phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy pyrene và khả năng xử lý nước thải ở quy mô phòng thí nghiệm 5 lít

Mục tiêu của đề tài - Phân lập tuyển chọn định tên , và kiểm tra khả năng phân hủy pyrene của chủng vi khuẩn được phân lập từ nguồn nước thải của khu công nghiệp Từ Liêm - Nghiên cứu kh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

Ở QUY MÔ PHÕNG THÍ NGHIỆM 5 LÍT

Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGHIÊM NGỌC MINH

THÁI NGUYÊN - 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác

Tác giả

Nguyên Hương Quỳnh

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới:

PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh, trưởng phòng Công nghệ Sinh học Môi trường,

Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án

Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của các cán bộ phòng Công nghệ Sinh học Môi trường, đặc biệt là

KS Cung Thị Ngọc Mai, CN Vũ Thị Thanh đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực

hiện luận văn của mình

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô khoa Sinh trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên, lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện và giúp đõ tôi trong quá trình học tập nghiên cứu tại trường và tại Viện

Bên cạnh đó tôi xin cảm ơn người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo điều kiện động viên và giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn này

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2011

Học viên

Nguyễn Hương Quỳnh

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt v

Danh mục các bảng vi

Danh mục các hình vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đặc điểm chung của PAH 3

1.1.1 Cấu trúc hóa học và một số đặc tính cơ bản của PAH 3

1.1.2 Tính độc và ảnh hưởng của PAH tới con người và môi trường 5

1.2 Nguồn gốc phát sinh PAH 7

1.3 Tình trạng ô nhiễm PAH và các biện pháp xử lý 9

1.3.1 Tình trạng ô nhiễm PAH 9

1.3.2 Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH 11

1.4 Phân hủy sinh học các PAH bởi vi sinh vật 14

1.4.1 Vi sinh vật phân hủy PAH 14

1.4.2 Cơ chế phân hủy PAH bởi vi sinh vật 16

1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình phân hủy PAH 22

1.5 Các phương pháp phân loại vi sinh vật 26

1.5.1 Phân loại theo phương pháp cổ điển 26

1.5.2 Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử 26

1.6 Quá trình xử lý sinh học nước thải và thành phần các chất ô nhiễm điển hình trong nước thải công nghiệp 29

1.6.1 Quá trình xử lý sinh học nước thải 29

1.6.2 Thành phần các chất ô nhiễm điển hình trong nước thải công nghiệp 31

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 33

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và các thiết bị sử dụng 33

2.1.1 Nguyên liệu 33

2.1.2 Hóa chất, môi trường 33

2.1.3 Thiết bị 34

2.2 Phương pháp nghiên cứu 35

2.2.1 Thu thập mẫu nước thải 35

2.2.2 Làm giàu tập đoàn vi sinh vật trên môi trường chứa hỗn hợp PAH 35

2.2.3 Phân lập một số chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng PAH 35

2.2.4 Quan sát hình thái tế bào trên kính hiển vi điện tử quét 36

2.2.5 Phân loại, định tên và xây dựng cây phát sinh chủng loại 36

2.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng lên sự phát triển của các chủng vi khuẩn được lựa chọn 37

2.2.7 Xác định khả năng phân hủy pyrene của vi khuẩn 42

2.3 Thử nghiệm trên quy mô 5 lít 43

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường chứa PAH 44

3.2 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng BTL4 47

3.3 Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng vi khuẩn BTL4 47

3.3.1 Tách chiết DNA tổng số và nhân đoạn gen 16S rRNA của chủng BTL4 47

3.3.2 Tách dòng gen 16S rRNA của chủng BTL4 48

3.3.3 Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BTL4 50

3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến sự phát triển của chủng BTL4 53

3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 53

3.4.2 Ảnh hưởng của pH 54

3.5 Khả năng phân hủy pyrene của chủng BTL4 55

3.6 Kết quả mô hình xử lý nước thải ở quy mô 5 lít 58

3.6.1 Quá trình hoạt hóa bùn 58

3.6.2 Xử lý nước thải ở quy mô 5 lít 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

môi trường Hoa Kỳ)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Tính chất vật lý của một số PAH 4 Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH 15 Bảng 1.3: Một số phương pháp phân loại vi sinh vật 28

Bảng 3.1: Chủng vi khuẩn phát triển trên môi trường khoáng có bổ sung hỗn

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) 3

Hình 1.2: Các con đường phân hủy hiếu khí PAH chính của vi khuẩn và nấm 16

Hình 1.3: Con đường phân hủy napthalene ở Pseudomonas 19

Hình 1.4: Con đường phân hủy pyrene ở Mycobacterium sp AP1 20

Hình 1.5: Con đường phân hủy anthracene ở Mycobacterium sp PYR-1 21

Hình 3.1: Mẫu làm giàu lần 3 của mẫu nước thải lấy từ khu công nghiệp Từ Liêm 44

Hình 3.2: Tập đoàn vi sinh vật trên môi trường khoáng thạch với 50 ppm PAH sau 3 lần làm giàu: (A) có bổ sung glucose, (B) không bổ sung glucose 45

Hình 3.3: (A) Hình thái khuẩn lạc và (B) hình thái tế bào chủng BTL 4 47

Hình 3.4: Điện di đồ DNA tổng số chủng BTL4 (A), và kiểm tra nhân đoạn gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR (B) 48

Hình 3.5: Kết quả biến nạp chủng BTL4(A), và điện di đồ DNA plasmid của dòng số 2 từ BTL4 trên gel agarose 1% plasmid của chủng lạc mầu xanh (B) 49

Hình 3.6: Sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng số 2 từ BTL4 50

Hình 3.7: Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng BTL4 51

Hình 3.8: Cây phát sinh chủng loại của chủng BTL4 52

Hình 3.9: Đồ thị thể hiện sự phát triển của chủng BTL4 ở 300C và 370C 54

Hình 3.10: Đồ thị mật độ quang phổ của chủng BTL4 ở các điều kiện pH khác nhau 54

Hình 3.11: Kết quả nuôi BTL4 ở các nồng độ pyrene khác nhau 56

Hình 3.12: Kết quả phân tích khả năng phân hủy pyrene của chủng BTL4 56

Hình 3.13: Quá trình hoạt hóa bùn sau 3 tuần 59

Hình 3.14: Màu sắc của nước thải trước xử lý (A, C) và sau xử lý (B, D) với thời gian lưu của nước thải là 3 ngày 60

MỞ ĐẦU

Nước là nguồn tài nguyên quý giá của nhân loại, không một ai, không một sinh vật nào có thể sống được nếu thiếu nước Tuy nhiên cùng với sự phát triển của mình, con người đang ngày càng làm cho nguồn nước bị ô nhiễm nghiêm trọng trong đó phải kể đến nước thải công nghiệp

Xã hội phát triển, các ngành công nghiệp khác nhau phát triển làm cho các khu công nghiệp không ngừng tăng về số lượng Tính đến tháng 10 năm 2009, toàn quốc

đã có 233 khu công nghiệp được thành lập theo Quyết định của Thủ tướng Chính phủ Trong đó, 171 khu công nghiệp đã đi vào hoạt động, với tổng diện tích đất

57264 ha, đạt tỷ lệ lấp đầy trung bình khoảng 46% [2] Không ai có thể phủ nhân sự độc hại của nước thải công nghiệp, và việc xử lý chúng là một trong nhưng vấn đề

đã được quan tâm, chú ý từ lâu, tuy nhiên do mức độ ô nhiễm và thành phần nước thải của các khu công nghiệp phụ thuộc vào thành phần các nhà máy, làng nghề thuộc khu công nghiệp, làm cho quá trình xử lý nước thải công nghiệp gặp rất nhiều khó khăn

Một trong những chất gây ô nhiễm nghiêm trọng nhất của nước thải công nghiệp là các hydrocarbon thơm đa vòng (PAH - Polycyclic Aromatic Hydrocarbon) PAHs có nguồn gốc khá đa dạng từ dầu mỏ, than đá, sản phẩm phụ của việc đốt nhiên liệu… [1]

PAHs tồn tại trong không khí có khả năng phản ứng với ozone và tạo thành ozone-alken có khả năng gây ung thư tồn tại trong khí quyển, ngoài ra nếu PAHs xâm nhập vào cơ thể con người thông qua con đường thực phẩm, tiếp xúc trực tiếp qua da… có thể gây ung thư, giảm tuổi thọ, đột biến thai nhi… Hầu hết PAHs đều ít tan trong nước nhưng tan tốt trong chất béo và khả năng gây ô nhiễm môi trường của chúng phụ thuộc vào khả năng tan của chúng trong môi trường nước Do tác hại của PAH với con người mà từ lâu con người đã quan tâm nghiên cứu các phương pháp phân hủy PAH Các PAH được nghiên cứu thường là các PAH có cấu tạo đơn giản như antharacene, naphthalene, phenantherene, pyren … trong đó pyren là chất

có cấu tạo phức tạp, có khả năng gây độc hơn những chất còn lại, vì vậy nếu vi

khuẩn có khả năng phân hủy pyren thì cũng có khả năng phân hủy các loại PAH đơn giản khác Có nhiều phương pháp phân hủy pyren như các phương pháp vật lý, hóa học tuy nhiên những phương pháp này vừa đắt lại vừa không triệt để nên khó có thể thực hiện trên quy mô lớn Tuy nhiên ngày nay các nhà khoa học đã thấy rằng không những có thể sử dụng vi sinh vật để loại bỏ pyren mà đó còn là phương pháp vừa rẻ, triệt để và có khả năng thực hiện trên quy mô công nghiệp, có thể tiến hành thuận lợi trong điều kiện tự nhiên, độ an toàn cao và thân thiện với môi trường Do vậy, trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu và điều tra về phân bố, cấu trúc các tập đoàn vi sinh vật, khả năng phân hủy pyren của các chủng đơn cũng như các tập đoàn vi sinh vật

Trong phương pháp này, vi sinh vật đóng vai trò quyết định do có khả năng

xử lý các chất có trong nước thải Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

"Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy pyrene và khả năng xử lý nước thải ở quy mô phòng thí nghiệm 5 lít"

Mục tiêu của đề tài

- Phân lập tuyển chọn định tên , và kiểm tra khả năng phân hủy pyrene của chủng vi khuẩn được phân lập từ nguồn nước thải của khu công nghiệp Từ Liêm

- Nghiên cứu khả năng xử lý nước thải của tập đoàn vi sinh vật được phân lập

từ nguồn nước thải của khu công nghiệp Từ Liêm ở quy mô 5 lít

Nội dung của đề tài:

- Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật trên môi trường chứa PAH

- Nghiên cứu khả năng phân hủy pyrene của chủng vi khuẩn đại diện từ những chủng vi khuẩn đã tuyển chọn được

- Đánh giá ảnh hưởng pH, nhiệt độ lên sự sinh trưởng…

- Thử nghiệm khả năng xử lý nước thải bởi các chủng vi khuẩn phân lập được

ở quy mô 5 lít phòng thí nghiệm

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm chung của PAH

1.1.1 Cấu trúc hóa học và một số đặc tính cơ bản của PAH

Các PAH có mặt khắp nơi trong môi trường, những hợp chất này có 2- 6 vòng benzen kết hợp với nhau, khối lượng phân tử vào khoảng 128 - 278 g/mol Cấu trúc hóa học của một số loại PAH được thể hiện ở hình 1.1

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocarbon thơm đa nhân (PAH)

PAH tinh khiết tồn tại ở thể rắn không màu, màu trắng hoặc màu vàng chanh ở

PAH có những tính chất vật lí, hóa học khác nhau

Tuy nhiên hầu hết các PAH đều ít tan trong nước, có áp suất hơi thấp nhưng lại tan tốt trong chất béo và có nhiệt độ nóng chảy, nhiệt độ sôi cao [57] Khả năng gây ô nhiễm môi trường tùy thuộc khả năng hòa tan của chúng trong môi trường

nước [16] Đặc điểm về khả năng hòa tan và áp suất hơi của PAH là nhân tố chính ảnh hưởng đến khả năng phân tán của chúng trong khí quyển, thủy quyển và sinh quyển Số lượng vòng benzen trong cấu trúc hóa học của các PAH quyết định khả năng hòa tan của các PAH trong nước PAH giảm khả năng hòa tan trong nước hay tăng tính kỵ nước khi số lượng vòng benzen tăng [59] Khả năng hòa tan của các PAH rất biến động, từ những chất khó hòa tan nhất là Benzo[g,h,i]perylene có chỉ

số hòa tan là 0,0003 mg/l cho đến chất dễ hòa tan nhất là naphthalen có chỉ số hòa tan tới 31 mg/l Nếu khả năng hòa tan trong nước của PAH thấp, hay hệ số hấp phụ cao sẽ dẫn đến các PAH có xu hướng bị hấp phụ trong cặn bùn, đất đá và trầm tích,

do đó ảnh hưởng rất nhiều tới khả năng chúng bị phân hủy sinh học bởi vi sinh vật [12] Ngược lại, khả năng hòa tan trong nước của PAH cao thì khả năng bị phân hủy bởi vi sinh vật cũng cao Điều đó cho thấy khả năng hòa tan trong nước của các PAH có ảnh hưởng đặc biệt quan trọng trong quá trình phân hủy sinh học PAH Tính chất vật lý của một số PAH được chỉ ra ở bảng 1.1

Nhiệt

độ sôi ( 0 C)

Độ tan trong nước (mg/l)

LogKp d

Áp suất hơi ở

20 0 C (torr)

Trong các tính chất vật lý của PAH, hệ số Kpd phản ánh khả năng hấp phụ

cao, các PAH có xu hướng tăng khả năng hấp phụ lên bề mặt các vật liệu rắn, đồng nghĩa với sự giảm khả năng phân hủy sinh học

Áp suất hơi và nhiệt độ sôi cũng có vai trò quan trọng trong quá trình xử lý loại bỏ PAH khỏi các địa điểm ô nhiễm, nó ảnh hưởng đến khả năng hóa hơi của mỗi PAH, mà sự bay hơi cũng là một con đường để loại bỏ PAH khỏi nguồn ô nhiễm Khi áp suất hơi tăng, khả năng bay hơi cũng tăng Khả năng bay hơi cũng phụ thuộc vào kích thước và khối lượng phân tử Từ cấu trúc phân tử PAH ở trên và bảng 1.1 ta thấy, naphthalene có kích thước nhỏ nhất nên có khả năng bay hơi đến 89%, trong khi đó benzo[a]pyrene là hợp chất có kích thước lớn, chỉ có khả năng bay hơi 1% Phenanthrene là đồng phân của anthracene có độ bay hơi thấp hơn do cấu trúc phân tử chứa các vòng thơm không thẳng hàng như trong cấu trúc của anthracene [27]

Ngoài ra, PAH có thể bị quang phân khi tiếp xúc với tia tử ngoại từ bức xạ mặt trời Trong không khí PAH còn có thể phản ứng với nhiều chất tồn tại trong khí

các chất có khả năng gây ô nhiễm và hủy hoại môi trường sống mạnh [27]

1.1.2 Tính độc và ảnh hưởng của PAH tới con người và môi trường

Tính độc của PAH đã được người ta biết đến từ những năm 30 của thế kỷ XX khi Hieger và Cook cùng những cộng sự khác nghiên cứu và thấy tinh thể benzo[a]pyrene màu vàng gây khối u ở động vật thí nghiệm [24 Một số nghiên cứu trên chuột cũng đã chứng minh rằng sự tiêu hóa benzo[a]pyrene ở nồng độ cao trong suốt quá trình mang thai của chuột sẽ dẫn đến việc sảy thai hoặc làm giảm cân chuột con khi mới sinh ra, ngoài ra nếu bị phơi nhiễm PAH trong thời gian dài chuột dễ bị các bệnh như: ung thư phổi qua đường hô hấp, ung thư dạ dày từ việc tiêu hóa thức ăn có PAH và ung thư da do tiếp xúc trực tiếp với PAH qua da Với con người, PAH có thể là tác nhân gây đột biến và dẫn đến ung thư [13, 16, 27] Một vài nghiên cứu trên đối tượng động, thực vật cho thấy, động vật nếu tiếp xúc

với naphthalene ở nồng độ cao thì chỉ trong thời gian ngắn cũng có thể gây mờ mắt, gây độc ở mức độ vừa phải Hiệu ứng mạnh hơn, naphthalene có thể gây chậm phát triển, thậm chí gây chết với động thực vật Nghiên cứu ngưỡng độc của naphthalene

50% mẫu sinh vật thí nghiệm) Bằng việc thử nghiệm với một nhóm chuột cho sử dụng anthracene với lượng 1,8 µg/l, người ta thấy rằng, sau 2 tuần gây nhiễm, tỷ lệ chuột xuất hiện khối u là 40% [27]

Trong thực tế, các nhà khoa học cũng đã tiến hành nhiều nghiên cứu để xác định khả năng gây ảnh hưởng của PAH đến sức khỏe con người Người ta đã tiến hành điều tra những người công nhân sống ở những nơi bị ô nhiễm PAH trong thời gian dài và nhận thấy rằng những người này có nguy cơ bị mắc các như bệnh ung thư da, ung thư phổi và ung thư dạ dày cao hơn những người bình thường Tuy hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu nào cho thấy rằng PAH có thể giết chết con người sau khi xâm nhập vào cơ thể nhưng những tác động của chúng đến cơ thể con người là khá rõ ràng Anthracene và naphthalene có thể gây dị ứng, viêm, sưng tấy da khi tiếp xúc trong thời gian ngắn Phenanthrene được biết như chất cảm quang với da người, chất gây dị ứng với động vật, đột biến tới hệ thống vi khuẩn trong các điều kiện đặc biệt Chất này gây yếu các nhiễm sắc thể tương đồng và kìm hãm sự nối liền các kẽ hở gian bào Các PAH khác như acenaphthalene, fluoranthene, fluorene đều gây độc cho động và thực vật Độc tính của benzo[a]pyrene, benzo[a]anthracene,

indenol[1,2,3-c,d]pyrene đã được nghiên cứu chứng minh gây ung thư cho người Trong tự nhiên hiếm khi bắt gặp các PAH đơn lẻ mà chỉ gặp chúng ở dạng hỗn hợp nhiều PAH, điều này càng làm cho độc tính của chúng càng được tăng cường [ 56] Khi xâm nhập vào cơ thể, PAH nhanh chóng xâm nhập và tích tụ trong các mô

mỡ và tiếp tục di chuyển đến những cơ quan khác Tùy từng loại PAH với liều lượng và thời gian tác động mà mức độ ảnh hưởng đến cơ thể khác nhau Chẳng hạn, với naphthalene, nếu tiếp xúc trong thời gian ngắn, nồng độ thấp, nó có thể gây

dị ứng, viêm tấy da, mắt Khi xâm nhập vào hệ tiêu hóa, naphthalene sẽ gây bệnh

thiếu máu do chúng phá vỡ các tế bào hồng cầu Nếu tiếp xúc với naphthalene trong thời gian dài với nồng độ lớn hơn 10 ppm sẽ dẫn tới các bệnh kinh niên, gây ung thư da phổi và có thể làm giảm khả năng thụ thai ở phụ nữ và có thể làm nguy hiểm tới sự phát triển của thai nhi [27]

Tính độc của PAH không những phụ thuộc vào nồng độ, cấu trúc hóa học, độ phân cực của các nguyên tố mang điện tích trong phân tử mà còn phụ thuộc vào những yếu tố môi trường như: ánh sáng, nhiệt độ… Tuy hiện nay các nghiên cứu để chứng minh tính độc của mỗi loại PAH đơn lẻ là không nhiều nhưng người ta cũng

đã xác định được 8 loại PAH có khả năng gây ung thư trên cơ thể người đó là:

benzo[a]anthracene, chrysen, benzo[b]fluoranthene, benzo[k]fluoranthene, BaP,

indeno[1,2,3-cd]pyren, dibenzo[ah]anthrancene và benzo[ghi]perylene [57] Ở một

số vùng bờ biển bị ô nhiễm bởi các hợp chất PAH thì một số loài cá và các sinh vật sống dưới nước khác sẽ tích tụ một lượng PAH nhất định từ đó có thể đe dọa tới sức khoẻ con người thông qua việc tiêu dùng đồ biển Do tính độc hại như vậy, Cục Bảo

vệ môi trường Mỹ (USEPA) đã liệt PAH vào danh sách những chất ô nhiễm điển hình và tiến hành kiểm định sự có mặt của chúng trong hệ sinh thái dưới nước cũng như trên cạn [16, 56] Cơ quan này cũng đã đưa ra mức nồng độ an toàn của PAH trong quá trình tiếp xúc để tránh gây ảnh hưởng đến sức khoẻ con người để chúng ta tham khảo, theo đó không nên tiếp xúc với một số loại PAH có nồng độ cao hơn các mức sau: 0.3 mg anthracene/kg cơ thể người, 0.06 mg acenaphthene/kg cơ thể người, 0.04 mg fluoranthene/kg cơ thể người và 0.03 mg pyrene/kg cơ thể người

1.2 Nguồn gốc phát sinh PAH

Có nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến sự phát sinh PAH tuy nhiên chúng đều bắt nguồn từ quá trình đốt cháy các vật liệu hữu cơ trong tự nhiên hay trong các hoạt động sản xuất của con người Trong tự nhiên, sự phát sinh PAH là từ các quá trình địa chất tự nhiên như: sự phun trào núi lửa, hóa lỏng khí than, cháy rừng, cháy đồng cỏ… nhưng phần lớn lượng PAH tồn tại trong môi trường hiện nay đều bắt nguồn từ các hoạt động sản xuất của con người PAH được hình thành từ quá trình khai thác than và dầu mỏ, sự đốt cháy các khí thiên nhiên, xử lý phế thải, từ khí thải

của các phương tiện giao thông, từ quá trình chế biến thức ăn hay trong khói thuốc lá…[46] Như vậy, PAH có thể được hình thành từ nhiều quá trình khác nhau tuy nhiên chúng ta có thể tóm tắt những nguồn phát sinh chính như sau:

- Các quá trình sản xuất công nghiệp: các công đoạn đúc sắt, thép, sản xuất nhôm, sản xuất than chì, quá trình bẻ gãy các liên kết hữu cơ trong sản xuất dầu thô

- Các thiết bị đốt nóng trong công nghiệp, các thiết bị sưởi, tháp chưng cất, các

lò đốt và lò luyện kim

- Các động cơ chạy bằng dầu diezen và các loại khí đốt khác

- Các hoạt động sinh hoạt thường ngày của con người: chế biến thức ăn, sưởi

độ PAH nhanh chóng trong vòng 100 -150 năm trở lại đây [27]

Có tới hàng trăm loại PAH khác nhau nhưng được biết đến nhiều nhất là

benzo[a]pyrene Năm 1981, ở CHLB Đức sự phát tán BaP vào không khí được ước

lượng là khoảng 18 triệu tấn trong đó có khoảng: 30% từ hoạt động sản xuất than, 56% từ quá trình đốt cháy bằng than, 13% từ khí thải của các phương tiện giao thông và khoảng 5% là do sự đốt cháy các nhiên liệu khác [57] Hiện nay sự phát

tán BaP vào không khí không chỉ do các nguyên nhân trên mà còn có sự đóng góp

của một số nguồn phát sinh quan trọng khác: sự đốt cháy các nguyên, nhiên vật liệu trong đời sống sinh hoạt của con người, quá trình đốt cháy các loại phế thải và rác thải, quá trình cracking dầu mỏ… Như vậy, bằng cách trực tiếp hay gián tiếp con người đã làm phát sinh PAH vào môi trường và chính những nguyên nhân này

đã và đang làm cho lượng PAH phát tán vào môi trường ngày càng nhiều, dẫn tới những nguy cơ nghiêm trọng làm ảnh hưởng đến sức khoẻ và môi trường sống của con người

Tuy nhiên, bên cạnh những tính độc của PAH kể trên thì một số loại PAH có ứng dụng lớn trong các ngành công nghiệp như trong công nghiệp dược, nhuộm,

sản xuất đồ nhựa, thuốc tẩy rửa và thuốc trừ sâu [27] Ở New York (Mỹ), hỗn hợp phenanthrene và anthracene được sử dụng để chống rỉ cho những thiết bị trữ nước [27] Benzo[a]pyrene được sử dụng để hạn chế muội và khói, trong công nghệ quét hắc ín, hay còn sử dụng để liên kết các phần tích điện lại với nhau Người ta cũng

có thể tìm thấy trong hợp chất creosote, một chất hóa học được sử dụng làm chất

bảo quản gỗ (PAH chiếm đến 85% khối lượng của creosote) [15] BaP cũng được

sử dụng là tác nhân gây đột biến lên động vật thí nghiệm, để kiểm tra đặc tính gây ung thư của nó trong thời gian ngắn Đặc biệt, phenanthrene còn được ứng dụng trong công nghiệp dược để sản xuất thuốc ngủ [27]

1.3 Tình trạng ô nhiễm PAH và các biện pháp xử lý

1.3.1 Tình trạng ô nhiễm PAH

tấn PAH xâm nhập vào hệ sinh thái nước mỗi năm Đặc biệt với hệ sinh thái biển, tình trạng ô nhiễm PAH thực sự đáng báo động Nguồn phát sinh PAH chủ yếu ở đây là từ phế thải của công nghiệp hóa dầu, công nghiệp khai thác và vận chuyển dầu mỏ, nước thải công nghiệp và sinh hoạt… Không chỉ tồn tại trong môi trường nước tự nhiên PAH còn được tìm thấy trong nhiều mẫu nước uống Người ta đã tiến hành kiểm tra

1 số lượng nước khoáng nhất định và xác định được 6 loại PAH có trong đó:

flouranthene, benzo[b]flouranthene, benzo[k]fluoranthene, BaP, benzo[ghi]perylene

và indeno [1,2,3- cd] pyrene Trong đó 90% mẫu nước kiểm tra có nồng độ 6 loại PAH trên từ 0,001-0,01μg/l, 1% mẫu nước có nồng độ trung bình lớn hơn 0,11μg/l

và nồng độ BaP trong đó là khoảng 0,002-0,024μg/l [27]

Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt của PAH trong các mẫu trầm tích với nồng độ cao Ở vịnh Boston (Mỹ) nồng độ PAH lên tới 100.000 ng/g PAH tích lũy nhiều như vậy là do chúng có khả năng hòa tan kém trong nước nên bị hấp phụ với số lượng lớn vào trong các lớp đá trầm tích [27]

Trong không khí cũng chứa một lượng đáng kể PAH Có khoảng hơn 500 loại PAH và các hợp chất có liên quan đã được phát hiện tuy nhiên lượng lớn nhất phải

kể đến BaP Vào những năm 70 của thế kỷ trước, ở Mỹ nồng độ BaP trung bình

hàng năm là 1-5 ng/m3

còn ở một số thành phố của châu Âu nồng độ BaP là 100

[57]

Trong khí quyển nồng độ PAH thay đổi tuỳ thuộc vào từng khu vực, ở nông

trong khi đó ở các đô thị hàm lượng này là

các khu công nghiệp, các phương tiện giao thông, vận tải và dân cư đông đúc [57] PAH cũng được tìm thấy trong lớp đất bề mặt Nồng độ đặc trưng của PAH trong đất rừng là 5-100 μg/kg, trong đất nông nghiệp là 10-100 μg/kg và trong đất đai ở các đô thị là 600-3000 μg/kg hay thậm chí có thể cao hơn rất nhiều ở những vùng sản xuất công nghiệp và giao thông đông đúc [51]

Ngoài ra người ta còn tìm thấy PAH trong hầu hết các sản phẩm thịt, cá, rau

và hoa quả Tùy thuộc vào phương thức chế biến, dự trữ và bảo quản mà hàm lượng PAH trong mỗi loại thực phẩm là khác nhau tuy nhiên hàm lượng PAH được tìm thấy cao nhất là trong nhóm sản phẩm “đường và đồ ngọt” trong đó nồng độ chrysen lên tới 36 μg/kg [57]

Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Mỹ được tiến hành ở Bắc Mỹ thì trung bình một ngày con người lấy vào 3,12 mg PAH trong đó 96,2% là từ thực phẩm, 1,6% từ không khí, 0,2% từ nước và 0,4% từ đất [57]

Tại Việt Nam, ô nhiễm nước thải từ các khu công nghiệp đã trở nên phổ biến Hiện nay, tỷ lệ các khu công nghiệp đã đi vào hoạt động có trạm xử lý nước thải tập trung chỉ chiếm khoảng 43%, rất nhiều khu công nghiệp đã đi vào hoạt động mà hoàn toàn chưa triển khai xây dựng hạng mục này Nhiều khu công nghiệp đã có hệ thống xử lý nước thải tập trung nhưng tỷ lệ đấu nối của các doanh nghiệp trong khu công nghiệp còn thấp Nhiều nơi doanh nghiệp xây dựng hệ thống xử lý nước thải cục bộ nhưng không vận hành hoặc vận hành không hiệu quả [2] Theo báo cáo của

nước thải/ngày từ các khu công nghiệp được xả thẳng ra các nguồn tiếp cận không qua xử

lý đã gây ra ô nhiễm môi trường nước mặt Chất lượng nước mặt tại những vùng chịu tác động của nguồn thải từ các khu công nghiệp đã suy thoái, đặc biệt tại lưu vực sông: Đồng Nai, Cầu và Nhuệ-Đáy [2]

Các khu công nghiệp với sự đa dạng của các nhà máy (sản xuất sơn, cơ khí, thép, thực phẩm, in…) có thể thải ra PAH trong quá trình hoạt động sản xuất Tuy hiện nay vẫn chưa có công bố chính thức về sự có mặt của PAH trong nước thải khu công nghiệp ở Việt Nam nhưng khả năng ô nhiễm nghiêm trọng khá rõ ràng

1.3.2 Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH

Việc làm thay đổi cấu trúc hóa học của chất độc nhằm tạo ra các sản phẩm ít độc hoặc không độc cho môi trường và con người đang là một thách thức đối với các nhà khoa học và công nghệ Để giảm độc tính của các chất này, người ta hay phá vỡ cấu trúc phân tử của chúng bằng cách sử dụng enzyme cắt vòng Đến nay, trên thế giới, người ta đã đưa ra một số phương pháp tiêu độc như: cô lập, chôn lấp,

xử lý hóa học, đốt ở nhiệt độ cao, lý học, sinh học…

* Phương pháp vật lý

Trong cấu tạo hóa học của PAH, do có cấu trúc vòng thơm, PAH tương đối khó phân hủy trong tự nhiên Phương pháp chôn lấp hay được áp dụng đối với nhiều chất thải, rác thải, kể cả các chất thải nguy hại trong đó có chất độc hóa học Ưu điểm của phương pháp này là không tốn kém nhưng nhược điểm là các chất độc vẫn nằm trong đất chứ không được phân hủy, các chất độc hóa học này sẽ là nguồn tiềm tàng gây ô nhiễm cho môi trường

Công nghệ thiêu đốt cũng đã được sử dụng trên thế giới, phương pháp xử lý này tương đối triệt để song giá thành lại cao và có khả năng gây ô nhiễm thứ cấp bởi các sản phẩm phụ tạo trong quá trình vận hành

* Phương pháp hóa lý

Các phương pháp hóa học như oxy hóa, phương pháp vật lý như quang hóa, sử dụng tia bức xạ, tia cực tím, hay áp suất cao cũng mang lại hiệu quả nhất định Theo Draper và cộng sự (1987), xử lý bằng phương pháp quang hóa, 80% chất độc bị

trong thời gian 3 ngày [19] Tuy nhiên, những phương pháp trên có nhược điểm là không có tác dụng với lớp đất có độ sâu dưới vài milimet, do đó chỉ xử lý được lớp

* Phương pháp phân hủy sinh học

Hiện nay, phương pháp sinh học đang bắt đầu được quan tâm bởi tính an toàn

và hiệu quả không những về mặt công nghệ mà còn về kinh tế Chìa khóa của công nghệ phân hủy sinh học là thúc đẩy tập đoàn vi sinh vật bản địa tham gia vào quá trình phân hủy ở mức cao nhất Các nghiên cứu cơ bản đều nhằm mục đích thúc đẩy hiệu quả quá trình tẩy độc thông qua việc kích thích tập đoàn vi sinh vật trong các điều kiện phân hủy khác nhau tạo ra kết quả cuối cùng là các sản phẩm ít độc hoặc hoàn toàn không độc Chính vì vậy, công nghệ phân hủy sinh học đã trở thành công nghệ thân thiện với môi trường

Phương pháp phân hủy sinh học đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và áp dụng trong những năm gần đây và cũng đã đạt được khá nhiều thành tựu Công nghệ sinh học đảm bảo an toàn cho môi trường hơn tất cả các công nghệ khác Đặc biệt, trong điều kiện sinh thái đa hệ, việc áp dụng công nghệ phân hủy sinh học PAH nói riêng và các nguồn chất độc nói chung sẽ mang lại hiệu quả kinh tế xã hội cao nhất [61], [64]

Quá trình làm sạch sinh học có thể thực hiện ở quy mô lớn nhỏ khác nhau và ở điều kiện hiếu khí hoặc kị khí Việc tẩy độc bằng phân hủy sinh học có thể được tiến hành riêng rẽ hoặc kết hợp với các phương pháp khác, sau vài tháng hoặc vài năm các chất ô nhiễm có thể được hoàn toàn loại bỏ Phương pháp phân hủy sinh học không đòi hỏi các điều kiện phức tạp (nhiệt độ cao, áp suất lớn, quá trình xúc tác…) không gây ra ô nhiễm thứ cấp, thân thiện với môi trường, chi phí thấp, do đó rất phù hợp với điều kiện ở nước ta Tuy nhiên, phương pháp sinh học thường diễn

ra với tốc độ chậm, thời gian xử lý kéo dài Đây chính là một nhược điểm cơ bản của nó, đòi hỏi có lời giải đáp từ phía các nhà khoa học

Xử lý chất ô nhiễm theo phương pháp sinh học có thể được tiến hành theo hai hướng chính: tăng cường sinh học và kích thích sinh học

- Tăng cường sinh học: là phương pháp sử dụng tập đoàn vi sinh vật bản địa đã

được làm giàu hoặc vi sinh vật sử dụng các chất độc từ nơi khác, thậm chí vi sinh vật

đã được cải biến về mặt di truyền bổ sung vào các môi trường bị ô nhiễm Tuy nhiên, vẫn còn có những khó khăn trong việc bổ sung vi sinh vật vào các nơi bị ô nhiễm do chi phí lớn; hiệu quả phân hủy nhiều khi không cao do nhiều nguyên nhân (sự cạnh tranh của vi sinh vật, độ độc của môi trường; sự thiếu hụt nguồn dinh dưỡng, các chất

đa lượng và vi lượng cần thiết cho hoạt động phân hủy của vi sinh vật) [37]

- Kích thích sinh học: là quá trình thúc đẩy sự phát triển, hoạt động trao đổi

chất của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng sử dụng các chất độc hại thông

dưỡng, các cơ chất, các chất xúc tác…

Kích thích sinh học hiện là khuynh hướng được sử dụng rộng rãi trong xử lý ô nhiễm theo phương pháp phân hủy sinh học [37] Trong hoạt động sống, vi sinh vật cần nguyên tố N, P, một số chất dinh dưỡng khác và các điều kiện sống thích hợp

Từ nguồn ô nhiễm, người ta có thể phân lập những chủng vi sinh vật có khả năng

sử dụng PAH, nghiên cứu các đặc tính sinh lý, sinh hóa của chúng để từ đó tìm ra điều kiện sống tối ưu của chúng từ đó ứng dụng cho việc kích thích hoạt động sống của tập đoàn vi sinh vật bản địa trong việc phân hủy sinh học PAH tại vùng ô nhiễm Để tăng cường quá trình phân hủy sinh học, việc bổ sung các nguồn dinh dưỡng như nguồn carbon, nito, phosphor theo phải theo tỷ lệ nhất định là C:N:P = 100:5:1 Ngoài ra, các yếu tố môi trường cũng cần điều chỉnh thích hợp, đảm bảo cho tốc độ phân hủy ở mức ổn định và đạt hiệu quả cao nhất

Đôi khi người ta cũng kết hợp cả hai biện pháp vừa bổ sung các chủng vi sinh vật nuôi cấy có khả năng phân hủy chất ô nhiễm, đồng thời bổ sung các nguồn dinh dưỡng để tạo điều kiện tối ưu cho tập đoàn vi sinh vật bản địa hoạt động tốt nhất Như vậy, hoạt động của tập đoàn vi sinh vật bản địa cùng với hoạt động của vi sinh vật ngoại lai sẽ tăng cường hiệu quả của quá trình xử lý [37]

Quá trình làm sạch sinh học có thể thực hiện với các quy mô khác nhau và ở điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí Việc tẩy độc bằng phân hủy sinh học có thể tiến hành riêng rẽ hoặc kết hợp với các phương pháp xử lý cơ học, hóa lý để tăng cường hiệu quả xử lý của quá trình Sau khoảng thời gian nhất định (vài tháng hoặc vài năm), các chất ô nhiễm có thể được loại bỏ hoàn toàn [20, 28, 39]

Hiện nay trên thế giới phân hủy sinh học đã được các nhà khoa học nghiên cứu và áp dụng khá rộng rãi Tại Việt Nam, các nhà khoa học tại Viện Công nghệ sinh học đã tiến hành nghiên cứu và phân lập thành công một số chủng vi sinh vật

có khả năng phân hủy sinh học PAH cũng như phân bố của các tập đoàn vi sinh vật tại các vùng sinh thái khác nhau [3, 6, 8]

1.4 Phân hủy sinh học các PAH bởi vi sinh vật

1.4.1 Vi sinh vật phân hủy PAH

Hiện nay, có nhiều nghiên cứu về khả năng của vi sinh vật sử dụng các PAH

có trọng lượng phân tử thấp như naphthalene, phenanthrene và anthracene Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về tiềm năng phân hủy các PAH có trọng lượng phân tử cao như chrysene và benzo[a]pyrene [16]

Vi sinh vật phân hủy PAH phân bố rộng rãi trong tự nhiên Số lượng các vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH tại các vùng ô nhiễm nhiều hơn so với các vùng không ô nhiễm Các loài vi sinh vật trong vùng ô nhiễm có xu hướng thích nghi, bằng cách thay đổi cấu trúc di truyền để hướng đến việc phân hủy PAH Vi khuẩn

có vai trò quan trọng trong tham gia phân hủy sinh học PAH trong nước và trầm tích, trong khi đó, nấm sợi và xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng phân hủy PAH và các chất ô nhiễm trong môi trường đất [22]

Thống kê ở bảng 1.2 cho thấy, vi sinh vật phân hủy PAH thuộc nhiều nhóm vi

sinh vật khác nhau [4, 8, 13, 14, 22, 36, 62, 63, 64, 65] Các vi sinh vật có khả năng

chuyển hóa PAH phần lớn thuộc vi khuẩn, vi khuẩn lam và một số vi nấm [13, 14,

17, 35, 61, 62]

Trong một báo cáo tổng quan gần đây về các phân hủy sinh học PAH của

Johnsen (2005) cho thấy các chủng vi khuẩn thuộc chi Sphingomonas, Burkholderia,

Pseudomonas và Mycobacteria là các chủng vi khuẩn chiếm ưu thế [26,34]

Đa số các vi sinh vật phân lập được đều có nguồn gốc từ các địa điểm ô nhiễm [39] Tuy nhiên, với mỗi loại vi sinh vật khác nhau thì khả năng phân hủy PAH ở các vùng ô nhiễm là khác nhau Cụ thể, vi khuẩn là nhóm vi sinh vật có vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy PAH trong nước, đất và trầm tích, nấm sợi có khả năng phân hủy với tốc độ cao các PAH trên bề mặt trong khi nấm men, vi khuẩn lam và vi tảo lại hoạt động phân hủy trong môi trường đất với tốc độ không cao [20]

Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH

Aphanocapsa sp

Chlorella autotrophica Chlamydomonas angulosa

Coccochloris elabens Cylindrotheca sp

Dunaliella tertiolecta Microcoleus

chthonoplastes Navicula sp

Nostoc sp

Phorphyridium Scapricomutum Synedar sp

Aspergillus sp FVX5 Basidiobolus ranarum Bjerkandera adusta Candida maltosa Chrysosporium pannorum Claviceps paspali Gliocladium sp

Helicostylum catenoides Linderina pennispora Mucor hiemalis Penicillium Chrysogenum Phycomyces Blakesleeanus Ramaria sp

Rhizopus stononife Sordaria fimicola Trichoderma viride

1.4.2 Cơ chế phân hủy PAH bởi vi sinh vật

Phân hủy sinh học các PAH có thể diễn ra theo hai cơ chế trao đổi chất và đồng trao đổi chất Quá trình chuyển hóa PAH bởi vi sinh vật có thể phân hủy thành

trình phân hủy PAH có thể theo ba chiều hướng: phân hủy hoàn toàn, đồng phân hủy và oxi hóa không đặc hiệu [16]

Suntherland (1995) cũng đưa ra sơ đồ tương tự về các con đường phân hủy PAH bởi vi khuẩn và nấm (Hình 1.2) [30,52] Các con đường phân hủy PAH có thể được tóm tắt như sau:

- Chuyển hóa PAH đến cis-dihydrodiol, phenol và các sản phẩm cắt vòng bởi

vi khuẩn và vi khuẩn lam

- Chuyển hóa PAH đến phenol bởi vi khuẩn nhóm methylotrophic

- Chuyển hóa PAH đến trans-dihydrodiol bởi vi nấm, vi khuẩn và vi khuẩn lam

- Chuyển hóa PAH đến quinon bởi nấm mục trắng (white-rot fungi)

Hình 1.2: Các con đường phân hủy hiếu khí PAH chính của vi khuẩn và nấm

Hiện nay người ta đã biết đến các enzyme cytochrome P450 monooxygenase được sinh ra bởi một loài vi nấm, vi khuẩn và vi khuẩn lam Các enzyme này tham gia chuyển hóa PAH đến dạng aren oxit, sau đó dạng hợp chất trung gian này được

hydrat hóa bởi enzyme epoxyt hydrolase đến dạng trans-dihydrodiols hoặc được tái

sắp xếp không có sự tham gia của enzyme tạo thành dạng phenol Trong trường hợp các vi sinh vật chỉ có thể thực hiện theo cách chuyển hóa này, thì chúng sẽ không sử dụng PAH như nguồn cacbon mà chỉ có thể loại bỏ tính độc của PAH [16,52] Chuyển hóa PAH đến quinon bởi nấm trắng (white- rot fungi): Một số nấm trắng phân hủy lignin và cellulose (có trong gỗ) sẽ chuyển hóa PAH đến quinon và

các chất khác mà không qua cis-dihydrodiol hoặc trans-dihydrodiol, trong một số

trường hợp quá trình chuyển hóa này có sự tham gia của lignin peroxydase [16,52] Nhiều nghiên cứu cho thấy, trong vi khuẩn, các gene mã hóa các enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa PAH có thể nằm trên plasmid hoặc chromosome [23] Trong hai thập kỷ vừa qua, một nhóm các gene bảo thủ cao dị hóa PAH (các gene

giống nah) từ các loài Pseudomonas đã được điều tra đầy đủ bao gồm cả quan hệ

chức năng, cấu trúc và tiến hóa của các gene này Tuy nhiên, gần đây các gene dị

hóa PAH mà có sự khác nhau về tiến hóa đối với gene giống nah đã được nghiên

cứu ở các vi khuẩn Gram âm khác và cả vi khuẩn Gram dương [23]

Theo Wikstrom (1996), bước đầu tiên của phân hủy sinh học hiếu khí PAH phụ thuộc có sự tham gia của hệ enzyme đa thành phần xúc tác sự hydroxyl hóa các

hợp chất PAH và tạo ra dạng cis-dihydrodiol [58] Một số tác giả khác cho rằng, các

con đường phân hủy hydrocarbon thơm trong điều kiện hiếu khí đều xảy ra qua các bước cắt vòng thơm, loại vòng theo con đường ở phần trên cùng (upper pathway) và tạo thành catechol [43,47,58] Tiếp theo, quá trình cắt vòng của catechol bởi

enzyme dioxygenase có thể xảy ra tại các vị trí meta và ortho Cắt vòng catechol ở

vị trí ortho được thực hiện bởi enzyme catechol 1,2-dioxygenase để tạo ra cis, muconic acid, chất này sau đó được phân hủy theo con đường β-ketoadipate [32]

cis-Cắt vòng tại vị trí meta của catechol được thực hiện bởi enzyme catechol

2,3-dioxygenase (C23O) tạo ra 2-hydroxymucomic semialdehyde [32], đây được coi là quá trình phổ biến nhất ở các giai đoạn tiếp sau ở con đường phía dưới (lower pathway) của quá trình phân hủy các PAH [43,44,58] Enzyme catechol 2,3-dioxygenase là thành viên của liên họ enzyme extradiol dioxygenase Các enzyme extradiol dioxygenase được xem như là các enzyme chìa khóa trong rất nhiều con đường phân hủy các hợp chất thơm bởi vi khuẩn cũng như các phản ứng được xúc tác bởi các enzyme này [47] Do vị trí quan trọng và trung tâm của catechol nên gene mã hóa cho enzyme catechol 2,3- dioxygenase được quan tâm đặc biệt trong các nghiên cứu đánh giá cũng như phát hiện ra khả năng phân hủy PAH của các chủng vi sinh vật, tập đoàn vi sinh vật tại các điểm ô nhiễm hydrocarbon dầu mỏ [44] Đã có rất nhiều nghiên cứu khai thác các giá trị tiềm tàng ứng dụng và lý thuyết của C23O trong bảo vệ môi trường và trong các lĩnh vực khác Các enzyme extradiol dioxygenase có hoạt tính tốt sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến sự gia tăng các hoạt động đồng hóa PAH Tính đến năm 2004 đã có trên 30 enzyme C23O và nhiều trình tự nucleotide của các gene mã hóa C23O đã được xác định [32] Hiện nay, các nhà nghiên cứu vẫn đang khai thác các khía cạnh ứng dụng và học thuyết của C23O

và gene mã hóa C23O trong các chủng đơn, tập đoàn và trong quá trình phân hủy các chất vòng thơm ở tự nhiên và trong xử lý làm sạch bằng phân hủy sinh học Hiện nay, một số nghiên cứu về con đường chuyển hóa cụ thể của vi sinh vật với PAH đã được công bố Năm 2003, Mrozik và cộng sự đưa ra con đường oxi hóa

naphthalene ở vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas [46] được đề xuất như sau:

Hình 1.3: Con đường phân hủy napthalene ở Pseudomonas

Năm 2001, Vila cà cộng sự đã đưa ra con đường phân cắt pyrene ở chủng

Mycobacterium sp AP1 [55] (Hình 1.4)

Hình 1.4: Con đường phân hủy pyrene ở Mycobacterium sp AP1

Cũng trong năm 2001, Moody và cộng sự cũng công bố con đường phân hủy

anthracene ở chủng Mycobacterium sp PYR-1 [45] (Hình 1.5)

Hình 1.5: Con đường phân hủy anthracene ở Mycobacterium sp PYR-1

PAH là các chât gây ô nhiễm quan trọng trong nước ngầm Các PAH có 2 và

3 vòng được quan tâm đặc biệt do khả năng hòa tan cao hơn trong nước và dễ di chuyển vào nước ngầm [42] Hiện nay, có rất ít công bố về chuyển hóa PAH bởi vi khuẩn kỵ khí Mặc dù naphthalene và acenaphthalene đã được loại bỏ (rất ít) bởi hỗn hợp vi khuẩn khử nitrat, tuy nhiên cơ chế trao đổi chất của quá trình chưa được

dưới điều kiện khử sulphate của các mẫu trầm tích vịnh San Diego [17] Tuy nhiên quá trình này đòi hỏi nhiều thời gian và tốc độ rất chậm [16]

các chất nhận điện tử và dưới các điều kiện sinh methane Các con đường phân hủy sinh hóa đã được nghiên cứu với các tập đoàn vi khuẩn hoặc chủng sạch phân hủy napthalene và cho thấy 2-naphthoic acid là chất trao đổi chất trung gian Naphthalene được hoạt hóa bởi bổ sung đơn vị C1 để tạo ra 2-naphthoic acid, trong khi đó methylnaphthalene được hoạt hóa bởi bổ sung fumarate đối với nhóm methyl

và được phân hủy tiếp thành 2-naphthoic acid Phân hủy 2-naphthoic acid được thực hiện qua khử và cắt vòng để tạo ra 5,6,7,8-tetrahydro-2-naphthoic acid Sản phẩm trung gian cắt vòng như là 2-carboxyclohexylacetic acid cho thấy sự phân hủy diễn ra qua các dẫn xuất cyclohexan chứ không qua các hợp chất thơm Phân hủy kỵ khí PAH cũng đã được chứng minh trong môi trường nước nhiễm bằng xác định các hợp chất trao đổi chất đặc hiệu và nghiên cứu đồng vị phóng xạ Các sản phẩm trao đổi chất đặc hiệu phân hủy kỵ khí PAH như naphthyl-2-methylsuccinate đã được phát hiện chứng tỏ sự phân hủy kỵ khí của 2-methylnaphthalene, trong khi đó 2-naphthoic acid là dấu hiệu của phân hủy kỵ khí naphthalene và 2-methylnaphthalene [42]

1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình phân hủy PAH

Sự phân hủy sinh học PAH phụ thuộc rất nhiều yếu tố

Nhiệt độ Mỗi chủng vi sinh vật thích hợp ở những nhiệt độ phát triển riêng vì

vậy để tối ưu hóa quá trình phân hủy sinh học chúng ta cần nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của vi sinh vật

pH môi trường cũng là một yếu tố gây ảnh hưởng không nhỏ tới sự phát triển

của vi sinh vật pH thích hợp nhất cho sự phát triển của vi sinh vật thường từ 5,5 đến 8,5 Tuy nhiên, sự phân hủy sinh học vẫn có thể xảy ra tại một số khu vực với những giá trị pH đặc biệt như tại các môi trường rất acid hay rất kiềm với tốc độ

chậm hơn Ví dụ đối với Thiobacillus thioxidan là vi sinh vật có khả năng oxy hóa

sulfur để tạo thành sulfuric acid chịu được pH từ 2-3 [53]

Nguồn dinh dƣỡng như Carbon (C), nito (N), phosphor (P) là các chất cần

thiết cho quá trình sinh tổng hợp của của tế bào vi sinh vật Các muối phosphate và muối nitor có vai trò quan trọng trong việc tổng hợp protein của vi sinh vật Carbon

và nitor luôn có mặt trong đất, tuy nhiên nếu nồng độ của chúng thấp thì không có khả năng kích thích tập đoàn vi sinh vật hoạt động Đó chính là lý do vì sao trong đất nhiễm chất độc luôn tồn tại tập đoàn vi sinh vật song số lượng và khả năng hoạt động của chúng không cao Nếu không bổ sung thêm nguồn dinh dưỡng thì vi sinh vật sẽ phân hủy các chất độc ở khu vực ô nhiễm với tốc độ rất chậm Đây cũng là những nghiên cứu rất cần thiết phục vụ cho quá trình tạo các yếu tố công nghệ thích hợp trong xử lý tẩy độc [53]

Thế oxy hóa khử là thể hiện cho xu hướng của môi trường biến đổi theo

hướng oxy hóa hay khử Các chất nhận điện tử rất cần thiết đối với các vi sinh vật

có khả năng phân huỷ chất độc hóa học trong đất Các chất nhận điện tử này gây nên thế oxy hóa khử của môi trường Đối với quá trình hiếu khí (quá trình oxy hóa) thế oxy hóa khử vào khoảng +800 mV, còn với quá trình kị khí (quá trình khử) thế oxy hóa khử vào khoảng từ 0-300 mV [53] Thực tế là các chất nhận điện tử khác nhau giúp cho vi sinh vật có khả năng chịu được những giá trị pH khác nhau

Ngoài các yếu tố môi trường như trên, sự phân hủy sinh học PAH còn phụ thuộc vào tính chất vật lý, hóa học của các PAH, sự có mặt đồng thời hay riêng rẽ của các PAH trong môi trường Ngoài ra nó còn phụ thuộc vào bản thân các vi sinh vật, phương thức mà các vi sinh vật chuyển cơ chất qua màng tế bào Thường những phân tử tan có thể được vận chuyển qua màng tế bào và có khả năng phân hủy sinh học tốt hơn [16, 27, 36, 52, 64]

Các yếu tố môi trường tại nơi mà vi sinh vật được phân lập ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của chúng Do vậy, trong quá trình xử lý làm sạch môi trường, vấn

đề này đóng vai trò quan trọng và quyết định hiệu quả của việc xử lý Quá trình phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân bởi các vi sinh vật thường xảy ra với tốc độ chậm, do vậy việc tạo điều kiện thích hợp cho tập đoàn vi sinh vật phát

triển tốt nhất, có hiệu quả phân hủy sinh học cao có thể coi là chìa khóa của công nghệ phân hủy sinh học

Theo Yuan và cộng sự (2000), điều kiện tối ưu cho sự phân hủy các PAH của

C, pH 7 [63] Chủng vi khuẩn Alcaligenes

eutrophus JMP134 và Pseudomonas cepacia AC1100 phát triển tốt nhất ở 29oC [25]

Một số nghiên cứu khác cho thấy chủng Streptomyces danangensis XKDN19 có

Streptomyces danangensis XKDN11 ở 30oC, pH 7, nồng độ NaCl 0,5% [3]; chủng

nitơ, photpho, cacbon và các khoáng khác cũng ảnh hưởng đến sự phát triển và phân hủy chất độc của các vi sinh vật

Nghiên cứu của Nguyễn Bá Hữu và cộng sự (2002) về ảnh hưởng của các yếu

tố môi trường đến sự phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân của một số

chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas, Sphingomonas phân lập từ đất nhiễm dầu

C, pH 7 - 7,8

và nồng độ muối NaCl từ 0% đến 3% [5] Một số tác giả khác cũng phát hiện điều

C và pH 7 [27, 52, 64] Trên đây là những kết quả quan trọng trong việc kích thích tập đoàn vi sinh vật bản địa trong đó

có vi khuẩn để tiến tới xử lý vùng đất nhiễm độc hóa học

Trong tự nhiên, thường không tồn tại một loại hydrocarbon thơm đa nhân mà thường tồn tại dưới dạng hỗn hợp Do đó việc nghiên cứu khả năng phân hủy hỗn hợp các PAH là điều cần thiết để xem ảnh hưởng qua lại của chúng trong hỗn hợp cũng như nồng độ của chúng Sự tồn tại của các PAH khác nhau có thể thúc đẩy hoặc ức chế quá trình phân hủy sinh học, nồng độ của PAH cao sẽ làm giảm quá trình phân hủy sinh học và gây độc cho vi sinh vật Các PAH có khối lượng phân tử thấp, cấu trúc đơn giản dễ dàng phân hủy hơn so với các PAH có khối lượng phân

tử cao và có cấu trúc phức tạp Theo Yuan, điều kiện tối ưu cho sự phân hủy các

C,

pH 7 [63] Tác giả Zaidi cùng các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự

phân hủy phenanthrene và nhận thấy tại pH từ 6 đến 7 thì không ảnh hưởng mạnh đến khả năng phân hủy, nhưng tại pH 10 thì gây ức chế khả năng phân hủy phenanthrene của vi sinh vật [64]

Sự phân hủy sinh học các PAH riêng rẽ trong mẫu thí nghiệm đã không ngừng được nghiên cứu và ngày càng thu được nhiều kết luận có giá trị [36,63] Các PAH

có cấu trúc phân tử đơn giản, khối lượng phân tử thấp dễ dàng phân hủy sinh học hơn so với các PAH có khối lượng phân tử cao và cấu trúc phức tạp [13,16, 61,63] Tuy nhiên, chúng ta còn ít hiểu biết về khả năng phân hủy sinh học các PAH khi chúng có mặt đồng thời trong các vùng ô nhiễm Thường trong tự nhiên không chỉ tồn tại một loại PAH mà tồn tại hỗn hợp các PAH Do đó, việc nghiên cứu khả năng phân hủy hỗn hợp PAH là điều cần thiết để có thể đánh giá được ảnh hưởng qua lại

và tương quan nồng độ của chúng đến sự phân hủy hỗn hợp Sự tồn tại của các PAH khác nhau có thể thúc đẩy hoặc ức chế quá trình phân hủy sinh học [63] Yuan cùng cộng sự (2000) tiến hành nghiên cứu khả năng phân hủy đồng thời các PAH trong bùn sông có nhiễm PAH Kết quả cho thấy, tốc độ phân hủy phenanthrene giảm khi

có mặt thêm bất kì một PAH nào trong mẫu Khi 6 PAH có mặt đồng thời, tốc độ phân hủy phenanthrene, acenaphthalene giảm nhưng tốc độ phân hủy Anthracene, Fluorene và Pyrene lại tăng [61,63]

Ngoài ra, tốc độ phân hủy PAH cũng còn bị ảnh hưởng mạnh bởi các chất hoạt động bề mặt không phân cực như Bij 30, Bij 35, triton X100, triton N110 Các chất này gây độc và ức chế hoạt động của vi sinh vật vì chúng có khả năng tương tác với màng tế bào hay chính xác hơn là các phân tử chất hoạt động bề mặt tương tác với protein màng tế bào [38] Các chất này cũng có thể trực tiếp gây ức chế hoạt động của các enzyme liên quan tới con đường chuyển hóa PAH Có thể chúng còn liên kết với cả các enzyme hay với các cơ chất Một lí do làm giảm khả năng phân hủy sinh học các hợp chất này là chúng hạn chế sự tiếp xúc của tế bào vi sinh vật với các chất hữu cơ hòa tan trên bề mặt [64]

Tóm lại, việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phân hủy sinh học các hợp chất PAH là rất quan trọng Có thể coi đây là cơ sở công nghệ cho quá trình xử

lý ô nhiễm PAH bằng phương pháp phân hủy sinh học (bioremediation), đảm bảo các điều kiện thuận lợi làm cho tốc độ phân hủy các hydrocarbon đa nhân có thể đạt tới mức tối đa

1.5 Các phương pháp phân loại vi sinh vật

Vi sinh vật rất đa dạng trong tự nhiên Tuy nhiên, chỉ một phần nhỏ trong số chúng là có thể nuôi cấy được ở trong điều kiện phòng thí nghiệm Do đó, việc phân loại chúng gặp nhiều khó khăn Hiện nay có nhiều phương pháp để phân loại vi sinh vật Các phương pháp cổ điển chỉ dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái cấu tạo bên ngoài để phân loại vi sinh vật, còn phương pháp hiện đại lại chú trọng nhiều đến việc nghiên cứu các phân tử axit nucleic như DNA, RNA để áp dụng trong phân loại Từ đó có thể thành lập cây phát sinh chủng loại, phản ánh mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa các loài với nhau

1.5.1 Phân loại theo phương pháp cổ điển

Phương pháp phân loại cổ điển là phương pháp dựa trên các đặc điểm hình dạng bên ngoài và các đặc điểm sinh lý của vi sinh vật để phân loại, cụ thể:

- Các đặc điểm về hình thái: hình dạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc; hình dạng, kích cỡ của tế bào vi sinh vật; các đặc điểm vi cấu trúc, có tiên mao, không có tiêm mao, số lượng các tiên mao, cách thức chuyển động của tế bào…

- Các đặc điểm về sinh lí và trao đổi chất như: nguồn C, N sử dụng, nguồn năng lượng và cơ chế chuyển hóa năng lượng, các sản phẩm lên men, các sản phẩm trao đổi thứ cấp, tính mẫn cảm với các chất ức chế và kháng sinh…

Ngoài ra, còn rất nhiều phương pháp phổ biến khác nữa như: kiểm tra các phản ứng sinh hóa của vi sinh vật với các chất phản ứng khác nhau, các phản ứng miễn dịch của các kháng nguyên là thành phần cấu tạo của tế bào như kháng nguyên

O của lipopolysaccharid hay của bao nhầy thường được sử dụng để phân biệt các chủng của một loài

1.5.2 Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử

Hiện nay, các phương pháp phân loại hiện đại thường dựa trên việc đánh giá mức phân tử axit nucleic Trên cơ sở trình tự DNA, người ta có thể có nhiều các phương pháp khác nhau để tiến hành phân loại

Từ cuối thế kỷ 20, đặc biệt là những năm 1980 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, người ta đã sử dụng một phương pháp nghiên cứu mới cho phân loại vi sinh vật đó là “phân loại học phân tử” Phương pháp mới này

có thể phát hiện, mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức phân tử giữa các loài và trong phạm vi loài trong thời gian ngắn và có độ chính xác cao

Trước đây, việc phân loại vi sinh vật đôi khi gặp khó khăn và thiếu chính xác Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, việc phân loại ngày nay dựa chủ yếu vào nghiên cứu trên các phân tử axit nucleic (DNA, RNA) Các phương pháp này phản ánh chính xác hơn mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa các nhóm sinh vật Tuy nhiên, cũng không thể phủ nhận vai trò của các phương pháp phân loại dựa trên các đặc điểm bên ngoài Do vậy, cần kết hợp cả hai phương pháp để kết quả phân loại được chính xác

Jesus và Silvia (1999) đã tóm tắt các phương pháp phân tích và khả năng sử

dụng trong phân loại vi sinh vật (Bảng 1.3) [33]

Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA được coi là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây tiến hóa của các vi sinh vật, vì rRNA có mặt

ở tất cả các loại vi sinh vật, có chức năng xác định và là trình tự có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật Dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng vi sinh vật Trong 3 loại gene rRNA của vi khuẩn (5S, 16S, 23S) thì gene 16S rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại Gene mã hóa cho 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotide, dễ đọc và so sánh trình tự, nhưng lại không đủ để phân biệt một cách chi tiết giữa các loài Ngược lại, gene mã hóa 23S rRNA lại có kích thước lớn (3000 nucleotide) do đó gây khó khăn cho việc tách dòng, đọc và so sánh trình tự Chỉ có gene 16S rRNA với kích thước khoảng 1500 nucleotide vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật và cũng không gây khó khăn trong nghiên cứu Do đó, nó được ưu tiên chọn lựa trong việc phân loại vi khuẩn Gene mã hóa cho cấu trúc 16S rRNA đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ lưỡng và họ đã thiết lập được rất nhiều các cặp mồi để nhân đoạn

chúng bằng kỹ thuật PCR Đây là một thuận lợi lớn cho các nghiên cứu phân loại dựa trên gene mã hóa 16S rRNA [33]

Bảng 1.3: Một số phương pháp phân loại vi sinh vật

Thành phần tế bào Phương pháp phân tích Phạm vi phân loại

Loài và dưới loài

Đa hình chiều dài các đoạn giới hạn của RNA riboxom RNA riboxom

Axit teichoic

Màng

Axít béo

Loài và chi Lipid phân cực

Axit mycolic Isoprenoid quinonones

1.6 Quá trình xử lý sinh học nước thải và thành phần các chất ô nhiễm điển hình trong nước thải công nghiệp

1.6.1 Quá trình xử lý sinh học nước thải

Để kiểm tra khả năng xử lý của các chủng vi sinh vật đã phân lập được chúng tôi tiến hành xử lý nước thải trên quy mô 5 lít bằng phương pháp sinh học Xử lý sinh học nước thải thực chất là lợi dụng sự sinh trưởng phát triển của các vi sinh vật

để thực hiện các dạng phân hủy khác nhau Sự phân hủy khác nhau thường kèm theo sự thoát khí dưới tác dụng của các enzim do vi khuẩn tiết ra Muốn cho quá trình xử lý sinh học đạt kết quả cao thì cần thiết phải tạo ra môi trường, điều kiện sống và hoạt động tốt nhất cho các vi sinh vật để chúng có thể phân hủy các chất hữu cơ được nhanh chóng

Quá trình phân hủy sinh học tại chính vị trí ô nhiễm được thực hiện bởi hai nhóm vi sinh vật, đó là nhóm vi sinh vật nuôi cấy và không nuôi cấy được, trong đó nhóm vi khuẩn nuôi cấy được chỉ chiếm 1% Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện các nhóm vi sinh vật không phụ thuộc nuôi cấy tại các vị trí ô nhiễm sẽ giúp các nhà khoa học hiểu biết rõ hơn về đặc tính cũng như các cơ chế phân hủy sinh học của những nhóm vi sinh vật để từ đó áp dụng cả hai phương pháp trong phân hủy sinh học là làm giàu và kích thích tập đoàn vi sinh vật bản địa làm tăng hiệu suất xử lý

Trong quá trình xử lý nước thải, dựa vào nguồn nước và nồng độ chất ô nhiễm, các nhà khoa học sẽ lựa chọn các phương pháp xử lý khác nhau Đối với nước thải ô nhiễm các hợp chất vòng thơm, phương pháp xử lý hiếu khí là một lựa chọn tối ưu Xử lý nước thải bằng phương pháp hiếu khí nhân tạo dựa trên nhu cầu oxy cần cung cấp cho vi sinh vật hiếu khí có trong nước thải hoạt động và phát triển Quá trình này của vi sinh vật được gọi chung là hoạt động sống, gồm hai quá trình: dinh dưỡng sử dụng các chất hữu cơ, các nguồn nito và phospho cùng những ion kim loại khác với mức độ vi lượng để xây dựng tế bào mới, phát triển tăng sinh

Quá trình sau là quá trình phân hủy ở dạng oxi hóa các hợp chất hữu cơ Cả hai quá

trình dinh dưỡng và oxi hóa của vi sinh vật có trong nước thải đều cần oxi Để đáp ứng được nhu cầu oxi này người ta thường phải khuấy đảo khối nước để oxi từ không khí được khuếch tán và hòa tan vào nước Tuy nhiên, biện pháp này chưa thể đáp ứng được nhu cầu oxi Do vậy, người ta sử dụng các biện pháp hiếu khí tích cực hơn như thổi khí kết hợp với khuấy đảo Các biện pháp này thường được sử dụng trong các công trình xử lý nước thải bằng phương pháp hiếu khí nhân tạo như: các

bể phản ứng sinh học hiếu khí, các bể lọc sinh học Biofilter, các loại đĩa quay sinh học (RBC) v.v… Đối với nguồn nước thải ô nhiễm với hàm lượng COD trên dưới

1000 mg/l và hàm lượng BOD5 trên dưới 400 mg/l thì bể xử lý hiếu Aeroten là một phương pháp phổ biến

Nước thải sau khi được xử lý sơ bộ loại bỏ rác và dầu mỡ còn chứa phần lớn các chất hữu cơ ở dạng hòa tan cùng các chất lơ lửng đi vào aeroten Các chất lơ lửng này là một số chất rắn và có thể cùng các chất hữu cơ chưa phải là dạng hòa tan Các chất lơ lửng này làm nơi vi khuẩn bám vào và để cư trú, sinh sản và phát triển, dần dần thành các hạt cặn bong Các hạt này dần dần to và lơ lửng trong nước của quần thể vi sinh vật Các hạt bông cặn này cũng chính là bùn hoạt tính Bùn hoạt tính là các bông cặn có màu nâu sẫm, chứa các chất hữu cơ hấp phụ từ nước thải và là nơi cư trú cho các vi khuẩn cùng các sinh vật bậc thấp khác, như nguyên sinh động vật sống và phát triển Trong nước thải có những hợp chất hữu cơ hòa tan- loại hợp chất dễ bị vi sinh vật phân hủy nhất Ngoài ra, còn có các loại hợp chất hữu cơ khó bị phân hủy hoặc loại hợp chất chưa hòa tan, khó hòa tan ở dạng keo - các dạng hợp chất này có cấu trúc phức tạp cần được vi khuẩn tiết ra enzyme ngoại bào phân hủy thành những chất đơn giản hơn rồi sẽ thẩm thấu qua màng tế bào và

bị oxi hóa tiếp thành sản phẩm cung cấp vật liệu cho tế bào hoặc sản phẩm cuối cùng là CO2 và nước

Quá trình oxi hóa các chất bẩn hữu cơ xảy ra trong bể aeroten qua ba giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Tốc độ oxi hóa bằng tốc độ tiêu thụ oxi Ở giai đoạn này bùn hoạt tính hình thành và phát triển Hàm lượng oxi cần cho vi sinh vật sinh trưởng, đặc biệt ở thời gian đầu tiên nguồn dinh dưỡng trong nước thải rất phong phú,

lượng sinh khối trong thời gian này rất ít Sau khi vi sinh vật thích nghi với môi trường, chúng sinh trưởng rất mạnh theo cấp số nhân Vì vậy, lượng oxi tiêu thụ tăng cao dần

- Giai đoạn 2: Vi sinh vật phát triển ổn định và tốc độ tiêu thụ oxi cũng ở mức gần như ít thay đổi Chính ở giai đoạn này các chất bẩn hữu cơ bị phân hủy nhiều nhất

- Giai đoạn 3: Sau một thời gian khá dài, tốc độ oxi hóa cầm chừng và có chiều hướng giảm, tốc độ tiêu thụ oxi tăng lên Đây là giai đoạn nitrat hóa các muối amoni

Sau cùng, nhu cầu oxi lại giảm và cần phải kết khúc quá trình làm việc của bể aeroten Sau khi oxi hóa được 80 - 95% BOD trong nước thải, nếu không khuấy đảo hoặc thổi khí, bùn hoạt tính sẽ lắng xuống đáy, cần phải lấy bùn cặn ra khỏi nước để tránh hiện tượng ô nhiễm thứ cấp, nghĩa là sinh khối vi sinh vật trong bùn (chiếm 70% khối lượng cặn bùn) sẽ bị tự phân Tế bào vi khuẩn có hàm lượng protein rất cao (60 - 80% so với chất khô), ngoài ra còn có các hợp chất chứa chất béo, hydratcarbon, các chất khoáng, v.v… khi bị tự phân sẽ làm ô nhiễm nguồn nước

1.6.2 Thành phần các chất ô nhiễm điển hình trong nước thải công nghiệp

Tính chất của nước thải khu công nghiệp rất đa dạng do thành phân và nồng

độ các chất ô nhiễm rất khác nhau Nước thải từ các loại hình công nghiệp như hóa dầu, chế biến thực phẩm, bia, rượu, hóa chất thường có hàm lượng các chất hữu cơ BOD, COD, TSS, dầu và mỡ, kim loại nặng, PAH, hợp chất dễ bay hơi, chất hữu cơ khó phân hủy cao độ pH, mùi và các hợp chất sunfua thường biến đổi Nước thải của các nhà máy hóa chất thường có nhiều các hợp chất độc hại như thuốc trừ sâu, PAH, phenol [11]

lượng oxi cần thiết cho các vi khuẩn oxi hóa sinh hóa các chất hữu cơ dễ phân hủy sinh học có trong một đơn vị thể tích nước thải trong thời gian 5 ngày ở điều kiện

thông số đánh giá múc độ ô nhiễm nước thải bởi các chất hữu cơ, hay hàm lượng