu là tính thơm; hàm lượng protein dự trữ đại diện cho nhóm chất lượng dinh dưỡng và hàm lượng amylose đại diện cho nhóm chất lượng cơm nấu, tính thơm, các chỉ tiêu nông học, thành phần năng suất và các chỉ tiêu sâu bệnh

4 Ý nghĩa của đề tài

Kết quả đạt được của đề tài sẽ mở ra một hướng mới cho công tác tuyển chọn giống lúa bằng công nghệ sinh học kết hợp với chọn lọc truyền thống Theo phương thức này sẽ chọn tạo ra được nhiều nguồn giống tốt cung ứng cho các địa phương cũng như làm đa dạng nguồn giống lúa ở ĐBSCL

Đối với trung tâm giống Hậu Giang: có được nguồn giống tốt, phù hợp với điều kiện địa phương, thích hợp sữ dụng để sản xuất giống tác giả, đảm bảo đáp ứng tốt nhu cầu về giống lúa tại địa phương

Đối với nông dân của tỉnh Hậu Giang: góp phần nâng cao đời sống kinh tế của nông dân trong vùng

Có được những giống lúa đặc sản phục vụ sản xuất tại địa phương, đảm bảo thuần giống, ổn định, năng suất cao, chất lượng tốt Góp phần giúp tỉnh Hậu Giang xây dựng được thương hiệu về các giống lúa gạo riêng cho mình

Chương 1

TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 1.1 Cơ sở khoa học của đề tài

1.1.1 Vai trò của giống lúa chất lượng cao trong sản xuất hàng hóa

Lúa gạo hiện nay là cây trồng quan trọng của nhiều quốc gia và là nguồn lương thực chính của trên ½ dân số thế giới, được gieo trồng tại 113 nước với 150 triệu

ha, sản lượng hằng năm là 600 triệu tấn Những năm gần đây nước ta đã trở thành một trong những nước xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới nhưng giá gạo của

ta luôn thấp hơn giá gạo xuất khẩu cùng loại của các nước như Thái Lan, Mỹ là

do gạo của ta có phẩm chất thấp Một trong những nguyên nhân chất lượng gạo thấp là giống lúa có phẩm chất gạo cao trong sản xuất còn rất ít Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là nơi đóng góp 95% lượng gạo xuất khẩu của cả nước cùng với việc mở rộng diện tích, tăng vụ, sử dụng giống mới có năng suất thương phẩm cao thì nhu cầu sử dụng giống lúa có phẩm chất gạo tốt, thơm có giá trị thương phẩm cao ngày một gia tăng

1.1.2 Chất lượng gạo và chỉ tiêu đánh giá phẩm chất hạt

Chất lượng hạt gạo được đánh giá thông qua nhiều chỉ tiêu Các chỉ tiêu đó có thể xếp thành ba nhóm thuộc ba lĩnh vực chất lượng: chất lượng dinh dưỡng bao gồm các chỉ tiêu hoá sinh của hạt gạo như hàm lượng tinh bột, hàm lượng amylose, hàm lượng protein, độ bền thể gel, nhiệt trở hồ chất lượng thương phẩm hay chất lượng kinh tế được đánh giá thông qua các chỉ tiêu vật lý và hình thái như tỷ lệ gạo xay xát, tỷ lệ hạt nguyên, gạo trắng trong, tỷ lệ tấm, bạc bụng,

độ đồng đều hạt, chiều dài, chiều rộng hạt và tỷ lệ dài/rộng chất lượng ăn uống

và chế biến gồm các chỉ tiêu như tỷ lệ cơm, sức hút nước, độ nở, độ xốp, độ dẻo,

độ bóng cơm, mùi thơm, (Nguyễn Thị Trâm, 2001) Trong các tính trạng về phẩm chất cơm, hàm lượng amylose được xem là tính trạng có ý nghĩa quyết định đến mềm cơm hoặc ngược lại

Mùi thơm từ thơm nhẹ đến thơm Tuy nhiên, chất lượng ăn uống của nhóm gạo này không chỉ phụ thuộc mức độ thơm mà còn có sự hiện diện của một số chỉ tiêu quan trọng khác như là chiều dài, chiều rộng hạt gạo, độ nở dài của hạt sau khi nấu, hàm lượng amylose, nhiệt trở hồ, độ bền thể gel và vị nếm Lúa thơm được phân ra thành ba nhóm như Basmati, Jasmine và trung gian giữa Basmati

và jasmine Bảng 1.1 cho thấy nhóm Basmati có nguồn gốc ở Ấn Độ và Pakistan

có hàm lượng amylose trung bình, nhiệt trở hồ thấp đến trung bình, độ bền thể gel trung bình; ngược lại nhóm Jasmine (Thái Lan) có hàm lượng amylose, nhiệt trở hồ thấp và độ bền thể gel mềm (Singh và ctv., 1997)

1.1.3 Các thành phần và đặc tính của protein dự trữ trong hạt lúa

Theo sự phân loại của Osborn (1924) protein hòa tan được trong nước, 0.5M Sodium chloride và ethyl alcohol 70% được gọi là: “albumin”, "globulin", và

"prolamin" tương ứng Protein không hòa tan được trong các chất trên nhưng hòa tan được trong 0.1M acid hoặc alkaline được gọi là "glutelin"

Hình 1.1 cho thấy, giữa các băng có các protein dự trữ hay còn gọi là tiểu đơn vị (subunit) như: 10 kDa, 13 kDaA, 13 kDaB, 16 kDa (prolamin) 26 kDa -(globulin), 22-23 kDa (glutelin basic), còn được gọi là β-glutelin và 37 - 39 kDa (glutelin acidic), còn được gọi là -glutelin

Theo Ogawa và ctv (1987), protein được dự trữ ở hai thể protein, thể protein loại I (PB-I) và thể protein loại II (PB-II), chiếm 20% và 60% protein tổng số theo thứ tự Chúng khác nhau về kích thước phân tử (Krishnan và Okita 1986; Tanaka and ctv.1980; Wen và Luthe 1985), hình dạng, mật độ, thành phần protein (Tanaka và Ogawa, 1985) và cơ chế sinh tổng hợp (Tanaka và Ogawa 1985; Yamagata và ctv.1982; Yamagata và Tanaka 1986) Hai thể protein này định vị ở khoảng trống giữa các hạt tinh bột (Juliano 1972)

Protein dự trữ trong PB-I là prolamin và bao gồm polypeptide 16 kDa, 13 kDa

và 10 kDa Trong đó, polypeptide 13 kDa được phân chia thành hai polypeptide với trọng lượng phân tử khác nhau, polypeptide 13A có trọng lượng phân tử lớn hơn polypeptide 13B Về mặt dinh dưỡng prolamin được xem là loại protein khó tiêu hoá đối với người sử dụng (Ogawa và ctv 1987)

Hình 1.1 Phổ điện di protein dự trữ trong nội nhũ hạt lúa (Tanaka origimal, 1988)

Hình 1.2 Hình dạng các thể PB-I và PB-II (Yamagata và Tanaka 1986)

Đối với PB-II, protein dự trữ chủ yếu là glutelin, đây là thành phần dự trữ quan trong nhất trọng nội nhũ hạt lúa, chiếm khoảng 80% protein tổng số và là thành phần dinh dưỡng chủ yếu của hạt lúa (Juliano, 1972) Trong suốt quá trình phát triển của hạt lúa, polypeptide pro-glutelin 57 kDa được tổng hợp trên mạng lưới nội chất thô và được chuyển vào mạng lưới nội chất lumen (Sacker và ctv 1986; Takemoto và ctv 2002; Wang 2000) và được cắt nối bởi enzyme protein disulfide isomerase tạo thành 2 tiểu đơn vị -glutelin có trọng lượng phân tử 22-

23 kDa và -glutelin có trọng lượng phân tử 37-39 kDa dự trữ trong thể protein (Yamagata và ctv 1982; Subodh và ctv 1986; Takaiwa và ctv 1986; Krishnan

và ctv 1986; Masumura và ctv 1989) -glutelin có tính acid và -glutelin có tính base (Robert và ctv 1985; Wen và Luthe, 1985) Trên phổ điện di,

polypeptide -glutelin có 3 tiểu đơn vị với trọng lượng phân tử là 37, 38 và 39 kDa; polypeptide -glutelin có hai tiểu đơn vị với trọng lượng phân tử là 22 và

23 kDa (Yamagata, Sugimoto và ctv.1982; Tanaka và Ogawa, 1985; Ogawa và ctv 1987) Một loại protein dự trữ khác trong thể PB-II là globulin, thành phần protein này chỉ chiếm khoảng 10% tổng số protein dự trữ trong nội nhũ hạt lúa (Juliano, 1972) Với phương pháp điện di SDS-PAGE, protein này chỉ xuất hiện với một tiểu đơn vị với trọng lượng phân tử 26 kDa (Tanaka và ctv 1980) Trong công tác chọn và lai tạo giống protein prolamin và protein glutelin được quan tâm nhiều nhất Hai thành phần protein này có mối tương quan nghịch, khi tăng hàm lượng prolamin lên thì hàm lượng glutelin sẽ giảm xuống và ngược lại

Để tăng hàm lượng lysine trong gạo là tăng thành phần glutelin và giảm thành phần prolamin (IRRI, 1988) Theo Ogawa và ctv (1987), để cải thiện chất lượng protein lúa là tăng hàm lượng protein trong thể PB-II hoặc giảm hàm lượng protein trong thể PB-I

1.1.4 Kỹ thuật điện di SDS-PAGE protein

Kỹ thuật điện di SDS-PAGE protein (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) được Laemmli (1970) phát triển từ sự hiệu chỉnh bằng cách thêm 0,1% SDS (chất tẩy mang điện tích âm) vào hệ PAGE của Ornstein-Davis,B.J (1964) nhằm xác định trọng lượng phân tử các loại protein trong phổ điện di (Davis E Garfin, 1985) bao gồm các bước: ly trích protein, tinh sạch protein, và điện di Trong dịch ly trích protein thường người ta dùng chất đệm Tris-base (pH>10), chất tẩy SDS, 2-Mercaptoethanol Khi đun nóng hỗn hợp protein trong dung dịch có dung dịch đệm SDS (2%) và nhờ vào chất hóa học có gốc thiol (2-mercapthoethanol) với nồng độ thường là 5%, protein sẽ bị phân cắt các cầu nối lưu huỳnh và biến tính thành các polypeptide mà vẫn giữ cấu trúc của nó nhờ sự áo của 1,4g SDS vào 1g polypeptide Ornstein-Davis,B.J (1964) Hơn nữa, mật độ điện tích SDS-polypeptide sẽ độc lập với pH trong khoảng từ 7 đến 10 Phân đoạn protein trong gel bị lưới của acrylamide ngăn chặn nên tách rời các polypeptide Dựa theo nguyên lý trên người ta cho thêm protein chuẩn có trọng lượng phân tử biết trước để xác định trọng lượng phân tử của các polypeptide trong phổ điện di để phát hiện protein, người ta thường dùng thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue R250 (0,1-1 g) cho mỗi vạch protein trong

phổ điện di (Somith, 1974) hay nhuộm bạc 2-10 ng cho mỗi vạch protein (Ornstein-Davis, B.J 1964)

1.1.5 Ứng dụng kỹ thuật DNA trong chọn giống

Việc cải thiện những giống lúa thơm bằng cách áp dụng các biện pháp lai tạo cổ điển rất khó thực hiện được do một số tính trạng chất lượng có thể bị mất trong quá trình thụ phấn và tạo hợp tử Để khắc phục hiện tượng đó kỹ thuật sinh học phân tử có thể được coi là một giải pháp có hiệu quả Một số thành tựu đó như là

sử dụng RFLP marker RG 28 để phát triển gen mã hoá tính thơm, hay marker

RZ 323 liên quan đến sự giản nở của chiều dài hạt ở giống Basmati 370 (Ahn và ctv., 1993)

Ngoài các RFLP marker còn có kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) cũng được sử dụng để phát hiện gen thơm của lúa Năm

1995, Jin và ctv., đã phát hiện ra một con mồi, Jas 1.5, có thể dùng để phân biệt giữa các giống lúa thơm và giống lúa thường

Tìm được marker cho gen qui định mùi thơm của lúa, band thơm có trọng lượng phân tử là 257bp, band không thơm có trọng lượng phân tử là 355bp (Louis và ctv., 2005)

Về căn bản, bất cứ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc giống khác nhau, đều có thể xem như là một DNA marker Các DNA marker có thể được chia thành hai nhóm như sau:

 PCR- based : ALP, AFLP, SSR, SSCP

 DNA/ DNA hybridization-based : RFLP, minisatellite

Các marker thuộc nhóm PCR-based có thể được chia nhỏ thành:

 Marker ngắn, có tính ngẫu nhiên: RAPD, AP-PCR, DAF, AFLP

 Amplicon đơn: ALP, SSR, SSCP

Bảng 1.1 Các loại DNA marker

RFLP Restriction frament length polymorphism

ALP Amplicon length polymorphism

AFLP Amplified fragment length polymorphism

RAPD Random amplified polymorphicDNA

DAF DNA amplification fingerprinting

SSR Simple sequence repeat (microsatellite)

AP-PCR Arbitrary priner-PCR

SSCP Single strand conformation polymorphism

MRDHV-DNA

Moderately repeated, dispersed, and highly variable DNA (minisatelltie)

Phản ứng chuỗi của polymerase thường được viết tắt là PCR (polymerase chain reaction) Đây là một kỹ thuật phân tử tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả PCR là kỹ thuật xử lý in vitro các chuỗi mã hóa di truyền DNA bằng cách phát triển primer một cách đồng loạt trên các dây đơn DNA Toàn bộ tiến trình được hoàn thiện do sự biến chất của DNA cần thiết, sự tác động của các primer tại đầu của các dây đơn DNA này, kế đến là sự phát triển của các primer do phản ứng DNA polymerase

Có hai vấn đề chính trong nguyên tắc PCR:

 Polymerase được sử dụng là những enzyme sống, nhạy cảm về độ nhiệt, phải được thêm vào trong mỗi chu kỳ

 Phải có một quy trình hướng dẫn cụ thể trong khi thực hiện từng giai đoạn của chu kỳ PCR

Cả hai tiến trình nói trên đều nặng nhọc và bất lợi cho các nhà nghiên cứu, nếu

họ có phương tiện quá hạn chế khi áp dụng PCR

Tuy nhiên, trong thiên nhiên vẫn có những sinh vật có thể sống ở nhiệt độ cao

Thí dụ polymerase được phân lập từ Thermus aquaticus có khả năng là vật thể

ổn định về nhiệt lượng Taq polymerase có hai thuận lợi chính: [i] hồi phục sau khi tác động nhiệt không cần kéo dài, [ii] enzyme này rất hoạt động ở nhiệt độ

cao, lúc đó việc tác động của các primer ở đầu dây đơn sẽ chuyên biệt hơn và sinh tổng hợp DNA sẽ nhanh hơn

DNA polymerase được dùng phổ biến là Taq polymerase, lấy từ Thermus aquaticus, có tính ổn dịnh nhiệt rất cao Một nửa chu kỳ của Taq polymerase

được giữ ở nhiệt độ 940C trong vòng 40 phút Taq polymerase có một mức tối hảo về nhiệt độ cao trong sinh tổng hợp DNA [70-720C] Ở quảng nhiệt độ này, hoạt động đặc biệt của Taq polymerase có thể cao như 150 nucleotide/giây/enzyme Do đó người ta phải cố gắng phát triển ở quãng nhiệt

độ 70-720C trong vòng một phút Từ đó hàng kilo bp của các đoạn DNA có thể được tổng hợp

Taq polymerase nhạy cảm với ion magnesium Nồng độ tối hảo của Mg2+ là 2,5mM Vì deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) có thể gắn với Mg2+, cho nên nồng độ chính xác của magnesium tùy thuộc vào nồng độ của dNTP Các thành phần khác ít mẫn cảm với Taq polymerase là KCL và Tris

Trong PCR tiêu chuẩn, người ta cần có một cặp primer Sự khuyếch đại chuyên biệt nào đối với một đoạn DNA cần nghiên cứu, đều phải tùy thuộc các primer tương xứng Cả hai yếu tố: chiều dài primer và thành phần G+C đều có ảnh hưởng quan trọng đối với nhiệt độ trong quá trình tác động ở đầu dây đơn Nhiệt

độ này sẽ là 2x (# của A+T) + 4x(# của G+C) + 50C nếu có 50% G+C, thì chiều dài của primer phải có kích thước tương ứng là 18-20 nucleotide

Người ta thường mua các nucleotide ở các công ty hóa chất, có chất lượng tốt Nếu nó được bảo quản ở dạng bột đông khô [freeze-dried powder] Sau đó người ta phải điều chỉnh lại độ pH, trước khi sử dụng

 DNA mục tiêu (Target DNA)

Người ta cần phải có các đoạn DNA mang mật mã đã biết trước, được gọi với thuật ngữ “target DNA” trong kỹ thuật PCR người ta sẽ nhận được những kết quả tốt nhất, nếu DNA thật sự thuần khiết, DNA từ mô lá Số lượng DNA cần cho một phản ứng không nhiều lắm, chỉ cần 5-10 ngDNA thuần khiết, đủ để cho những kết quả theo mong muốn Người ta cần có ethanol trong lần cuối của quy trình chuẩn bị DNA Với 10% ethanol, nó vẫn chưa có thể gây ảnh hưởng đến hoạt động của Taq polymerase

Điều ghi nhận quan trọng là: phải có một mM EDTA trong chất đệm TE trong khi sử dụng để hòa tan DNA EDTA sẽ gắn với Mg2+, sao cho thể tích của DNA mục tiêu không vượt quá 1/5 của thể tích PCR

Sản phẩm của PCR là những đoạn mã DNA Khi DNA xuất phát từ hai dòng lai với nhau được khuếch đại lên nhờ các primer tại locus đặc biệt nào đó, thì trọng lượng phân tử của sản phẩm PCR này có thể rất khác nhau, vì có những thay đổi vật lý trên chuỗi mã DNA, nghĩa là, sự mất đoạn hay thêm đoạn DNA sẽ xảy ra trong vùng bị khuyếch đại nầy Thể đa hình này được gọi là “amplicon length polymorphism” [ALP] phản ánh DNA có tính đa hình giữa các cá thể/ các dòng lai/ các giống lúa Thuận lợi của ALP so với RFLP trong việc phát hiện này là:(1) nó rất nhanh, chỉ cần một ngày giúp ta tìm ra kết quả, (2) không có chất đồng vị, (3) rẻ tiền, (4) cần rất ít DNA Bất lợi của ALP là người ta phải biết rõ chuỗi mã DNA đầu tiên khi tổng hợp primer

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.2.1 Những nghiên cứu liên quan đến protein hạt

 Protein được xem là chỉ thị di truyền trong công tác chọn giống

Giống như DNA và enzyme, protein dự trữ cũng đã được dùng làm dấu phân tử trong công tác chọn tạo giống vì:

Chúng có độ đa hình cao ngay cả bên trong và giữa các quần thể Tập đoàn giống lúa cổ truyền trồng ven biển ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, Việt Nam có

độ đa dạng di truyền tương đối cao (Vương Hỗ, 2003) Đa dạng di truyền về

glutelin có trọng lượng phân tử cao ở lúa mì hoang dại (Triticum turgidum var dicoccoides) có phân phối bằng nhau bên trong cũng như giữa các quần thể lúa

mì trồng Paul Gepts, (1990)

Độ đa hình của chúng được xác định phần lớn là do di truyền Bởi vì các mức độ

đa hình và tính ổn định môi trường cao nên protein dự trữ có thể dùng để xác định giống hay liên quan đến các dấu (Marker) khác Xác định giống thông qua protein của hạt đã áp dụng ở cây lúa mì, đậu faba, lúa đại mạch, bắp… Độ đa hình protein dự trữ bên trong loài cũng đã được xác định ở nhiều loài cây trồng

và mối quan hệ của nó với loài hoang dại Đậu Phaseolus, đậu phộng, bắp, đậu nành (Mori và ctv., 1987) Kết quả so sánh với phương pháp phân tích bằng isoenzyme, người ta thấy rằng kỹ thuật protein phát hiện đa dạng hơn gấp nhiều lần, thí dụ trong thí nghiệm của Paul Gepts, (1990) đánh giá rằng protein dạng hordeins mức độ đa dạng gấp 10-30 lần

Kiểm soát di truyền về các biến dị di truyền chất lượng thì đơn giản và bao gồm một số locus có giới hạn nằm trong bộ gen trong nhân tế bào Gene conglycinin hay globulin 7S ở hạt đậu nành quyết định đến phẩm chất chế biến, bao gồm protein ',  và  đều do một gen kiểm soát (Kitamura và ctv., 1984)

Tính đồng dạng về protein dự trữ của các loài khác nhau sẽ được xác định Các nguồn phân tử về tính đa hình protein dự trữ đã được biết cho thấy hầu hết các thể biến dị protein là đồng nhất và do đó có thể được xem như là các chỉ thị (marker) về tiến hóa

 Kiểm tra sự khác biệt giữa các loài

Dựa trên phân tích trọng lượng phân tử khác nhau của protein dự trữ mà người

ta đánh giá tính đa hình và phổ biến Do vạch protein trong phổ điện di là kết quả của một chuỗi phức tạp ở mức độ phân tử nên không có một vạch protein nào có thể xuất hiện hai lần, do đó mỗi mẫu có một nguồn gốc riêng và các kiểu gen có cùng dạng mẫu là có nguồn gốc chung Kết quả phân tích nầy giống như kết quả phân tích trên mức độ chuỗi trình tự DNA bởi vì các protein dự trữ được

mã hóa do một số locus phức tạp có giới hạn Hơn nữa, nghiên cứu sinh học phân tử và hóa học của các protein dự trữ cho thấy có sự đồng dạng giữa các thành phần protein có tính phổ biến trong hệ thống phân loại (Paul Gepts, 1990)

Kỹ thuật điện di SDS-PAGE protein giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền và phân biệt hai loài lúa hoang ở ĐBSCL dựa vào mức độ ăn màu Coomassie của băng protein chỉ thị dạng glutelin và dạng prolamin (Phạm Văn Phượng, 2006)

 Nghiên cứu sự tiến hoá của loài (cây phả hệ)

Giống như mức độ biểu hiện DNA, sự biểu hiện mức độ ăn màu protein cũng được ghi nhận ở mức độ nhị phân, có ăn màu được ghi nhận là 1, không có ăn màu do đột biến các amino acid bên trong sẽ được ghi nhận là 0 Từ đó, dựa vào

sự giống nhau hay khác biệt các băng protein để tính theo chỉ số Jascard và chuyển đổi ma trận sự khác biệt để lập biểu đồ nhóm (cluster) để cho ta thông tin về mối quan hệ tiến hóa giữa các loài Thông qua biểu đồ như vậy nhà chọn giống sẽ chọn lựa và tiến hành chọn cặp cha mẹ để lai (Võ Công Thành và ctv., 2003)

 Xác định độ thuần của giống cây trồng

Khảo nghiệm tính khác biệt, tính đồng nhất, và tính ổn định của giống cây trồng DUS (Distinctness, Uniformity, và Stability) thường dựa trên các phương pháp hình thái nên kết quả thường phản ánh không chính xác do ảnh hưởng của môi trường Các dấu hình thái thường chưa phản ánh hết hoàn toàn tính đa dạng di truyền giữa các giống có sự giống nhau chồng chéo về dạng hình và các mẫu giống đồng nhất về hình thái Do đó, nhà chọn giống cần có một công cụ mới để phân biệt được Kỹ thuật điện di là một công cụ phân tích cho phép đánh giá gián tiếp dò tìm bộ gen thông qua kỹ thuật phân tích tính biến dị cấu trúc của các enzyme và protein (Paul Gepts, 1990) Phương pháp phân tích nội nhũ từ ½ hạt lúa không chứa phôi bằng Kỹ thuật điện di SDS-PAGE protein giúp nhà chọn giống chọn được những cá thể ưu tú chất lượng cao từ những quần thể giống đã

bị thoái hóa Dòng 007 giống lúa Tài Nguyên mùa; Dòng 124 giống lúa Klong Kluong; Dòng 03 giống lúa VD20 và dòng 1-2 giống lúa Nếp Bè được chọn lọc dòng thuần từ 4 giống lúa đặc sản đã bị thoái hóa (Phạm Văn Phượng ,2006)

1.2.2 Những nghiên cứu liên quan đến phẩm chất hạt gạo

 Nghiên cứu về hàm lượng protein trong hạt gạo

Hàm lượng protein là một chỉ tiêu tương đối quan trọng đối với chất lượng dinh dưỡng của hạt lúa Dù bị ảnh hưởng nhiều bởi giống và môi trường, hàm lượng protein của lúa thường trung bình khoảng 7% ở gạo chà trắng và 8% ở gạo lức Khi lượng protein tăng, do di truyền hay do canh tác, thì lượng protein mất trong lúc xay chà cũng giảm, chứng tỏ phần lớn protein tăng thêm không phải ở trong cám Lượng acid amin của lúa rất cân đối, lượng lysine chiếm trung bình từ

3,8% đến 4,0% trong protein Trong quá trình canh tác nếu không bón hay bón ít đạm, thì các giống lúa cao sản chỉ chứa một lượng protein tương đương với lúa địa phương Nhưng khi được bón phân và áp dụng các biện pháp kỹ thuật canh tác thích hợp thì hàm lượng protein sẽ tăng từ 7 đến 9 hay 10% là một đóng góp

to lớn cho dinh dưỡng của con người (Jennings và ctv., 1979) [50] Ngoài ra hàm lượng protein còn chịu ảnh hưởng của bức xạ mặt trời, hàm lượng protein

có khuynh hướng giảm khi bức xạ mặt trời cao hơn trong thời gian hạt đang phát triển IRRI (1976) cho rằng ở vùng nhiệt đới, trong mùa khô hàm lượng protein thấp hơn so với mùa mưa; hàm lượng protein trung bình của 11 giống lúa canh tác tại IRRI trong điều kiện tương tự nhau là 8% trong mùa khô và 9,5% trong mùa mưa (Gomex và De Detta, 1975) Nghiên cứu của Chang và Somrith (1979) cho biết di truyền tính trạng protein do đa gen điều khiển có hệ số di truyền khá thấp, có thể do ảnh hưởng tương tác mạnh mẽ giữa kiểu gen và môi trường Người ta phân loại protein dựa theo vị trí, chức năng sinh học, đặc tính hoà tan (Osborne, 1924) hay cấu trúc của nó

Amylose là thành phần tinh bột không phân nhánh có trong gạo tẻ Amylosepectin là tinh bột có công thức phân nhánh chiếm phần còn lại Hàm lượng amylose ảnh hưởng chủ yếu trên đặc tính của cơm Nó tương quan nghịch với độ dẻo, độ mềm và độ bóng của cơm Tùy theo hàm lượng amylose các giống lúa có thể phân nhóm thành nếp (1-2%), amylose thấp (8-20%), trung bình (21-25%) và cao (hơn 25%) (Jennings et al., 1979)

Chất lượng nấu nướng và nếm thử được xác định bởi hàm lượng amylose và nhiệt trở hồ mà ít phụ thuộc vào hàm lượng protein Người Việt Nam thường thích cơm mềm nhưng lại ráo và đậm Nếu hàm lượng amylose trung bình từ 22-24% thì nhiệt trở hồ cũng trung bình và cơm sẽ mềm; nếu hàm lượng amylose từ 25-26% thì cơm hơi khô nhưng lại cứng; hàm lượng amylose nhỏ hơn 22%, cơm hơi ướt và nhạt (Nguyễn Thị Trâm, 2001)

 Nghiên cứu về kích thước hạt gạo

Kích thước hạt có thể được biểu hiện bởi các chỉ tiêu về trọng lượng, thể tích hoặc chiều dài hạt, chiều dài và chiều rộng hạt là chỉ số được sử dụng phổ biến Chiều dài và hình dạng hạt di truyền theo số lượng Chiều dài hạt và đặc tính hình thái hạt di truyền độc lập với nhau và có thể kết hợp được với các tính trạng phẩm chất như hàm lượng amylose, hay với kiểu cây, thời gian sinh trưởng

(Jenning và ctv., 1979) Chiều dài hạt gạo là tính trạng ổn định nhất, ít bị ảnh hưởng của môi trường, được điều khiển bởi đa gen (Somrith, 1974)

Kết quả nghiên cứu của Takeda et al (1978) cho thấy rằng kích thuớc hạt có liên quan chặt chẽ đến năng suất Trong giống lúa thông thường, kích thước hạt được điều khiển bởi đa gen, ở những giống lúa có hạt rất to, rất nhỏ hoặc có sự đột biến về dạng hạt, nó được điều khiển bởi một gen chủ lực Chiều dài và hình dạng hạt được di truyền độc lập với nhau và có thể kết hợp theo ý muốn mặc dù kiểu hạt này rất dày và mập Khối lượng hạt lúa có tương quan với thể tích hạt, chiều dài, chiều rộng, bề dày hạt (Taneda, 1980) đã chứng minh chiều dài hạt quyết định mạnh đến kích thước của hạt Nhưng trong nhiều trường hợp sự tương quan của chiều dài với chiều rộng và độ dày của hạt cũng không chặt Đó

là do ảnh hưởng của môi trường đối với chiều dài hạt ít hơn trọng lượng hạt Do

đó giá trị di truyền của chiều dài thường cao hơn Nên chiều dài hạt được coi như là tính trạng chính để phân tích về tính di truyền của kích thước hạt

Nhiệt độ trở hồ là một tính trạng biểu thị nhiệt độ cần thiết để gạo hoá thành cơm và không hoàn nguyên (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000) Nhiệt độ trở hồ có thể liên quan một phần với lượng amylose của tinh bột, nhiệt độ trở hồ thấp không liên hệ chặt với lượng amylose cao, thấp hay trung bình Gạo có nhiệt trở hồ cao có phẩm chất nấu kém (Jennings và ctv., 1979) Trong nhóm các giống lúa có cùng hàm lượng amylose, cùng kích thước và hình dạng hạt, giống có nhiệt trở hồ trung bình được ưa thích hơn (Khush và ctv., 1979) Kết quả nghiên cứu về di truyền của nhiệt trở hồ cho thấy nhiệt trở hồ được điều khiển bởi một gen (IRRI, 1976; Choi và ctv., 1980), một gen chính và vài gen phụ bổ sung điều khiển (Kahlon, 1965); Heu và Choi, 1973; Heu và Park, 1976; Choi và ctv., 1980), Chen và ctv., 1997) đã kết luận hai gen điều khiển đặc tính này

Những nghiên cứu về độ bền thể gel cho thấy trong cùng một nhóm có hàm lượng amylose cao giống nhau (> 25%), giống lúa nào có độ bền thể gel mềm hơn, giống lúa đó được ưa chuộng nhiều hơn (Khush và ctv., 1979) Độ bền thể gel được điều khiển bởi đơn gen Người ta tìm thấy dãy alen ở cùng một locus,

ký hiệu geea đối với gen điều khiển độ bền thể gel trung bình và geeb đối với gen điều khiển độ bền thể gel cứng Dãy alen này có tính lặn so với alen điều khiển độ bền thể gel cứng và geea thể hiện tính trội hơn geeb Việc chọn lọc các

dòng có độ bền thể gel như ý muốn nên được tiến hành ở những thế hệ đầu tiên Đánh gía kết qủa phân tích ở các quần thể phân ly cho thấy gen chủ lực, gen thứ yếu và gen phụ bổ sung đều có thể ảnh hưởng đến việc thể hiện tính trạng độ bền thể gel, bên cạnh đó còn có hiện tượng con lai có gía trị vượt trội (transgressive) thể hiện ở vài cặp lai (Tang và ctv., 1991)

Ðộ bền thể gel biến động rất lớn giữa hai vụ Ðông Xuân và Hè Thu, giữa các điểm canh tác khác nhau (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000)

Trong những nghiên cứu về di truyền độ bạc bụng của gạo tại Ấn Độ và Mỹ, người ta nhận thấy độ bạc trắng ở trung tâm hạt do gen lặn wc điều khiển và độ bạc trắng ở bụng hạt do gen lặn wb điều khiển Người ta thấy rằng đó là một tính trạng bị ảnh hưởng bởi tương tác giữa gen và môi trường (Seetharaman, 1959) Độ bạc bụng của hạt gạo được điều khiển bởi đa gen và đa gen này có ảnh hưởng tương hỗ và phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh (Lê Doãn Diên, 1995)

Độ bạc bụng có tần suất liên kết với tính trạng hạt tròn lớn hơn hạt thon dài (Somrith, 1974) Độ bạc bụng của hạt gạo một mặt do yếu tố di truyền, mặt khác điều kiện môi trường cũng tác động đến đặc điểm này Điều kiện môi trường chủ yếu ảnh hưởng đến đặc tính này là nhiệt độ sau khi trổ, nhiệt độ cao làm tăng độ bạc bụng, ngược lại nhiệt độ thấp làm giảm độ bạc bụng (Bùi Chí Bửu

và ctv., 1996)

Nhiều nghiên cứu cho rằng tính trạng này là do hợp chất 2-acetyl 1-1 pyroprolin gây ra và chịu ảnh hưởng mạnh mẽ của môi trường và được tìm thấy trong thành phần dầu của gạo nấu gây ra do một hóa chất có khả năng khuyếch tán trong không khí, đó là este-aceton-andehit, nó là một chỉ số quan trọng có ảnh hưởng rất lớn đến khẩu vị và dễ bị biến đổi trong khi bảo quản (Buttery et al., 1983) Theo Ahn et al (1993) đã áp dụng RELP maker để nghiên cứu, sự định vị của gen điều khiển tính trạng mùi thơm ở cây lúa, đó là một gen lặn, ký hiệu “fgr”, nằm trên nhiễm sắc thể số 8, liên kết với marker RG28, với khoảng cách di truyền là 4,5 cM

Cho đến nay các nhà chọn giống lúa trên thế giới đều thất bại trong việc cải tiến tính trạng mùi thơm bằng con đường lai tạo, trừ trường hợp IR841 Nếu chúng ta chú ý đến tính trạng này từ giống lúa cổ truyền, thông qua chọn lọc dòng thuần

sẽ mang lại hiệu quả và có tính thích nghi cao (Bùi Chí Bửu và ctv., 2000) Tiêu chuẩn đánh giá mùi thơm theo Viện nghiên cứu Lúa quốc Tế (IRRI, 1988) chia thành 3 cấp:

Bảng 1.2 Phân cấp mùi thơm theo thang điểm của IRRI (1988)

1.2.3 Những nghiên cứu liên quan đến đặc tính nông học và năng suất lúa

Thời tiết và tập quán canh tác sẽ quyết định phần lớn đến số ngày từ khi gieo đến thu hoạch lúa Tập đoàn giống có số giống khác nhau rất nhiều về thời gian sinh trưởng Theo Nguyễn Đình Giao và ctv (1997), các giống có thời gian sinh trưởng quá ngắn có thể cho năng suất không cao vì sự sinh trưởng dinh dưỡng bị hạn chế, còn những giống có thời gian sinh trưởng quá dài cũng không cho năng suất cao vì sự dinh dưỡng dư có thể gây đổ ngã

Đối với các giống lúa ngắn ngày do có thời gian sinh trưởng ngắn, nó cần sử dụng nhiều hơn về mặt dinh dưỡng, năng lượng ánh sáng mặt trời để tạo năng suất nên phải chú ý tạo giống lúa thấp cây, lá đòng thẳng đứng (Bùi Chí Bửu, 1998)

Võ Tòng Xuân (1979) cho rằng các giống lúa có thời gian sinh trưởng từ 110 đến 135 ngày luôn luôn cho năng suất cao hơn các giống chín sớm hơn và các giống muộn hơn ở phần lớn các điều kiện canh tác Tuy nhiên, Yosida (1972) (được trích dẫn bởi Trần Minh Thành, 1981), các giống lúa có thời gian sinh trưởng khoảng 90 ngày, nếu cấy khoảng 100 ngày là thời gian ngắn nhất, hợp lý

nhất để đạt năng suất cao

Hơn bất cứ đặc tính nào khác, thân rạ thấp và cứng là hai yếu tố quyết định tính

đổ ngã Thân rạ cao, ốm yếu, dễ đổ ngã sớm làm rối nùi bộ lá, tăng hiện tượng

rợp bóng, cản trở sự chuyển vị các dưỡng liệu và các chất quang hợp làm cho hạt bị lép và giảm năng suất Thân rạ ngắn và dày cũng sẽ chống lại sự đổ ngã Tuy nhiên, không phải tất cả thân ngắn đều cứng rạ Nó còn phụ thuộc vào các đặc tính như đường kính thân, độ dày thân rạ, mức độ bẹ lá ôm lấy các lóng (Jenning và ctv., 1979)

Bùi Chí Bửu và ctv., (1992) kết luận có ít nhất năm nhóm gen điều khiển tính trạng chiều cao của cây lúa

Theo Nguyễn Đình Giao và ctv., (1997) trong bốn yếu tố tạo thành năng suất thì

số bông trên bụi là yếu tố có tính quyết định nhất và sớm nhất Nó có thể đống góp 74% năng suất, trong khi số hạt và trọng lượng hạt đóng góp 26% năng suất còn lại Nó mang đặc tính di truyền định lượng và di truyền độc lập với nhiều đặc tính quan trọng khác Nguyễn Thị Lang,1994 cho rằng, mức trội cao được ghi nhận rõ ràng đối với tính trạng số bông trên bụi ở bộ giống lúa cao sản Tuy nhiên, nó còn chịu ảnh hưởng lớn của kỹ thuật canh tác và điều kiện ngoại cảnh (chế độ phân bón, nước tưới, mật độ sạ hoặc cấy, nhiệt độ, ánh sáng,… )

Vì vậy để cho năng suất cao cây lúa cần có số bông trên m2 vừa phải, gia tăng

số hạt chắc trên bông trên một đơn vị diện tích là biện pháp gia tăng năng suất tốt hơn là gia tăng số bông trên m2 (Nguyễn Đình Giao và ctv., 1997)

 Số hạt trên bông

Đặc tính số hạt trên bông chịu tác động rất lớn của điều kiện môi trường Số hạt trên bông nhiều hay ít tùy thuộc vào số gié hoa phân hóa và số gié hoa không phân hóa Lúa sạ có trung bình từ 80-100 hạt trên bông và 100-120 hạt trên bông đối với lúa cấy là tốt trong điều kiện ở Đồng bằng Sông Cửu Long (Nguyễn Ngọc Đệ, 1998) Trên cùng một cây lúa, những bông chính thường có nhiều hạt, những bông phụ phát triển sau nên ít hạt hơn Hoạt động của gen không cộng tính chiếm ưu thế trong sự điều khiển tính trạng số hạt chắc trên bông Ngoài ra, tuỳ thuộc vào số hoa trên bông, đặc tính sinh lý của cây lúa và ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh mà tỉ lệ hạt chắc cao hay thấp Số hoa trên bông quá nhiều

dễ dẫn đến tỉ lệ hạt chắc thấp Do vậy, muốn năng suất cao, thì tỉ lệ hạt chắc phải trên 80% (Lê Thị Dự, 2000)

 Tỷ lệ hạt chắc

Nguyễn Thạch Cân (1997) và Lê Thị Dự (2000) cho rằng hoạt động của gene không cộng tính chiếm ưu thế trong sự điều khiển tính trạng số hạt chắc trên bông

Ngoài ra, tỷ lệ hạt chắc tuỳ thuộc vào số hoa trên bông, đặc tính sinh lý của cây lúa và chịu ảnh hưởng lớn của điều kiện ngoại cảnh Thường số hoa trên bông quá nhiều dễ dẫn đến tỷ lệ hạt chắc thấp Muốn có năng suất cao, tỷ lệ hạt chắc phải đạt trên 80% (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008)

Đặc tính khối lượng 1000 hạt rất ít chịu tác động của điều kiện môi trường và có

hệ số di truyền cao (Nguyễn Đình Giao và ctv., 1997) Nó phụ thuộc hoàn toàn vào giống Khối lượng 1000 hạt của một giống giữ ổn định không có nghĩa là từng hạt có khối lượng như nhau, chúng thay đổi trong một giới hạn nhất định nhưng giá trị trung bình thì luôn ổn định Khối lượng hạt do hai yếu tố cấu thành, khối lượng vỏ trấu chiếm 20% và khối lượng hạt gạo chiếm 80% (Nguyễn Đình Giao và ctv., 1997) Vì vậy, cần chọn tạo ra những giống có khối lượng hạt cao để gia tăng năng suất Tuy nhiên không chọn hạt quá to vì hạt to thường kéo theo bạc bụng nhiều, giá trị xuất khẩu sẽ thấp

Bệnh được phát hiện đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1977 tại Tiền Giang Năm

2006, bệnh đã gây hại nghiêm trọng trên các vụ lúa hè thu, lúa mùa, lúa đông xuân ở nhiều tỉnh vùng đồng bằng sông Cửu Long, Đông Nam bộ, Nam Trung

Cỏ lồng vực (Echinochloa Crus-galli) và cỏ đuôi phượng (Leptochloa chinensis)

là 2 loại ký chủ trung gian quan trọng của bệnh Do đó trừ các loài cỏ này cũng góp phần hạn chế nguồn bệnh lùn xoắn lá trên đồng ruộng

Những kết quả nghiên cứu cũng ghi nhận vi rút lùn xoắn lá lúa không truyền lan qua hạt giống, đất, tiếp xúc cơ giới dịch cây, và không truyền bệnh qua trứng rầy nâu

Cây lúa bị bệnh lùn xoắn lá sinh trưởng cằn cọc, cây thấp lùn, chiều cao cây, chiều dài lá, rễ, cổ áo đều bị giảm sút, co ngắn lại khoảng 40-60% so cây khoẻ

Số dảnh/khóm tuy có nhiều song hầu hết không có bông hoặc trỗ bông muộn, trỗ bông không thoát Bông lúa ngắn, ít hạt, lép lửng, dẫn đến thất thu hoặc giảm năng suất nghiêm trọng

Hình 1.3 Cây lúa bị bệnh lúa lùn xoắn lá

Chương 2

PHƯƠNG TIỆN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm

2.1.1 Thời gian

- Chọn lọc cá thể trong phòng thí nghiệm và nhân dòng trong nhà lưới Bộ môn

Di Truyền Giống Nông Nghiệp, Đại học Cần Thơ từ tháng 03/2009 đến tháng 07/2009

- Bố trí thí nghiệm khảo nghiệm cơ bản 2 vụ: vụ Hè Thu 2009, Đông Xuân 2009-2010 từ tháng 8/2009 đến tháng 4/2010

- Bố trí khảo nghiệm sản xuất 2 vụ: Hè Thu 2010, Đông Xuân 2010-2011 từ tháng 05/2010 đến tháng 03/2011

- Về khí hậu, thời tiết: huyện Châu Thành A, huyện Phụng Hiệp, huyện Vị Thủy, tỉnh Hậu Giang nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa chung của ĐBSCL với nền nhiệt độ ổn định, biên độ nhiệt ngày đêm nhỏ, các chế độ quang năng, vũ lượng, gió, bốc hơi, ẩm độ không khí phân hóa thành 2 mùa tương phản: mùa mưa (tháng 5 - 11) và mùa khô (tháng 12 - 4)

- Về thổ nhưỡng: huyện Châu Thành A, huyện Phụng Hiệp và huyện Vị Thủy gồm 2 nhóm đất chính: nhóm đất Phù Sa và nhóm đất phèn

* Địa điểm bố trí thí nghiệm

Hình 2.1 Bản đồ vị trí thực hiện thí nghiệm

1) Xã Tân Hòa, huyện Châu Thành A

2) Xã Vị Đông, huyện Vị Thủy

3) Phường Lái Hiếu, Thị xã Ngã Bảy

Phường Lái Hiếu, Thị xã Ngã Bảy

Xã Tân Hòa, huyện

Châu Thành A

Xã Vị Đông,

huyện Vị Thủy

Tổ hợp lai Jasmine85 x Amaro

Các dòng đã được thanh lọc và tuyển chọn bằng phương pháp điện di protein SDS-PAGE

2.2.2 Thiết bị, hóa chất

Máy ly tâm 13.000 vòng/phút, hiệu Hettich 1110 (Đức)

Máy chụp hình gel (chụp UV), hiệu Bio-Rad (Mỹ)

Bộ điện di một chiều, hiệu Bio-Rad (Mỹ)

1 2 3 4

5 6 7 8

Hình 2.2 Dụng cụ, thiết bị máy sử dụng cho điện di SDS-PAGE

1: Cân phân tích, 2: pipetteman , 3: Microtuber, 4: Máy ly tâm

5: Bộ nguồn , 6: Máy lắc, 7: Microwave, 8: Dụng cụ khác

Các hóa chất phân tích điện di SDS-PAGE bao gồm: Tris-base, glycine, SDS (Sodium dodecyl sulfate), Ammonnium persulfate, Acrylamide; thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue R250 (CBBR250), máy ly tâm với tốc độ 14.000 vòng/phút, máy đo quang phổ THEMO SPECTRONIC GESSYSTM 8; Cân phân tích: Lib101 AEG-120G (Nhật)

Các hóa chất bao gồm: dung dịch Iod, HCl 30%, Ethanol 95%, NaOH 0,1N, dung dich A, dung dịch B1, dung dịch B2,…

Hóa chất phân tích mùi thơm bằng phương pháp định tính: KOH 1,7%

Hoá chất chạy điện di: Agarose tinh khiết, loading bufer, 1x TBE EDTA), Tube các loại, Lamda marker

(Tris-Borate-2.3 Phương pháp nghiên cứu chung

Bước 1: Thanh lọc, tuyển chọn cá thể, kiểm tra phẩm chất, độ thuần các dòng được chọn kết hợp thanh lọc rầy nâu trong điều kiện nhà lưới

Bước 2: Khảo nghiệm cơ bản 2 vụ: vụ Hè Thu 2009 và Đông Xuân 2009-2010:

từ 10 -20 dòng ưu tú, thuần, phẩm chất tốt chọn được khoảng 2-3 giống/dòng đạt mục tiêu đề ra

Bước 3: Khảo nghiệm sản xuất 2 vụ: Hè Thu 2010, Đông Xuân 2010-2011: phân tích các chỉ tiêu phẩm chất hạt

2.4 Phương pháp nghiên cứu cụ thể

2.4.1 Phương pháp thanh lọc tuyển chọn cá thể

* Trong phòng thí nghiệm

Ứng dụng qui trình điện di protein SDS-PAGE (Bộ Nông Nghiệp Nhật, 1986)

để phân tích 40 hạt/giống/dòng lúa từ nguồn giống gốc được thu thập từ địa phương và các dòng lai đã thực hiện tại Bộ môn Di Truyền Giống Nông Nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ để chọn ra những cá thể ưu tú có hàm lượng amylose thấp và hàm lượng protein cao

* Trong nhà lưới

Từ kết quả phân tích điện di ½ hạt của những hạt lúa ưu tú được chọn đem trồng trong chậu điều kiện nhà lưới có cách ly an toàn để loại bỏ những cá thể có dạng hình xấu, đánh giá và tuyển chọn các cá thể có độ thuần cao, theo hướng có tiềm năng năng suất cao, chống chịu tốt với một số sâu bệnh hại như: rầy nâu, đạo ôn, sâu cuốn lá,…đồng thời nhân dòng để có đủ hạt giống cho thí nghiệm ngoài đồng

* Phương pháp đánh giá tính kháng rầy nâu

Phương pháp thử rầy (theo phương pháp Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp & SHƯD, Trường ĐHCT)

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với

12 nghiệm thức trong đó có 10 giống/dòng lúa được chọn thí nghiệm, giống chuẩn nhiễm Jasmine85, giống chuẩn kháng OM5930, 3 lần lặp lại

Cách tiến hành:

* Nuôi rầy

Rầy nâu đựợc nuôi trên chậu lúa 30 ngày tuổi Giống lúa được dùng để nuôi rầy

là Jasmine 85 Chậu dùng nuôi rầy có đường kính 30 cm, cao 15 cm Mỗi chậu trồng 2-3 buội lúa Những chậu lúa này được đặt trên khay nhựa kích thước 45 x

60 cm, bên trong khay nhựa có chứa một lớp nước khoảng 5 cm nhằm tạo ẩm độ cho rầy phát triển và ngăn ngừa kiến Sau đó, dùng mùng lưới bao xung quanh (Hình 2.3) Mỗi mùng có khoảng 2 chậu lúa/khay Trước khi thả rầy vào, làm sạch gốc lúa, tỉa bỏ những bẹ lá già, bẹ gần sát mặt nước, đảm bảo những bẹ mang trứng không rơi xuống nước Đồng thời, tiến hành tỉa ngắn lá tránh không cho lá lúa chạm vào mùng lưới tạo điều kiện cho kiến dễ dàng xâm nhập

Hình 2.3 Lúa dùng để nuôi rầy

Sau khi chuẩn bị chậu nuôi rầy, tiến hành bắt rầy cái có bụng to thả vào Số lượng rầy cái thả vào tùy thuộc vào lượng giống dùng trắc nghiệm và mật độ thả vào Thông thường một rầy cái cánh ngắn có thể đẻ 300-400 trứng, rầy cái cánh dài có thể đẻ 100 trứng

Hai ngày sau khi thả rầy, khi thấy trên cơ thể rầy có mọc nấm trắng (rầy đã đẻ

và chết), tiến hành bắt những rầy cái còn lại trên cây lúa sang mùng khác đã

chuẩn bị sẵn Một mặt có thể giữ được nguồn rầy, một mặt có thể đảm bảo độ đồng đều của tuổi rầy

* Chuẩn bị lúa trắc nghiệm

Hai ngày sau khi thả rầy, tiến hành gieo giống lúa trắc nghiệm (đã được ngâm

24 giờ, ủ 48 giờ trước đó) vào rổ nhựa 30 x 25 cm, có chứa sẵn một lớp đất dày

5 cm Gieo ngẫu nhiên mỗi giống một hàng (Hình 2.4) Mỗi rổ là một lần lặp lại Sau khi gieo đặt rổ nhựa vào khay nhựa 45 x 60 cm bên trong có sẵn một lớp nước mỏng 2-3 cm để ngăn ngừa kiến và tạo ẩm độ cho lúa phát triển Một tuần sau khi gieo tỉa bỏ mỗi hàng chừa 15 cây

Hình 2 4 Lúa trắc nghiệm tính kháng rầy lúc 7 ngày tuổi

Thả rầy: khi lúa ở các nghiệm thức được 2-3 lá thật (5-7 ngày tuổi), tiến hành bắt rầy tuổi 1-2 thả vào, mật số 5-8 con/cây Rầy được thả vào bằng cách cắt ngang cây lúa sau đó gõ nhẹ

Bảng 2.1 Bảng đánh giá khả năng kháng rầy theo tiêu chuẩn quốc tế (1980)

* Khảo nghiệm cơ bản

Địa điểm: 3 huyện: huyện Châu Thành A, huyện Phụng Hiệp, huyện Vị Thủy, tỉnh Hậu Giang

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lặp lại, 11 nghiệm thức, trong đó giống Jasmine85 làm giống đối chứng

Mùa vụ: Hè Thu 2009, Đông Xuân 2009-2010

Diện tích mỗi lô thí nghiệm là: 15m2/lô

Phương pháp canh tác: cấy mạ lúc 12 ngày tuổi, cấy 1 tép/bụi, khoảng cách cấy

15 x 20 cm

Phân bón: bón phân theo công thức phân của địa phương 100:60:60 kg NPK/ha

và bón 3 lần vào các thời điểm 7-10 ngày sau khi sạ, 22-25 ngày sau khi sạ,

42-45 ngày sau khi sạ

Không sữ dụng thuốc bảo vệ thực vật trong suốt quá trình thí nghiệm

Thường xuyên theo dõi tình hình phát triển, ghi nhận các chỉ tiêu nông học, các thành phân năng suất và năng suất thực tế

* Khảo nghiệm sản xuất

Địa điểm: 3 huyện: huyện Châu Thành A, huyện Phụng Hiệp, huyện Vị Thủy, tỉnh Hậu Giang

Thí nghiệm được bố trí với 2 giống/dòng được chọn đạt mục tiêu đề tài và giống Jasmine85 làm giống đối chứng

Mùa vụ: Hè Thu 2010 và Đông Xuân 2010-2011

Diện tích mỗi lô thí nghiệm là: 500m2/lô

Phương pháp canh tác: cấy mạ lúc 12 ngày tuổi, cấy 1 tép/bụi, khoảng cách cấy

15 x 20 cm

Phân bón: bón phân theo công thức phân của địa phương 100:60:60 kg NPK/ha

và bón 3 lần vào các thời điểm 7-10 ngày sau khi sạ, 22-25 ngày sau khi sạ,

42-45 ngày sau khi sạ

Không sữ dụng thuốc bảo vệ thực vật trong suốt quá trình thí nghiệm

Thường xuyên theo dõi tình hình phát triển, ghi nhận các chỉ tiêu nông học, các thành phân năng suất và năng suất thực tế

2.4.3 Phương pháp đánh giá chỉ tiêu nông học và thành phần năng suất

Khi cây lúa sinh trưởng tối đa, tiến hành đo chỉ tiêu chiều cao cây

Khi thu hoạch, tiến hành đo chiều dài bông của 12 buội lúa và tính trung bình chiều dài của mỗi bông

Thời gian sinh trưởng của lúa là thời gian từ khi cây lúa nẩy mầm cho đến khi thu hoạch (chín 85% bông trở lên trên toàn ruộng)

* Đánh giá chỉ tiêu năng suất và các thành phần năng suất

Gặt 12 buội lúa trên một lô thí nghiệm

Đếm tất cả số bông của 12 buội lúa, kí hiệu là B (bông)

* Đánh giá khả năng phản ứng với một số sâu bệnh hại chính

Thang điểm đánh giá bệnh Đạo ôn hại bông (IRRI, 1988)

+ Cấp 0: không thấy vết bệnh hoặc chỉ có vết bệnh trên vài cuống bông

+ Cấp 1: vết bệnh có trên vài cuống bông hoặc trên gié cấp 2

+ Cấp 3: vết bệnh trên một vài gié cấp 1 hoặc phần giữa của trục bông

+ Cấp 5:vết bệnh bao quanh một phần gốc bông hoặc phần thân rạ ở phía dưới trục bông

+ Cấp 7: vết bệnh bao quanh toàn bộ cổ bông hoặc phần gần cổ bông, có hơn 30% hạt chắc

+ Cấp 9: vết bệnh bao quanh cổ bông hoặc phần thân rạ cao nhất hoặc phần trục gần gốc bông, số hạt chắc thấp hơn 30%

Bảng 2.2 Cấp bệnh cháy lá theo tiêu chuẩn của IRRI (1980)

1 Có chấm màu nâu li ti như đầu kim Kháng

3 Vết bệnh nhỏ, hơi kéo dài 1-2 mm, có viền nâu Hơi kháng

4 Vết bệnh hình elip, dài 1-2 cm, < 2% diện tích lá Hơi kháng

5 Vết bệnh điển hình, tác hại < 10% diện tích lá Hơi nhiễm

6 Vết bệnh điển hình, tác hại 10-25% diện tích lá Nhiễm

7 Vết bệnh điển hình, tác hại 26-50% diện tích lá Nhiễm

8 Vết bệnh điển hình, tác hại 51-75% diện tích lá Rất nhiễm

+ Cấp 1: hơi biến vàng trên một số cây

+ Cấp 3: lá biến vàng nhưng chưa bị cháy rầy

+ Cấp 5: lá bị vàng rõ, cây lùn và héo, ít hơn một nửa số cây bị cháy rầy, còn lại lùn nặng

+ Cấp 7: hơn một nửa số cây bị héo hoặc cháy rầy, số cây còn lại lùn nặng + Cấp 9: tất cả cây bị chết

2.4.4 Phân tích các chỉ tiêu phẩm chất hạt gạo

* Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Bộ Nông Nghiệp Nhật, 1980)

- Bước 1: Chuẩn bị mẫu

Lấy 10 hạt gạo nghiền mịn, cân chính xác 3 mg tinh bột vào ống tuýt

Thêm 100 μl dung dịch ly trích vào mỗi ống tuýt, để qua đêm

Vortex cho đều, sau đó ly tâm 14,000 vòng/phút trong 3 phút

- Bước 2: Đổ gel

Đổ gel theo công thức được trình bày như Bảng 2.3

Bảng 2.3 Công thức pha dung dịch tạo 1 gel

- Bước 3: Tiến hành điện di

+ Bơm 10 μl dung dịch ly trích protein vào mỗi giếng của gel

+ Cho 1 giọt chất chỉ thị màu Bromophenol vào mỗi gel

+ Chỉnh đến 20 V đối với gel cô mẫu và 60 V đối với gel phân tách

+ Ngừng điện di khi chất chỉ thị cách đáy gel từ 0,5-1 cm

- Bước 4: Nhuộm và rửa gel

+ Gel được nhuộm bằng dung dịch Coomassie Brilliant Blue 0,2%, lắc nhẹ trong 30-45 phút

+ Loại bỏ thuốc nhuộm

+ Rửa gel bằng Autowave

- Bước 5: Đọc kết quả và bảo quản gel

* Chiều dài và rộng hạt gạo theo phương pháp của IRRI (1988)

Chiều dài hạt gạo trắng được thực hiện bằng cách đo chiều dài của 10 hạt và tính trung bình chiều dài của một hạt (mm), sau đó phân loại chiều dài hạt gạo trắng dựa theo Bảng 2.4

Bảng 2.4 Tiêu chuẩn đánh giá chiều dài hạt gạo (IRRI, 1988)

* Độ trở hồ theo phương pháp của IRRI (1996)

Chuẩn bị 2 mẫu cho mỗi giống, mỗi mẫu lấy 6 hạt gạo đã chà trắng không bị nứt

bể, cho vào hộp petri

Cho 10 ml dung dịch KOH 1,7% vào

Sắp xếp các hạt đều ra trong hộp

Đậy lại, để yên trong nhiệt độ phòng trong 23 giờ

Độ trở hồ của các giống lúa được đánh giá theo Bảng 2.5

Bảng 2.5 Thang đánh giá độ trở hồ của hạt gạo trắng theo IRRI (1996)

3 Cao Phồng lên, viền còn nguyên, nở ít 3

4 Trung bình Phồng lên, viền còn nguyên, nở rộng 4

5 Trung bình Hạt rã ra, viền hoàn toàn nở rộng 5

6 Thấp Hạt tan ra hoàn toàn với viền 6

7 Thấp Hạt tan ra hoàn toàn và trong 7

* Độ bền thể gel theo phương pháp của IRRI (1996)

Cà mịn 20 – 30 hạt gạo, chuẩn bị 3 mẫu cho mỗi giống, mỗi mẫu cân theo công thức:

1 Rất dài (lớn hơn 7,5 mm) thon dài (D/R >3)

3 Dài (6,6 -7,5 mm) trung bình (D/R = 2,1-3)

5 Trung bình (5,51 -6,6 mm) bầu (D/R = 1,1-2)

7 Ngắn (5,5 mm và ngắn hơn) Tròn (D/R <1)

Cho 0,2 ml Ethanol 95% có chứa 0,025% Thymol blue, lắc nhẹ

Cho tiếp 2ml KOH 0,2N, sau đó khuấy đều bằng máy wortex

Cho vào waterbath ở 80 – 850C trong 5 – 10 phút cho đến khi hỗn hợp trở thành dạng gel là được

Lấy ra để nguội tự nhiên trong 5 phút

Làm lạnh trong 10 – 15 phút

Đặt ống nghiệm nằm ngang trên mặt phẳng cho gel chảy từ từ

Sau 1 giờ tiến hành đo chiều dài gel

Độ bền thể gel đánh giá theo bảng 2.6

Bảng 2.6 Thang đánh giá độ bền thể gel của hạt gạo trắng theo IRRI (1996)

Cấp Chiều dài Xếp loại độ bền thể gel

* Hàm lượng amylose theo phương pháp của Cagampang và Rodriguez (1980)

Bước 1: Chuẩn bị dung dịch

o Ethanol 95%

o HCl 30%

o NaOH 1N

o Dung dịch Iod (0,2% I2 và 2% KI)

Bước 2: Chuẩn bị mẫu

o Cân 50 mg bột gạo đã được nghiền mịn, cho vào ống 50 ml

o Thêm 0,5 ml ethanol 95%, lắc nhẹ cho tan đều

o Thêm 9,5 ml NaOH 1N, đun sôi trong 10 phút và lắc đều

o Để qua đêm ở nhiệt độ phòng

Bước 3: Pha loãng mẫu và đo

o Rút 100 μl dung dịch trích vào trong bình định mức 25 ml (đối với mẫu thử thay dung dịch trích bằng 100 μl NaOH 1 N)

o Thêm nước cất vào đến ½ bình, lắc đều

o Thêm 250 μl HCl 30%, lắc đều

o Thêm 250 μl dung dịch Iod, lắc đều

o Thêm nước cất đến vạch định mức

o Chuyển sang ống 50 ml, lắc đều và để yên khoảng 30 phút

o Lắc đều trước khi cho vào cuvette, độ hấp thụ ở bước sóng 600 nm

Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả

o Đường chuẩn có dạng: Y = aX + b

o Trong đó Y: Độ hấp thụ OD

X: Lượng amylose có trong mẫu đem đo (mg/ml)

o Tính hàm lượng amylose theo công thức:

Amylose (%):

Bảng 2.7 Thang điểm đánh giá hàm lượng amylose theo IRRI (1980)

* Hàm lượng protein (%) theo phương pháp của Lowry.O.H (1956)

Bước 1: Chuẩn bị dung dịch trích

o Dung dịch Folin 1N

Bước 2: Chuẩn bị mẫu

o Cân 20 mg bột gạo + 1 ml NaOH 0,1 N

o Lắc ít nhất 2 giờ hay để qua đêm

Bước 3: Pha loãng mẫu và đo

o Ly tâm mẫu 14.000 vòng/phút trong 3 phút

o Hút 50 μl mẫu + 5 ml dung dịch C, đối với mẫu blank, thay dung dịch trích mẫu bằng 50 μl NaOH 0,1 N

o Trộn đều và để yên trong 10 phút

o Thêm 50 μl Folin 1 N, trộn đều và để yên trong 30 phút

o Lắc đều mẫu, sau đó cho vào Cuvette và đo ở bước sóng 600 nm

Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả

o Pha dung dịch gốc Bovine serum albumin (BSA)

o Đường chuẩn có dạng

Y = aX + b Trong đó: Y là độ hấp thu OD

X là lượng protein có trong mẫu đem đo

Hàm lượng protein được tính theo công thức:

Protein (%):

* Đánh giá tính thơm trên hạt gạo bằng phương pháp cảm quan đun cách thủy

và ngửi mùi thơm (phương pháp của IRRI, 1996)

- Bước 1: chuẩn bị mẫu

+ Lấy khoảng 20 – 30 hạt gạo mới thu đã chà trắng cho vào ống nghiệm

+ Bơm vào mỗi ống nghiệm 10ml nước cất, đậy kín ống nghiệm bằng nút cao

+ Đặt vào nồi chưng có nước đang sôi, để sôi 10 phút (gạo lức cần nấu 20 phút)

+ Sau đó đem ra để nguội, mở nút, ngửi và phân hạng mùi thơm ở 3 mức: rất thơm, thơm vừa và không mùi Mỗi lần trắc nghiệm nên dùng giống gạo thơm

để đối chứng

+ So sánh kết quả và cho kết luận sau cùng

* Xác định tính thơm của hạt gạo bằng kỹ thuật điện di DNA

Bộ gen DNA của các giống lúa được ly trích dựa theo phương pháp Roges và Bendich (1988) Các DNA của các giống lúa được ly trích từ lá theo quy trình sau:

Thu mẫu cây và khử trùng mẫu bằng cồn trước khi nghiền mẫu và sau đó nghiền mẫu với nitơ lỏng

Chuyển phần bột vào tube 2,2 ml, sau đó thêm 1ml dung dịch trích cộng 50 l SDS 10%, ủ ở nhiệt độ 650C trong 30 phút, khoảng 5 phút đảo nhẹ tube để trộn mẫu và sau đó li tâm 13.000 vòng trong 10 phút

Chuyển phần trong vào tube mới và thêm một lượng tương đương isopropanol,

ủ 10-30 phút trên khay nước đá (hoặc ủ ở -200C) Li tâm 13.000 vòng trong 10 phút, hoà tan DNA trong 400 l TE Thêm 1l RNase (10 mg/ml) và ủ ở 370C trong 10 phút Thêm 400 l CTAB buffer và ủ ở 650C trong 15 phút, thỉnh thoảng đảo ngược ống tube để trộn đều Thêm 800 l Chloroform/Isoamylalcohol và trộn đều sau đó li tâm 13.000 vòng trong 5 phút Chuyển phần dung dịch trong qua tube 2,2 ml mới, thêm 1,4 ml Ethanol 96% và

 Chuẩn bị dung dịch PCR và chạy PCR

Phản ứng PCR được thực hiện với các thành phần như sau: 50-100 ng DNA lá lúa, 2,5 µl dung dịch đệm PCR 10X (có chứa 3,0 mM MgCl2), 1 l dNTP có

200 µM mỗi loại, 1 l mỗi mồi có nồng độ 2 µM, 1 unit của Taq DNA polymerase Tổng thể tích trong một phản ứng là 25 l Phản ứng khuếch đại được tiến hành ở 960C trong 3 phút, sau đó lặp lại 35 chu kỳ với các bước như sau: biến tính ở 960C trong 10 giây, bắt cặp mồi vào khuôn ở 590C trong 10 giây, kéo dài ở 720C trong 10 giây Cuối cùng phản ứng được duy trì 720C trong

5 phút Sản phẩm sau khi khuếch đại được phân tích bằng điện di gel agarose 2% trong đệm TBE PCR marker Smartladder (Eurogentec) đã được sử dụng để ước lượng kích thước đoạn sản phẩm PCR

Bốn loại primer lấy từ BADH2 enzyme gen (Betaine Aldehyde Dehydrogenase

2) (Bradbury et al., 2005) như sau:

External Sense Primer (ESP): 5’ TTGTTTGGACTTGCTGATG 3’

Internal Fragrant Antisense Primer (IFAP):

5’CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC 3’

Internal non-fragrant Sense Primer (INSP):

5’CTGGTAAAAAGATTATGGCTTCA 3’

External Antisense Primer (EAP): 5’ AGTGCTTTACAAAGTCCCGC 3’

Đổ gel agarose 2% bằng dung dịch TBE 1x

Cho agarose và TBE 1x vào khay điện di

Đun agarose trong microwave oven

Làm nguội đến 550C

Đổ gel vào khuôn (tránh bọt khí) và gắn lược vào để tạo giếng

Để gel nguội khoảng 1 giờ

Sau khi gel đặc, lấy nhẹ lược ra khỏi agrarose, đặt gel vào hộp điện di đã được

đổ TBE 1x (tránh bọt khí)

Dùng Pipette bơm 2 l loading buffer và 5 l sản phẩm PCR vào giếng

Điều chỉnh bộ nguồn ở 100V và định thời gian cho gel chạy (khoảng 1 giờ 30 phút)

Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromide (2%) Chụp gel dưới tia UV

Đọc và phân tích kết quả

2.5 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu các thí nghiệm ngoài đồng được xử lý bằng phương pháp toán thống kê sinh học trên phần mềm EXCEL và MSTAT-C của máy vi tính

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thanh lọc các dòng lúa

3.1.1 Thanh lọc các dòng lúa bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE

Từ kết quả phân tích điện di 60 hạt/1 giống/dòng của các dòng đã được tuyển chọn bằng kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE, cho thấy mức độ ăn màu đậm nhạt của các band protein không đồng nhất Căn cứ vào mức độ ăn màu của các band protein từ kết quả điện di chọn ra những hạt có hàm lượng amylose thấp tương ứng với band waxy 60 KDa nhạt và hàm lượng protein cao tương ứng với band -glutelin 37-39 KDa đậm

Hình 3.1 Phổ điện di protein tổng số của giống/dòng BN3

Các giếng có đánh dấu * là các giếng được chọn

Kết quả trình bày ở Hình 3.1 phổ điện di protein tổng số của giống/dòng BN3 cho thấy các band protein ăn màu đậm nhạt khác nhau cho thấy dòng BN3 này chưa thuần, ta chọn các hạt có band waxy 60 KDa nhạt tương ứng với hạt có hàm lượng amylose thấp và hạt có band -glutelin 37-39 KDa đậm tương ứng với hạt có hàm lượng protein cao được chọn nhân dòng thuần trong nhà lưới

-glutelin 22-23KDa

Giếng 1* 2 3 4 5 6* 7 8* 9* 10*

Waxy 60KDa

-glutelin 37-39KDa Globulin 26KDa Prolamin 16KDa Proglutelin 57KDa