Bệnh Lao (Mycobacterium Tuberculosis MTB) – Tác nhân gây bệnh nhiễm trùng chiếm tỉ lệ tử vong hàng đầu tại các Quốc gia đang phát triển trong khoảng 15 năm trở lại đây. Cùng với sự bùng phát của đại dịch HIV trên toàn cầu, môi trường sống ngày càng suy thoái, người nhập cư từ các quốc gia kém phát triển, bệnh nhân mắc lao bỏ điều trị … ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng miễn dịch của con người và sức khỏe cộng đồng, và quan trọng nhất sự quay trở lại của bệnh lao – lao kháng thuốc đã đặt nhân loại một lần nữa đối diện với đại dịch lao tưởng như đã được thanh toán ở thế kỷ trước.Còn tại các nước phát triển, nơi bệnh lao về cơ bản được khống chế thì bệnh lao không điển hình (Nontubercolusis Mycobacterium – NTM) lại là tác nhân gây nhiễm trùng âm thầm và nguy hại đối với các bệnh nhân mắc bệnh liên quan đến tình trạng miễn dịch.
Trang 1SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI TRƯỜNG THPT CHUYÊN HÀ NỘI-AMSTERDAM
QUẬN CẦU GIẤY
**************
ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ
LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015)
Tên đề tài: NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ SINH PHẨM
CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO KHÔNG ĐIỂN HÌNH
(NONTUBERCULOSIS MYCOBACTERIA - NTM)
TRÊN BỆNH NHÂN NGHI MẮC BỆNH LAO
TẠI VIỆT NAM
Lĩnh vực: Y- Sinh
NGƯỜI HƯỚNG DẪN
- Th.S Phan Minh Tuấn
- Phòng Phát triển Công nghệ
Y-Sinh, Trung tâm phát triển
công nghệ cao, Viện Hàn lâm
Khoa học kĩ thuật Việt Nam
Hà Nội, tháng 12 năm 2014
Trang 2LỜI CẢM ƠN
Nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn công ty Intel đã tổ chức Hội thiKhoa học trẻ Intel ISEF trên toàn thế giới, cảm ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo ViệtNam, Sở Giáo dục và Đào tạo Hà Nội chi nhánh công ty ISEF tại Việt Nam đãphối hợp tổ chức nên hội thi này tại Việt Nam, tạo cơ hội cho nhóm tiếp cận gầnhơn với các hoạt động khoa học trẻ trên toàn thế giới Đây là một cơ hội tốt chonhóm nghiên cứu nói riêng và học sinh Hà Nội cũng như học sinh Việt Nam nóichúng có dịp đào sâu kiến thức, đưa ra ý tưởng khoa học và hiện thực hóa, làmquen các kỹ năng mềm khác, giao lưu và học hỏi với bạn bè trong nước và quốc tế
Trong quá trình thực hiện đề tài, nhóm đã nhận được sự quan tâm chỉ đạo,những góp ý chân thành của Ban Giám hiệu và Nhóm Khoa học cũng như sự tạođiều kiện của các thầy cô giáo trường THPT Hà Nội Amsterdam Đồng thời, sự hỗtrợ của phòng phát triến công nghệ Y Sinh, Trung tâm phát triển công nghệ caothuộc viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam về mặt địa điểm, cơ sở vậtchất, trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm là vô cùng quý giá với nhóm nghiên cứutrong suốt thời gian nghiên cứu
Nhóm thực hiện đề tài đã nhận được sự hỗ trợ vô cùng nhiệt tình của cácgiáo viên hướng dẫn: ThS Trần Thị Thu Hương, cô Nguyễn Thị Hưởng cùng cácchuyên gia là ThS Phan Minh Tuấn, ThS Nguyễn Chi Mai và KS Lê Thành Long
đã hỗ trợ hết lòng về mặt lí thuyết và kĩ năng, nhờ đó mà nhóm nghiên cứu có thểhoàn thành được đề tài này
Một lần nữa, nhóm xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến các cánhân, tập thể và tổ chức về những đóng góp quý báu và sự ủng hộ nhiệt tình trongsuốt thời gian thực hiện đề tài
Nhóm nghiên cứu
Trang 3M c l c ục lục ục lục
TÓM TẮT 5
I GIỚI THIỆU 6
1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 6
2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 7
3 TÍNH MỚI VÀ SÁNG TẠO CỦA ĐỀ TÀI 7
II.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 8
1 KHÁI NIỆM CHUNG 8
2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 9
3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG 10
4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ DỰ KIẾN 12
III QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU 13
1 THU THẬP, VẬN CHUYỂN, BẢO QUẢN MẪU BỆNH PHẨM VÀ CHỦNG VI KHUẨN 13
2 XỬ LÝ VÀ KHỬ TẠP MẪU BỆNH PHẨM 14
3 TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MAC 14
4 KIỂM TRA KẾT QUẢ SẢN PHẨM PCR 15
5 GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GENE TRÊN PHẦN MỀM CHUYÊN DỤNG 20
IV.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
1 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ 24
2 KẾT QUẢ NHÂN GENE(PCR) 24
3 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE 27
4 THỜI GIAN HOÀN THÀNH MỘT LẦN XÉT NGHIỆM 27
IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28
1 KẾT LUẬN 28
Trang 42. KIẾN NGHỊ 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 PHỤ LỤC 31
Trang 5M c l c b ng ục lục ục lục ảng
Bảng 1 Thành phần phản ứng PCR 11
Bảng 2 Chu kỳ nhiệt thông thường cho phản ứng PCR 11
Bảng 3 Danh sách các mẫu 13
Bảng 4 Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại DNA tổng số thu từ mẫu 19
Bảng 5 Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự 20
Trang 6Mục lục hình ảnh
Hình 1: MAC trên môi trường Lowenstein – Jensen sau 6 tuần nuôi cấy 8
Hình 2 Tỉ lệ các ca bệnh do vi khuẩn nhóm NTM gây ra tại khu vực châu Á 9
Hình 3: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm thông tin qua từ khóa “mycobacterium” trên cổng thông tin NCBI 16
Hình 4: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thông qua từ khóa “mycobacterium 16S” trên cổng thông tin NCBI 17
Hình 5: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thông qua từ khóa “mycobacterium rpoB” trên cổng thông tin NCBI 17
Hình 6: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thông qua từ khóa “mycobacterium hsp65” trên cổng thông tin NCBI 18
Hình 7: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự 21
Hình 8: Kết quả trình tự được so sánh với các mẫu đối chứng 22
Hình 9: Kết quả trình tự được so sánh với ngân hàng genethế giới (Genbank) để tìm sự tương đồng 23
Hình 10: Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ mẫu NTM1 theo 3 quy trình tách chiết 24
Hình 11: Kết quả điện của thí nghiệm tìm nhiệt độ bắt cặp và nồng độ DNA tổng số phù hợp 25
Hình 12: Kết quả điện di sản phẩm PCR 26
Trang 7mới, nhưng các hiện tượng mắc lao không điển hình (Nontuberculosis
mycobacteria - NTM) lại gia tăng trên đối tượng bệnh nhân có tình trạng suy giảm
miễn dịch, có tiền sử bệnh lý mãn tính tại phổi hay có những bất thường về kiểugenecủa bệnh xơ hóa kén, α-antitrypsin, interferon-gamma (IFN-), interleukin-12
Tại Việt Nam, việc chẩn đoán NTM tại các bệnh viện và cơ sở y tế từ trước
đến nay đều sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống cho kết quả chậm(15 – 20 ngày) và thường xuyên bị tạp nhiễm, nên khả năng đặc hiệu trong chẩnđoán là thấp Ở lĩnh vực chẩn đoán phân tử thì gần như chưa có nghiên cứu nào vềvấn đề này triển khai được ghi nhận Cũng phải nói rằng việc chẩn đoán cận lâm
sàng về NTM hiện nay tại các cơ sở y tế tại Việt Nam chưa được đầu tư nghiên cứu
một cách có bài bản, chính điều này đã góp phần đưa bệnh lao không điển hình do
NTM âm thầm bùng phát gây tác hại lớn đến sức khỏe và kinh tế của người bệnh.
Do vậy, Nhóm nghiên cứu đề xuất nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chẩn đoán phân tửhiện đại trong việc chẩn đoán phát hiện sớm sự có mặt của vi khuẩn lao không điển
hình (NTM) trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nghi mắc lao nhưng không đáp
ứng với công thức điều trị lao thông thường, mục tiêu của nghiên cứu tập trungtối
ưu các khâu trong quá trình thực hiện như khâu xử lý mẫu, tách chiết DNA của vikhuẩn từ mẫu bệnh phẩm và khâu xác định kết quả theo hướng đơn giản, dễ thaotác, hạn chế tối đa khả năng nhiễm chéo giữa các mẫu xét nghiệm, an toàn chongười sử dụng và thân thiện với môi trường
Từ khóa: Mycobacterium tuberculosis (MTB), Non Tubercolusis Mycobacterium (NTM), Mycobacterium avium complex (MAC), PCR, lao điển hình, lao không điển hình, lao môi trường
Trang 8I GIỚI THIỆU
1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Bệnh Lao (Mycobacterium Tuberculosis - MTB) – Tác nhân gây bệnh nhiễm
trùng chiếm tỉ lệ tử vong hàng đầu tại các Quốc gia đang phát triển trong khoảng
15 năm trở lại đây Cùng với sự bùng phát của đại dịch HIV trên toàn cầu, môitrường sống ngày càng suy thoái, người nhập cư từ các quốc gia kém phát triển,bệnh nhân mắc lao bỏ điều trị … ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng miễn dịch củacon người và sức khỏe cộng đồng, và quan trọng nhất sự quay trở lại của bệnh lao– lao kháng thuốc đã đặt nhân loại một lần nữa đối diện với đại dịch lao tưởng như
đã được thanh toán ở thế kỷ trước
Còn tại các nước phát triển, nơi bệnh lao về cơ bản được khống chế thì bệnh
lao không điển hình (Nontubercolusis Mycobacterium – NTM) lại là tác nhân gây
nhiễm trùng âm thầm và nguy hại đối với các bệnh nhân mắc bệnh liên quan đếntình trạng miễn dịch
Tại Việt Nam, nếu trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) là tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện hàng đầu thì NTM âm thầm đứng ở vị trí thứ 2 về độ
nguy hiểm, và tác hại to lớn của nó với bản thân bệnh nhân, liệu trình điều trị đãgây ra tổn thất nặng nề về kinh tế, và tâm lý cho người bệnh Thông thường một
trường hợp nuôi cấy xác định có vi khuẩn lao M.tuberculosis thì vấn đề điều trị thường đặt ra sớm Nhưng với một trường hợp nuôi cấy NTM (+) thì không phải
lúc nào cũng đặt vấn đề điều trị mà cần phải cần nhắc giữa nguy cơ và lợi ích chongười bệnh Ngoài ra còn thấy rằng có sự khó khăn trong việc điều trị phức tạp vàkéo dài cần kết hợp nhiều loại thuốc hoặc sự nhiễm đồng thời nhiều loại bệnh cơ
hội khác cùng NTM Vì vậy, việc xác định rõ ràng căn nguyên gây bệnh nhiễm trùng do NTM và các vấn đề liên quan mang tính cấp thiết và thời sự đối với ngành
Y tế hiện nay
Từ những thống kê nêu trên, nhóm nghiên cứu quyết định tiến hành đề tài
“Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm chẩn đoán vi khuẩn lao không điển hình
trên bệnh nhân nghi mắc bệnh lao tại Việt Nam” nhằm thiết kế một bộ sinh
phẩm đơn giản, hiệu quả, an toàn và có giá trị thực tiễn và tính linh động cao
Trang 92 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI.
Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu nghiên cứu, phát triển và bước đầu ứng
dụng bộ sinh phẩm trong việc xác định chẩn đoán sự có mặt của vi khuẩn NTM (cụ thể là MAC-Mycobacterium avium complex) trên đối tượng nghi mắc bệnh lao
nhưng không đáp ứng với phương pháp điều trị lao truyền thống ở mức độ phòngthí nghiệm
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là một công cụ hữu hiệu hỗ trợ đắc lực chongành chẩn đoán cận lâm sàng tại các bệnh viện, trung tâm y tế trong cuộc đấu
tranh chống lại bệnh nhiễm trùng do NTM là căn nguyên, nhằm giảm bớt thiệt hại
về tình trạng sức khỏe, thời gian, tâm lý cũng như tài chính của bệnh nhân cũngnhư cộng đồng xã hội
3 TÍNH MỚI VÀ SÁNG TẠO CỦA ĐỀ TÀI.
-Vi khuẩn gây bệnh NTM không phải là chủng vi khuẩn mới mà là một vi
khuẩn được ghi nhận là phân bố phổ biến và rộng rãi trong môi trường trên toàncầu Tuy nhiên, do đặc tính thích nghi của vi khuẩn tùy thuộc vào môi trường pháttriển và tồn tại mà độc lực cũng như hệ gene của chúng có thể thay đổi tùy theomôi trường và điều kiện sống Vì thế, mục tiêu của đề tài là nhằm xác định chủng
vi khuẩn NTM tồn tại tại Việt Nam liệu có những thay đổi gì so với các chủng
NTM được ghi nhận ở các quốc gia khác Nếu có, đó là những thay đổi gì? có
mang tính đặc hữu vùng miền hay không? có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng,phát triển và đặc tính gây bệnh hay không? Nội dung này chưa được ghi nhận bởibất cứ nghiên cứu nào tại Việt Nam
- Ngoài ra, bộ sinh phẩm, nếu được nghiên cứu và phát triển thành công, sẽ
là vũ khí hữu hiệu hỗ trợ cho ngành chẩn đoán cận lâm sàng với tiêu chí: đơn giản,giá thành thấp, hiệu quả trong sử dụng và có tính ứng dụng cao
Trang 10II.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1 KHÁI NIỆM CHUNG
NTM là nhóm vi khuẩn cùng họ với vi khuẩn lao gây bệnh ở phổi, nhưng
điểm khác biệt là nó được phân tán rộng rãi trong môi trường, đặc tính gây bệnh rất
linh động và không lây từ người này sang người khác NTM có hơn 140 loài khác
nhau và không nhất thiết liên quan đến bệnh lao nên đôi khi nó được gọi dưới
những tên khác như Vi khuẩn lao không điển hình (atypical tuberculosis), vi khuẩn lao cơ hội (opportunitic tuberculosis), vi khuẩn lao môi trường (environmental
tuberculosis) Những nghiên cứu dịch tễ gần đây đã ghi nhận sự gia tăng các ca
bệnh NTM xảy ra trên toàn cầu với tỉ lệ cao hơn cả bệnh lao truyền thống
Hình 1: MAC trên môi trường Lowenstein – Jensen sau 6 tuần nuôi cấy
Triệu chứng lâm sàng bệnh biểu hiện ở cả phổi và ở ngoài phổi, trong đó biểuhiện ở phổi thường gặp hơn Các triệu chứng toàn thân thường không đặc hiệu nhưsốt nhẹ về chiều, mệt mỏi, gầy sút ăn uống kém Các triệu chứng tại chỗ bao gồm
ho, ho khan, hoặc ho khạc đờm kéo dài Triệu chứng tại phổi thường là các triệuchứng của bệnh lao Ngoài những trường hợp nhiễm trùng biểu hiện tại một số cơquan như hạch, da, vết mổ… thì còn có thể có thể gặp tình trạng bệnh toàn phát ở
đa cơ quan
Trang 11Trong tổng số các ca bênh Lao ngoài phổi trên thế giới do 140 loài thuộc loại
NTM gây ra thì có đến hơn 50% trường hợp mắc bệnh do chủng Mycobacterium
avium complex (MAC) Ở Việt Nam nói riêng, số ca bệnh Lao ngoài phổi do chủngMAC gây ra chiếm đến 95% tổng số Vì vậy, có thể nói, MAC là chủng vi khuẩn
đáng lo ngại nhất trong các ác loài gây bệnh NTM nói chung
2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
Đối với nhiều nước trên thế giới, đặc biệt như Mỹ, Nhật… NTM đã được
nghiên cứu và đưa vào chương trình an toàn y tế Quốc gia và được đánh giá là 1trong những tiêu chí hàng đầu trong công tác chống nhiễm khuẩn tại bệnh viện và
các cơ sở y tế Những chương trình nghiên cứu về chẩn đoán và điều trị NTM được tiến hành trên phổ rộng các chủng vi khuẩn NTM Ngoài ra các kỹ thuật real-time
PCR, multiplex PCR, sequencing… được ứng dụng như là những phương phápchẩn đoán thường quy tại bệnh viện và các trung tâm nghiên cứu đã giúp các Quốc
gia này hoàn toàn chủ động trong việc khống chế và giảm thiểu các ca bệnh NTM.
Hình 2 Tỉ lệ các ca bệnh do vi khuẩn nhóm NTM gây ra tại khu vực châu Á
Ở Việt Nam, việc chẩn đoán NTM tại các bệnh viện và cơ sở y tế từ trước đến
nay đều sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống cho kết quả chậm (15– 40 ngày) và thường xuyên bị tạp nhiễm, nên khả năng đặc hiệu trong chẩn đoán
là thấp Ở lĩnh vực chẩn đoán phân tử thì gần như chưa có nghiên cứu nào về vấn
đề này triển khai được ghi nhận Cũng phải nói rằng việc chẩn đoán cận lâm sàng
Trang 12về NTM hiện nay tại các cơ sở ý tế tại Việt Nam chưa được đầu tư nghiên cứu một
cách có bài bản, chính điều này đã góp phần đưa bệnh lao không điển hình do
NTM âm thầm bùng phát gây tác hại lớn đến sức khỏe và kinh tế của người bệnh
Ngoài phương pháp nuôi cấy định danh, các kĩ thuật mới chẩn đoán NTM
hiện nay bao gồm macroarray, microarray, v.v lai với cặp mồi gắn đầu dò huỳnhquang cũng được các bệnh viện lớn phát triển như Bệnh viện Quân y 103 hay Viện
Vệ sinh Dịch tễ Trung ương tuy nhiên chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu Thêmvào đó, các kĩ thuật này rất phực tạp, yêu cầu người làm có kinh nghiệm và taynghề cao và trang thiết bị hiện đại Với thực trạng trên, việc đưa phương pháp nàytrong khảo sát dịch tễ hay đến những nơi hẻo lánh miền núi là vô cùng khó
3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG Phương pháp thu nhận, đóng gói, bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm
Nội dung của đề tài thực hiện trên đối tượng vi khuẩn có nguy cơ lây nhiễmcấp độ 2 (Risk 2) theo quy định của WHO, vậy nên công việc phải được thực hiệntại phòng xét nghiệm ATSH cấp độ II (Biosafety laboratory level 2) Các quy trìnhthu nhận, đóng gói, bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm đều tuân thủ theo quy tắc
thực hành an toàn sinh học theo tiêu chuẩn của Bộ y tế và WHO (Laboratory
biosafety manual, third edition – WHO – Geneva, 2004)
Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ bệnh phẩm
DNA tổng số với chất lượng tốt là điều kiện quan trọng để thực hiện các phântích chẩn đoán phân tử như phân lập các đoạn gene chỉ thị từ các mẫu Để tìm đượcquy trình tách chiết DNA phù hợp và hiệu quả với các mẫu nghiên cứu, chúng tôi
đã tiến hành so sánh 3 quy trình tách chiết DNA trong đó một quy trình áp dụngtheo phương pháp kit tách chiết DNA của nhà cung cấp, các quy trình còn lại đượcthực hiện dựa vào vào các phương pháp tách chiết truyền thống và theo các tài liệutham khảo đồng thời có điều chỉnh cho phù hợp với mẫu
Phương pháp thiết kế mồi
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng Ngân hàng dữ liệu NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) để tìm kiếm các thông tin và kết hợp với hai phầnmềm hiện đại, thông dụng là BioEdit và DNAstar nhằm lưu giữ thông tin và phântích sự đa dạng hệ genecủa chi Mycobacterium Từ đó chọn lọc một số genetiêubiểu có sự đa dạng di truyền cao giữ các chủng vi khuẩn gây bệnh lao truyền thống
Trang 13M tuberculosis và các chủng vi khuẩn lao không điển hình để thiết kế các cặp mồi
tương ứng tại các vùng có độ bảo thủ cao bằng công cụ PrimerSelect trong
DNAstar Cặp mồi đặc hiệu cho vi khuẩn M avium complex gây bệnh trên người
có đặc điểm: đoạn trình tự đầu 3’ (từ 1 nucleotide trở lên) của mồi xuôi và ngược
đặc hiệu đối với chủng vi khuẩn M.avium complex nhưng không đặc hiệu đối với các chủng vi khuẩn lao M.tuberculosis.
Phương pháp PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp) chophép nhân một số lượng không giới hạn nguyên bản của một đoạn DNA nhất địnhtrong thời gian ngắn, nhờ xúc tác của DNA polymerase Đoạn geneđược nhân lênnhờ cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế Quy trình PCR được tối ưu ở các yếu tố: nồng độDNA ban đầu và nhiệt độ bắt cặp mồi
Thành phần phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt được thể hiện ở Bảng 1 và 2
Bảng 1. Thành ph n ph n ng PCR ần phản ứng PCR ảng ứng PCR
STT Thành phần Thể tích(µl)
1 DNA tổng số (100ng) 0.5-2
2 Mồi xuôi (10 pmol) 1.0
3 Mồi ngược (10 pmol) 1.0
4 DreamTaq™ MasterMix 12.5
5 Nước cất khử ion, khử trùng 8.5-10
Tổng thể tích 25.0
Bảng 2 Chu kỳ nhiệt thông thường cho ph n ng PCR ảng ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian Chu kỳ
Kéo dài chuỗi
Hoàn tất kéo dài
Kết thúc phản ứng
94 94 50-60 72 72 4
3 phút
30 giây
30 giây 1phút
10 phút
1 30 1
Trang 14Phương pháp đọc và phân tích trình tự nucleotid
Trình tự nucleotid được xác định trên máy xác định tự động ABI PRISM®
3100 Avant Genetic Analyzer theo bộ kit BigDye® Terminator v3.1 CycleSequencing Trình tự được xác định trên cả hai sợi khuôn và đối nghĩa với việc sửdụng hai mồi xuôi và ngược Tuy nhiên, chỉ có một mồi tham gia phản ứng, mồiđơn này bám vào vùng bổ sung đã được thiết kế trong vector Hiện nay, có nhiềuphần mềm chuyên dụng xử lý trình tự như PC GENE, Clustal, DNA star, BioEdit,Chromas… Trong các phần mềm kể trên BioEdit là hệ thống phần mềm tiện dụngnhất Chúng tôi sẽ sử dụng BioEdit trong kỹ thuật phân tích trình tự ở đề tài này
4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ DỰ KIẾN
Nội dung 1: Hoàn thiện quy trình phát hiện nhanh vi khuẩn lao không điển hình
theo nguyên lý PCR đối với đoạn trình tự đặc trưng cho M.avium complex.
- Thu thập chủng vi khuẩn và mẫu bệnh phẩm MAC từ người bệnh (đã được kết
luận là mắc bệnh lao không điển hình bằng phương pháp nuôi cấy vi sinh truyềnthống) phục vụ nghiên cứu và thử nghiệm
- Thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn geneđặc trưng cho chủng MAC
- Tối ưu các bước trong quy trình sử dụng kit nhằm mục tiêu sau: chất lượng ổnđịnh, giảm tối đa thời gian thực hiện, tiết kiệm chi phí, đảm bảo an toàn sinh học
và thân thiện với môi trường
Nội dung 2: Tạo bộ sản phẩm thử nghiệm
- Xây dựng quy trình chuẩn phát hiện vi khuẩn MAC của bộ sinh phẩm.
- Thử nghiệm bộ sinh phẩm ở cấp độ phòng thí nghiệm, đánh giá độ nhạy, đặc hiệu
và mức độ ổn định của bộ sinh phẩm
Trang 15III. QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU
1 THU THẬP, VẬN CHUYỂN, BẢO QUẢN MẪU BỆNH PHẨM VÀ CHỦNG VI KHUẨN
1.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm và chủng vi khuẩn.
5 chủng vi khuẩn MAC có nguồn gốc từ Bệnh viện Phổi Trung Ương, 5 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân dương tính với NTM bằng phương pháp nuôi cấy vi sinh
truyền thống, 1 chủng gốc Mycobacteria Avium (Avium ATCC® 25291TM*)
Bảng 3. Danh sách các m u ẫuSTT Tên mẫu Ghi chú STT Tên mẫu Ghi chú
1.2 Bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm và chủng vi khuẩn:
- Nhiệt độ bảo quản: nhiệt độ từ 4-80C có thể áp dụng nếu như không cóđiều kiện xử lý sớm bệnh phẩm ngay sau khi thu thập,
- Đóng gói bệnh phẩm: Bệnh phẩm phải được đóng gói trước khi vận
chuyển, bảo đảm không dễ đổ, vỡ, phát tán tác nhân gây bệnh trong quá trình
vận chuyển
+ Đóng chặt các tube chứa bệnh phẩm, bọc từng tube bệnh phẩm bằng giấythấm, buộc chặt
+ Bọc ra ngoài các túi bệnh phẩm bằng giấy thấm hoặc bông thấm nước có
chứa chất tẩy trùng (cloramine B), đặt gói bệnh phẩm vào túi nilon thứ 2, buộc chặt.
+ Các phiếu thu thập, xét nghiệm bệnh phẩm được đóng gói chung vào túinilon cuối cùng, buộc chặt, chuyển vào hộp bảo ôn
- Vận chuyển bệnh phẩm: Bệnh phẩm được vận chuyển tới phòng thí
nghiệm bằng đường bộ, đường không .thời gian ngắn nhất tính từ thời điểm thu
thập bệnh phẩm
Trang 162 XỬ LÝ VÀ KHỬ TẠP MẪU BỆNH PHẨM
Bệnh phẩm mà nhóm thu thập được là các mẫu ở dạng đờm có nhiễm vi khuẩn gây bệnh Liên kết giữa các phân tử đờm và các tế bào vi khuẩn nhìn chung tương đối chắc chắn; ngoài ra, lớp đờm bao quanh tế bào vi khuẩn sẽ bảo vệ vi khuẩn khỏi ảnh hưởng của các hóa chất gây phá hủy thành tế bào Bệnh phẩm không qua xử lí làm tan đờm sẽ cho lượng DNA tổng số vô cùng ít, không đủ cho quá trình nhận biết sau này Vì vậy, việc là sử dụng hóa chất gây tan đờm là một phần quan trọng của quá trình chẩn đoán bệnh.
2.1 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất.
- Dụng cụ: pipetter, ống tube 1,5ml, falcon 50ml, đầu type, găng tay y tế,
- Thiết bị: máy li tâm, bể ổn nhiệt ướt, tủ lạnh 4oC…
- Hóa chất: Cồn kỹ thuật, Cồn tuyệt đối, EDTA, Phenol, Chloroform, Isoamyl
alchohol, NaOH 1M, NALC, TTE, L6, L2, NaCl, RNase, PBS, Acetone, Protease
K, Sodium acetate, Ethidium bromide, Agarose, Isopropanol, nước cất
2.2Khử tạp mẫu
- Bất hoạt ở 100OC trong 10 phút
- Dịch : Ly tâm lấy cặn trong ống tube 1,5ml, 12000 v/ phút x10 phút.
- Đờm : Khử nhiễm bằng 1 thể tích NaOH 1M (40g NaOH/lit) + 1 thể tích Natri
Citrat 0,1M (29,4gr Na-citrat.2H2O/lit) và 30mM N-acetyl-L-cystein (NALC)(15mg/100ml), lắc cho đờm loãng đều trong 15 phút, ly tâm tách cặn như đối vớidịch
- Mảnh sinh thiết, chủng vi khuẩn và mủ: Ly giải bằng Protease K qua đêm ở 560C
- Xử lý bệnh phẩm có máu bằng TTE (1% Triton X 100, 20mM Tris-HCl pH8.3,
1m EDTA): cho 1 ml dung dịch TTE vào mẫu đã tách cặn, lắc kỹ cho tan máu, lytâm loại bỏ nước nổi
3 TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MAC
Phương pháp sử dụng đệm chiết.
+ Bổ sung 500 µl đệm chiết (100 mM Tris - HCl (pH 8), 1.5 M NaCl, 20 mMEDTA (pH 8)), 50 µl protein K
+ Trộn đều hỗn hợp và ủ ở 650C trong 1 giờ, 10 phút lắc đảo 1 lần
+ Ly tâm tốc độ 12 000 rpm trong 15 phút, thu pha trên
Trang 17+ Thêm 600 µl hỗn hợp phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) và trộn hỗnhợp bằng cách đảo đều ống trong 10 phút.
+ Ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 15 phút, chuyển pha lớp dung dịch trên sang ốngeppendorf loại 1,5 ml
+ Thêm 600 µl hỗn hợp chloroform-isoamyl alcohol (24:1) và trộn hỗn hợp bằngcách đảo đều ống trong 10 phút
+ Ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 15 phút, chuyển pha lớp dung dịch trênsang ốngeppendorf loại 1,5 ml
+ Bổ sung 1 µl RNase A 10 g/mL Ủ hỗn hợp trong 1 giờ ở 370C
+ Thêm 800 µl isopropanol để kết tủa DNA, trộn hỗn hợp bằng cách đảo đều ống
4 KIỂM TRA KẾT QUẢ SẢN PHẨM PCR
4.1Thiết kế mồi đặc hiệu
Do điều kiện kĩ thuật không cho phép, nhóm nghiên cứu chỉ xây dựng đoạnmồi trên phương diện lí thuyết Công đoạn chế tạo mồi được thực hiên tại các cơ
sở nước ngoài, nơi có điều kiện kĩ thuật và cơ sở vật chất phù hợp Tại cơ sở củanhóm nghiên cứu, sau khi nhận được sản phẩm là các đoạn mồi do nhóm đặt thiết
kế, nhóm tiến hành kiểm tra đoạn mồi với DNA tổng số của chủng gốc Avium
ATCC® 25291 TM sử dụng phương pháp PCR
Bằng từ khóa “mycobacterium” trên mảng dữ liệu về nucleotide của ngân hàng
dữ liệu Genbank của NCBI có 361314 kết quả hiện thị; trong đó chiếm phần lớn là
162563 trình tự của vi khuẩn lao (M tuberculosis); 61847 trình tự của vi khuẩn lao không điển hình M avium (hình 1) Từ số liệu này cho thấy hệ genecủa vi khuẩn lao
và vi khuẩn lao không điển hình đã nghiên cứu khá sâu và phổ biến trên thế giới
Trang 18Hình 3: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm thông tin qua từ khóa “mycobacterium”
trên cổng thông tin NCBI
Tìm hiểu các tài liệu tham khảo của các công trình đã công bố, việc chuẩn đoán,đánh giá đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn lao, vi khuẩn lao không điển hình,
và các chủng vi khuẩn khác trong chi mycobacterium được thực hiện phổ biến trêncác gene16S, rpoB, hsp65 trong đó gene16S được sử dụng nhiều nhất Bằng từ khóa
“mycobacterium 16S” trên mảng dữ liệu về nucleotide Genbank của NCBI có 103283
kết quả hiện thị; trong đó nhiều nhất là 20104 trình tự gene16S của vi khuẩn lao (M.
tuberculosis); 21379 trình tự gene16S của vi khuẩn lao không điển hình M avium
(hình 2) Bằng từ khóa “mycobacterium rpoB” trên mảng dữ liệu về nucleotide củangân hàng dữ liệu Genbank của NCBI chỉ có 53 kết quả hiện thị (hình 3);
“mycobacterium hsp65” có 2488 kết quả Do đó chúng tôi chọn các chỉ thị 16S đểthiết kế mồi nhân gen, phục vụ nghiên cứu chuẩn đoán vi khuẩn lao không điển hình
Trang 19Hình 4: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thông qua từ khóa
“mycobacterium 16S” trên cổng thông tin NCBI
Hình 5: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thông qua từ khóa
“mycobacterium rpoB” trên cổng thông tin NCBI
