thẩm định quy trình xác định hàm lượng kháng nguyên vi trong vắc xin thương hàn vi tại viện kiểm định quốc gia vắc xin và sinh phẩm y tế

Hiệu quả của vắc xin thương hàn Vi được đánh giá trong phòng thí nghiệmchủ yếu thông qua kiểm định hàm lượng kháng nguyên Vi.. Quy trình xác định hàm lượng kháng nguyê

Trang 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vắc xin là chế phẩm sinh học có tính kháng nguyên, dùng để tạo miễndịch đặc hiệu, chủ động, nhằm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với một tácnhân gây bệnh cụ thể nào đó Việc sử dụng vắc xin đã đẩy lùi nhiều bệnh:Loại trừ bệnh đậu mùa trên toàn cầu, thanh toán gần như hoàn toàn bệnh bạiliệt, giảm đáng kể các bệnh sởi, bạch hầu, ho gà, uốn ván và thương hàn v.v…Thương hàn là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, chủ yếu do trực khuẩn

Salmonella typhi gây nên Bệnh lây qua đường tiêu hóa, nếu không được điều

trị kịp thời, bệnh có nhiều diễn biến phức tạp, có thể gây nhiều biến chứngnguy hiểm như: thủng ruột, viêm cơ tim, có nguy cơ dẫn đến tử vong

Vắc xin thương hàn ra đời (vắc xin thương hàn uống, vắc xin thương hàn

Vi Polysaccharide, vắc xin thương hàn Vi cộng hợp…) đã góp phần làm giảm

tỷ lệ mắc và tử vong do bệnh thương hàn

Hiệu quả của vắc xin thương hàn Vi được đánh giá trong phòng thí nghiệmchủ yếu thông qua kiểm định hàm lượng kháng nguyên Vi Theo WHO, tất cảcác quy trình kiểm định đều phải được xây dựng dựa trên tính khả thi và tínhkhoa học, nghĩa là phải thẩm định quy trình trước khi áp dụng chính thức[44] Trong quá trình áp dụng, khi có sự thay đổi của các yếu tố tham gia vàoquy trình (thay đổi kỹ thuật, thay đổi nguyên liệu đầu vào, thay đổi trang thiếtbị, dụng cụ…), thì quy trình phải được tiến hành thẩm định lại Việc thẩmđịnh lại có thể là thẩm định toàn phần hay thẩm định một phần

Quy trình xác định hàm lượng kháng nguyên Vi có trong vắc xin thương

hàn Vi được tiến hành dựa trên kỹ thuật điện di miễn dịch tên lửa (Rocket immunoelectrophoresis), đây là phương pháp đã có trong dược điển Việt Nam

xuất bản lần thứ IV (DĐVN IV) [18] Quy trình này đã được thẩm định vàthực hiện tại khoa Kiểm định vắc xin Vi khuẩn, Viện Kiểm định Quốc giaVắc xin và Sinh phẩm Y tế từ năm 2000 [28] Tuy vậy, việc thẩm định quytrình này trước đây chưa đầy đủ, chưa đánh giá độ mạnh và độ đặc hiệu của

Trang 2

quy trình Mặt khác, bộ nguồn sử dụng trong quy trình điện di được xác lậpqua thẩm định quy trình trước đây có hiệu điện thế đầu ra được cài đặt bằngnút điện tử, luôn ổn định ở mức 86 V, bộ nguồn này nay đã hỏng Bộ nguồnthay thế mới có hiệu điện thế đầu ra được cài đặt bằng nấc cơ học nên chỉ sốvôn kế đầu ra luôn giao động, nằm ngoài khoảng hiệu điện thế đã thẩm địnhtrước Hoạt động của bộ nguồn mới này có đáp ứng với quy trình, cho kết quảkiểm định có độ tin cậy cao hay không thì phải được thẩm định, nên nhómnghiên cứu thực hiện thẩm định lại quy trình trên bộ nguồn mới, với tất cả cácthông số cần thiết của quy trình.

Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài:

Thẩm định quy trình xác định hàm lượng kháng nguyên Vi trong vắc xin thương hàn Vi tại Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế.

Với mục tiêu cụ thể như sau:

- Đánh giá độ tuyến tính và vùng tuyến tính (Linearity & Range);

- Đánh giá độ đúng (Accuracy);

- Đánh giá độ chính xác (Precision);

- Đánh giá độ mạnh (Robustness);

- Đánh giá độ đặc hiệu (Specificity).

Trang 3

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Thẩm định quy trình

1.1.1 Khái niệm về phương pháp, quy trình

1.1.1.1 Phương pháp

* Khái niệm: Phương pháp là trình tự logic của các thao tác được mô tả một

cách tổng quát để thực hiện phép đo [1]

* Phân loại phương pháp: Phòng thí nghiệm thường sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, dựa vào nguồn gốc có thể phân loại phương pháp như sau

[10]:

+ Phương pháp tiêu chuẩn: Được ban hành bởi các tổ chức tiêu chuẩn quốc

gia hoặc quốc tế, khu vực, bộ, ngành, hiệp hội khoa học có uy tín Phươngpháp tiêu chuẩn được thừa nhận và chấp nhận ở phạm vi quốc gia hoặc quốctế

Để xây dựng phương pháp tiêu chuẩn, tổ chức viết tiêu chuẩn cần thu thập,thống kê, phân tích các kết quả thu được từ các phòng thử nghiệm khác nhauđể thiết lập các dữ liệu về độ đúng, độ chính xác, độ không đảm bảo đo Các

dữ liệu này được soát xét và cập nhật dựa trên cơ sở các ý kiến phản ánh củanhững người thực hiện

Phương pháp tiêu chuẩn còn được sử dụng để so sánh các kết quả thửnghiệm trên mẫu thử đồng nhất từ các phòng thí nghiệm khác nhau

Do sự cẩn thận trong việc xây dựng và sửa đổi cho tiêu chuẩn của tổ chứcviết tiêu chuẩn hoặc chậm chễ trong quá trình xem xét nên đôi khi phươngpháp tiêu chuẩn bị lỗi thời

+ Phương pháp đã được công bố: Được ban hành bởi cơ sở, nhà sản xuất

thiết bị Thường xây dựng trong các phòng thí nghiệm riêng lẻ

Phương pháp đã được công bố thường gần với công nghệ hiện đại, gần vớinhu cầu của phòng thí nghiệm Tuy nhiên, các bước thực hiện đôi khi thiếu sự

Trang 4

thảo luận kỹ lưỡng từ nhiều phòng thí nghiệm khác nhau, nên dữ liệu về độđúng, độ chính xác thường không có sẵn hoặc không đủ độ tin cậy.

+ Phương pháp nội bộ: Do phòng thí nghiệm tự xây dựng, đáp ứng nhu cầu

của phòng thí nghiệm và sử dụng các nguồn lực hiện có, phù hợp nhiệm vụhoặc loại mẫu cụ thể

Phương pháp nội bộ thường ít tốn kém, dễ xem xét và cập nhật Tuy nhiên,phương pháp này thường không được so sánh kết quả thử nghiệm giữa cácphòng thí nghiệm, nên ít được chấp nhận trên bình diện quốc gia cũng nhưquốc tế

Trong quá trình sử dụng, ưu tiên sử dụng phương pháp đã được ban hành dưới hình thức là tiêu chuẩn quốc tế, quốc gia hoặc khu vực.

1.1.1.2 Quy trình

* Khái niệm: Quy trình là các thao tác được mô tả chi tiết để thực hiện một

phép đo cụ thể theo một phương pháp đã chọn [1]

Thực hiện theo quy trình nhằm thực hiện một việc gì đó theo một trình tự nhất quán Để xây dựng quy trình, người ta cần liệt kê các bước thực hiện chi

tiết, theo trình tự nhất định, đặc biệt là các yếu tố gây ảnh hưởng đến kết quảcần được quy định rõ ràng

Thẩm định quy trình phân tích (Validation of Analytical Procedures) là

một phần không thể thiếu nếu muốn có một kết quả phân tích đáng tin cậy,được công nhận Hiện nay có nhiều thuật ngữ khác nhau sử dụng để chỉ kháiniệm trên như: định trị quy trình, đánh giá quy trình, xác nhận giá trị sử dụngcủa quy trình, phê duyệt quy trình Tất cả thuật ngữ này đều là cách gọi khácnhau của “thẩm định quy trình”

1.1.2 Khái niệm về thẩm định và các loại thẩm định

1.1.2.1 Khái niệm về thẩm định quy trình

Thẩm định quy trình là đánh giá các yếu tố tham gia vào quy trình để xem

có phù hợp với mục đích đặt ra và thích hợp trong điều kiện hiện có hay

Trang 5

không Thẩm định quy trình được thực hiện trong các điều kiện thực, nghĩa là

các hoạt động diễn ra tương tự các hoạt động thường xuyên trong quá trìnhlàm việc hàng ngày

Thẩm định một quy trình phải được khẳng định bằng việc kiểm tra và cungcấp các bằng chứng khách quan xem các yêu cầu sử dụng quy trình đó đãđược thực hiện và cho kết quả tin cậy hay không

Trước khi thẩm định, cần xác nhận các yếu tố tham gia vào quy trình cótheo nguyên tắc của GMP (các yếu tố này là các thủ tục, con người, mẫuchuẩn, hóa chất, chất thử, máy móc…) hay không Các yếu tố tham gia vàoquá trình thẩm định quy trình đều phải đạt tính ổn định cao

Có rất nhiều loại quy trình trong các hoạt động sản xuất, kiểm định chấtlượng vắc xin cần được thẩm định: thẩm định quy trình vệ sinh, thẩm địnhquy trình tiệt trùng, thẩm định quy trình đóng ống, thẩm định quy trình xétnghiệm,…

Theo ISO/IEC 17025: Thẩm định qui trình xét nghiệm là việc khẳng địnhbằng kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan rằng các thông số cần xácđịnh cho việc sử dụng một qui trình cụ thể đã đạt yêu cầu hay chưa [10], [2].Theo WHO: Thẩm định qui trình xét nghiệm là quá trình thiết lập một hoặc

nhiều hơn các đặc tính: Độ đúng (Accuracy), độ chính xác (Precision), độ tuyến tính (Linearity), vùng tuyến tính (Range), độ đặc hiệu (Specificity), giới hạn phát hiện (Limit of Detection), giới hạn định lượng (Limit of Quantitation), độ mạnh (Robustness) phù hợp với từng qui trình [42].

1.1.2.2 Các loại thẩm định [22], [30], [38], [40].

* Tiền thẩm định

Trong một số trường hợp cần phải thẩm định trước (tiền thẩm định) để xácđịnh các điều kiện phù hợp nhất cho quá trình thẩm định

Trang 6

* Thẩm định toàn phần (Full Validation)

Thẩm định toàn phần là xem xét và đánh giá một cách khoa học tất cả cácthông số phù hợp của quy trình

Loại thẩm định này được áp dụng khi:

- Quy trình thực hiện theo phương pháp thử nội bộ hoặc phương pháp

cũ nhưng có một số thay đổi

- Phát hiện sự không ổn định của quy trình đã phê duyệt

- Quy trình có thay đổi hoặc sử dụng ngoài phạm vi so với phươngpháp tiêu chuẩn

- Quy trình thực hiện theo phương pháp do nhà sản xuất cung cấp hoặcđăng trong tạp chí khoa học

- Quy trình thực hiện theo phương pháp do các bộ, ngành, tổ chức kỹthuật ban hành mà chưa có thông tin chi tiết về tính khoa học của phươngpháp

* Thẩm định một phần (Partial Validation)

Thẩm định một phần là xem xét và đánh giá một hay nhiều thông số cầnxác định phù hợp với quy trình

Loại thẩm định này được áp dụng khi:

- Quy trình thực hiện theo phương pháp đã có trong Dược điển

- Quy trình thực hiện theo phương pháp đã có trong tiêu chuẩn quốc gia

* Tái thẩm định (Revalidation)

Loại thẩm định này được áp dụng khi quy trình đã được thẩm định có sựthay đổi:

- Thay đổi phần mềm

- Thay đổi vị trí đặt máy

- Thay đổi nguyên liệu đầu vào

- Thay đổi kỹ thuật

- Thay đổi trang thiết bị, dụng cụ

Trang 7

Quá trình tái thẩm định có thể là toàn phần hay một phần tùy theo sự đánhgiá mức độ ảnh hưởng của sự thay đổi.

Quy trình sau khi được thẩm định được viết thành SOP (quy trình chuẩn)để thực hiện thường quy

1.1.3 Các thông số cần xác định trong thẩm định quy trình xét nghiệm

Quy trình xét nghiệm mà trong đó thực hiện các phép thử phân tích gọi là

quy trình phân tích (Analytical Procedures) Thẩm định quy trình phân tích là

việc xác định, đánh giá một hoặc nhiều chỉ tiêu: độ đúng, độ chính xác, độtuyến tính và vùng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ đặchiệu và độ mạnh phù hợp với từng quy trình và từng loại thẩm định [10], [22],[32], [35], [36], [38], [39], [40], [42]

1.1.3.1 Độ đúng (Accuracy)

Độ đúng của một quy trình biểu diễn mức độ gần gũi giữa giá trị tìm thấysau thử nghiệm với giá trị thực hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận Để xácđịnh được độ đúng của phương pháp, mẫu thử phải là mẫu chuẩn đã biết trướcgiá trị

Độ đúng được biểu thị dưới dạng phần trăm (%) của chất chuẩn (thu được

sau thử nghiệm) hoặc độ chệch (bias) giữa kết quả thu được với giá trị thực

hoặc sự khác biệt giữa giá trị trung bình thu được và giá trị thực được chấpnhận cùng với khoảng tin cậy cho phép Giá trị % càng lớn thì độ đúng củaquy trình càng cao Ngược lại, độ chệch càng bé thì độ đúng của quy trìnhcàng cao

1.1.3.2 Độ chính xác (Precision)

Trong nhiều trường hợp, các phép thử nghiệm trên những đối tượng giốngnhau với những điều kiện khác nhau thường không cho kết quả giống nhau,điều này do sai số ngẫu nhiên của mỗi quy trình gây ra, người ta không thểkiểm soát được hoàn toàn tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thử

Trang 8

nghiệm, do đó cần đánh giá độ chính xác Độ chính xác chỉ phụ thuộc vào saisố ngẫu nhiên và không liên quan đến giá trị thực.

Độ chính xác là giá trị gần nhất giữa nhiều lần đo khi được thực hiện trêncác mẫu thử đồng nhất với cùng phương pháp

Độ chính xác bao gồm:

+ Độ lặp lại (Repeatability)

Thực hiện thử nghiệm trong cùng một phòng xét nghiệm, cùng người thaotác và sử dụng cùng một thiết bị, hóa chất trong khoảng thời gian ngắn

+ Độ chính xác trung gian (Intermediate precision)

Diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một phòng xét nghiệm đượcthực hiện ở các ngày khác nhau, kiểm nghiệm viên khác nhau hoặc các thiếtbị, hóa chất khác nhau

+ Độ tái lặp (Reproducibility)

Thực hiện thử nghiệm trong các phòng xét nghiệm khác nhau, thườngđược áp dụng để tiêu chuẩn hóa phương pháp hoặc đánh giá năng lực mộtphòng thí nghiệm

Độ chính xác là khái niệm định tính và được biểu thị định lượng bằng độlệch chuẩn (Standard Deviation / SD) hay hệ số biến thiên ( Coefficient of Variation/ CV) Độ chính xác càng cao thì độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiêncàng nhỏ

Như vậy, độ chính xác có thể coi là độ “chụm” các kết quả tìm được củamẫu thử, tâm hình tròn là giá trị đúng với giá trị thật của mẫu Ta có sơ đồminh họa độ đúng và độ chính xác như sau:

Trang 9

Không đúng, không chính xác Không đúng nhưng chính xác

Tương đối đúng, không chính xác Đúng và chính xác

Hình 1.1: Minh họa độ đúng và độ chính xác

1.1.3.3 Độ tuyến tính và vùng tuyến tính

* Độ tuyến tính (Linearity): Là đường thẳng biểu diễn sự tương quan giữa

giá trị trực tiếp đo được và nồng độ chất phân tích trong mẫu Chúng tươngquan với nhau theo dạng phương trình y = ax + b, thông thường biến độc lập(nồng độ chất phân tích trong mẫu) được ký hiệu bằng chữ “x”, biến phụthuộc (giá trị trực tiếp đo được) được ký hiệu bằng chữ “y” Đến một nồng độ(thấp nhất và cao nhất) nào đó, giá trị đo được này không tuân theo phươngtrình trên nữa, nghĩa là nồng độ chất phân tích và giá trị trực tiếp đo đượckhông còn mối tương quan tuyến tính với nhau và nằm ngoài vùng tuyến tính

* Vùng tuyến tính (Range): Là khoảng giữa nồng độ thấp nhất và cao nhất

của chất phân tích được xác định với mức độ chấp nhận về độ đúng, độ chínhxác, mà vẫn còn có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ của chất phân tíchvới giá trị trực tiếp đo được Việc xác định vùng tuyến tính thường bắt đầu từgiới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểmcao nhất) Trong thực tế, không nhất thiết phải xác định toàn bộ vùng tuyến

Trang 10

tính mà có thể xây dựng các đường chuẩn ngắn, phủ được vùng nồng độthường dùng của mẫu Nồng độ trong mẫu không được vượt ra ngoài giới hạncao nhất hoặc thấp nhất của đường chuẩn, tốt nhất nằm ở khoảng giữa đườngchuẩn.

Độ tuyến tính và vùng tuyến tính cần đưa ra các dữ liệu sau: Phương trìnhhồi quy đơn biến (y = ax + b) và hệ số tương quan (r)

1.1.3.4 Độ đặc hiệu (Specificity/Selectivity)

Có nhiều định nghĩa khác nhau về độ đặc hiệu Theo WHO, áp dụng trongkiểm định vắc xin, độ đặc hiệu là khả năng xác định được chất cần tìm cótrong mẫu thử khi có mặt các thành phần khác: tá dược, tạp chất,… [42]

1.1.3.5 Độ mạnh (Robustness)

Là khả năng duy trì được các thông số phù hợp mà cho kết quả đạt yêucầu, cung cấp những dấu hiệu ở mức tin cậy trong quá trình sử dụng bìnhthường Độ mạnh đánh giá qua sự tái lặp kết quả thu được bằng cách phântích các mẫu giống nhau với nhiều thay đổi nhỏ, nhưng có chủ ý so với điềukiện chuẩn của các thành phần tham gia vào thử nghiệm (phòng thí nghiệmkhác nhau, kỹ thuật viên khác nhau, dụng cụ, trang thiết bị khác nhau, thuốcthử khác lô, khác nhau về nhiệt độ, thời gian thử…)

Nếu điều kiện trong quá trình đo dễ bị biến đổi trong quá trình thựcnghiệm ảnh hưởng đến kết quả đo, thì các điều kiện này cần được kiểm soátphù hợp và có biện pháp phòng ngừa

1.1.3.6 Giới hạn phát hiện (LOD – Limit of Detection)

Là lượng mẫu nhỏ nhất mà một quy trình kỹ thuật có thể phát hiện đượcnhưng không định lượng được giá trị thực của nó Giá trị này càng nhỏ thìquy trình (phương pháp) càng “nhạy”

1.1.3.7 Giới hạn định lượng (LOQ – Limit of Quantitation)

Là lượng mẫu nhỏ nhất mà một quy trình kỹ thuật có thể định lượng đượcvới điều kiện thỏa mãn độ đúng, độ chính xác thích hợp Xác định LOQ bằng

Trang 11

cách pha loãng mẫu chuẩn thành nhiều nồng độ khác nhau, sau đó xác địnhnồng độ tối thiểu mà quy trình này có thể định lượng được với độ đúng và độchính xác theo yêu cầu Cũng giống như giới hạn phát hiện, giá trị này càngnhỏ thì quy trình (phương pháp) càng “chính xác”.

x: Nồng độ chất cần phân tích

y: Giá trị trực tiếp đo được

Theo WHO/VSQ/97.02 (2004), những quy trình và các chỉ số tươngứng cần thực hiện trong thẩm định quy trình như sau:

-Bảng 1.1: Các thông số cần xác định trong thẩm định quy trình

(-): Các chỉ tiêu này thông thường không cần phải đánh giá

(+): Các chỉ tiêu này cần phải đánh giá

Trang 12

Tùy vào từng loại quy trình mà áp dụng bảng hướng dẫn trên để thiết lậpcác thông số phù hợp cho một mục đích thẩm định cụ thể.

1.2 Bệnh thương hàn và vắc xin thương hàn Vi

1.2.1 Bệnh thương hàn

1.2.1.1 Tình hình bệnh thương hàn trên thế giới và Việt Nam

Thương hàn là bệnh truyền nhiễm cấp tính gây thành dịch, phát tán rầm rộ,

do vi khuẩn S typhi, S paratyphi A, S paratyphi B, S paratyphi C gây ra Vi

khuẩn này được Eberth (Đức) phân lập vào năm 1880 khi ông tìm thấy chúngtrong lách và tủy xương các tử thi chết vì thương hàn Do đó nó còn có tênkhác là trực khuẩn Eberth [16]

Trước thế kỷ 19, thương hàn bị nhầm lẫn với bệnh sốt do Rickettsia Năm

1779, Hauxhmann nhận thấy ở một số người mắc bệnh về đường tiêu hóa cóbiểu hiện sốt kéo dài và ảnh hưởng đến hệ thần kinh Năm 1804, Prost vàRetit Serres phát hiện vết loét ở ruột non những bệnh nhân có biểu hiện sốtnhư trên [6]

Năm 1829, Louis tách bệnh thương hàn khỏi những người bị sốt donguyên nhân khác trên cơ sở tổn thương giải phẫu bệnh ở ruột, hạch mạc treovà lách Đồng thời ông cũng mô tả bệnh cảnh lâm sàng với các dấu hiệu đặctrưng: thủng ruột, xuất huyết tiêu hóa [6], [17]

Năm 1850, Jenner phân biệt thương hàn qua tổn thương giải phẫu bệnh lýmảng Peyer và hạch lympho mạc treo Năm 1873, Budd chứng minh thươnghàn có thể lây theo đường thức ăn, nước uống, các sản phẩm bơ, sữa… Đếnnăm 1896, Pfeiffer và Kalle lần đầu tiên sản xuất được vắc xin chết từ vikhuẩn thương hàn bất hoạt bằng nhiệt độ Vắc xin này được sử dụng chongười, đồng thời được đánh giá hiệu lực và khả năng bảo vệ bằng đáp ứngmiễn dịch chủ động trên lợn rừng [6]

Từ năm 1930, Reilly cho rằng bệnh thương hàn là một tình trạng nhiễmđộc – nhiễm khuẩn và nội độc tố đóng vai trò quyết định các dấu hiệu lâm

Trang 13

sàng và biến chứng [5], [17] Ông cùng với một cộng sự người Việt Nam bác sĩ Phạm Hữu Chí, năm 1935 chứng minh vai trò của hệ thần kinh thực vậtdưới tác động của nội độc tố trực khuẩn thương hàn, trong cơ chế hình thànhmột số tổn thương bệnh lý của bệnh thương hàn như loét mảng Peyer, thủngvà chảy máu ruột, nhiễm trùng mật… [9], [16]

-Năm 1948, Theodore Woodward là người đầu tiên điều trị thành côngbệnh thương hàn ở Malaysia bằng Chloramphenicol, đánh dấu bước ngoặt lớntrong điều trị bệnh thương hàn [3], [4]

Thương hàn là bệnh lây qua đường tiêu hóa Người bị nhiễm bệnh do ăn,uống phải thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn WHO ước tính, hằng năm trêntoàn cầu có khoảng 21 triệu trường hợp mắc bệnh thương hàn, trong đó 1 –4% chết vì bệnh thương hàn (216.000 – 600.000 người), chủ yếu là trẻ em độtuổi đi học, 90% ca tử vong là ở châu Á Tổ chức Y tế thế giới đặt thương hànvào loại bệnh truyền nhiễm quan trọng, bệnh lây lan nhiều nhất ở độ tuổi từ 5

- 19 tuổi [29], [41] Các hiện tượng như sự gia tăng dân số, thiên tai cùng vớihệ thống y tế thấp kém ở những nước chậm phát triển, đang phát triển,… đặc

biệt là tình trạng vi khuẩn Salmonella typhi kháng kháng sinh là nguyên nhân

gia tăng số người mắc bệnh thương hàn trong phần lớn các dịch thương hàn

Chủng S typhi đề kháng với Ciprofloxacin lần đầu tiên được báo cáo năm

2005 tại Karachi (Pakistan) sau đó ở India và các nước châu Phi [41]

Sự đa kháng thuốc (Multidrug-resistant/MDR) của S typhi góp phần gây

ra dịch bệnh và đại dịch Hơn 80% các chủng Salmonella typhi từ đồng bằng

sông Cửu Long của Việt Nam đề kháng với ampicillin, chloramphenicol, acidnalidixic, ciprofloxacin [45] Trong những năm đầu thập niên 90 của thế kỷ

XX, sự bùng phát dịch bệnh thương hàn gây ra do những chủng vi khuẩnkháng fluoroquinolones đã xảy ra ở Tajikistan và Việt Nam [29]

Ở Việt Nam, trong “Luật phòng, chống bệnh truyền nhiễm”, bệnh thươnghàn xếp vào nhóm bệnh lây truyền nhóm B, lấy phòng bệnh là chính trong đó

Trang 14

có thông tin, giáo dục, truyền thông, giám sát bệnh truyền nhiễm, tiêm phòngvắc xin kết hợp các biện pháp chuyên môn kỹ thuật y tế trong phòng, chốngbệnh truyền nhiễm [14].

Theo thống kê của Bộ Y tế, số mắc thương hàn ở trẻ em năm 2008 là1.316 trẻ, năm 2009 con số này có giảm, còn 823 trẻ mắc thương hàn, nhưng

tỷ lệ chết không thay đổi Theo số liệu tổng hợp của Tổng cục Thống kê, năm

2011, cả nước có 664 trường hợp mắc bệnh thương hàn [8]

1.2.1.2 Tác nhân gây bệnh

* Đặc điểm sinh học của Salmonella

Salmonella là một trong những chi quan trọng, thuộc họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae), là trực khuẩn Gram âm, không sinh nha bào, có nhiều lông xung quanh thân (trừ S gallinarum và S pullorum) Trực khuẩn

thương hàn có kích thước trung bình dài 2 - 3 µm, đường kính 0,5 – 1,0 µm,là vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy ngộ, phát triển được trên các môi trường nuôi cấythông thường và có thể mọc trên một số môi trường có chất ức chế chọn lọcnhư DCA (deoxycholate) và XLD (xylose lysine deoxycholate), dùng trongphân lập vi khuẩn

Trên tiêu bản nhuộm từ nuôi cấy thuần, Salmonella thường đứng rời rạc,

riêng rẽ, hay từng đôi, ít khi từng đám Trong môi trường nuôi cấy ở 370Cchúng đứng gần nhau Ở giai đoạn phân chia, chúng xếp thành chuỗi ngắn từ

3 đến 4 tế bào hay xếp thành từng cặp một cách ngẫu nhiên

Hình 1.3: S typhi chụp qua kính hiển vi điện tử (2.450X)

(nguồn Sciencephotolibrary)

Trang 15

* Đặc điểm sinh hóa của Salmonella

Salmonella không lên men lactose, lên men đường glucose thường sinh

hơi và sử dụng được citrat ở môi trường Simmons Phản ứng catalase (+),oxidase (-), lysin decarboxylase (+), urease (-), H2S thường (+)

Tuy nhiên không phải bất kỳ loài Salmonella nào cũng có đầy đủ các tính chất trên Những ngoại lệ đã được xác định và có giá trị phân biệt cao là: S typhi lên men đường glucose không sinh hơi và citrat Simmons (-) [16].

* Kháng nguyên [13], [16], [26]

Salmonella có ba loại kháng nguyên chính, bao gồm:

+ Kháng nguyên thân (KN O), có ở tất cả các Salmonella.

+ Kháng nguyên lông (KN H), có ở đa số các Salmonella, trừ một số ít Salmonella không di động.

+ Kháng nguyên vỏ (KN Vi), chỉ có ở S typhi và S paratyphi C.

Hình 1.4: Minh họa cấu trúc kháng nguyên của Salmonella

Màng nguyên sinh chất

Trang 16

 Kháng nguyên O

Kháng nguyên O (Ohne Hauck – tiếng Đức), có bản chất là

lipopolysaccharide (LPS) Đây chính là nội độc tố của vi khuẩn, chỉ được giảiphóng ra khi vi khuẩn bị phá hủy LPS bao gồm 3 phần: chuỗi bên đặc hiệu

O, nhân cơ bản polysaccharide và lipid A Hàm lượng lipid và polysaccharidetương đương nhau [7]

Kháng nguyên O mang tính đặc hiệu nhóm Tính chất đặc hiệu nhómcủa nó dựa trên cấu trúc của đường trong thành phần polysaccharide củaliposaccharide thành tế bào: phần đa đường có hoạt tính kháng nguyên cao docó chứa các nhóm quyết định kháng nguyên, thành phần protein trong cấutrúc làm cho phức hợp có tính kháng nguyên và lipid A đóng vai trò nội độctố, ức chế bổ thể

Kháng nguyên O có tính bền vững cao, không bị phá huỷ dưới tác dụngcủa cồn, acid phenic và cả ở nhiệt độ 1000C /2 giờ 30 phút [7], [13]

 Kháng nguyên H

Kháng nguyên H (Hauck – tiếng Đức), có bản chất là protein, được

cấu tạo từ 14 loại axít amin khác nhau (không chứa tryptophan, histidin,cystein)

Các Salmonella có lông đều có kháng nguyên H Các Salmonella không có lông (S gallinarum và S pullorum) thì không có kháng nguyên H

[16], [26]

Kháng nguyên H có thể có hai pha [16]:

+ Pha 1 (pha đặc hiệu) có các týp huyết thanh được kí hiệu bằng cácchữ cái a, b, c, d…

+ Pha 2 (pha không đặc hiệu) có thể ở một số týp huyết thanh, đượcđánh dấu bằng các chữ số nguyên: 1, 2, 3, 4

Kháng nguyên H dễ bị phá hủy ở 1000C trong 150 phút, cồn 50% vàphenol, bền với formol 0,5% [13]

Trang 17

 Kháng nguyên Vi

Kháng nguyên Vi (Virulence) là kháng nguyên bề mặt hay còn gọi là kháng nguyên K (Kapsul – tiếng Đức), là lớp rất mỏng ngoài cùng (lớp vỏ) của vi khuẩn Salmonella, bao bọc xung quanh kháng nguyên O Kháng nguyên Vi không tham gia vào việc gây bệnh và chỉ có ở S typhi và S paratyphi C [16], [26].

Kháng nguyên Vi của S typhi có khối lượng phân tử từ 100 – 3000

kDa [37], bản chất hóa học là polysaccharide (PS), một polyme mạch thẳngvới đơn phân là 1, 4 (2 deoxy)-2-N-acetyl galactouronic acid có nhóm O-acetyl ở C3 [33], [37],[43]

Hình 1.5: Sơ đồ minh họa cấu trúc hóa học của kháng nguyên Vi

Trong đó:

. : Nhóm CH3

Ac: nhóm Acetyl (CO – CH3)

Nhóm O-acetyl (mũi tên)

Kháng nguyên Vi cản trở quá trình thực bào, có khả năng chống lại tácđộng của bổ thể trong huyết thanh Kháng nguyên Vi được coi là một trongcác yếu tố độc lực và là chất sinh miễn dịch có tính bảo vệ [13], [16], [26]

Trang 18

Đối với S typhi, kháng nguyên Vi là một trong các yếu tố bám dính, đó là

bước quan trọng đầu tiên trong quá trình tương tác giữa tác nhân gây bệnh và

vật chủ Kháng nguyên Vi còn bảo vệ vi khuẩn chống lại sự thực bào bằngcách không cho các kháng thể tạo hiện tượng opsonin hóa trên vách vi khuẩn

Do không có hiện tượng opsonin hóa nên các đại thực bào và bạch cầu trungtính tiếp cận kém hoặc không thể tiếp cận được vi khuẩn

Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên Vi liên quan đến kích thước phân

tử O-acetyl, kích thước phân tử càng lớn, tính sinh miễn dịch càng cao O–

acetyl là phần quyết định kháng nguyên (epitope) quan trọng của kháng

nguyên Vi, nhóm O-acetyl kết hợp đặc hiệu với kháng thể kháng Vi trongphản ứng KN-KT [34]

Ngoài ra, khả năng sinh miễn dịch còn tuỳ thuộc vào mức độ O–acetylhoá Trong trường hợp kháng nguyên là polysaccharide, các nhánh chuỗi O– acetyl thông qua cầu glycosit sẽ tạo ra cấu trúc không gian ba chiều củaepitope Việc loại từng phần nhóm O-acetyl làm giảm khả năng sinh miễndịch Khi loại hoàn toàn nhóm này thì kháng nguyên Vi mất khả năng sinhmiễn dịch [13], [34], [37]

1.2.1.3 Dịch tễ học

Thương hàn là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây bằng đường tiêu hóa.Người bị bệnh do ăn uống phải thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn, nên dễtạo thành dịch Biểu hiện lâm sàng là hội chứng nhiễm khuẩn, nhiễm độc toànthân, kèm theo tổn thương bệnh lý đặc hiệu ở đường tiêu hóa [9]

Bệnh xảy ra quanh năm, không phân bố theo mùa hay theo tháng Tuynhiên trong thực tế, bệnh thương hàn thường xảy ra vào mùa hè (khoảng từtháng 6 đến tháng 9)

Bệnh có thể xảy ra ở bất kỳ ai vào bất kỳ độ tuổi nào Một số, số liệuthống kê cho thấy bệnh thường xảy ra ở những người trong khoảng tuổi từ 15đến 30 tuổi Nguyên nhân là những người ở độ tuổi này thường là những

Trang 19

người đi làm, sống và lao động trong những nơi có điều kiện vệ sinh bất lợi:uống nước lã, ngâm mình dưới ao, hồ nước bẩn,…[15].

Người bệnh là nguồn bệnh quan trọng Người bệnh có thể lây cho ngườikhác ngay trong thời kỳ ủ bệnh từ chất thải: phân, chất nôn, nước tiểu, Người khỏi bệnh mang vi khuẩn, sau khi hết các triệu chứng lâm sàng, đa sốngười khỏi bệnh vẫn đào thải vi khuẩn ra môi trường bên ngoài trong 2 - 3tuần Khoảng 2% - 20% người bệnh vẫn có thể thải vi khuẩn ra môi trường 2đến 3 tháng sau khi hết các triệu chứng lâm sàng

S typhi có thể sống vài tuần trong nước, nước đá, bụi, nước thải khô và

trên đồ vải nhưng sống trong nước thải chưa đến 1 tuần Vi khuẩn cũng có thểsống và nhân lên trong sữa và các sản phẩm sữa mà không thay đổi tính chấtsữa Đồ ăn có thể bị nhiễm trực tiếp qua nước rửa hoặc khi chế biến do ngườimang vi khuẩn, qua bụi và có thể qua ruồi[11].

Do ăn phải thực phẩm, uống nước bị nhiễm khuẩn không được nấu chíndẫn đến nhiễm bệnh, đây là đường lây quan trọng và thường gây dịch lớn Dotiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân, người mang vi khuẩn qua chất thải, chân,tay, đồ dùng bị nhiễm khuẩn,… đường lây này thường gây dịch nhỏ, tản phát[9], [15]

1.2.1.4 Bệnh sinh

Bệnh thương hàn xuất hiện phụ thuộc vào số lượng, độc lực của vi khuẩn

và đáp ứng miễn dịch của cơ thể chủ Hàm lượng vi khuẩn Salmonella từ 106

-109 CFU/ml mới gây bệnh

Trang 20

Hình 1.6: Minh họa con đường xâm nhập của S typhi

S typhi gây bệnh thương hàn qua 3 giai đoạn [9]:

* Giai đoạn 1 (thời kỳ nung bệnh)

Vi khuẩn thương hàn qua đường tiêu hóa đến dạ dày Tại đây một số vikhuẩn bị tiêu diệt bởi độ toan của dịch vị, số còn lại xuống ruột non Tại ruộtnon một phần vi khuẩn tiếp tục bị tiêu diệt bởi IgA tiết, số còn lại bám vào vinhung mao của thành ruột, sau 24 – 72 giờ chui qua niêm mạc ruột vào cáchạch mạc treo, theo đường bạch huyết đến mảng Payer và phát triển ở đókhoảng 15 ngày Từ đó, vi khuẩn đi vào các nang lympho ruột và hệ thốnghạch mạc treo rồi theo đường máu (vào máu lần thứ nhất) và đi khắp cơ thể.Trong quá trình này, vi khuẩn có thể xâm nhập vào bất cứ các cơ quan tổchức nào, hay gặp nhất là ở gan, lách, tủy xương, túi mật Tại đây chúng bịcác đại thực bào bắt giữ và nhân lên tại đó, nhưng chưa gây ra bệnh cảnh lâmsàng cũng như biến đổi rõ rệt chức năng của các cơ quan

* Giai đoạn 2 (thời kỳ khởi phát)

Sau thời gian phát triển ở hạch mạc treo và vào máu lần thứ nhất, mộtsố vi khuẩn đã lan truyền khắp cơ thể theo đường máu Từ trong máu vikhuẩn xâm nhập vào gan, theo đường mật tới túi mật và tăng sinh tại đó, sau

Trang 21

đó xuống hệ tiêu hóa, rồi lại xâm nhập vào máu lần 2 Khi số lượng đủ lớn, vikhuẩn vào máu gây ra triệu chứng lâm sàng ở giai đoạn khởi phát.

* Giai đoạn 3 (giai đoạn toàn phát)

Các vi khuẩn bị tiêu diệt giải phóng nội độc tố Chính nội độc tố của vikhuẩn thương hàn đóng vai trò quyết định các dấu hiệu lâm sàng như: li bì,rối loạn nhiệt độ và một số tổn thương ở ruột…Nặng hơn bệnh nhân có thểhôn mê, trụy tim mạch, thủng ruột non, đây là biến chứng nặng thường gây tửvong

+ Vắc xin sống giảm độc lực (sản xuất từ chủng S typhi Ty21a).

+ Vắc xin Vi-capsulepolysaccharide (Vi-CPS) (sản xuất từ KN thương hàn Vi)

+ Vắc xin cộng hợp (sản xuất từ kháng nguyên thương hàn Vi cộng hợpprotein tái tổ hợp)

1.2.2 Vắc xin thương hàn Vi

1.2.2.1 Vai trò của vắc xin thương hàn Vi

Bệnh thương hàn lây qua đường tiêu hóa, vì vậy miễn dịch tại chỗ đóngvai trò quan trọng chống lại mầm bệnh ở ruột Lớp IgA tiết có vai trò quan

Trang 22

trọng trong miễn dịch ruột, mảng Payer là nơi chứa nhiều các tế bào tiền thâncủa IgA

Vắc xin thương hàn sống dùng theo đường uống có khả năng gây miễndịch mạnh do có sự hiện diện thường xuyên và lặp lại của kháng nguyên Tuynhiên cần phải uống nhắc lại nhiều lần nên khó có thể áp dụng rộng rãi trongcộng đồng Mặt khác, trong quá trình sản xuất vi khuẩn thương hàn phải quacác khâu lên men, đông khô nên dễ thay đổi về mặt di truyền thường dẫn đếngiảm khả năng tổng hợp kháng nguyên Vi nên chất lượng vắc xin khó đảmbảo

Kháng nguyên Vi được cho là một yếu tố độc và là chất sinh miễn dịch, vìvậy ngày nay người ta đã sử dụng những chủng giàu kháng nguyên Vi trongsản xuất vắc xin Việc tạo miễn dịch thành công bằng polysaccharid vỏ Vitinh chế tạo ra hướng sản xuất mới cho việc sản xuất vắc xin thương hàn Vi.Hiệu quả bảo vệ của vắc xin thương hàn Vi dựa trên miễn dịch dịch thể

Khi nghiên cứu với hàm lượng kháng nguyên Vi ở mức 25 g ViPs/liều và

50 g ViPs/liều, người ta thấy ở cả hai hàm lượng đều có sự tăng lượngkháng thể trong huyết thanh gấp 4 lần hoặc cao hơn ở 95% người lớn ở Phápvà Hoa Kỳ [13] Năm 1985, người ta tiến hành thực địa bằng phương phápmù kép và ngẫu nhiên, có đối chứng, dùng vắc xin thương hàn Vi của ViệnPasteur Merieux, ở Nepan, đông Transvaal, Nam Phi với liều kháng nguyên

Vi 25 g ViPs Kết quả cho thấy kháng thể Vi trong huyết thanh tăng gấp 4lần hoặc cao hơn so với trước khi tiêm ở khoảng 75% người nhận Vì thế, cácnhà sản xuất đã lấy hàm lượng này là tiêu chuẩn cho một liều vắc xin thươnghàn Vi

1.2.2.2 Sản xuất vắc xin thương hàn Vi

Hiện nay, vắc xin thương hàn Vi polysaccharide được sản xuất trên dây

chuyền công nghệ sinh học hoàn chỉnh, tinh chế từ vỏ của Salmonella typhi

Ty2, có độ tinh khiết cao Vắc xin thương hàn dùng để gây miễn dịch chủ

Trang 23

động phòng bệnh thương hàn cho trẻ em từ 2 tuổi trở lên và người lớn Quytrình sản xuất vắc xin thương hàn Vi qua các giai đoạn sau:

 Nhân chủng:

Mỗi loạt sản xuất dùng một ống chủng đông khô, nhân chủng qua môitrường canh thang TSB được canh khuẩn thuần khiết

 Nuôi cấy và thu hoạch Vi thô

Đưa canh khuẩn chủng vào nồi lên men nuôi cấy ở nhiệt độ 320C trongthời gian từ 6 đến 8 giờ Thu canh khuẩn, bất hoạt canh khuẩn bằng 0,5%Formaline 35 – 38% Tách xác vi khuẩn bằng hệ thống lọc với màng lọc 0,45

µm Cô đặc kháng nguyên Vi thô bằng hệ thống lọc với màng lọc có lỗ lọccác phân tử có khối lượng 10.000 Dalton

Hình 1.7: Kháng nguyên Vi của S typhi dưới kính hiển vi điện tử (mũi tên)

(12.000X)

 Tinh chế

Dùng các men DNAase, RNAase, Proteinase để cắt DNA, RNA,Protein của kháng nguyên Vi thô Ly tâm để thu Vi tinh khiết Đông khôkháng nguyên Vi

 Pha vắc xin bán thành phẩm cuối cùng

Pha kháng nguyên Vi đông khô trong dung dịch đệm, lọc vô trùng bằngmàng lọc kích thước 0,2 µm

 Đóng ống, dán nhãn, đóng hộp

Thành phần trong 1 liều vắc xin

Trang 24

 Polysacchride Vi tinh khiết 0,025 mg

 Dung dịch đệm đẳng trương 0,5 ml

Vắc xin thương hàn Vi kích thích cơ thể tạo kháng thể kháng Vi tối ưu dotính tinh khiết cao của nó Sau khi tiêm vắc xin, KT xuất hiện sau 2 - 3 tuần,khả năng bảo vệ ít nhất 3 năm Theo quy định hiện hành hàm lượng khángnguyên Vi thành phẩm là: 25 g/liều  30% (35 – 65 g/ml)

Liều tiêm: một liều duy nhất (0,5 ml)

Đường tiêm: dưới da hoặc bắp thịt

1.2.2.3 Tác dụng của vắc xin thương hàn Vi

Khi tiêm hay mắc bệnh thương hàn đều xuất hiện kháng thể trong huyết

thanh và ruột S typhi sau khi vượt qua dạ dày xuống ruột non, IgA tiết có

khả năng ngăn cản vi khuẩn này bám vào niêm mạc ruột [6] Chau và cộng sựnhận thấy kháng thể kháng LPS (IgG, IgM) trong dịch tiết của ruột ở 12người mắc bệnh thương hàn cao hơn so với nhóm đối chứng

Sau khi tiêm vắc xin thương hàn Vi, cơ thể được miễn dịch tạo kháng thể

kháng Vi Khi nhiễm S typhi, kháng nguyên vỏ Vi bị ngưng kết bởi phản ứng

kết hợp KT-KN đặc hiệu, ngăn cản sự bám dính của vi sinh vật Khi đó cơ thểtạo ra nhiều lực cơ học khác nhau, nhu động ruột, dòng máu chảy nhằm loại

bỏ S typhi dễ dàng hơn, bảo vệ cơ thể khỏi sự nhiễm bệnh.

1.2.2.4 Kiểm định chất lượng vắc xin thương hàn Vi

Việc kiểm định thực hiện bắt đầu ngay từ nguyên liệu đầu: Chủng gốc,chủng sản xuất, nước, hóa chất pha môi trường, lọ, nắp, nhãn… Trong quátrình sản xuất việc giám sát và kiểm định chất lượng ở từng giai đoạn đềuphải thực hiện thường xuyên, theo đúng SOP Việc giám sát và kiểm tra sựtuân thủ điều kiện bảo quản luôn được ghi nhận lại tới khi tiêm cho người.Trong phòng thí nghiệm, kiểm định chất lượng vắc xin này dựa trên cáctiêu chí chính sau đây:

Trang 25

 Tính chất vật lý, hóa học [18] [43]

- Dung dịch trong, không màu, không có vật thể lạ

- pH: 6,5 – 7,5

- Thể tích đủ theo đăng ký (nhãn)

- Hàm lượng Phenol: ≤ 0,25 g/100 ml

 Tính vô khuẩn [23], [43]

Cấy trực tiếp vắc xin vào môi trường nuôi cấy phù hợp với sự phát triểncủa vi khuẩn và nấm Ủ môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ 300C đến 350C đối với

vi khuẩn, 200C đến 250C đối với vi nấm

Tiêu chuẩn: Không có vi khuẩn và nấm mọc sau 14 ngày theo dõi

 An toàn không đặc hiệu [25], [43]

Dùng 5 chuột nhắt trắng nặng 17 - 22 g/con và 2 chuột lang nặng 250 –

350 g/con Tiêm ổ bụng 1 liều tiêm cho người (nhưng không quá 1 ml) chochuột nhắt và 1 liều tiêm cho người cho chuột lang

Tiêu chuẩn: Toàn bộ chuột tiêm vắc xin phải sống khỏe mạnh, khôngcó dấu hiệu bệnh lý, lên cân sau 7 ngày theo dõi

 Chất gây sốt [24], [43],

Chất gây sốt được xác định gián tiếp qua việc thân nhiệt thỏ tăng sautiêm vắc xin vào tĩnh mạch tai thỏ Tiêm 1 ml/1 kg cân nặng thỏ dung dịchvắc xin thương hàn Vi (pha loãng 1/2000)

Tiêu chuẩn: nhiệt độ tăng ≤ 0,60C/3 thỏ

 Nhận dạng [19], [43]

Áp dụng kỹ thuật khuyếch tán miễn dịch kép (Ouchterlony) Cùng nhỏ

kháng thể kháng Vi và vắc xin thương hàn Vi vào hai giếng của bản thạch,cách nhau 1 cm Kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu cùng khuyếch tán tronggel ở vùng có nồng độ phù hợp, khi gặp nhau sẽ tạo đường kết tủa

Tiêu chuẩn: Tạo cung ngưng kết trên bề mặt gel

 Hàm lượng Vi polysaccharide [20], [43]

Trang 26

Áp dụng kỹ thuật điện di miễn dịch hình tên lửa để xác định hàm lượngkháng nguyên Vi có trong vắc xin thương hàn Vi.

Tiêu chuẩn: 25 µg ± 30% / liều

 Hàm lượng O – acetyl [21], [43]

Áp dụng kỹ thuật so màu giữa mẫu vắc xin và hàm lượng O – acetylchuẩn

Tiêu chuẩn: ≥ 0,085 µmol ± 25% / liều

1.2.2.5 Kháng thể kháng Vi dùng trong kiểm định vắc xin thương hàn Vi

Trên thế giới, các viện nghiên cứu y học đều có xu hướng nghiên cứu tựsản xuất huyết thanh kháng Vi để sử dụng cho mục đích riêng của mình, trong

đó có huyết thanh đa giá chẩn đoán Salmonella Một số hãng như Difco Mỹ,

Pasteur Meurieux, Sanofi Pháp, Bio Rad… đã sản xuất các loại kháng huyết

thanh loài cho Salmonella ở dạng thương phẩm và lưu hành trên thị trường từ

nhiều năm nay Tuy nhiên, các thương phẩm này có giá thành tương đối caovà khó vận chuyển vì đòi hỏi tuân thủ chặt chẽ quy trình dây chuyền lạnh

Vắc xin thương hàn Vi polysaccharide được sản xuất từ chủng S typhi Ty2 Chủng S typhi Ty2 có khả năng sản xuất kháng nguyên Vi Việc sản xuất huyết thanh kháng Vi từ chủng S typhi Ty2 - là một chủng độc nên quy

trình sản xuất phải tuân thủ chặt chẽ các quy định về an toàn phòng thínghiệm và phải thực hiện bất hoạt chủng cũng như tính toán hàm lượng khángnguyên sau bất hoạt rất phức tạp

Chủng Citrobacter freundii có cấu tạo KN Vi giống với KN Vi chủng S typhi Ty2 Chính vì vậy, WHO khuyến cáo sản xuất KT Vi dùng cho kiểm định vắc xin thương hàn Vi từ chủng Citrobacter freundii [43] Việc sản xuất

KT Vi từ chủng Citrobacter freundii đơn giản hơn, an toàn hơn, vì đây là

chủng vi khuẩn không độc, khi gây miễn dịch trên thỏ cho khả năng tạo đápứng miễn dịch tốt và thu được KT Vi ở mức khả quan Hơn nữa, việc tạo KT

Trang 27

Vi từ chủng Citrobacter freundii không xảy ra hiện tượng ngưng kết chéo với các kháng nguyên khác ngoài KN Vi của chủng S typhi Ty2.

Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Việt Nam sản xuất

kháng thể kháng Vi thông qua miễn dịch thỏ bằng chủng C freundii WR7011 Kháng thể kháng Vi thu được, được sử dụng trong kiểm định nhận

dạng và xác định hàm lượng kháng nguyên Vi có trong vắc xin thương hàn Vi[27]

1.3 Kỹ thuật điện di miễn dịch hình tên lửa trong kiểm định chất lượng

vắc xin thương hàn Vi (Rocket immunoelectrophoresis)

1.3.1 Nguyên lý

Kỹ thuật điện di hình tên lửa do Laurell đề xuất (1965) [31] Khángnguyên Vi di chuyển về cực dương trong điện trường, gặp kháng thể kháng Vitương ứng trong thạch, tạo kết tủa

Trong điện di trên thạch, các kháng nguyên chịu tác động của 2 lực:

+ Lực điện di: Tạo bởi hiệu điện thế dòng điện, ở pH > 8 thì hầu hết cáckháng nguyên đều tích điện âm, do đó điện di làm cho chúng đi về phíacực dương

+ Lực thẩm thấu nội điện từ: (electroendosmosis): Kháng nguyên đi về

phía cực âm

Như vậy phương di chuyển tổng thành của kháng nguyên phụ thuộc vàotương quan giữa lực điện di và lực thẩm thấu nội điện từ Với phần lớn cáckháng nguyên lực điện di lớn hơn đáng kể, vì vậy phần lớn các kháng nguyênđều đi về phía cực dương Để giảm lực thẩm thấu nội, người ta dùng thạchtinh khiết, đó là thạch Agarose

1.3.2 Kỹ thuật

Tạo bản gel thạch Agarose có hòa đều kháng thể đặc hiệu Đục lỗ giếng,nhỏ kháng nguyên chuẩn đã biết hàm lượng và kháng nguyên mẫu thử vàocác giếng, chạy điện di

Trang 28

Kháng nguyên chuyển động về cực dương trong môi trường thạch chứakháng thể, nghĩa là đi vào các khe hở của thạch chứa kháng thể đặc hiệu.Trong quá trình điện di, các kháng nguyên phản ứng tủa với các kháng thể,kết tủa được tạo thành một cách đầy đủ cho một hình thon mảnh đỉnh nhọn cóhình dáng như một quả tên lửa có đáy là một phần đường cong của lỗ giếng

1.3.3 Tính kết quả và biện luận

Quá trình điện di xảy ra tới lúc hoàn tất thì có thể coi quãng đường màkháng nguyên đi được trong điện di (chiều cao của cột tên lửa) là tỉ lệ thuậnvới lượng kháng nguyên có sẵn trong mẫu thử

Chiều cao cột tên lửa là chiều dài đường vuông góc đỉnh nhọn của cột tênlửa với tiếp tuyến mép trên của lỗ giếng

Dựa vào nồng độ kháng nguyên chuẩn tương ứng với chiều cao cột tênlửa, dựng đường chuẩn và lập phương trình của đường chuẩn, từ đó tính đượchàm lượng kháng nguyên Vi có trong mẫu thử

Lỗ giếng

nhỏ KN Vi

Hình 1.8: Cách xác định chiều cao cột tên lửa trên bản gel

Trong đó:

: Chiều cao cột tên lửa

Trang 29

Chiều cao cột tên lửa phụ thuộc vào: kích thước lỗ giếng, hàm lượng KN

Vi nhỏ vào lỗ giếng, hiệu điện thế dòng điện và thời gian chạy điện di

1.3.4 Ứng dụng của kỹ thuật điện di miễn dịch tên lửa

Áp dụng đối với các KN mang điện tích:

- Định tính kháng nguyên đặc hiệu với mẫu kháng thể hòa tan trongbản gel

- Định lượng kháng nguyên đặc hiệu với mẫu kháng thể hòa tan trongbản gel Xây dựng đường chuẩn với các nồng độ kháng nguyên chuẩn Từđường chuẩn có thể xác định nồng độ chưa biết của cùng kháng nguyên

Trang 30

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Quy trình xác định hàm lượng kháng nguyên Vi có trong vắc xin thươnghàn Vi bằng kỹ thuật điện di miễn dịch tên lửa

- Nguồn điện di Thermo EC105 (USA), model: 105 ECA – LVD

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Kháng nguyên Vi chuẩn

Kháng nguyên Vi nội bộ (inhouse) của hãng Aventis Pasteur (Pháp), loạt

140301, đông khô, hàm lượng kháng nguyên Vi 20,25 g ViPs/lọ

2.2.2 Kháng thể kháng Vi

Kháng thể kháng Vi điều chế tại Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin vàSinh phẩm Y tế loạt 01/11 đã được chuẩn hóa và cho phép sử dụng là chấtchuẩn

2.2.3 Mẫu vắc xin

- Vắc xin Typhim Vi của hãng Sanofi Pasteur, dùng đánh giá độ chính xác,độ mạnh, độ đặc hiệu của quy trình

+ Loạt H0472 – 1, hạn sử dụng: 9/2014

+ Loạt H0492 – 1, hạn sử dụng: 9/2014

+ Loạt H0495 – 1, hạn sử dụng: 9/2014

- Vắc xin Meningococcal B+C của Cu Ba loạt M12HD05.15, hạn sử dụng:05/2013, dùng đánh giá độ đặc hiệu của quy trình

Trang 31

+ Agarose: Hãng sản xuất Sigma (Mỹ), loạt 0912-36-6.

+ PBS: Hãng sản xuất Gibco (Mỹ), loạt 624218

+ Dung dịch nhuộm màu (Brilliant blue R Staining Solution): Hãng sảnxuất Sigma (Mỹ), loạt 024K4407

+ Dung dịch tẩy màu (Destain Solution, Coomassie R-250): Hãng sảnxuất Bio-Rad (Mỹ), loạt 210007125

2.2.5 Máy móc

+ Bể điện di Hoefer (Mỹ), model: HE99X – 15 – 1.5, dùng chứa bảngel trong môi trường có pH > 8

+ Nguồn điện di Thermo EC105 (Mỹ), model: 105 ECA – LVD

+ Máy đo pH Thermo orion (Mỹ), model: 720a, đã được hiệu chuẩn

2.2.6 Dụng cụ

+ Ống đong thủy tinh Schott Duran (Đức)

+ Pi pét loại 100 – 1000 µl: Hãng Eppendorf, mã số 1854695, đã đượchiệu chuẩn

+ Pi pét loại 20 – 200 µl: Hãng Eppendorf, mã số 476444, đã được hiệuchuẩn

+ Pi pét loại 0,5 – 10 µl: Hãng Eppendorf, mã số 4860672, đã được hiệuchuẩn

+ Giọt nước thăng bằng

+ Thước đo chiều cao cột tên lửa, độ chính xác 1/20 mm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu mô tả trong phòng thí nghiệm

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu độ tuyến tính và vùng tuyến tính

Hầu hết trong các thử nghiệm định tính kết quả của thử nghiệm được xácđịnh dựa vào mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất cần phân tích vàgiá trị trực tiếp đo được, đó là việc dựng đường chuẩn

Trang 32

Đường chuẩn là yếu tố quyết định sự đúng đắn của kết quả phân tích, dođó nếu trong quá trình xây dựng đường chuẩn, những sai số lớn sẽ dẫn đếnmất chính xác của kết quả Đường chuẩn được thiết lập dựa vào độ tuyến tínhvà phải nằm trong vùng tuyến tính của quy trình Vì thế, để đánh giá độ tuyếntính và vùng tuyến tính ta dựa vào các kết quả của việc dựng đường chuẩn.

2.3.1.1 Độ tuyến tính

* Cỡ mẫu

Sử dụng kháng nguyên Vi (inhouse) của hãng Aventis Pasteur (Pháp), loạt

140301 dựng đường chuẩn:

+ Sử dụng 5 độ pha chuẩn

+ Mỗi độ pha nhỏ vào 3 giếng

Thêm 202,5 l PBS vào lọ mẫu chuẩn chứa 20,25 g ViPs đông khô, đượcdung dịch chứa 100 g ViPs/ml (ddA)

Do hàm lượng Vi trong vắc xin thương hàn Vi từ 35 – 65 µg ViPs/ml, nênviệc xây dựng đường chuẩn từ nồng độ 12,5 µg ViPs/ml đến 100 µg ViPs/mllà phù hợp Từ ddA pha các dung dịch nồng độ chuẩn B, C, D, E có hàmlượng 75,0; 50,0; 25,0; 12,5; (g ViPs/ml)

+ Dung dịch B (ddB): 30 l dd A + 10 l PBS

+ Dung dịch C (ddC): 30 l dd A + 30 l PBS

+ Dung dịch D (ddD): 30 l dd C + 30 l PBS

+ Dung dịch E (ddE): 30 l dd D + 30 l PBS

Nhỏ 7 l mỗi độ pha (ddA, ddB, ddC, ddD, ddE) vào mỗi giếng Tiếnhành điện di, đo chiều cao cột tên lửa tương ứng của 5 nồng độ mẫu chuẩntrên

Đánh giá sự tương quan tuyến tính giữa giá trị hàm lượng kháng nguyên

Vi và chiều cao cột tên lửa, thông qua việc xác định hệ số tương quan (r) Lập phương trình hồi quy tuyến tính cho đường chuẩn trong khoảng hàmlượng từ 12,5 µg ViPs/ml đến 100 µg ViPs/ml

Trang 33

* Cách tính hệ số tương quan (r)

x

y y x

x r

1

2 1

Trong đó:

x : Chiều cao trung bình mẫu chuẩn

x i : Chiều cao mẫu chuẩn ở từng độ pha loãng.

y : Hàm lượng kháng nguyên Vi trung bình mẫu chuẩn

y i : Hàm lượng kháng nguyên Vi ở từng độ pha loãng.

Từ hệ số tương quan, kiểm định độ tin cậy 95% của hệ số tương quantheo quy luật “Student” với (n – 2) bậc tự do

n: số nồng độ mẫu dựng đường chuẩn

* Tiêu chuẩn đánh giá [12]

0 ≤ | r | < 0,3: x và y không tương quan tuyến tính.

0,3 ≤ | r | < 0,6: x và y có tương quan tuyến tính

0,6 < | r | ≤ 1: x và y có tương quan tuyến tính chặt chẽ

Kiểm định độ tin cậy của hệ số tương quan:

+ T < t: Hàm lượng kháng nguyên Vi và chiều cao cột tên lửa không tươngquan (độc lập với nhau) ở mức ý nghĩa α = 0,05 (p > 0,05) Quy trình khôngđạt độ tuyến tính

Trang 34

+ T > t: Hàm lượng kháng nguyên Vi và chiều cao cột tên lửa có sự tươngquan tuyến tính chặt chẽ ở mức ý nghĩa α = 0,05 (p < 0,05) Quy trình đạt độtuyến tính với độ tin cậy 95%.

2.3.1.2 Vùng tuyến tính

Ở đây nhóm nghiên cứu không xác định giới hạn toàn bộ vùng tuyến tínhmà chỉ khẳng định rằng, trong khoảng 12,5 µg ViPs/ml đến 100 µg ViPs/mlcủa đường chuẩn, các hàm lượng kháng nguyên Vi chuẩn thu được theophương trình hồi quy, đều đạt tính đúng và tính chính xác

2.3.2 Thiết kế nghiên cứu độ đúng

2.3.2.1 Cỡ mẫu thử

- Thực hiện 6 lần, mỗi lần như nhau:

+ Dùng 3 độ pha khác nhau

+ Mỗi độ pha thực hiện 3 lần trên cùng 1 mẫu (triplicate tests)

- Thực hiện bởi 1 nghiên cứu viên, ở 6 ngày khác nhau

2.3.2.4 Cách tính độ đúng

Sau khi dựng đường chuẩn, từ chiều cao tương ứng đo được, tính nồng độdung dịch chuẩn ở nồng độ 25; 50; 75 (g ViPs/ml)

Kết quả thu được tính được độ chệnh (bias) theo công thức:

∆ = x  x 100Trong đó:

∆: Độ chệnh (%)

Trang 35

x: Giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm

(hoặc kết quả thử nghiệm)

µ: Giá trị thực đã biết

Kiểm định giá trị trung bình lý thuyết

x xi

2 ) (

1 1

Tính T =

n S

µ: Giá trị thực của mẫu

x: Giá trị trung bình kết quả thu được

xi: Giá trị kết quả thu được lần thứ i

S2: Phương sai n: Số lần thử nghiệm

2.3.2.5 Tiêu chuẩn đánh giá

Đối với từng giá trị thu được: Giá trị ∆ ≤ 30% [43]

Đối với các giá trị thu được: Kiểm định giá trị trung bình thu được và giátrị thực được chấp nhận cùng với khoảng tin cậy 95% của độ đúng chung chocác mẫu [12]:

+ T < t: Không có sự khác nhau về kết quả của giá trị trung bình thuđược so với giá trị thực của mẫu với mức ý nghĩa α = 0,05 (p > 0,05)

+ T > t: Có sự khác nhau về kết quả của giá trị trung bình thu được so vớigiá trị thực của mẫu với mức ý nghĩa α = 0,05 (p < 0,05)

Trang 36

2.3.3 Thiết kế nghiên cứu độ chính xác

* Dung dịch chuẩn

Sử dụng kháng nguyên Vi đông khô inhouse của hãng Aventis Pasteurloạt 140301 dựng đường chuẩn Cách pha để dựng đường chuẩn như phadựng đường chuẩn đối với độ tuyến tính

* Dung dịch mẫu thử

Mỗi loạt vắc xin làm mẫu thử có hàm lượng kháng nguyên Vi khác nhau,vì vậy sử dụng các loạt khác nhau để tăng tính khách quan của thử nghiệmtrong việc xác định tính lặp lại của độ chính xác

Sử dụng 3 loạt vắc xin Typhim Vi của hãng Sanofi Pasteur: Loạt H0472 –

1, loạt H0492 – 1, loạt H0495 – 1

* Cách tính tính lặp lại

SD = S2

* Tiêu chuẩn đánh giá:

Các kết quả thu được nằm trong khoảng x  2SD [22]

2.3.3.2 Tính chính xác trung gian

* Cỡ mẫu thử

Thực hiện bởi 2 nhóm nghiên cứu, cùng 1 loạt vắc xin

Mỗi nhóm nghiên cứu thực hiện 6 lần thử nghiệm (6 ngày khác nhau)

* Dung dịch chuẩn

Trang 37

Sử dụng kháng nguyên Vi đông khô inhouse của hãng Aventis Pasteurloạt 140301 dựng đường chuẩn Cách pha để dựng đường chuẩn như phadựng đường chuẩn đối với độ tuyến tính.

* Dung dịch mẫu thử

Sử dụng 1 loạt vắc Typhim Vi của hãng Sanofi Pasteur làm mẫu thử

* Cách tính tính chính xác trung gian

- Trong từng nhóm nghiên cứu: Tính x , SD.

- Trong 2 nhóm nghiên cứu:

+ Kiểm định so sánh phương sai giữa 2 nhóm thử nghiệm để đánh giáđộ tản mạn của 2 dãy số liệu với độ tin cậy 95% [12]

Tính F = 2

2

Y

X S

S : Phương sai kết quả của nhóm nghiên cứu 1, 2

n1, n2: số lần thực hiện thử nghiệm của từng nhóm

+ Kiểm định 2 giá trị trung bình để so sánh giá trị thu được trong hainhóm nghiên cứu có như nhau không, với độ tin cậy 95% [12]

S m S

T =

m n S

y x

c

1 1

S : Phương sai mẫu chung của 2 nhóm

x, y : Giá trị trung bình kết quả thu được của từng nhóm

n, m: Số lần thực hiện thử nghiệm của từng nhóm

Tra t = t(n + m – 2; α/2) = t(6 + 6 – 2; 0,025) = 2,228

Trang 38

(tra bảng “Quy luật Student với n bậc tự do”)

* Đánh giá kết quả

Trong từng nhóm nghiên cứu: Các kết quả thu được nằm trong khoảng:

x ± 2SD [22]

Trong 2 nhóm nghiên cứu: Tính phương sai, kiểm định so sánh phươngsai, giá trị trung bình kết quả của 2 nhóm nghiên cứu với khoảng tin cậy 95%[12]:

+ F < f: Hai phương sai như nhau, nghĩa là độ tản mạn của kết quảthử nghiệm ở 2 nhóm như nhau với mức ý nghĩa α = 0,05 (p > 0,05)

+ F > f: Hai phương sai không như nhau, nghĩa là độ tản mạn của kếtquả thử nghiệm ở hai nhóm khác nhau với mức ý nghĩa α = 0,05 (p < 0,05)

So sánh giá trị KN Vi trung bình thu được của hai nhóm với độ tin cậy95%

+ T < t: Giá trị KN Vi trung bình thu được của hai nhóm như nhauvới độ tin cậy 95% (p > 0,05)

+ T > t: Giá trị KN Vi trung bình thu được của hai nhóm khác nhauvới độ tin cậy 95% (p < 0,05)

Quy trình đạt tính chính xác trung gian nếu phương sai và giá trị trungbình của hai nhóm là như nhau với độ tin cậy 95% (p > 0,05)

2.3.4 Thiết kế nghiên cứu độ mạnh

2.3.4.1 Cỡ mẫu

Độ mạnh của quy trình đánh giá thông qua kết quả tính lặp lại và độ chínhxác trung gian Khi quy trình đạt tính lặp lại và độ chính xác trung gian thìquy trình đã đạt được độ mạnh

Để thêm độ mạnh cho quy trình nhóm nghiên cứu đã thực hiện:

Trang 39

+ Trên 2 loạt Sodium bacbital: loạt 206A4590 và loạt 206A5574 Mỗiloạt hóa chất tiến hành làm 6 lần thử nghiệm trên cùng mẫu thử Chọn mẫuthử là vắc xin thương hàn Vi.

+ Thay đổi thể tích như nhau dung dịch kháng nguyên nhỏ vào mỗigiếng mẫu chuẩn và giếng mẫu thử trong một lần thử nghiệm: lấy thể tích 7, 8µl/giếng Thực hiện 6 lần thử nghiệm trên cùng mẫu thử Chọn mẫu thử là vắcxin thương hàn Vi

2.3.4.2 Cách tính và đánh giá độ mạnh

Cách tính và đánh giá độ mạnh giống như cách tính và đánh giá tínhchính xác trung gian [12]

2.3.5 Thiết kế nghiên cứu độ đặc hiệu

Bản chất kỹ thuật điện di miễn dịch hình tên lửa gần giống kỹ thuậtkhuyếch tán miễn dịch đơn Kháng thể được hòa trong bản gel, KN trong lỗgiếng di chuyển trong bản gel nhờ lực điện di Chỉ những KN đặc hiệu KThòa tan trong bản gel mới xảy ra hiện tượng ngưng kết

Trong quy trình:

+ Bản gel có chứa sẵn kháng thể kháng Vi

+ Mẫu được nhỏ vào giếng của bản gel

Với kháng thể Vi thì chỉ có kháng nguyên Vi mới tạo ngưng kết KN – KT

+ Vắc xin Typhim Vi pha loãng 1/2 bằng PBS (Mẫu thử 1).

+ Vắc xin Typhim Vi pha loãng 1/2 bằng dung dịch mẫu chuẩn có hàm

lượng KN Vi 50 µg/ml (Mẫu thử 2) Nghĩa là mẫu thử 2 đã được thêm 25 µg/

ml KN Vi so với mẫu thử 1.

Trang 40

Như vậy hàm lượng KN Vi mẫu thử 2 nhiều hơn mẫu thử 1 là 25 µg/ml

+ Vắc xin Meningococcal B + C pha loãng 1/2 bằng PBS (Mẫu thử 3).

+ Vắc xin Meningococcal B + C pha loãng 1/2 bằng dung dịch mẫu

chuẩn có hàm lượng KN Vi 50 µg/ml (Mẫu thử 4) Nghĩa là mẫu thử 4 đã được thêm 25 µg/ml KN Vi so với mẫu thử 3.

Như vậy hàm lượng KN Vi mẫu thử 4 nhiều hơn mẫu thử 3 là 25 µg/ml

Nhỏ 7 µl mẫu chuẩn dựng đường chuẩn, mẫu thử 1, 2, 3, 4 và mẫu PBS

(mẫu trắng) vào các giếng.

2.3.5.2 Cách tính kết quả

Tính hàm lượng KN Vi thu được ở các giếng mẫu thông qua việc đo đượcchiều cao cột tên lửa Tính hàm lượng kháng nguyên Vi thêm thu được

+ Mẫu thử 2 – Mẫu thử 1

+ Mẫu thử 4 – Mẫu thử 3

2.3.5.3 Đánh giá kết quả như đánh giá kết quả độ đúng

Đối với từng giá trị thu được: Giá trị ∆ không vượt quá ± 30% so với mẫuthử chứa 25 µg ViPs/ml [43]

Đối với các giá trị thu được: Tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn, kiểmđịnh giá trị trung bình lý thuyết với khoảng tin cậy 95% của độ đúng chungcho các mẫu [12]:

+ T < t: Không có sự khác nhau về kết quả trung bình hiệu số thu được

so với giá trị mẫu chuẩn thêm vào mẫu với mức ý nghĩa α = 0,05 Quy trìnhđạt độ đặc hiệu với độ tin cậy 95% (p > 0,05)

+ T > t: Có sự khác nhau về kết quả trung bình hiệu số thu được so với giátrị mẫu chuẩn thêm vào mẫu với mức ý nghĩa α = 0,05 Quy trình không đạtđộ đặc hiệu với độ tin cậy 95% (p < 0,05)

Định dạng
Số trang	81
Dung lượng	3,99 MB