sử dụng enzyme laccase sinh từ nấm đẩm để loại bỏ chất ô nhiễm nồng độ thấp (micropollutants)

LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀITrong thời gian gần đây, sự xuất hiện của các chất gây ô nhiễm nồng độ thấp Micropollutants – MPs trong môi trường nước đã trở thành một vấn đề môi trường toàn cầu.. Nồn

SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI TRƯỜNG THPT VIỆT ĐỨC QUẬN HOÀN KIẾM – HÀ NỘI

**************

ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ

LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015)

Tên đề tài:

SỬ DỤNG ENZYME LACCASE SINH TỪ NẤM ĐẨM ĐỂ LOẠI BỎ CHẤT Ô NHIỄM NỒNG ĐỘ THẤP (MICROPOLLUTANT)

Lĩnh vực: Công nghệ sinh học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN

- GS TS Đặng Thị Cẩm Hà

- ThS Ngô Thị Huyền Trang

- Đơn vị công tác: Viện Công nghệ

Sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam

TÁC GIẢ:

- Đặng Trần Quang

- Lớp 12A3 Trường THPT Việt Đức

Hà Nội, tháng 12 năm 2014

MỤC LỤC

Trang

3.2.1 Phương pháp phân lập, sàng lọc, tuyển chọn vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme ngoại bào

6

3.2.4 Đánh giá hiệu quả loại bỏ MPs 7

3.3.2 Ảnh hưởng của chất gắn kết (CGK) tới hiệu suất

loại bỏ MPs

7

MỤC LỤC

Trang

Hình 3.1: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ BPA bởi

laccase từ FPT5

11

Hình 3.2: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ TCS bởi

laccase từ FPT5

12

Hình 3.3: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ BPA bởi

laccase từ FBV25

12

Hình 3.4: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ TCS bởi

laccase từ FBV25

13

Hình 3.5: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ BPA bởi

laccase từ FBV41

13

Hình 3.6: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ TCS bởi

laccase từ FBV41

14

Bảng 3.1: Hiệu suất loại bỏ bỏ Bisphenol A và Triclosan 10

Bảng 3.2: Thống kê một số nghiên cứu về loại bỏ Bisphenol A và

Triclosan sử dụng enzyme laccase

16

I LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Trong thời gian gần đây, sự xuất hiện của các chất gây ô nhiễm nồng

độ thấp (Micropollutants – MPs) trong môi trường nước đã trở thành một vấn đề môi trường toàn cầu Khoảng 80% các dòng sông ở Mỹ (108 trên

139 dòng được khảo sát) bị ô nhiểm bởi hàng loạt MPs, bao gồm cả Bisphenol A và Triclosan (Kolpin và cộng sự, 2002) Chúng được sử dụng trong dược phẩm, sản phẩm chăm sóc cá nhân, các chất thay đổi hormone

sử dụng cho người, hóa chất công nghiệp, thuốc trừ sâu và nhiều hợp chất khác

MPs tồn tại trong nước ở nồng độ rất thấp, từ một vài pg / L tới một vài µg / L Sự đa dạng cũng như nồng độ rất thấp của MPs của các chất gây

ô nhiễm này nên quan trắc, đánh giá chúng rất phúc tạp Các phương pháp

xử lý nước thải truyền thống cũng không xử lý được các chất ô nhiễm này (Yunlong và cộng sự 2012) khiến MPs thoát thẳng vào môi trường nước một cách dễ dàng Sự thải liên tục MPs vào môi trường dẫn tới nhiều hậu quả lâu dài cho hệ sinh thái (Daughton và cộng sự, 1999)

Ở Việt Nam, nồng độ Bisphenol A được tìm thấy ở Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh cao hơn 3 lần so với các khu vực khác (từ 5.3 µg/l tới 11 µg/l) Nonylphenol được tìm thấy trong các kênh nước thải của Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh với nồng độ từ 0.02 – 9.7 µg/l tới 2 – 20 µg/l Nồng

độ nonylphenol trong các sông của Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh đã được kiểm định có thể gây nguy hại cho hệ sinh thái dưới nước (Yamamoto

và cộng sự., 2014) Hơn nữa, gần đây nồng độ quá mức cho phép của Triclosan được tìm thấy trong kem đánh răng đã gây ra tranh cãi Tuy nhiên, giải pháp thích hợp để xử lý vấn đề này chưa được công bố Ở Việt Nam, cũng chưa có nhiều nghiên cứu về MPs

Trong nghiên cứu 2 năm trước của chúng tôi cho thấy laccase sinh

tổng hợp từ Cerrena sp FBV41 đã loại được nhiều màu thuốc nhuộm hoạt

tính và có hiệu quả cao trong tiền xử lý rơm rạ để tạo đường Thực tế, laccase đã được các nhà nghiên cứu chứng minh khả năng oxy hóa MPs (Chairin và cộng sự, 2013) Sử dụng laccase có thể cản trở hoạt động của các chất kháng sinh trong nước thải (De Gunzburg và cộng sự, 2012), ngăn chặn

ô nhiễm môi trường Ví dụ, Margot và cộng sự cũng đã chỉ ra rằng 25% diclofenac và 95% mefenamic acid có thể bị loại trong 20 giờ bằng laccase

từ chủng Trametes versicolor Vì thế, laccase đã được chọn làm đối tượng

nghiên cứu Đây là nghiên cứu có tính kế thừa và chọn đối tượng là một số MPs là một nhiệm vụ có tính mới và có tính ứng dụng cao

II TỔNG QUAN

Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát khả năng loại 2 chất MPs đại diện gồm Bisphenol A và Triclosan bởi enzyme laccase tạo ra từ 3 chủng FBV41, FBV25 và FPT5 thuộc bộ sưu tập giống của phòng Công nghệ Sinh học Tái tạo Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam

Hiện nay ở Việt Nam cũng như trên thế giới chưa hề có tiêu chuẩn, quy chuẩn nào về nồng độ các chất ô nhiễm nồng độ thấp được cho phép xả thải ra môi trường (Deblonde và cộng sự, 2011), cũng vì thế mà chúng được thải ra ngoài môi trường mà việc thải liên tục có thể dẫn tới nhiều hậu quả khó lường (Daughton và cộng sự, 1999)

Điểm mới và tính sáng tạo của đề tài là đưa ra giải pháp kỹ thuật sử dụng enzyme laccase từ nấm đảm chủ động phân lập từ Việt Nam với nguồn

đa dạng cao, hoạt tính laccase cũng rất cao và có thể sản xuất dễ dàng để xử

lý ô nhiễm môi trường bởi MPs vốn vẫn chưa có giải pháp loại bỏ triệt để Đây là biện pháp sinh học không gây ra ô nhiễm thứ cấp cho môi trường, chi phí không cao và nếu được đầu tư nghiên cứu nghiêm túc và sự kết hợp với các công nghệ khác thì ý tưởng này có tính ứng dụng đại trà Nghiên cứu này là nghiên cứu bước đầu để tìm ra giải pháp loại bỏ hoàn toàn các chất ô nhiễm nguy hiểm nói trên khỏi môi trường khi các chất ô nhiễm nguy hiểm này ảnh hưởng đến cuộc sống thường ngày và sức khỏe của cộng đồng Hướng nghiên cứu mà chúng tôi thực hiện nhằm tạo cơ sở đầu tiên trong thiết kế, xây dựng công nghệ hiệu quả và bền vững Ngoài sử dụng chính bản thân nấm sống và enzyme tự do thì cố định laccase lên các vật liệu nano

để chế tạo các màng xử lý sinh học phục vụ cho việc xử lý các loại nước thải chứa MPs và các chất đa vòng thơm khác là một định hướng có tính áp dụng thực tế cao đối với Việt Nam

III QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ

3.1 Vật liệu

3.1.1 Laccase

Các chủng nấm FBV25 đã được phân lập từ gỗ mục từ rừng quốc gia

Ba Vì và FPT5 từ tỉnh Phú Thọ Riêng chủng FBV41 đã được nhóm nghiên

cứu của chúng tôi phân lập từ đất rừng Ba Vì năm 2012 và đã được sử dụng

để loại màu thuốc nhuộm có hiệu quả Ba chủng nấm này được lựa chọn để nuôi cấy thu dịch enzyme laccase thô cho nghiên cứu này

Laccase (EC 1.10.3.2) là các hợp chất oxi hóa polyphenol có khả năng xúc tác sự oxi hóa của nhiều hợp chất hữu cơ đa vòng thơm, đặc biệt là những chất có nhóm chức cho electron như phenol (-OH) hay aniline (-NH2) bằng cách sử dụng bằng cách sử dụng phân tử oxi làm chất oxi hóa (Gianfreda và cộng sự 1999) Laccase là một trong những enzyme khá phổ biến trong tự nhiên có mặt ở nhiều loại thực vật, nấm cũng như ở một số loài

vi khuẩn và côn trùng và có nhiều chức năng như phân hủy các hợp chất polymer phức tạp (lignin, humic acid), lignin hóa, phân hủy độc, bệnh nhân tạo, tạo hình thái, hình thành bào tử, trùng hợp melanin (Strong & Claus

2011) Khả năng xúc tác của laccase từ nấm (một mình hoặc có sự trợ giúp của chất gắn kết) sự oxi hóa của dược phẩm và chất diệt cỏ được diễn ra ở một vài chất, ví dụ như các hợp chất nội tiết (Auriol và cộng

và cộng sự 2009; Marco-Urrea và cộng sự 2010; 2013b Margot và cộng sự), kháng sinh (Schwarz và cộng sự 2010; Suda và cộng sự 2012),

bộ lọc tia cực tím (Garcia và cộng sự 2013b 2011), chất diệt sinh vật (Margot và cộng sự.) và thuốc trừ sâu halogen khác (Torres-Duarte và cộng sự 2009) Do phổ cơ chất rộng và yêu cầu duy nhất của là oxi làm hợp chất nền, laccase là một chất xúc tác sinh học đầy hứa hẹn với khả năng phân hủy hữu cơ các hợp chất micropollutants trong nước thải thứ cấp

3.1.2 Micropollutants (Chất ô nhiễm nồng độ thấp)

Các chất Bisphenol A, Triclosan là đại diện của MPs đã được sử dụng cho nghiên cứu loại chất ô nhiễm nồng độ thấp này

3.1.2.1 Micropollutant là gì?

MPs là các hợp chất ô nhiễm được tìm thấy chỉ với nồng độ từ vài pg/L tới vài µg/L trong môi trường Nhiều MPs có mặt trong nước thải thành thị, từ dược phẩm hay chất diệt cỏ, rất khó để bị loại bỏ bằng các phương pháp xử lý sinh học truyền thống nên chúng liên tục thải vào môi trường nước Những hợp chất này có cấu trúc bền vững nên rất khó phân hủy bởi rất nhiều tác nhân khác nhau Chính vì vậy mà chúng ảnh hưởng tới các sinh vật nhạy cảm dù với nồng độ rất thấp (Yunlong và cộng sự

3.1.2.2 Bisphenol A

Bisphenol A (BPA) là một hợp chất carbon tổng hợp có công thức hóa học (CH3)2C(C6H4OH)2 thuộc nhóm dẫn xuất diphenyl-mê-tan và bisphenols, với hai nhóm hydroxyphenyl Nó đã được sử dụng trong thương mại từ năm 1957 (Gemma và cộng sự., 2014) BPA cũng là một chất phá hủy nội tiết (Krishnan và cộng sự, 1993; Fujimoto và cộng sự, 2006) và được biết là gây độc cấp tính cho sinh vật với nồng độ 1-10lgL 1 (Alexander

và cộng sự, 1988.)

Hình 1.1 Công thức hóa học của Bisphenol A

BPA được sử dụng làm nguyên liệu ban đầu cho sản xuất nhựa polycarbonate và nhựa epoxy Nó xuất hiện trong môi trường do các nhà máy sản xuất BPA, kết hợp BPA thành nhựa (Staples và cộng sự, 1998), lọc các chất thải nhựa (Sajiki và Yonekubo, 2003) hoặc các bãi chôn lấp (Asakura và cộng sự, 2004) thải ra Nồng độ BPA có thể lên tới 21 µgl-1 ở bề mặt và dưới nước biển (Belfroid và cộng sự, 2002) và lên đến 702 ngl-1 trong nước thải Vi khuẩn có khả năng giảm BPA đã được phân lập từ một nhà máy xử lý nước tải (Lobos và cộng sự, 1992) và nước sông (Kang và cộng

sự, 2004) BPA cũng là một chất phá hủy hệ nội tiết (Krishnan và cộng sự, 1993; Fujimoto và cộng sự 2006) và được biết răng có khả năng gây độc cho các sinh vật dưới nước ở nồng độ từ 1-10 g/L (Alexander và cộng sự 1988)

Đã có một số nghiên cứu trước đây cho thấy BPA có thể bị loại bỏ bởi enzyme từ nấm (Kim và Nicell, 2005; Cabana và cộng sự 2012)

3.1.2.3 Triclosan

Triclosan (2,4,4 '-trichloro-2'-hydroxydiphenyl ether) là một hợp chất

đa vòng thơm có chứa clo Nhóm chức của nó bao gồm cả phenol và ete Triclosan lần đầu tiên được đăng ký là một thuốc trừ sâu vào năm 1969 (Cabana và cộng sự, 2006)

Hình 1.2 Công thức hóa học của Triclosan

TCS là một tác nhân kháng khuẩn có phổ rộng Nó được sử dụng trong nhiều loại PCP như kem đánh răng, lăn khử mùi, xà phòng và nước rửa tay TCS được tìm thấy chủ yếu trong nước thải cùng cặn từ các nhà máy xử lý nước thải Nồng độ TCS trong nước thải từ các nhà máy xử lý nước thải có thể lên tới 37.8 µgl-1 (Hua và cộng sự, 2005) và mặt nước lên đến 431 ngl-1

(Morrall và cộng sự, 2004) Do tính kị nước cao của hóa chất này (Log Kow

= 4.8), sự tản của nó trong môi trường nước xảy ra bởi sự hấp phụ của các hạt và trầm tích và thường tích lũy trong sinh vật dưới nước (AdolfssonErici

và cộng sự, 2002) TCS được chú ý là bởi có sự giống nhau ở cấu trúc hóa học với BPA xenoestrogen và chất gây ô nhiễm có độc tính cao như dioxin Một số thông tin cho thấy TCS có khả năng can thiệp và suy giảm hệ nội tiết Các nghiên cứu về medaka (Oryzias latipes) cho thấy TCS có thể là một chất androgenic yếu (Foran và cộng sự, 2000) và sản phẩm chuyển hóa của

nó có thể hoạt động như thụ thể đối kháng estrogen (Ishibashi và cộng sự, 2004) TCS cũng được loại bỏ tới 65% sau 8 giờ khi sử dụng enzyme

laccase từ chủng nấm Coriolopsis polyzona (Cabana và cộng sự, 2007)

3.1.3 Chất hóa học sử dụng để nghiên cứu

Các chất hóa học đã sử dụng trong nghiên cứu bao gồm Bisphenol A, Triclosan, Violuric acid, ABTS, guaiacol, di-sodium hydrogen phosphate buffer, sodium acetate, citric acid, methanol, HCl, CuSO4, NaOH v.v từ Sigma- Alrich, Merck, Fermentas

3.1.4 Thiết bị và máy móc

Nghiên cứu này được thực hiện bằng trang thiết bị của phòng Công nghệ Sinh học Tái tạo môi trường của viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Các thiết bị chính bao gồm: bình tam giác, cân kỹ thuật, máy đo pH Hanna, tủ cấy vô trùng Laminar của Pháp, tủ sấy, nồi khử trùng, máy nuôi lắc ở các nhiệt độ khác nhau, tủ nuôi

ổn nhiệt, máy ly tâm Eppendorf, tủ lạnh cách loại 4 ºC, -20ºC; máy đo quang phổ Novaspec II, lò vi sóng, pipet man của hãng Eppendorf, đầu côn,

v.v.Thiết bị phân tích LC-MS/MS và HPLC-DAD của Trung Tâm I, Bộ KHCN

3.2 Phương pháp

3.2.1 Phương pháp phân lập, sàng lọc, tuyển chọn vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme ngoại bào

Các chủng vi sinh vật được phân lập theo phương pháp pha loãng– gạt đĩa thạch theo nồng độ pha loãng hay đặt trực tiếp các mẫu gỗ mục và rơm mục (kích thước 2-3 mm) có sợi nấm lên các đĩa thạch chứa môi trường có chất chỉ thị Phương pháp này thường nhanh và sợi nấm xuất hiện chỉ sau 16-20 giờ

Chất chỉ thị được sử dụng để nhận biết khả năng sinh tổng hợp laccase của các chủng nấm là guaiacol (0,01%) Trên môi trường thạch, chủng nào oxy hóa guaiacol tạo ra màu nâu đỏ thì có thể chủng đó sẽ sinh tổng hợp enzyme ngoại bào trong đó có laccase

Cuối cùng, FBV41, FBV25 và FPT5 được nuôi cấy trong các môi trường thích hợp để tạo laccase thô

3.2.2.Xác định hoạt tính laccase

Phương pháp xác định laccase được Eggert và cộng sự (1996) công bố và

cho đến nay vẫn được xem là phương pháp thường qui đã được sử dụng cho nghiên cứu này

Nguyên tắc: Hoạt độ của laccase được xác định bằng sự tăng độ hấp

thụ ánh sáng của sản phẩm được tạo thành ở bước sóng 420 nm ở điều kiện phòng thí nghiệm

Hỗn hợp phản ứng đo hoạt tính laccase gồm 0,2 ml ABTS 2,5 mM; 0,6 ml đệm natri axetat 20 mM và 0,2 ml dịch enzyme laccase thô đã được

ly tâm

Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ laccase là lượng enzyme cần thiết để

tạo thành 1 µM sản phẩm từ cơ chất ABTS (2,2-azino-bis 3-ethylbenzothiazoline-6sulfonic acid) trong thời gian 1 phút, ở điều kiện phòng thí nghiệm

3.2.3 Thí nghiệm loại bỏ MPs

Hỗn hợp phản ứng gồm 5 mg/L của một trong các chất BPA hoặc TCS, enzyme laccase thô của FBV41, FBV25 và FPT5, đệm citrate

disodium hydrogen phosphate pH 5 và 1% v/v methanol Hoạt tính của laccase trong phản ứng là 1000 U/L Ngoài ra, 50µM Violuric acid được bổ sung với vai trò chất gắn kết đối với các phản ứng loại bỏ MPs Các mẫu thí nghiệm được ủ ở 40oC trong 4 giờ Dừng phản ứng bằng cách đun sôi dung dịch trong 15 phút Dung dịch sau khi đun được phân tích bởi HPLC-DAD (Bisphenol A) và LC-MS/MS (Triclosan)

3.2.4 Đánh giá hiệu suất loại bỏ MPs

Như đã đề cập ở trên Triclosan được phân tích bằng phương pháp LC-MS/MS theo một giao thức chuẩn (QHFSS Document No 27701:PPCP trong nước; chuẩn bị và phân tích bởi SPE và LCMSMS) và Bisphenol A phân tích bằng HPLC-DAD

3.3.Kết quả

3.3.1 Hiệu suất loại bỏ MPs

Sau 4 giờ phản ứng, dung dịch được phân tích bởi các thiết bị chuyên dụng chủ yếu nêu trên Hệ số thu hồi

của phản ứng rất tốt nằm trong khoảng trên dưới 100 % lần lượt là 5.044 mg/L đối với BPA và 4.995 mg/L đối

với TCS (Bảng 3.1) Hiệu suất loại bỏ Bisphenol A và Triclosan bằng laccase thô từ 3 chủng FPT5, FBV25, FBV41 từ 85.66 – 100% sau 4 giờ phản ứng (Bảng 3.1) Trong đó laccase từ chủng FBV41 loại MPs tốt nhất đối với cả Bisphenol A và Triclosan lần lượt là 100 và 99,8% Kết quả lý thú thu được là không cần có chất gắn kết chỉ

có laccase đơn lẻ của 3 chủng hiệu suất loại cả 2 loại MPs nghiên cứu cao từ 85,66 - 97,7% (Bảng 3.1)

Bảng 3.1: Hiệu suất loại bỏ bỏ Bisphenol A và Triclosan

3.3.2 Ảnh hưởng của chất gắn kết (CGK) tới hiệu suất loại bỏ MPs

Việc sử dụng các chất oxy hóa có trọng lượng phân tử thấp trong nhóm chất xúc tác của laccase nâng cao hoạt tính của enzyme này Quá trình oxy hóa trung gian này gồm hai bước oxy hóa Trong bước đầu, laccase oxy hóa chất nền, chất gắn kết Chất này sẽ hoạt động như một hợp chất vận chuyển electron Sau đó, chính chất gắn kết sẽ chuyển electron cho cơ chất chính cần phản ứng Những chất gắn kết tăng khả năng phản ứng của laccase

Mẫu

MPs

Đối chứng

Nồng độ (mg/L )

Nồng độ (mg/L )

Hiệu suất loại (%)

Nồng độ (mg/L )

Hiệu suất loại (%)

Nồng độ (mg/L )

Hiệu suất loại (%)

Nồng độ (mg/L )

Hiệu suất loại (%)

Nồng độ (mg/L )

Hiệu suất loại (%)

Nồng độ (mg/L)

Hiệu suất loại (%)