nghiên cứu đa hình gen 12s rrna của thằn lằn bóng eutropis multifascisata kuhl, 1820 ở miền trung và tây nguyên

Tính cấp thiết của đề tài Giống thằn lằn bóng Mabuya Fitzinger, 1826 thuộc họ Thằn lằn bóng Scincidae trong lớp Bò sát Reptilia là một trong số các loài thằn lằn phân bố rộng rãi ở vùng

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Giống thằn lằn bóng Mabuya Fitzinger, 1826 thuộc họ Thằn lằn bóng

(Scincidae) trong lớp Bò sát (Reptilia) là một trong số các loài thằn lằn phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới [9], Một số đặc điểm sinh học, sinh thái của 2 loài

thằn lằn bóng giống Mabuya Fitzinger, 1826 (M longicaudata, M Multifasciata) ở Thừa Thiên Huế] Theo Miralles A và cs (2005), giống Mabuya có khoảng hơn 110 loài phân bố khắp châu Phi, châu Á và châu Mỹ

[22] Dựa trên những nghiên cứu gần đây trên lĩnh vực sinh học phân tử, loài này được chia chính thức thành bốn giống (Mausfeld et al., 2000, 2002;

Mausfeld và Schmitz, 2003) Giống Mabuya ở châu Á được thay bằng Eutropis Fitzinger, 1943 Giống Afro-Malagasy được đăng ký dưới tên Euprepis Wagler, 1830 Giống thằn lằn bóng ở đảo Cape Verde chính thức là giống Chioninia Gray, 1845 và giống ở Nam Mỹ là Mabuya Fitzinger, 1826

[19]

Ở Việt Nam thằn lằn bóng phân bố ở hầu hết các tỉnh ở nước ta từ Lai

Châu đến Bạc Liêu [Nguyễn Văn Sáng (2005), Danh lục bò sát và ếch nhái Việt Nam] Theo thống kê tại vùng Nam Bình Trị Thiên có đến 102 loài

lưỡng cư và bò sát, trong đó họ thằn lằn bóng là loài có mức độ phân bố khá cao với 8 loài [3]

Thằn lằn bóng được biết đến khá lâu với các giá trị về dược học và thực phẩm Thịt thằn lằn bóng không chỉ thơm ngon mà còn có giá trị dinh dưỡng cao, tác dụng tốt đối với một số bệnh như suy dinh dưỡng, khó thở, nhức mỏi xương khớp… Tuy nhiên ngày nay, cùng với sự đô thị hóa, mở rộng các

khu dân cư và sự khai thác quá mức đã làm cho số lượng thằn lằn bóng ngày càng suy giảm.

Trên thế giới đã có các công trình nghiên cứu về thằn lằn bóng, tuy nhiên tại Việt Nam việc nghiên cứu chủ yếu tập trung về hình thái, sinh thái [3], [4], [9], [14], chưa thấy có công bố nào về đặc điểm di truyền của thằn lằn bóng

Xuất phát từ các lý do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài

“Nghiên cứu đa hình gen 12S rRNA của thằn lằn bóng Eutropis multifascisata Kuhl, 1820 ở miền Trung và Tây Nguyên”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá đa dạng di truyền thằn lằn bóng Eutropis multifascisata Kuhl,

1820 ở miền Trung và Tây Nguyên.

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên đối tượng là các mẫu đuôi của

thằn lằn bóng Eutropis multifascisata Kuhl, 1820 thu được ở miền Trung

và Tây Nguyên

4 Nội dung nghiên cứu

- Tách chiết và đánh giá chất lượng DNA tổng số

- Tạo dòng gen 12S rRNA

- Khuếch đại gen 12S rRNA

- Giải trình tự gen 12S rRNA

- Xác định mối quan hệ di truyền bằng phần mềm DNA star

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

5.1 Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu xác định mối quan hệ di truyền của thằn lằn bóng Eutropis multifasciata Kuhl một số tỉnh miền Trung và Tây Nguyên, làm tiền đề xác định nguồn gốc của thằn lằn bóng Việt Nam, đồng thời xác định mức độ đa dạng di truyền của loài

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Việc nghiên cứu đa dạng di truyền loài thằn lằn bóng Eutropis multifasciata có ý nghĩa trong việc xác định mức độ đa dạng di truyền của

loài dưới tác động của các điều kiện tự nhiên, nhân tố con người Nghiên cứu cung cấp thêm dẫn liệu khoa học về mặt di truyền để từ đó đặt nền móng cho việc khai thác, sử dụng, bảo vệ và phát triển hợp lý nguồn tài nguyên thiên nhiên này

6 Tính mới của đề tài

Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về đa dạng di truyền của loài

thằn lằn bóng Eutropis multifasciata Kuhl, 1820.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vài nét về thằn lằn bóng Eutropis multifasciata Kuhl, 1820

1.1.1 Hình thái

Loài Eutropis multifasciata là loài thằn lằn bóng phân bố rộng rãi khắp

Châu Á Về ý nghĩa tên loài “multi” nghĩa là nhiều, “fasciata” có nghĩa là dải, do đó tên loài dựa trên các dải màu hình thành dọc thân thằn lằn bóng

Mô tả: cơ thể có kích thước trung bình Đầu phủ vảy tấm đối xứng, ít phân biệt với cổ Mõm tù, tấm mõm rộng hơn cao Lỗ mũi tròn, nằm giữa tấm mũi, 2 tấm trên mũi cách nhau bởi tấm trán-mũi và tấm trán Có một cặp tấm gáy tiếp xúc nhau, đôi khi ngăn cách bởi một vảy nhỏ Có 2 tấm má, 4 tấm trên ổ mắt, 6-7 tấm trên mí mắt.Có 1-2 vảy trước trên ổ mắt, đôi khi không có, 2 vảy trước dưới ổ mắt, 8-10 vảy sau ổ mắt, 1 vảy sau- trên ổ mắt

Có 6-7 tấm mép trên, 7-8 tấm mép dưới mỗi bên Có 3 hàng vảy thái dương Tấm cằm rộng hơn cao, một tấm sau cằm lẻ, rộng hơn dài, 2 cặp tấm sau cằm, cặp thứ nhất tiếp xúc nhau, cặp thứ hai thường cách nhau bởi 1 vảy nhỏ Màng nhĩ sâu, cao hơn dài một chút

Vảy thân tương đối đồng đều, xếp theo hình ngói lợp từ trước ra sau Vảy trên lưng có 3 gờ rõ (đôi khi có 5 gờ), vảy phía bên có gờ yếu hơn, vảy bụng nhẵn Có 30-33 hàng vảy xung quanh giữa thân kể cả vảy bụng, 39-46 hàng vảy dọc lưng, 46-54 hàng vảy dọc bụng, 68-94 hàng vảy dưới- giữa đuôi Vảy ở các chi nhỏ hơn vảy thân Vảy chi trước nhẵn, vảy chi sau ở mặt trên có gờ yếu mặt dưới không có gờ Chi trước có 6-8 bản mỏng dưới ngón

I, 11-14 bản mỏng dưới ngón III, 11-15 bản mỏng dưới ngón IV Chi sau có 6-9 bản mỏng dưới ngón I, 13-17 bản mỏng dưới ngón III, 15-19 bản mỏng dưới ngón IV

Thân màu nâu hoặc nâu đen, mặt bụng và phía dưới các chi sáng màu hơn trên lưng Trên lưng có từ 5-7 dải nhỏ màu nâu sẫm (rộng bằng 1/3 chiều rộng của 1 hàng vảy) chạy dọc từ sau tấm gáy đến gốc đuôi Hai bên thân màu nâu sẫm Những cá thể cái có các đốm trắng nằm dọc hai bên thân

từ sau lỗ tai đến 1/3 chiều dài đuôi và ở mặt trên của đùi và cánh tay Mỗi đốm trắng có viền đen nằm trong một vảy [14]

Eutropis multifasciata trưởng thành có những đặc điểm sau:

- Kích thước lớn nhất có thể đạt là 36cm

- Phần đầu phát triển mạnh mẽ, chân sau gồm có 5 ngón giúp thằn lằn bóng di chuyển nhanh nhẹn

- Phần đầu bao phủ bởi lớp vẩy lớn, sắp xếp đối xứng

- Mí mắt dưới gắn liền với mi mắt và không có mí mắt trên

- Mở nhĩ tương đối lớn và màng nhĩ bị chìm sâu

- Thường có từ 3-5 đường vảy chạy dọc sống lưng và bụng [31]

Hình 1.1 Hình thái Thằn lằn bóng Eutropis multifasciata

(Photo by Kenny Heng, 2011)

1.1.2 Ảnh hưởng của các điều kiện sinh thái đến thằn lằn bóng

Thằn lằn bóng là động vật máu lạnh và là động vật biến nhiệt, nhiệt độ trong cơ thể có thể thay đổi trong một phạm vi rộng Theo Laurie J Vitt và

Daniel G B (1991), loài Mabuya bistriata hoạt động ở nhiệt độ khoảng 32,9

± 0,98°C [35]

Do đó chu kỳ hoạt động ngày đêm của thằn lằn bóng như sau: thời gian hoạt động trong ngày của thằn lằn bóng thường bắt đầu từ 8h đến 16h hàng ngày Tần số bắt gặp cao nhất là từ 9h-11h Buổi sáng, sau khi ra khỏi chổ ở, chúng leo lên thân, lá cây hoặc bãi cát, bãi đất trống, nơi có nhiều ánh nắng để sưởi nắng khoảng 10-20 phút Sau đó, chúng đi kiếm ăn, đến 11h30’-12h00’ đến các chổ râm mát dưới bóng cây tránh nắng, khoảng 13h00’-13h30’ chúng tiếp tục đi kiếm mồi [9]

Ảnh hưởng của ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm: hoạt động sống của M multifasciata mạnh nhất trong điều kiện nắng ấm, nhiệt độ 30-35°C, độ ẩm

70-80%

E multifasciata phân bố hầu hết các vị trí trong địa điểm nghiên cứu

Tuy nhiên, gặp phổ biến nhất ở cây bụi, hang đá - bê tông, bờ sông, bụi tre,

bờ mương, đống gạch, ngói vỡ Môi trường sống của loài này thường ở khu vực dân cư, các công viên, khuôn viên trường học và cơ quan, bãi cát ven biển, đầm phá, khu vực ven sông, hồ, bãi cỏ

Eutropis multifasciata chủ yếu ăn ấu trùng của côn trùng (13,77 %), bộ

Cánh thẳng (13,17 %), bộ Cánh màng (11,68 %), bộ Cánh phấn (8,68 %)

Bảy loại chiếm ưu thế trong thành phần thức ăn của E multifasciata: ấu

trùng côn trùng, Kiến, Nhện, Mọt ẩm, Cào cào, Mối, Bướm cải

Xiang & cs (2006) cho biết loài Mabuya multifascisata cái sinh sản lúc

thân dài 90 mm Cá thể đực trưởng thành có thân dài 117 mm và cá thể cái thân dài là 116 mm Sự sinh con bắt đầu vào tháng 5, không thấy có sự liên quan giữa kích thước cơ thể và số con đẻ [24] Nhiệt độ môi trường thời kỳ thai nghén tác động đến ngày sinh nhưng không tác động đến kích thước ổ đẻ và

khối lượng ổ đẻ Mabuya bistriata đạt đến độ chín sinh dục gần hết năm thứ

nhất của đời sống, con cái sinh sản lứa đầu tiên lúc một năm tuổi [35]

1.1.3 Vai trò

+Về sinh thái: Thằn lằn bóng tham gia vào nhiều chuỗi thức ăn và lưới

thức ăn của các hệ sinh thái ở cạn Chúng là mắt xích quan trọng góp phần chuyển hóa vật chất và năng lượng, đảm bảo cân bằng trong các hệ sinh thái

+ Về nông, lâm nghiệp: Thằn lằn bóng là một thiên địch có lợi, chúng

ăn nhiều loài động vật gây hại như: Châu chấu, rầy, bọ Cánh cứng, sâu, mối gián, Góp phần bảo vệ vật nuôi, cây trồng

+ Về dược liệu: Thằn lằn bóng là một vị thuốc có tác dụng chữa được

một số bệnh Người dân vẫn hay dùng Thằn lằn bóng để chữa bệnh hen

suyễn, biếng ăn ở trẻ em [11].

+Về thực phẩm: Thằn lằn bóng là nguồn cung cấp protein tự nhiên, có

thể làm thức ăn cho con người, vật nuôi hoặc làm nguyên liệu sản xuất thức

ăn chăn nuôi

+ Về giáo dục: Do có mặt phổ biến ở nhiều nơi và con người có thể bắt

gặp hàng ngày nên Thằn lằn bóng được chọn làm đối tượng đại diện cho lớp

Bò sát, đưa vào chương trình giảng dạy sinh học ở bậc Trung học cơ sở (Sinh học 7) hoặc làm mẫu vật thí nghiệm về bò sát trong các môn học thực hành ở cao đẳng, đại học (Thực hành sinh học đại cương, Giải phẫu so sánh động vật)

2.1 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền động vật

2.1.1 Kỹ thuật RADP (Random Amplified Polymorphic DNA)

RAPD (Ramdon Amplified Polymorphism DNA) là các phân đoạn DNA đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên Phương pháp này do William (1990), Welsh và cộng sự (1991) phát triển từ phương pháp PCR chuẩn

nhưng với một mồi duy nhất có kích trước từ 5 đến 12 nucleotide Do kích thước bộ gen của một cá thể là rất lớn từ vài trăm triệu với vài tỉ base, là những chuỗi được hình thành từ bốn base duy nhất là adenine, guanine, cytosine, và thymine cho nên sẽ tồn tại nhiều trình tự 5 đến 12 base bắt cặp với trình tự mồi ngẫu nhiên Sản phẩm PCR với một mồi có trình tự ngẫu nhiên như vậy, ở những điều kiện PCR nhất định sẽ cho một (hoặc vài) phân đoạn DNA (khác nhau) trên điện di đồ.

Các cá thể sinh vật cùng loài, giống, họ có bộ gene giống nhau hoàn toàn do đó kết quả điện di trên điện di đồ sẽ gồm những băng vạch DNA có kích thước như nhau Khi bộ gen của chúng có nhiều trình tự khác nhau, với một mồi ngẫu nhiên nào đó, các sản phẩm PCR của chúng sẽ cho một số băng vạch DNA có kích thước khác nhau trên điện di đồ

Phương pháp RAPD cho phép phát hiện tính đa hình giữa các cá thể trong một quần đàn, giữa các quần đàn trong cùng một loài hoặc giữa các loài trong một giống, mà không cần biết trình tự sắp xếp của các nucleotide Mặt khác mồi RAPD sẽ chỉ ra một đa hình thường xuất hiện nhất [17]

Mồi ngẫu nhiên được thiết kế là những oligonucleotide có kích thước từ

5 đến 12 nucleotide, và được tổng hợp hóa học Tuỳ theo hãng sản xuất, các mồi có kí hiệu, tên gọi cũng như trình tự rất khác nhau Yêu cầu cơ bản là mồi phải bắt cặp và bám vào hai đầu của đoạn khuôn, để phân đoạn DNA nằm giữa có kích thước khoảng 50 đến 5000 nucleotide được nhân lên Mồi càng ngắn thì khả năng bắt cặp càng cao, và do đó số sản phẩm PCR càng nhiều Ngược lại mồi càng dài thì thì độ bắt cặp chính xác càng lớn, số phân đoạn PCR càng ít đi

Các bước thực hiện: gồm bốn bước cơ bản sau

- Bước 1: Tách chiết, tinh sạch và đánh giá độ tinh sạch của DNA tổng số

- Bước 2: Thực hiện phản ứng PCR với primer ngẫu nhiên

- Bước 3: Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide

- Bước 4: Phân tích và đánh giá kết quả đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster) các số liệu thu được cho thấy

sự gần gũi hoặc tách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu

Ưu và nhược điểm của phương pháp

Ưu điểm của phương pháp RAPD là thời gian thực hiện nhanh, dễ làm

và ít tốn kém, giúp cho xác định tính đa dạng sinh học, nguồn gốc các giống động vật, thực vật và vi sinh vật [17] Kỹ thuật chỉ cần một lượng DNA nhỏ làm khuôn, không đòi hỏi phân lập và đọc trình tự, có thể phát hiện nhiều locus cùng lúc do đó phân tích được lượng mẫu lớn Đồng thời RAPD không dùng chất phóng xạ để phát hiện đa hình Do đó RAPD thường dùng trong phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các thứ (variety) cây trồng hay giữa các cá thể để phục vụ công tác lai tạo hoặc phân loại

RAPD cũng có một số hạn chế như sau: có tính trội (dominant) do đó khó phân biệt được những gen lặn hay cá thể dị hợp tử Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thường không thống nhất nếu được lặp lại thí nghiệm (không ổn định) Độ tin cậy còn tùy thuộc vào kỹ thuật của cá nhân Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao do đó khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp

2.1.2 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Ngay từ khi ra đời, RFLP là một chỉ thị phân tử rất hữu dụng trong việc đánh giá đa dạng di truyền RFLP (Restrition Fragment Length Polymorphism DNA) là DNA đa hình chiều dài các phân đoạn DNA được cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác

Ngày nay, RFLP là kỹ thuật phân tích đa dạng di truyền được sử dụng phổ biến nhất Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt hạn chế đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gene DNA bộ gene sẽ được cắt bởi các enzyme cắt hạn chế, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (được đánh dấu phóng xạ) liên kết với một locus đặc biệt Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau.

Ưu và nhược điểm của phương pháp

RFLP có ưu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp Do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu Tuy nhiên do quy trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm do sử dụng đánh dấu phóng xạ, DNA yêu cầu chất lượng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này [1]

Cùng với sự phát triển của kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn Một cặp mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát, sau đó đoạn DNA được khuếch đại được cắt bằng enzyme cắt hạn chế, điện di và phân tích trên gel nhuộm ethidium bromide hoặc bạc PCR-RFLP bỏ qua bước lai phóng xạ nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phương pháp RFLP

2.1.3 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

AFLP được định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gene, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt

Kỹ thuật AFLP dựa trên nguyên tắc sử dụng kỹ thuật PCR để nhân bản các đoạn DNA đã bị cắt bởi enzyme cắt giới hạn Khâu quan trọng của kỹ thuật này là thiết kế các primer đặc trưng, được thực hiện bằng cách cắt DNA mẫu bằng hai enzyme cắt giới hạn DNA bị cắt thành nhiều đoạn có kích thước khác nhau nhưng trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn cắt giống nhau và đã xác định Dựa vào trình tự đã biết ở hai đầu cắt, ta thiết kế các đoạn oligonucletide ngắn (adapter) và gắn chúng vào hai đầu cắt Dựa vào trình tự adapter, thiết kế primer PCR gồm hai phần: phần có trình tự bổ sung với adapter và phần có 1-3 nucleotide tùy ý và tiến hành phản ứng PCR [29].Các bước thực hiện: gồm 5 bước cơ bản [29].

Bước 1: Ly trích DNA

Điều kiện tiên quyết cho phản ứng AFLP là DNA sạch và không bị gãyBước 2: Cắt DNA bằng enzyme giới hạn

Sử dụng hai enzyme cắt giới hạn

Một enzyme có trình tự cắt thông thường: tạo những đoạn cắt nhỏ, chúng sẽ được khuếch đại tốt và có phạm vi kích thước tối ưu khi phân tách trên gel

Một enzyme có trình tự cắt hiếm: giới hạn số lượng đoạn cắt được khuếch đại

Bước 3: Nối đoạn DNA với các adapter (trình tự tiếp hợp)

Adapter chứa một trình tự lõi và một trình tự chuyên biệt thích hợp để nối vào đầu đoạn cắt Trình tự lõi của adapter chứa một đoạn DNA khoảng

20 nucleotide đã biết trình tự, chúng sẽ được dùng để thiết kế primer trong phản ứng PCR

Bước 4: Khuếch đại các đoạn cắt giới hạn

DNA được khuếch đại qua 2 giai đoạn

Giai đoạn 1: Giai đoạn khuếch đại tiền chọn lọc Khuôn mẫu là các DNA

đã gắn adapter ở bước 3, sử dụng primer tiền chọn lọc là DNA mạch đơn có trình tự bổ sung với trình tự của adapter có thêm 1 nucleotide ở đầu 3’

Giai đoạn 2: Giai đoạn khuếch đại chọn lọc Khuôn mẫu là các DNA ở giai đoạn 1, sử dụng primer chọn lọc có trình tự tương tự primer tiền chọn lọc và có thêm 2-3 nucleotide ở đầu 3’

Bước 5: Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di và xử lý số liệu bằng phần mềm thông dụng để đánh giá sự khác biệt di truyền và đa dạng sinh học của mẫu nghiên cứu

Ưu và nhược điểm của phương pháp

Ưu điểm

- Lượng DNA cần dùng ít

- Tạo được nhiều băng khuếch đại, khả năng tạo đa hình cao, chỉ thị phân tử cho lượng thông tin cao

- Kết quả có độ tin cậy cao, có khả năng lặp lại

- Không cần biết trước trình tự bộ gene hoặc sử dụng đầu dò

- Rất hữu dụng trong việc tạo nhanh bản đồ gene [7]

Nhược điểm

- Tạo được lượng lớn thông tin và cần phân tích trên máy vi tính

- Đòi hỏi có chuyên môn, kỹ thuật trong phòng thí nghiệm và đặc biệt trong kỹ thuật phân tích số liệu [7]

2.1.4 SSR (Simple Sequence Repeat)

Nguyên lý: kỹ thuật này dựa vào nguyên lý giữa các giống khác nhau có một đoạn DNA ổn định và chuyên biệt có trình tự đơn giản gồm khoàng 2-6 nuleotide được lặp lại nhiều lần Thực hiện phản ứng PCR dùng các primer chuyên biệt để nhân bản đoạn DNA này lên Điều quan trọng là phải biết được những trình tự lặp lại chuyên biệt này để thiết kế primer cho từng

giống Kỹ thuật SSR có độ tin cậy cao, chủ yếu dùng để định danh những giống hay những loài rất gần nhau về mặt di truyền.

Các bước thực hiện: gồm bốn bước [8]

- Bước 1: Tách chiết và tinh sạch DNA của các mẫu nghiên cứu

- Bước 2: Thực hiện phản ứng PCR với các primer đặc trưng cho các đoạn lặp lại đơn giản

- Bước 3: Điện di và đọc kết quả trên gel polyacrylamide Tính toán số liệu, xác định mức độ giống nhau và khác nhau giữa các đoạn lặp DNA

- Bước 4: Xử lý số liệu bằng các phần mềm NTSYSpc, SYSTAT lập bản đồ di truyền và dựng cây phát sinh chủng loại

Ưu và nhược điểm của kỹ thuật SSR:

Mỗi ty thể có từ 2 đến 10 bản sao của DNA và bởi vì mỗi tế bào chứa từ hàng trăm cho đến hàng triệu ty thể nên số lượng DNA ty thể rất lớn Trong

tế bào trứng động vật có xương sống, ước tính con số này lên đến 108 Với

số lượng bản sao lớn như vậy nên có thể thu được DNA ty thể có giá trị cho các phân tích quan hệ di truyền từ một số lượng ít tế bào

DNA ty thể có các đặc điểm cơ bản sau [18]:

- Tốc độ đột biến lớn gấp 5-10 lần so với hệ gen nhân

- Số lượng bản sao lớn

- Đơn bội, hầu như không có sự tái tổ hợp

- Di truyền theo dòng mẹ ở phần lớn các loài

Phân tử mtDNA có tốc độ tiến hóa nhanh hơn 5-10 lần so với các gen nhân do cơ chế sửa chữa tái bản DNA không hiệu quả do đó dẫn đến nhiều biến dị trong ty thể, không chỉ giữa các loài mà còn cả trong một loài Bên cạnh đó, các biến dị này không giống nhau giữa các ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tế bào khác nhau MtDNA có đặc điểm đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ, tồn tại với số lượng bản sao lớn Các đặc điểm trên cùng với việc mtDNA bền vững hơn DNA trong nhân trong khi tách chiết do có cấu trúc dạng vòng, nên sử dụng mtDNA như là một công cụ phân tử trong việc phân tích các mối quan hệ tiến hóa và biến đổi di truyền trong loài và giữa các loài có nhiều thuận lợi [18]

Cơ chế di truyền của mtDNA

MtDNA được di truyền theo dòng mẹ thông qua tế bào chất của noãn bào Trong quá trình hình thành hợp tử, tinh trùng cung cấp cho trứng genome nhân của nó, không cung cấp hoặc đóng góp rất ít tế bào chất, mtDNA vào hợp tử Kết quả là hầu như tất cả ty thể trong phôi đều có nguồn gốc từ trứng Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tinh trùng bị loại bỏ ngay sau khi vào trứng Một số cơ chế được đưa ra nhằm giải thích hiện tượng này đó

là : (1) do sự phân hủy protein phụ thuộc ubiquitin, (2) do hiện tượng pha loãng, phân hủy mtDNA của tinh trùng, (3) do sự khác nhau về trao đổi chất giữa hợp tử và tinh trùng Tuy nhiên những cơ chế này vẫn chưa phải là những lời giải thích thỏa đáng và thật sự thuyết phục.

DNA ty thể được sao chép từ 2 điểm khởi đầu Sự tái bản DNA bắt đầu

từ chuỗi nặng tiếp tục cho đến hai phần ba vòng của phân tử mtDNA, chuỗi mới sẽ thay thế chuỗi nặng ban đầu cho đến khi nó tìm được điểm khởi đầu của chuỗi nhẹ Phiên mã của mtDNA được khởi đầu từ 2 promoter trong vùng D-loop Hai sợi phiên mã theo 2 chiều ngược nhau quanh một vòng để hình thành những phân tử RNA polycistronic Các tRNA được tạo thành nhờ ngắt quãng các trình tự dài hơn của rRNA và mRNA, sau đó chúng được cuộn xoắn trong các bản phiên mã và được phân cắt Các mRNA tự do được polyadenyl hóa sau phiên mã và tRNA được biến đổi thêm CCA vào cuối đầu 3’ [18]

Trong đó: Pi là tần suất xuất hiện của allele thứ i

3.1 Một số thành tựu về định loại phân tử thằn lằn bóng trên thế giới và Việt Nam

3.1.1 Trên thế giới

Masanao Honda, Hidetoshi Ota, Mari Kobayashi, Jaruijinn Nabhitabhata, Hoi- Sen Yong và Tsutomu Hikida (1999) đã nghiên cứu sự

tiến hóa của họ thằn lằn bóng Mabuya, đánh giá trên lĩnh vực phân tử Mối quan hệ phát sinh loài giữa thằn lằn bóng châu Á và châu Phi (họ Mabuya)

được suy ra bằng chỉ thị phân tử hệ gen ty thể 12S và 16S rRNA Kết quả chỉ

ra rằng có 2 dòng riêng biệt trong mỗi nhóm, nhóm Mabuya châu Á bao gồm

Lamprolepis và Lygosoma, nhóm Mabuya châu Phi bao gồm Apterygodon và Dasia Nghiên cứu cũng bác bỏ giả thuyết của Greer (1977) về sự độc lập của Lamprolepis và Lygosoma, đồng thời khẳng định 2 chi này xuất hiện trước và phân chia thành Mabuya Châu Phi và Mabuya Châu Á gồm 2 nhánh Apterygodon và Dasia [22].

Patrick Mausfeld, Miguel Vences, Andreas Schmitz, và Michael Veitht (2000) đã cung cấp các dữ liệu phân tử đầu tiên về dòng địa lý của giống

Mabuya Phân đoạn 487 bp của hệ gen ty thể 16S rRNA 26 loài Mabuya

được phân tích để đánh giá mối quan hệ di truyền của các loài Những loài thuộc châu Phi và Madagascar hình thành nên một nhóm đơn ngành mà có quan hệ với nhóm bao gồm các loài từ châu Á và Nam Mỹ Những kết quả

ban đầu nhận định rằng Mabuya ở Madagascar có thể từ châu Phi thông qua

nước Mozambique [30]

A Brehm, J Jesus, M Pinheiro và D J Harris (2001) đã đánh giá mối

quan hệ giữa các loài thằn lằn bóng giống Mabuya ở đảo Cape Verde dựa

trên hệ gen ty thể và trình tự DNA nhân Một phần trình tự DNA của hệ gen

ty thể (12S rRNA và C-mos) và trình tự DNA nhân được sử dụng để đánh giá

mối quan hệ phát sinh loài giữa 6 loài thằn lằn bóng hiện có trên đảo Cape Verde Archipelago Các loài tạo thành một đơn vị đơn ngành, cho thấy một thuộc địa duy nhất của hòn đảo, có thể là từ Tây Phi Các loài thằn lằn bóng

trên đảo có thể chia thành 2 nhóm: nhóm thứ nhất bao gồm M vaillanti từ Fongo và Santiago và M delalandii, nhóm thứ hai bao gồm các giống còn lại

được phân chia dựa trên đặc điểm hình thái [19]

Patrick Mausfeld và các cộng sự (2002) đã nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài của Mabuya atlantica Schmidt, 1945 là loài đặc hữu của quần đảo Fernando de Noronha thuộc Đại Tây Dương (Brazil) Vị trí phân loại của

thằn lằn bóng Mabuya atlantica được nghiên cứu dựa trên phân đoạn 16S và 12S rRNA Kết quả cho thấy M atlantica khả năng có nguồn gốc từ Madagasy hơn là Nam Mỹ M atlantica có thể đại diện do việc phát tán

xuyên lục địa của loài Mabuya từ bờ biển Tây Nam Châu Phi [30]

S Carranza và E.N Arnold (2003) đã điều tra về nguồn gốc của sự

phân bố xuyên đại dương của loài thằn lằn bóng Mabuya bằng chỉ thị mtDNA Sự phát sinh loài Mabuya dựa trên hệ gen ty thể (305 bp cytochrome b, 379 bp 12S rRNA và 388 bp 16S rRNA) được sử dụng để cho

thấy rằng chi này xâm chiếm vùng nhiệt đới châu Mỹ từ châu Phi hai lần trong 9 triệu năm trước, một lần đến lục địa Mỹ và một đến các đảo của Fernando de Noronha, ít nhất 3.000 km cho hai cuộc hành trình [20]

Patrick Mausfeld, Andreas Schmitz (2003) đã nghiên cứu sự đa dạng

chủng loại và hình thành loài của thằn lằn bóng châu Á Eutropis Fitzinger,

1843 Nghiên cứu sử dụng 2 phân đoạn 16S rRNA gồm 564 bp và 12S rRNA

gồm 408 bp Kết quả cho thấy loài Trung Đông chắc chắn không thuộc

Eutropis, thay vào đó các loài Eutropis auratus (L.) và Eutropis septemtaeniatus có thể đại diện cho các loài riêng biệt Thêm vào đó, nghiên cứu làm sáng tỏ hệ thống phân loại học của chi Apterygodon Edeling, giả định cho rằng nó bắt nguồn từ Eutropis Apterygodon không thực sự phản ánh một đơn vị phân ngành, nó tương đồng với Dasia Gray Dựa trên chỉ thị

phân tử mtDNA nghiên cứu đã chỉ ra được bằng chứng cho sự đơn ngành

của thằn lằn bóng châu Á Eutropis Fitzinger, chứng minh hệ thống phát sinh loài của Eutropis multifasciata (Kuhl) và xác nhận rằng sự khác biệt của một phân loài E m balinensis Mertens là không hợp lý Tương tự như vậy, kết

quả chỉ ra sự cần thiết phải nghiên cứu sâu hơn về Eutropis macularia, có ít nhất hai loài khác nhau được giấu dưới tên E macularia (Blyth) [30].

José Jesus, D James Harris, António Brehm (2005) đánh giá dòng địa

lý của Mabuya maculilabris của đảo São Tomé thông qua chỉ thị DNA ty thể (12S rRNA, 16R rRNA, cytochrome c) Nghiên cứu đã phát hiện 44 điểm đa

hình khác nhau thuộc 66 cá thể thu nhận ở 12 vị trí thuộc đảo São Tomé Kết quả nghiên cứu phù hợp với lịch sử địa lý của vùng đảo nơi hoạt động của núi lửa với dòng chảy dung nham đã xuất hiện trong một vài giai đoạn Cấu trúc di truyền trọng yếu giữa các loài thằn lằn bóng này là sự khác biệt mức

độ cao giữa phân bố bờ nam (đặc biệt những vùng thuộc Rolas Islet) và vùng còn lại [25]

José Jesus, António Brehm, D James Harris (2005) đã phân tích trình tự

hệ gen ty thể bao gồm 12S rRNA, 16S rRNA và cytochrome b để xác định mối quan hệ di truyền của các giống Mabuya sp của đảo Gulf của Guinea Kết quả công trình cho thấy Mabuya maculilabris có thể là một giống phức hợp, có sự khác nhau khá lớn so với các giống Mabuya của đại lục Mabuya affinis, Mabuya azorii và Mabuya maculilabris có mối quan hệ không mật

thiết, điều này được giải thích do vùng đất này đã từng bị thuộc địa hóa bởi nhiều quốc gia khác nhau [26]

Sara Rocha, Miguel A Carretero, D James Harris (2010) đã nghiên cứu

đa dạng di truyền và mối quan hệ tiến hóa của giống Mabuya của các đảo Tây Ấn Độ Dương Một phân đoạn xấp xỉ 700 bp của cytochrome c và trình

tự 16S rRNA được sử dụng làm chỉ thị phân tử để đánh giá mức độ quan hệ

di truyền của 5 giống M maculibaris, M comorensis, M atriata, M wrightii, M sechellensis [34].

Miralles, S Caranza (2010) đã đánh giá hệ thống địa sinh học của giống

thằn lằn bóng Mabuya Neotropical, đặc biệt nhấn mạnh giống Mabuya

nigropunctata Nghiên cứu sử dụng 1532 bp của hệ gen ty thể để phân tích

sự hình thành loài của 106 giống Mabuya Neotropical Kết quả nghiên cứu

chỉ ra được 3 sự khác nhau lớn của các nhóm thằn lằn bóng Tây, Nam và

Đông Amazonia Kết quả cho thấy mối quan hệ phát sinh loài của Mabuya

Neotropical được công bố bởi Whiting và cộng sự (2006) là không chính xác [31]

Aniruddha Data-Roy, Mewa Sigh, C Srinivasulu, K Praveen Karanth

(2012) đã phân tích trình tự hệ gen ty thể 16S rRNA và 12S rRNA của 44 loài

thuộc Đông Nam Á và Nam Á, Afro-Malagasy, Neotropical và Cape

Verdean Kết quả nghiên cứu chỉ ra nguồn gốc ban đầu của Eutropis Đông

Nam Á vào Ấn Độ khoảng 5,5 đến 17 triệu năm trước khi châu Á và châu phi nối liền nhau [21]

Năm 1996, trong Danh lục ếch nhái, bò sát Việt Nam của Nguyễn Văn

Sáng, Hồ Thu Cúc đã thống kê ở Việt Nam hiện có 5 loài thuộc giống Mabuya Fitzinger, 1826 bao gồm: Mabuya longicaudata, Mabuya chapaensis, Mabuya macularia, Mabuya multifasciata, Mabuya darevski [14].

Những năm tiếp theo, có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần loài ếch nhái, bò sát đã ghi nhận sự có mặt của các loài Thằn lằn bóng ở nhiều nơi khác nhau, điển hình như: Lê Nguyên Ngật (1997) đã xác định

ở vùng núi Ngọc Linh (Kon Tum) có loài Mabuya multifasciata Nguyễn

Văn Sáng, Alexander L Monastyrskii (1998) xác nhận ở Xuân Liên,

Thường Xuân, Thanh Hóa có 2 loài là: Mabuya multifasciata và Mabuya macularia [14].

Năm 1998, Ngô Đắc Chứng đã nghiên cứu thành phần loài lưỡng cư và

bò sát của khu vực phía Nam Bình Trị Thiên Kết quả nghiên cứu cho thấy khu vực Nam Bình Trị Thiên có 102 loài lưỡng cư và bò sát thuộc 3 bộ và 21

họ khác nhau Về bò sát có 2 bộ, 15 họ, với 74 loài trong đó họ thằn lằn bóng

Scincidae có 8 loài bao gồm: Emola laobaoensis Buorret, 1937; Leiolepisma Eunice Cochran, 1927; Mabuya macularia (Blyth, 1853); Mabuya longicaudata (Halowell, 1857); Riopa bowringi (Giither, 1864); Saiphos poilanti Bourret, 1937; Saiphos trigigitum Burrer, 1939; Mabuya sp [3].

Năm 2007, Lê Thắng Lợi, Ngô Đắc Chứng đã phân tích một số đặc

điểm sinh học, sinh thái của 2 loài thằn lằn bóng giống Mabuya Fitzinger,

1826 (M logicaudata, M multifasciata) ở Thừa Thiên Huế Công trình đã

nghiên cứu về các đặc điểm sinh thái của thằn lằn bóng về phân bố, thành phần thức ăn, các đặc điểm về sinh sản Nghiên cứu đã bổ sung một số hiểu biết về thằn lằn bóng tại Thừa Thiên Huế mà các tài liệu có được cho đến nay chưa đề cập hoặc đề cập còn ít, cung cấp một số cơ sở khoa học cho việc khai thác, sử dụng chăn nuôi và bảo vệ nguồn lợi này ở nước ta [9]

Năm 2008, Trần Quốc Dung, Nguyễn Đình Thi, Ngô Đắc Chứng, Trần

Văn Thiện đã phân tích tính đa hình gen 16S rRNA ty thể của hai loài nhông cát Leiolepis guentherpetersi và Leiolepis reevesii ở Thừa Thiên Huế Công trình đã phân tích trình tự 16S rRNA để nhận dạng 2 loài với độ tương đồng

91,1 đến 91,6% và độ khác biệt lên đến 8,8-9,3%, đồng thời đăng ký trình tự

16S rRNA của các cá thể L guentherpetersi và L reevesii trên ngân hàng

GenBank [5]

Nói chung, các nghiên cứu đã công bố về thằn lằn bóng ở Việt Nam chỉ mới tập trung về mặt sinh học, sinh thái, khu hệ và định loại

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và vật liệu

Các mẫu đuôi của thằn lằn bóng Eutropis multifasciata Kuhl, 1820 thu

được ở miền Trung và Tây Nguyên

Loài: Eutropis multifasciata Kuhl, 1820

Bảng 2.1 Cặp primer đặc hiệu cho đoạn gen 12S rRNA của hệ gen ty

thể thằn lằn bóng Eutropis multifasciata Kuhl, 1820

- Chủng vi khuẩn E.coli Top 10

- Vector tạo dòng pGEM

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành tại phòng kỹ thuật gen, trung tâm ươm tạo

và chuyển giao công nghệ, Đại học Huế

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu thuộc các hãng sản xuất được trình bày lần lượt ở bảng 2.1

Bảng 2.2 Những thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu

Các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu là hóa chất của các hãng Sigma (Mỹ) và Merck (Đức) được trình bày ở bảng 2.2

Bảng 2.3 Thành phần các loại dung dịch và đệm dùng trong nghiên cứu

Dung dịch phá tế bào 10mM Tris, 100 mM EDTA, 2% SDS, pH

8.0

25-24-1