sử dụng nước sắc lá muồng (cassia angustifolia) để ức chế nấm mốc và vi khuẩn trong bảo quản trái cây

Để đáp ứng được yêu cầu chất lượng hiện nay của các cơ quan quản lý vàchức năng như Cục Bảo Vệ Thực Vật, Cục Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm, việc tạo ra các loại thuốc bảo quản trái cây với q

SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI

QUẬN TÂY HỒ TRƯỜNG THPT CHU VĂN AN

**************

ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ

LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015).

Tên đề tài: SỬ DỤNG CAO CHIẾT LÁ MUỒNG (CASSIA ANGUSTIFOLIA) ĐỂ

ỨC CHẾ NẤM MỐC VÀ VI KHUẨN TRONG BẢO QUẢN TRÁI CÂY

MỤC LỤC Trang

PHẦN I Lý do chọn đề tài……….3

PHẦN II Tổng quan………4

PHẦN III Qúa trình nghiên cứu và kết quả……… 5

3.1 Cây Muồng……….5

3.2 Phương pháp chiết cao và hướng nghiên cứu……….6

3.3 Thực nghiệm………7

3.3.1 Xay Muồng……… 7

3.3.2 Tách chiết lấy hoạt chất từ lá Muồng…… 7

3.3.3 Kiểm tra anthraquinone tổng số………….10

3.3.4 Kiểm tra hoạt tính của cao chiết………….11

PHẦN IV Kết luận……….….20

PHẦN I

LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Vi sinh vật (như nấm mốc và vi khuẩn) làm trái cây bị hư hỏng và cóthể gây bệnh đối với người sử dụng Các biện pháp bảo quản trái cây, chống lạicác vi sinh vật gây bệnh đã được tìm hiểu từ lâu

Bảo quản trái cây có thể thực hiện bằng phương pháp sơ chế vật lý nhưchiếu xạ, bao gói bằng màng bán thấm - điều hòa khí hoặc đưa về môi trườngbảo quản bất lợi đối với sự phát triển của vi sinh vật, nhưng các phương phápnày phức tạp và nhiều tốn kém

Trái cây cũng được bảo quản nhờ phương pháp xử lý bằng hóa chất[1,2], tuy nhiên có nhiều loại hóa chất độc hại cho sức khỏe của người sản xuất

và tiêu dùng như: hóa chất nguồn gốc organophosphate, carbamate, dẫn xuấtcủa DDT, carbenadazim, auxin, 2,4-D và các chất diệt cỏ đã bị cấm hoàn toànhoặc một phần trong điều kiện sống hiện tại

Để đáp ứng được yêu cầu chất lượng hiện nay của các cơ quan quản lý vàchức năng như Cục Bảo Vệ Thực Vật, Cục Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm, việc

tạo ra các loại thuốc bảo quản trái cây với quy trình công nghệ đơn giản, thân thiện với môi trường, không độc hại, có nguồn gốc từ các nguyên liệu

thảo mộc, thực vật làm thuốc hoặc sàng lọc hoạt tính trong điều kiện nghiên cứuhóa học, sinh học hiện tại là hết sức cần thiết

Thực tế cho thấy nhiều loại cây cỏ đã được sử dụng để trị bệnh, trong đó

lá Muồng là một loại thảo dược có tác dụng trong việc gây xổ ở những trườnghợp táo bón Tra cứu tiếp từ nguồn tài liệu về cây cỏ làm thuốc, nguyên liệu láMuồng còn được biết có hiệu quả ức chế khối u, kháng viêm và đặc biệt cónhiều hoạt tính ức chế vi sinh vật gây bệnh đường ruột đối với người

Như vậy, lá Muồng có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây

hại trên trái cây hay không??? vấn đề này hiện nay vẫn chưa được nghiên cứurộng rãi trong nước và trên thế giới

Xuất phát từ các lý do nêu trên, chúng em tiến hành chế tạo cao chiết từ

lá Muồng; kiểm tra hiệu quả ức chế của cao chiết này với một số vi khuẩn gâybệnh cho trái cây trong phòng thí nghiệm và thử nghiệm khả năng bảo quản tráicây của cao chiết

Phần II TỔNG QUAN

Cây Muồng lá hẹp (tên khoa học: Cassia angustifolia Vahl; họ:

Caesalpinaceae), được trồng tại các nước nhiệt đới, thuộc họ Muồng

Lá Muồng được sử dụng làm thuốc để trị bệnh táo bón (Atal et al 1982;Das et 2003; Martindale, 1997; Sharma, 2004), kháng viêm, ức chế khối u…trên cơ thể người

Thực nghiệm cho thấy cao chiết thu được từ nguồn nguyên liệu lá Muồng (bằng các phương pháp chiết khác nhau) đều có chứa hoạt chất anthraquinone Các cao chiết đều ức chế có hiệu quả sự phát triển của nấm Colletotrichum gloeosporioides (gây bệnh đốm đen); vi khuẩn Xanthomonas axonopodis (gâybệnh loét vi khuẩn) trên trái cây và ngoài ra còn ức chế sự phát triển của chủng

Tụ cầu vàng

2.1 Tính mới

Sử dụng cao chiết chứa hoạt chất anthraquinone có trong lá Muồng để

ức chế hiệu quả sự phát triển của vi sinh vật gây hại trên trái cây là một

hướng đi mới của đề tài

2.2 Tính sáng tạo

Việc sử dụng lá Muồng - nguồn nguyên liệu rẻ tiền, sẵn có, không độchại với con người và thân thiện với môi trường, để chiết lấy cao chứa

anthraquinone bằng quy trình công nghệ đơn giản, dễ thực hiện: phương

pháp chiết với dung môi nước (sắc) là một ý tưởng sáng tạo

Phần III QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ

3.1 Cây Muồng

Cây Muồng lá hẹp (tên khoa học: Cassia angustifolia Vahl; họ:

Caesalpinaceae), được trồng tại các nước nhiệt đới, thuộc họ Muồng

Trong cây Muồng lá hẹp có chứa sennoside A, B, C và D (Hayashi et al

1980); kaemferol; phytosterols (Khorama và Sanghvi, 1964); rhein; glylcoside

của rhein và chrysophanic acid Vỏ và lá của cây chứa hoạt chất chính là

sennosides A và B được sử dụng rộng rãi trong y học vì chúng có tính nhuận

tràng

Muồng lá hẹp có vị ngọt, đắng, tính hàn, qui kinh Đại tràng, là loại cây cógiá trị y dược cao Từ thế kỷ thứ 9, cây Muồng lá hẹp đã được dùng làm thuốctại các nước Ả rập, đến thời kỳ cận đại mới truyền vào Trung quốc Cây Muồng

lá hẹp có tác dụng nhuận tràng, được sử dụng để trị bệnh táo bón (Atal et al

1982; Das et 2003; Martindale,1997; Sharma, 2004), kháng viêm,

ức chế khối u…

Lá Muồng nghiên cứu trong đề tài được mua tại cửa hàng bán thuốc đông ydưới dạng lá đã sấy khô.

3.2 Phương pháp chiết cao và hướng nghiên cứu

Bằng một số phương pháp chiết với dung môi nước hoặc dung môi hữu

cơ như etanol, nhóm nghiên cứu đã tiến hành tách hoạt chất anthraquinone khỏi

thực vật, sau đó cô đuổi dung môi để thu được cao chiết.

Phương pháp chiết với dung môi nước (sắc), dùng để thu hồi các hoạt

chất có trong lá cây hòa tan vào dịch nước Phương pháp này rẻ tiền, dễ thựchiện, tuy nhiên dịch chiết thu được có nhiều tạp chất, có thể gây thuỷ phân một

số hoạt chất (glycoside, ancaloid) hoặc gây phân huỷ một số hoạt chất khi tiếnhành ở nhiệt độ cao

Phương pháp chiết với dung môi etanol, nhằm thu hồi các hoạt chất có

trong lá cây hòa tan vào dịch etanol Phương pháp này tiến hành ở nhiệt độ ởnhiệt độ dưới 400C nên hoạt chất ít bị phân huỷ, cao chiết có khả năng phaloãng với nước nên dễ phun hoặc tẩm vào quả thực nghiệm ở các nồng độ thấphơn Với nồng độ trên 20% dịch chiết có khả năng bảo quản, ngăn cản vi khuẩn,nấm mốc phát triển, không làm trương nở dược liệu, có thể loại tạp chất do làmđông vón chất nhày, albumin, gôm pectin…Tuy nhiên phương pháp này dễ gâycháy nên đòi hỏi thao tác trong điều kiện an toàn

Để tinh chế anthraquinone, dịch chiết nước được axit hóa để chuyển

anthraquynone về dạng ít tan trong nước Dịch nước này được lắc chiết với etylaxetat, sau đó tiếp tục chiết với butanol Phần dung môi butanol thu được cóhàm lượng các anthraquinone cao hơn so với dịch chiết nước ban đầu và dịchchiết sử dụng cồn Nhược điểm của phương pháp này là trải qua ba bước chínhphức tạp, sử dụng hai loại dung môi hữu cơ khác nhau Hóa chất tiến hành cónguy cơ gây cháy nổ và ảnh hưởng sức khỏe người làm việc trong không gian

xung quanh

Các sản phẩm thu được chứa hàm lượng antharaquinon cao (hình ảnh sắcký) sẽ được đưa thử nghiệm theo hai hướng:

Hướng 1: Kiểm tra hoạt tính ức chế của cao chiết đối với một số vi khuẩn gâybệnh cho trái cây và gây ngộ độc thức ăn trên người trong phòng thí nghiệm.

1 Phương pháp khuyếch tán giếng trên đĩa thạch với vi khuẩn gây hại cây

2 Phương pháp khoanh giấy với vi khuẩn gây bệnh trên người

Hướng 2: Thử nghiệm hiệu quả ức chế vi sinh vật gây bệnh trực tiếp trên trái

cây

3.3 Thực nghiệm

3.3.1 Xay nhỏ lá Muồng khô nhằm tăng diện tích

tiếp xúc của dược liệu với dung môi

3.3.2 Tách chiết lấy hoạt chất từ lá Muồng:

Cách 1: Tách chiết cao bằng nước (sắc)

(1,3 lít)cao màu đenchứa anthraquinone

và tạp chất (tinh bột, protein…)

Cách 2: Tách chiết cao bằng dung môi etanol

Màu dịch chiết lá Muồng trong etanol 300, 500 và 700 theo thứ tự có màuvàng đậm dần, chứng tỏ nồng độ etanol càng cao, lượng anthraquinone tantrong dịch chiết càng nhiều.

Dịch chiết etanol 960 có màu xanh đậm do hòa tan nhiều chất diệp lục làmgiảm độ tinh khiết của anthraquinone trong dịch chiết

Vì vậy chúng tôi quyết định chọn etanol 70 0 làm dung môi chiết.

Cách 3: Tinh chế hoạt chất trong dịch chiết nước (thu từ hai lần chiết 100

gam lá muồng) với các dung môi hữu cơ thu được cao chiết butanol.

3.3.3 Kiểm tra anthraquinone tổng số trong các mẫu cao

Bằng phương pháp sử dụng sắc ký bản mỏng với kích thước: rộng 2 cm;chân 1 cm; khoảng cách chạy sắc ký 3,5 cm; khoảng cách chạy trên đỉnh 0,5

Các anthraquinone được hiện màu (màu cam) bằng tác nhân KOH 5%trong etanol.

Kết quả cho thấy hàm lượng anthraquinone trong các mẫu cao giảm dầntheo thứ tự: Cao chiết butanol > Cao chiết cồn > Cao chiết nước

3.3.4 Kiểm tra hoạt tính của cao chiết

3.3.4.1 Thí nghiệm với vi khuẩn trong phòng thí nghiệm

3.3.4.1.1 Kiểm tra hoạt tính ức chế của cao chiết đối với một số vi sinh vật gây

hại trái cây bằng phương pháp khuyếch tán giếng trên đĩa thạch.

Phương pháp được tiến hành trên cơ sở phương pháp của Hadacek et al.(2000) [3] có điều chỉnh phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm tại ViệnCông nghệ Môi trường, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Nguyên lý:

Mỗi chủng vi khuẩn có thể bị ức chế bởi các chất khác nhau vì vậy có thể kiểmtra sự kháng khuẩn của một chất dựa vào sự khuyếch tán của chất đó trên môitrường phát triển của vi khuẩn Nếu vi khuẩn bị ức chế sẽ tạo ra vòng vô khuẩnxung quanh lỗ thạch có chứa chất thử

Tiến hành:

Các vi khuẩn gây bệnh cây (Xanthomonas axonopodis, Ralstonia

solanacearum, Clavibacter michiganensis) được nuôi kích hoạt trong 100 ml

môi trường MP lỏng ở nhiệt độ phòng

Dịch nuôi cấy vi khuẩn bệnh cây sau 1 ngày (50µL) được cấy gạt đềutrên đĩa petri chứa môi trường MPA (mỗi đĩa petri được cấy một chủng vikhuẩn nghiên cứu)

Sử dụng ống sắt có đường kính d = 1 cm (đã khử trùng trên ngọn lửa đèncồn rồi để nguội) để đục lỗ thạch trên các đĩa petri đã được cấy gạt vi khuẩn

Dùng pipet hút 100 µl dịch chiết tại các nồng độ khác nhau cho vào các

lỗ thạch, mỗi đĩa sẽ để lỗ thạch nhỏ 100µl dung dịch pha loãng làm đối chứng

Đĩa thạch trên được ủ ấm ở nhiệt độ 27°C trong 24h - 48h sau đó quan sátvòng vô khuẩn

Kiểm tra vòng kháng khuẩn và chụp ảnh sau 24h và sau 48h nuôi cấy

Kết quả:

Xuất hiện vòng vô khuẩn xung quanh giếng thạch (trên đĩa petri nuôi cấy chủng

Xanthomonas axonopodis gây bệnh cho một số loài cây ăn quả) tại các nồng độ

500 µg / 100 µL và nồng độ 1000 µg /100 µL

Vòng kháng khuẩnvới cao chiếtetanol

Vòng kháng khuẩn

với cao chiết butanol

Vòng kháng khuẩn với cao chiết nước (sắc)

3.3.4.1.2 Kiểm tra hoạt tính ức chế của cao chiết đối với một số vi khuẩn bệnh

trên người trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp khoanh giấy.

Phương pháp đánh giá trên cơ sở đánh giá độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được kiểm tra (CLSI [5]) sử dụng khoanh giấy: khoanh giấy tẩm

dung dịch thuốc thử khuếch tán trong thạch (kỹ thuật Kirby-Bauer) [4,5].

+ Chủng vi khuẩn: ATCC S aureus; ATCC E coli; V parahaemolyticus;

V cholerae; Salmonella group D; S flexneri; Các chủng vi khuẩn phải thuầnkhiết được nuôi cấy sau 18 - 24 giờ;

+ Khoanh giấy tẩm dịch chiết lá Muồng với nồng độ khác nhau để khô tựnhiên trước khi sử dụng

Tiến hành:

+ Pha loãng vi khuẩn: dùng que cấy vô trùng chấm vào ít nhất ba điểm trênmặt thạch nghiêng có vi khuẩn hoặc 5 khuẩn lạc thuần chủng nếu trên thạch đĩa(để tránh các vi khuẩn đột biến), hòa tan vào ống nghiệm có chứa sẵn 1ml nướcmuối sinh lý vô trùng Lắc đều bằng máy lắc Vortex So với độ đục chuẩn McFaland 0.5 bằng máy đo độ đục, độ đục này tương đương 108 CFU/ml (ColonyForming Unit) Nếu hỗn dịch vi khuẩn đục hơn thì cho thêm nước muối sinh lý

vô trùng, ngược lại nếu trong hơn cho thêm vi khuẩn để có độ đục bằng độ đụcchuẩn;

+ Ria cấy vi khuẩn: dùng que tăm bông vô trùng nhúng vào hỗn dịch 108

CFU/ml vi khuẩn Ép nhẹ tăm bông lên thành ống nghiệm cho bớt nước Riađều hỗn dịch vi khuẩn lên mặt thạch bằng cách vừa ria vừa xoay que tăm bông,các đường ria chéo nhau 1200C sao cho sau khi để tủ ấm các khuẩn lạc vi khuẩnmọc sát vào nhau mà không chồng lên nhau;

+ Đặt khoanh giấy tẩm dịch chiết lá Muồng : mỗi khoanh cách nhau tốithiểu 2 cm và rìa khoanh giấy cách thành đĩa tối thiểu 1 cm;

+ Để đĩa kháng sinh đồ ở nhiệt độ phòng 30 phút cho khoanh giấy tẩm dịch

chiết lá Muồng khuếch tán đều ra môitrường, sau đó để tủ ấm 350C qua đêm Đọc kết quả:

Kết quả thử nghiệm tại khoa xét nghiệmviện Y học lâm sang các bệnh nhiệt đới

Bạch Mai làm ngày 22/10, bằng phương pháp khoanh giấy tẩm dung dịch thuốcthử khuếch tán trong thạch (kỹ thuật Kirby-Bauer) [4]:

- Xuất hiện rất rõ ràng vòng vô khuẩn với chủng Tụ cầu vàng ở dịch chiết nồng

độ 500 micro gram/ 100 microlít và nồng độ 1000 microgram/ 100 microlít với

cả 2 loại cao và ở dịch sắc không cô đặc (dịch sắc ngâm rau quả.)

- Vòng vô khuẩn không rõ với chủng Vibrio parahemolyticus và E Coli

- Không có vòng vô khuẩn với chủng thương hàn, lỵ, tả

3.3.4.2 Thử nghiệm hiệu quả ức chế vi sinh vật gây bệnh trực tiếp trên trái cây

Nguyên liệu: Nguồn trái cây tươi, sạch

( Hợp tác xã rau sạch Vân nội Đông Anh

Hà Nội):

Ổi; Khế; Cà chua; Bơ; Xoài; Chanh;

Chuối; Đu đủ; Su su; Dưa chuột; Mướp

đắng; Cà tím; Ớt

3.3.4.2.1 Mỗi loại trái cây thử nghiệm được chia làm ba nhóm đối chứng

Nhóm 1: Trái cây không được xử lý, để trong môi trường tự nhiên (K).

Nhóm 2: Trái cây được rửa sạch, ngâm trong nước muối loãng (0,9%)

trong 5 phút, để khô tự nhiên (M)

Nhóm 3: Trái cây được ngâm trong

dịch sắc lá Muồng trong 5 phút, để khô tự

nhiên (P)

Kết quả:

Nhóm 2 Nhóm 1 Nhóm 3 Ngày kiểm tra 03/10/2014

Nhóm quả ngâm dịch sắc lá Muồng giữ được tươi lâu hơn, không thối so vớinhóm đối chứng từ 6 đến 8 ngày.

3.3.4.2.2 Gây bệnh đốm đen trên trái cây (do nấm Colletotrichum

gloeosporioides):

Sau khi xử lý theo 3 nhóm thí nghiệm (như ở mục 3.3.4.2.1.), trái câyđược gây bệnh bằng cách lấy mầm bệnh từ quả bị bệnh (hớt một lớp mỏng (0,2mm); đường kính 1 cm trên vỏ nơi quả bị bệnh), ép lên chỗ lớp vỏ quả không bịbệnh, cố định bằng băng dính trong

Theo dõi quá trình lây bệnh

Quả bơ trước khi lây bệnh

(Ngày 27/09/2014)

Kết quả:

Quả để tự nhiên Quả ngâm

Nhóm bơ, xoài, ổi để tự nhiên 0% 100%

3.3.4.2.3 Gây bệnh loét vi khuẩn trái cây: (do chủng vi khuẩn Xanthomonas

axonopodis)

Ngày kiểm tra 10/10/2014Ngày thử nghiệm 4/10/2014

Phân chia chanh trên cây thành 3 nhóm thí nghiệm: nhóm ngâm dịch sắc

lá Muồng; nhóm ngâm nước muối và nhóm để tự nhiên, không xử lý Dùng tămbông thấm dung dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn Xanthomonas axonopodis rồixoa đều lên 3 nhóm quả chanh Ngày thử nghiệm 7/10/2014

Theo dõi quá trình lây bệnh trên cácnhóm thử (Ngày kiểm tra 20/10/2014)

Kết quả: Nhóm quả chanh ngâm dịch sắc không bị nhiễm bệnh

KẾT LUẬN 1- Chế tạo thành công một loại cao chiết từ lá Muồng (Cassia angustifolia) bằng cách sắc với nước hoặc chiết với cồn 70° Các loại cao chiết đều có chứa

các hoạt chất hóa học là các anthraquinone và có hiệu quả ức chế gây bệnh trêntrái cây như bơ, ổi, xoài và chanh Cao chiết này có tính an toàn cao, có thể sửdụng làm thành thuốc bảo vệ thực vật, sử dụng để bảo quản hoa quả

2- Hiệu quả ức chế sự phát triển vi sinh vật gây bệnh cho cây của dịch chiết với

dung môi nước (sắc) tương đương dịch chiết etanol và dịch chiết butanol

3- Dịch chiết xuất từ lá Muồng ức chế có hiệu quả vi sinh vật gây bệnh cho trái

cây

- Ức chế sự lây bệnh do nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh

đốm đen trên quả bơ, quả ổi, quả xoài

- Ức chế vi khuẩn Xanthomonas axonopodi gây bệnh cho quả chanh trên cây

và trong phòng thí nghiệm

- Ức chế vi khuẩn Tụ cầu vàng (Staphilococus aureus) hay gây ngộ độc thực

phẩm

- Tăng thời gian bảo quản trái cây như Bơ, Xoài, Ổi, Đu Đủ, Chanh

4- Đề tài sẽ tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của cao chiết,

tiến hành nhiều thí nghiệm lặp lại, và sẽ có những đánh giá có giá trị hơn saukhi các nghiên cứu khoa học hoàn chỉnh Cao chiết có thể ứng dụng làm thuốcbảo quản trái cây khi đã đủ điều kiện để đáp ứng yêu cầu đăng ký của Cục Bảo

Vệ Thực Vật

5- Đề tài có thể còn được phát triển tiếp theo hướng nghiên cứu về khả năng ức

chế thêm một số vi khuẩn gây bệnh cho cây, gây ngộ độc thức ăn ở người