phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng thủy phân keratin từ lông vũ gia cầm và thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện keratinase trong tế bào vi khuẩn e.coli

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NGUYỄN THỊ MINH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN KERATIN TỪ LÔNG VŨ GIA CẦM

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

NGUYỄN THỊ MINH

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT

CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN KERATIN TỪ LÔNG VŨ GIA CẦM

VÀ THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN KERATINASE

TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN – 2011

Trang 2

NGUYỄN THỊ MINH

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT

CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN KERATIN TỪ LÔNG VŨ GIA CẦM

VÀ THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN KERATINASE

TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI

Chuyên ngành : Di truyền học

Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Huy Hoàng

THÁI NGUYÊN – 2011

Trang 3

Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tri ân và sâu sắc tới TS Nguyễn Huy Hoàng

– Phó trưởng Phòng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH&CN Việt Nam, là người thầy_người anh đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, em đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ

bảo tận tình của các cán bộ Phòng Vi sinh vật đất, đặc biệt là Th.S Nguyễn Quỳnh Mai, CN Nguyễn Thu Hiền đã giúp đỡ em trong quá trình tiến hành

thí nghiệm

Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo tham gia giảng dạy tại Khoa Sinh-KTNN Đại Học Thái Nguyên- ĐH Sư Phạm Thái Nguyên- Khoa đào tạo sau đại học đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích trong suốt 2 năm qua

Bên cạnh đó, em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới BGH cùng toàn thể cán bộ giáo viên trường THPT Điềm Thụy, Phòng ADT ứng dụng thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm CNG đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường và Viện

Cuối cùng, em xin gửi tới bố, mẹ và những người thân trong gia đình lòng biết ơn sâu sắc, cảm ơn những người bạn đã chia sẻ khó khăn thử thách trong cuộc sống và công việc để em có được kết quả này

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 09 năm 2011

Nguyễn Thị Minh

Trang 4

Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17i

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vi

MỞ ĐẦU 1

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Keratin .3

1.2 Keratinase 6

1.3 Đa dạng vi sinh vật có khả năng sinh keratinase cao 8

1.4 Tình hình nghiên cứu 12

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 12

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13

1.5 Sản xuất và ứng dụng quá trình thuỷ phân keratin trong lông vũ 14

1.5.1 Tăng hàm lượng chất dinh dưỡng trong thức ăn gia súc 17

1.5.2 Tạo phân bón 17

1.5.3 Tạo enzyme trong các ngành công nghiệp 18

1.5.4 Cải tạo đất 18

1.5.6 Tạo hợp chất màu 19

1.5.7 Ứng dụng trong công nghiệp dược và sản xuất thực phẩm chức năng 19

PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

2.1 Nguyên liệu 20

2.1.1 Nguyên liệu 20

2.1.2 Hoá chất 20

2.1.3 Thiết bị 20

Trang 5

Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17ii

2.1.4 Môi trường nuôi cấy 20

2.1.4.1 Môi trường Broth Peptone 20

2.1.4.2 Môi trường I 20

2.1.4.3 Môi trường II 21

2.1.4.4 Môi trường III 21

2.1.4.5 Môi trường để phân lập chủng Chryseobacterium .21

2.1.4.6 Môi trường nuôi lắc lông vũ 21

2.1.4.7 Môi trường MPA 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao 22

2.2.1.1 Lấy mẫu và đo pH đất 22

2.2.1.2 Phân lập chủng vi khuẩn Chryseobacterium 22

2.2.1.3 Phân lập chủng vi khuẩn Vibrio 23

2.2.1.4 Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus 23

2.2.2 Xác định khả năng thuỷ phân lông vũ 23

2.2.2.1 Nuôi giống cấp 1 vào môi trường MPA 23

2.2.2.2 Xác định mật độ tế bào 25

2.2.3 Lựa chọn môi trường thích hợp cho các chủng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao 25

2.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên khả năng sinh trưởng của vi khuẩn thủy phân lông vũ 26

2.2.5 Xác định đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn 26

2.2.6 Xác định gram âm và gram dương của vi khuẩn 26

2.2.6.1 Phương pháp Hucker cải tiến 26

2.2.6.2 Xác định bằng cách kiểm tra độ kết dính 27

2.2.7 Phương pháp phân loại vi khuẩn theo đặc tính sinh hoá 28

2.2.8 Chọn dòng gene keratinase vào vector biểu hiện pET32a 30

2.2.8.1 Tách chiết DNA tổng số của chủng vi khuẩn 30

2.2.8.2 Nhân bản đoạn DNA bằng PCR 32

Trang 6

Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17iii

2.2.9 Phân tích hoạt tính keratinase ngoại bào 38

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Kết quả lấy mẫu ở các địa điểm 41

3.2 Giá trị pH của các mẫu đất 41

3.3 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả thủy phân keratin 42

3.4 Lựa chọn môi trường thích hợp của các chủng được chọn lọc 44

3.5 Tối ưu nhiệt độ của các chủng vi khuẩn chọn lọc 47

3.6 Đặc điểm hình thái nhóm vi khuẩn thuỷ phân lông vũ 48

3.7 Kết quả xác định gram của các chủng vi khuẩn 49

3.8 Phân loại các chủng phân lập theo phương pháp sinh hoá 50

3.8.1 Phân loại theo kit API 50CHB của chủng vi khuẩn Đ.GT.2.2 50

3.8.2 Phân loại theo kit API 20NE của chủng vi khuẩn L.SC.1.2 51

3.9 Phân loại theo kiểu gene 52

3.9.1 Tách DNA tổng số 52

3.9.2 Nhân đoạn gene mã hóa 16S rARN bằng kỹ thuật PCR 53

3.10 Chọn dòng gene keratinase vào vector biểu hiện pET32a 55

3.10.1 Nhân đoạn gene keratinase bằng kỹ thuật PCR 55

3.10.2 Gắn sản phẩm PCR đã thôi gel tinh sạch vào vector tách dòng pET32a 56

3.10.3 Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến DH10B 58

3.10.4 Tách DNA plasmid tái tổ hợp 59

3.11 Đánh giá hoạt tính ezyme dịch thô của chủng chọn lọc 60

3.11.1 Định lượng Protein bằng phương pháp Bradford 60

3.11.2 Thử hoạt tính enzyme bằng azokeratin 62

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

4.1 Kết luận 64

4.2 Kiến nghị 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

Trang 7

Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17iv

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) EtBr Dung dịch Ethidium Bromide

BSA Bovine serum albumin

DNA Deoxyribonucleic axid

rARN Ribosomal ribonucleic acid

LB Luria-Bertani

Ker Keratinase

bp Base pair(cặp ba zơ)

E.coli Escherichia coli

µl Microlit

EtOH Ethanol

Primer-F Mồi xuôi

Primer-R Mồi ngược

Trang 8

Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17v

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Sự đa dạng của vi sinh vật có khả năng sinh

keratinase và các đặc tính hóa sinh của keratinase

9

3.3 Tỷ lệ thủy phân lông vũ của các chủng tuyển chọn 43 3.4 Mật độ tế bào và khả năng thủy phân 1 gam lông vũ

ở các nhiệt độ khác nhau(Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)

47

3.6 Kết quả phép thử sinh hóa theo kit API 50 CHB của

Trang 9

Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

1.3 Ảnh dưới kính hiển vi các sợi bên trong tế bào

keratin

6

3.1 Khả năng thủy phân lông vũ của 4 chủng chọn lọc

(Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)

44

3.2 Khả năng sinh trưởng và thủy phân lông vũ của

các chủng vi khuẩn trên các môi trường khác nhau (Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)

46

3.3 Khả năng thủy phân lông vũ của các chủng vi

khuẩn trên các môi trường khác nhau (Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)

46

3.4 Khả năng thủy phân lông vũ của các chủng vi

khuẩn các khung nhiệt độ khác nhau (Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)

Trang 10

Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17vii

3.11 Sản phẩm tinh sạch gene ker và vector

pET32asau khi xử lý bằng 2 enzyme cắt

57

3.13 Sản phẩm biến nạp của 2 chủng vi khuẩn vào tế

bào khả biến E.coli DH10B

58

3.14 Ảnh điện di sản phẩm tách DNA plasmid tái tổ

hợp của các chủng sau biến nạp

59

3.15 Sản phẩm phản ứng cắt DNA plasmid tái tổ hợp

bằng 2 enzyme cắt XhoI và BamHI

60

Trang 11

Chuyên ngành Di truyền học 1 Lớp Sinh K17

MỞ ĐẦU

Lông vũ có lượng protein keratin thô rất cao (90 - 95%), nhưng phần lớn protein trong lông vũ không hòa tan trong nước Mặc dù rất khó bị phân hủy, nhưng các chất thải keratin có thể bị phân hủy bởi các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm có khả năng sinh tổng hợp keratinase Vi sinh vật sinh tổng hợp keratinase đã được phân lập từ nhiều vị trí địa lý khác nhau, từ đất Nam cực đến suối nước nóng, kể cả ở điều kiện môi trường hiếu khí và kỵ khí Ðến nay, các keratinase được nghiên cứu chủ yếu có nguồn gốc từ vi khuẩn như

Bacillus, Chryseobacterium, Pseudomonas,… Vì vậy, việc khai thác đa dạng

vi sinh vật sẽ cung cấp sản phẩm keratinase phù hợp với từng ứng dụng cụ thể

Keratinase phá vỡ cầu nối disunfua của keratin làm đứt liên kết của vòng xoắn Sau khi thủy phân hợp chất keratin trong lông vũ đã được phân huỷ và chia nhỏ thành các axit amin và peptit ngắn Như vậy, gia súc, gia cầm có thể

sử dụng lông vũ sau khi bị thủy phân làm thức ăn Chính vì vậy, keratinase đã

và đang được nghiên cứu ứng dụng trong các quá trình thủy phân lông vũ để tạo thành các hợp chất có thể bổ sung vào thức ăn gia súc, gia cầm hoặc làm phân bón hữu cơ,…

Ở Việt Nam hiện nay ngành công nghiệp tái tạo nguồn phế thải làm phân bón và thức ăn cho gia súc vẫn còn non trẻ và đang trong giai đoạn tìm nguồn nguyên liệu cũng như định hướng để phát triển Phương pháp được ứng dụng phổ biến hiện nay để xử lý phế thải lông vũ là sử dụng kiềm hoặc acid Tuy nhiên, phương pháp này còn nhiều hạn chế (giá thành cao, hiệu suất thấp…),

do vậy việc ứng dụng enzyme từ vi khuẩn để xử lý phế thải có nhiều ưu điểm hơn như tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giá thành thấp, mặt khác còn rất thân thiện với môi trường Vì vậy, việc nghiên cứu enzyme từ vi khuẩn để thủy phân lông vũ vừa có ý nghĩa khoa học, vừa có ý nghĩa thực tiễn

Trang 12

Với những ưu điểm trên, để phục vụ cho việc nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật đất và trên lông vũ có khả năng phân huỷ lông vũ, chúng tôi đã tiến hành

nghiên cứu đề tài: Tên đề tài “Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng thủy phân keratin từ lông vũ gia cầm và thiết kế vector tái tổ

hợp biểu hiện keratinase trong tế bào vi khuẩn E.Coli ”

 Mục tiêu của đề tài:

- Tuyển chọn được bộ chủng vi sinh vật đất thuộc các nhóm vi sinh vật như

Bacillus, Chryseobacterium và Vibrio có hoạt tính thủy phân với hiệu suất 70

– 80% lượng keratin lông vũ trong môi trường nuôi cấy

- Thiết kế được vector tái tổ hợp biểu hiện keratinase ở E.Coli

 Ý nghĩa của đề tài:

Ứng dụng xử lý lông vũ trong sản xuất phân bón

Thay thế hoặc tăng hàm lượng protein trong thức ăn gia súc gia cầm

Ngoài ra, việc nghiên cứu của đề tài còn mang lại nhiều ý nghĩa thiết thực trong đời sống như: Cải tạo đất trồng, giảm thiểu ô nhiễm môi trường và tạo

ra nguồn keratinnase vô cùng phong phú

 Nội dung:

- Thu thập mẫu đất chăn nuôi gia cầm hoặc nơi giết mổ gia cầm

- Tuyển chọn được các chủng Bacillus, Pseudomonas, Chryseobacterium trên

môi trường nuôi cấy

- Nhận dạng về hình thái và đặc điểm hóa sinh của các chủng thu được có khả năng phân giải mạnh keratin

- Thiết kế và nhân đoạn gen keratinase từ chủng có hoạt tính mạnh

- Chọn dòng keratinase trong vector biểu hiện pET32a để biểu hiện trong tế

bào vi khuẩn E coli

- Phân tích hoạt tính enzyme keratinase (enzyme ngoại bào)

Trang 13

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Keratin

Keratin là một hợp chất sừng rất khó phân huỷ, là thành phần chủ yếu của lớp biểu bì, tóc, lông, móng chân móng tay và men răng Keratin là một phức chất hóa học có chứa một lượng lớn sulfua, các acid amin, đặc biệt là cystein Ngoài ra còn có tyrosin, histidin, lysin, arginin, các muối: carbonat canxi, phosphat canxi

Hình 1.1: Một số hình dạng lông vũ

Nhìn hình dạng bên ngoài của lông vũ có thể thấy được lông vũ bao gồm hai thành phần chính đó là các sợi lông và cuống lông (Hình 1.1) Trong lông vũ hàm lượng protein keratin chiếm tỉ lệ rất cao chiếm từ 90 – 95% Từ các sợi keratin có chứa hàm lượng lưu huỳnh lớn đã được ép thành các bó keratin lớn hơn Trên các sợi lông, chất keratin rất mềm dẻo và dễ dàng bị phân cắt thành những sợi nhỏ và tan hết vào môi trường Tuy nhiên, trên cuống lông thì keratin lại có hàm lượng lưu huỳnh cao, tạo ra những hợp chất cứng, thô nên rất khó có thể thuỷ phân được Khi cấy các vi khuẩn để thuỷ phân lông vũ thì tất cả các cuống lông nhỏ đều được thuỷ phân hoàn toàn nhưng các cuống lông to thì mới chỉ được phân cắt thành những đoạn và những sợi rất nhỏ

Trang 14

trong khoảng thời gian hơn từ 7- 10 ngày Như vậy, hàm lượng hợp chất keratin trong lông vũ là nguyên nhân gây nên mùi khét rất lớn khi đốt lông vũ [13,14,15]

Keratin là thành phần chính của biểu bì và ở tóc, lông vũ, sừng, móng, len Dựa trên xác định cấu trúc cơ bản bậc hai, keratin được phân thành α và β (α-helix của tóc và len, β-sheets của lông vũ) [33] Các sợi keratin ở cả hai dạng α-helix và β-sheets được xoắn song song với nhau để đảm bảo độ bền ổn định của sợi [34,35] Các keratin được chia thành keratin cứng và keratin mềm tùy thuộc vào lượng sulfur Keratin cứng ở lông vũ, tóc, móng guốc, móng có nhiều cầu nối disulfur và không thể kéo dài ra Trong khi đó, keratin mềm như da, chai ở da có ít cầu nối disulfur và mềm dẻo hơn Các enzyme được biết đến như trypsin, pepsin và papain có khả năng cắt các cầu nối trong keratin để phân hủy [36] Mặc dù rất khó phân hủy, nhưng các chất thải keratin có thể bị phân hủy bởi vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm do chúng tạo ra các protease – keratinase

Thủy phân keratin từ vi sinh vật đã được nghiên cứu từ năm 1959 [37], tuy nhiên cơ chế thủy phân từ vi khuẩn vẫn chưa được nghiên cứu nhiều, nhưng việc giảm cầu nối disulfur có thể có ảnh hưởng đáng kể đến sự phân hủy keratin [38,39] Keratinase [EC 3.4.21/24/99.11] là serine hay là các metalloprotease có khả năng phân hủy cấu trúc protein keratin khó tan Các keratinase tham gia thủy phân các chất thải keratin từ lông vũ trong công nghiệp chăn nuôi gia cầm đã tạo ra các sản phẩm có giá trị như thức ăn chăn nuôi, phân bón, các polymer và các amino acid hiếm như serine, cysteine và proline

Trong móng chân tay và men răng thì hàm lượng keratin tồn tại ở dạng cứng nên rất khó phân huỷ Ngoài ra, keratin còn tồn tại trong sừng và móng của các loài động vật có vú.Còn ở 1 sốđộng vật chân đốt, lớp giáp xác thường

có các bộ phận giống như chiếc áo giáp hoặc giống bộ xương ngoài làm

Trang 15

nhiệm vụ bảo vệ đều được cấu tạo bằng keratin, chỉ một phần rất nhỏ cấu tạo

từ chitin

Tính chất

Keratin có cấu tạo hình sợi xoắn Chúng xoắn xung quanh nhau tạo thành các sợi trung gian, điều này đã tạo lên cầu nối disulfua, hình thành lên cấu trúc rất bền vững Trong phân tử của keratin có chứa tỉ lệ cao phân tử lưu huỳnh và nhiều loại axit amin Đặc biệt trong đó có một loại axit amin là cysteine, chính điều này làm nổi bật tính chất của keratin là rất khó hòa tan (Hình 1.2)

Hình1.2: Cấu tạo phân tử keratin

Theo cấu tạo của keratin có 2 loại chính sau:

Anpha- keratin (α-keratin): Trong tóc (kể cả lông cừu), sừng, móng tay, móng

chân, móng và móng guốc của động vật có vú Cấu tạo là các sợi đơn protein liên kết với nhau bằng liên kết hydro

Beta keratin (β-keratin): Trong móng tay và móng vuốt của loài bò sát, họ vỏ

chelonians (ba ba, rùa, …), và trong lông, mỏ, móng vuốt của chim và nhím,

được hình thành chủ yếu trong các tấm β Cấu trúc β cứng, chắc hơn cấu trúc

α do các tấm β được nối với nhau bằng các cầu nối disulfide

Trang 16

Keratin được tạo thành bởi keratinocytes, các tế bào sống tạo nên một phần lớn của da, tóc, móng tay móng chân, và keratin khác có chứa trong các

bộ phận của cơ thể Các tế bào từ từ đẩy lên trên bề mặt, cuối cùng chết và tạo thành một lớp bảo vệ của các tế bào Hàng ngàn các tế bào này có thể được sản sinh ra trong các điều kiện khác nhau, chẳng hạn như bệnh vẩy nến. Do đó gây hư hại cho các lớp bên ngoài của keratin, cho nên có thể làm, tóc, móng tay móng chân hay gãy và da bong ra từng mảng (Hình 1.3)

Hình 1.3: Ảnh dưới kính hiển vi các sợi bên trong tế bào keratin 1.2 Keratinase

Keratinase là một enzyme thuộc nhóm protease Đây là enzyme có khả năng thuỷ phân cấu trúc phức tạp của keratin lông Keratinase được tạo ra từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau thuộc nhóm vi sinh vật cổ, nhóm vi sinh vật nhân thật và nấm Keratinase thuộc nhóm enzyme protease, có khả năng thủy phân protein keratin không tan Các enzyme này được tạo ra trong sự quá trình phân hủy các cơ chất như keratin trong tóc, lông, sừng, … Các đặc tính

về hóa sinh và lý sinh của keratinase là rất đa dạng Phần lớn keratinase hoạt động ở điều kiện tối ưu là pH trung tính tới kiềm và nhiệt độ từ 300C đến

600C Kerainase có tiềm năng ứng dụng lớn trong nông nghiệp, dược học và các lĩnh vực y sinh học Ngoài ra, sử dụng keratinase trong sinh khối sinh học

Trang 17

có thể giải quyết một phần nào đó về chuyển đổi năng lượng và tái sử dụng các nhiên liệu

Gần đây, một nghiên cứu đã công nhận và định nghĩa keratinase là protease serine do hình dạng cấu tạo có tới 97% giống với protease kiềm và

nó cũng bị ức chế bởi các thuốc ức chế giống như ức chế protease serine [18] Khối lượng phân tử tùy theo từng loại sinh vật có thể dao động từ 18 đến 35 kDa đối với protease serine có khối lượng phân tử nhỏ và lớn hơn 90 kDal đối với protease serine có khối lượng lớn

Hình 1.4: Cấu tạo phân tử của enzym Keratinase

Trang 18

Tính chất:

 Keratinase thuỷ phân thành các axit amin:

Với tính chất thuỷ phân của keratinase, nó phá vỡ cầu nối disunfua của keratin làm đứt liên kết của vòng xoắn Như vậy, sau khi thuỷ phân hợp chất keratin trong lông vũ đã được phân huỷ và chia nhỏ thành các axit amin và peptit ngắn Khi đó protein keratin mang đầy đủ các tính chất của protein tan như là: Tính hoà tan, kết tủa, điện ly lưỡng tính, thuỷ phân và phản ứng màu đặc trưng

Keratinase chủ yếu tấn công vào các liên kết disulfide (S-S), làm suy giảm các protein dạng sợi fibrin, elastin, collagen và sợi protein khác

 pH và nhiệt độ:

Keratinase chịu được ở nhiệt độ từ 30o

C - 80oC nhưng nhiệt độ tối ưu là:

50oC và enzyme này được ổn định khi bảo quản ở -20oC [21] Keratinase bền vững trong khoảng pH từ 6,0 - 9,0 nhưng pH tối ưu là 7,5 [21]

 Chất kìm hãm:

Khi bổ sung đường sucrose và lactose làm ức chế sự tổng hợp keratinase [21] Chất nền có nồng độ và lượng cơ chất quá cao cũng sẽ làm ức chế sự tổng hợp keratinase [21] Khi bổ sung các chất có chứa các ion kim loại nặng hoá trị hai như: Cu2+

, Ag2+, Hg2+ và Pb2+ thì cũng làm ức chế sự hoạt động của keratinase [22] Một số hoá chất khác cũng ức chế phản ứng enzyme keratinase như: EDTA,…[21]

 Chất hoạt hoá:

Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới thì khi bổ sung các chất có chứa các ion kim loại hoá trị hai như: Ca2+

, Mg2+, Mn2+ thì kích thích sự hoạt động của keratinase [22]

1.3 Đa dạng vi sinh vật có khả năng sinh keratinase cao

Trang 19

Các keratinase là một dạng protease rất phổ biến trong thế giới vi sinh vật

và được phân lập từ nhiều vị trí địa lý khác nhau cả ở điều kiện môi trường hiếu khí và kỵ khí Vì vậy, vi khuẩn tổng hợp keratinase có sự đa dạng rất lớn

về đặc tính hóa sinh và lý sinh Các đặc tính của một số vi khuẩn tổng hợp keratinase được tóm tắt trong bảng 1.1

Bảng 1.1: Sự đa dạng vi sinh vật có khả năng sinh keratinase và các đặc tính hóa sinh của keratianse

Vi sinh vật

Dạng xúc tác

Trọng lƣợng phân tử (kDa)

Trang 20

Ðến nay, keratinase được nghiên cứu chủ yếu có nguồn gốc từ vi khuẩn, trong

đó Bacillus được nghiên cứu nhiều nhất Nhiều chủng B licheniformis và B

subtilis được mô tả có khả nãng thủy phân keratin [44, 63-66], những loài

khác như B pumilus và B cereus cũng có khả nãng tổng hợp keratinase [40,

43, 67, 68] Các loài khác nhau của cùng một chi (chẳng hạn, Bacillus) có thể

tạo ra các keratinase khác nhau (Bảng 1.1)

Sinh tổng hợp keratinase cũng được nghiên cứu ở xạ khuẩn, chủ yếu là từ

các chi Streptomyces Nhóm vi khuẩn này được phân lập từ các vùng đất khác

nhau, có khả năng thủy phân một loạt các chất chứa keratin như tóc, len và

Trang 21

lông Gushterova và cộng sự [69] đã phân lập hai chủng xạ khuẩn chịu nhiệt

có hoạt tính thủy phân keratin cao là Streptomyces flavis 2BG và

Microbispora aerata IMBAS-11A Các loài chịu nhiệt như Streptomyces gulbarguensis [60], Streptomyces thermoviolaceus [61] và Streptomyces thermonitrificans [70] cũng đã được phân lập từ đất Ngoài những chủng ưa

nhiệt, một số Streptomyces kém bền nhiệt đã được phân lập như Streptomyces

pactum DSM 40.530 [59], Streptomyces graminofaciens [39] và Streptomyces albidoflavus K1-02 [58]

Ngoài các chủng thuộc Bacillus sp và xạ khuẩn, một số chủng vi khuẩn có

khả năng thủy phân keratin diễn ra ở nhiệt độ cao, pH và kiềm nhiệt hóa đã

được công bố như Fervidobacterium pennavorans [50], Fervidobacterium

islandicum [49], Meiothermus ruber H328 [72], Clostridium sporogenes [47]

và các chủng Thermoanaerobacter sp [62] được phân lập từ các môi trường

khắc nghiệt như suối nước nóng, lỗ thông hơi nhiệt, và khu vực núi lửa Một

số vi sinh vật hoạt động ở môi trường kiềm như Nesternkonia sp [73] và

Nocardiopsis sp TOA-1 [54] cũng có khả nãng thuỷ phân keratin

Đặc tính hóa sinh của keratinase

Các đặc tính của enzyme được tạo ra từ vi khuẩn là rất đa dạng, tùy thuộc vào loại vi sinh vật sản xuất ra keratinase Các enzyme này chủ yếu là enzyme ngoại bào được tiết ra từ vi sinh vật Một số đặc điểm sinh hóa của keratinase

đã được trình bày ở bảng 1.1 Phần lớn các keratinase được tiết ra từ vi khuẩn

có pH là kiềm hoặc trung tính, pH tối ưu từ 7,5-9,0 Tuy nhiên, một số keratinase khác được tối ưu hoạt động ngoài phạm vi này, pH hoạt động ở kiềm hóa [74] hoặc pH là axít [75,76] Một số keratinase ổn định trên một

khoảng pH rộng Ví dụ như keratinase của chủng Nocardiopsis TOA-1, được

ổn định trong khoảng pH từ 1,5-12, trong 24 h ở 30°C [54]

Trang 22

Điều kiện hoạt động tối ưu của keratinase rất thay đổi, thường phụ thuộc vào

nơi và nguồn gốc phân lập (bảng 1.1) Keratinase từ chủng chịu nhiệt F

pennavorans có nhiệt độ tối ưu ở 80°C [50] trong khi keratinase từ chủng

nhiệt độ thường Stenotrophomonas maltophila DHHJ có hoạt động tối ưu ở 40°C [55] Nam và công sự [49] đã chứng minh được F islandicum AW-1 có

nhiệt độ tối ưu ở 100°C Trọng lượng phân tử keratinase đã được xác định

Mặc dù trọng lượng phân tử các enzyme từ 18 kDa (S albidoflavus [58]) đến

240 kDa (K rosea [51]) nhưng phần lớn keratinase có trọng lượng phân tử

thấp hơn 50 kDa (bảng 1.1) Phần lớn các keratinase là các đơn enzyme, tuy nhiên phân lớp đa enzyme cũng đã được ghi nhận [57] Trọng lượng phân tử cao thường kết hợp với các keratinase với các đặc tính của metalloprotease hoặc chúng có nguồn gốc từ chịu nhiệt (bảng 1.1)

Ảnh hưởng của các ion kim loại và các bất hoạt hoạt tính keratinase đã và đang được nghiên cứu Gần đây các nghiên cứu của Gupta và Ramnani [77] cho thấy các ion kim loại hóa trị 2 như Ca2+

, Mg2+ và Mn2+ có xu hướng kích thích hoạt tính enzyme keratinase Ảnh hưởng này có thể liên quan tới việc duy trì hoạt tính của enzyme và tạo ra sự ổn định phức hợp giữa cơ chất và enzyme Ngoài ra các ion kim loại có thể bảo vệ cho enzyme chống lại biến tính về nhiệt độ [53, 58] Ngược lại, sự chuyển trạng thái và các kim loại nặng khác như Cu2+

, Ag+, Hg2+ và Pb2+ là nguyên nhân của sự bất hoạt các enzyme keratinase Các keratinase thường ổn định trong sự hiện diện của dung môi hữu cơ như DMSO, Triton X-100

1.4 Tình hình nghiên cứu

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Việt Nam là nước sản xuất gia cầm chủ yếu ở quy mô nhỏ tiêu thụ ngay trên thị trường địa phương hoặc các tỉnh lân cận, nhưng đến nay đã có nhiều

hộ gia đình bắt đầu sản xuất gia cầm ở quy mô công nghiệp như các trại gà

Trang 23

lạnh khép kín theo dây truyền sản xuất của Cộng Hoà Liên Bang Đức Nhiều công ty cũng bắt đầu tập trung vào đầu tư chế biến sản xuất gia cầm như công

ty CP dự định xây dựng thêm 2 nhà máy chế biến gia cầm mới ở ngoại ô Hà Nội với công suất 50.000 con gia cầm/tuần và một nhà máy sẽ được đặt tại Đồng Nai Theo tổng cục thống kê, năm 2003 tổng gia cầm của Việt Nam lên tới 250 triệu con và cho ra sản lượng thịt gia cầm đạt tới 371 ngàn tấn [27]

Do lông tạo nên 5% trọng lượng cơ thể gia cầm do đó lượng lông vũ từ gia cầm có thể là 18,6 ngàn tấn năm, đây có thể là nguồn nguyên liệu lớn làm phân bón hữu cơ và thức ăn gia súc cho ngành nông nghiệp Năm 1993, Văn Thị Hạnh cùng cộng sự đã nghiên cứu tạo protein hòa tan từ lông vũ phế thải bằng phương pháp kiềm để thủy phân [3] Hiện nay, tại Phòng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ Sinh học đã và đang tiếp tục phân lập các chủng vi khuẩn có thể thuỷ phân lông vũ Sau khi tìm ra những điều kiện tối ưu cho các chủng có khả năng thuỷ phân tốt sẽ tiến hành định tên chủng bằng các phương pháp hoá sinh (API 20 NE và API 50 CHB) cũng như định loại bằng phương pháp sinh học phân tử Sau khi phân lập và tuyển chọn các chủng tốt, nhóm nghiên cứu đang tìm ra những ứng dụng hữu ích và thiết thực nhất đối với vật nuôi và cây trồng

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay trên thế giới, các kết quả nghiên cứu về keratinase cho thấy nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau có khả năng thủy phân lông vũ, chẳng hạn

các chủng thuộc các nhóm Bacillus, Chryseobacterium, Actinomycetes, Vibrio

và nấm [18, 19, 20] Sử dụng vi sinh vật và keratinase nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm dinh dưỡng từ bột lông vũ đã và đang được quan tâm Bột

lông vũ thủy phân bằng Bacillus licheniformis có bổ sung amino acid làm

thức ăn cho gà đã tạo ra sự tăng trưởng của gà tương tự như gà sử dụng nguồn

thức ăn ở đậu tương [22] Sử dụng keratinase thô từ chủng Bacillus

licheniformis làm tăng khả năng phân giải nguồn lông vũ thô cũng như là bột

Trang 24

lông vũ Enzyme thủy phân này sẽ làm tăng khả năng tiêu hóa lông vũ tới 82% và có thể thay thế tới 7% protein ăn cho gà [24]

Mỗi năm trên thế giới có 24 tỷ gà bị chết tạo ra khoảng 9 tỉ tấn lông gia cầm Thời gian cần thiết để một chiếc lông thực hiện quá trình phân hủy tự nhiên của mình là 5-7 năm, dẫn đến hậu quả ô nhiễm môi trường

Một số nghiên cứu đã chứng minh được rằng vi sinh vật thủy phân keratin

có thể tồn tại trong lông, móng, guốc Chính sự xuất hiện của vi sinh vật này

đã làm tăng khả năng xử lý chất thải, giảm thiểu gây ô nhiễm môi trường Đặc biệt keratinase của chủng vi sinh vật là thành phần quan trọng trong công nghệ sinh học liên quan tới nguồn chất thải công nghiệp lông vũ và trong chăn nuôi [24]

Đối với phân bón, keratin sau khi bị thủy phân thành các amino acid, các peptide hòa tan sẽ cung cấp dinh dinh dưỡng cho cây trồng Các dạng phân hữu cơ này có thể được bón qua lá với một lượng nhỏ nhưng có tác dụng làm tăng quá trình phát triển của cây, giảm được lượng phân bón hoá học vào đất

và có khả năng tăng chất lượng cho sản phẩm Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng đã chỉ ra rằng phun qua lá tăng hiệu quả hơn bón qua gốc từ 8-10 lần

1.5 Sản xuất và ứng dụng quá trình thuỷ phân keratin trong lông vũ

Keratinase đã được sản xuất và bán trên thị trường với nhiều mục đích khác nhau Sinh tổng hợp keratinase thường được cảm ứng bởi keratin Do đó,

cơ chất keratin (lông gà, bột lông vũ, tóc) thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, việc bổ sung cơ chất keratin không phải nhất thiết cho sản xuất keratinase Các chất không phải là keratin, như bột đậu nành [78], đậu nành [79], sữa tách kem [54], bột tôm [48], gelatin [52], casein và

Trang 25

phomat lỏng [80], đã được chứng minh là những chất cảm ứng của sinh tổng hợp keratinase

Bổ sung vào môi trường keratin với các nguồn carbon hoặc các nguồn nitơ khác nhau có thể làm tăng sinh tổng hợp keratinase Ví dụ, bổ sung glucose, sucrose, tinh bột, mật đường, và thêm các nguồn nitơ, chẳng hạn như urê, dung dịch peptone, tryptone, men chiết xuất, amoni clorua và nitrat natri

đã nâng cao sản lượng enzyme [39, 47, 51, 81] Tuy nhiên ở một số vi sinh vật nhất định lại giảm sản xuất enzyme do bị ức chế quá trình trao đổi chất [82,83] Do đó, hiệu quả của sinh tổng hợp keratinase có sự biến động lớn, phụ thuộc vào chủng vi sinh vật, chất cảm ứng và nồng độ nguồn carbon và nitơ Vì vậy, thành phần môi trường phải được xác định theo từng trường hợp

cụ thể Bên cạnh thành phần môi trường nuôi cấy, các điều kiện khác như nhiệt độ, pH, và sục khí cũng là những yếu tố quan trọng để có được sản lượng keratinase cao

Bài tiết keratinase thường đạt được cao nhất trong pha log hoặc pha sinh

trưởng cân bằng của tế bào Tuy nhiên, chủng Serratia sp HPC 1383 có hoạt

tính cao nhất trong giai đoạn sinh trýởng (24 h đầu tiên) trên môi trường bột lông vũ, trong khi nhiên liệu sinh học tối đa được đạt được ở 96 h [84]

Ðể tăng cường khả năng sinh tổng hợp keratinase và thủy phân keratin các kỹ thuật sinh học phân tử đã được sử dụng trong nghiên cứu phát triển các chủng đột biến và tái tổ hợp Bằng kỹ thuật chọn dòng và biểu hiện gen tái tổ hợp, sinh tổng hợp keratinase tái tổ hợp trong tế bào vi sinh vật không gây hại với thông tin di truyền từ vi sinh vật có nguồn bệnh tới sức khỏe cũng đã được

nghiên cứu Gen kerA, mã hóa keratinse của chủng B licheniformis, được

biểu hiện cùng với lông vũ (lông vũ là nguồn cacbon và nitơ) trong môi trường nuôi cấy dẫn đến sự biểu hiện mạnh của protease thủy phân keratin Ngoài ra, tăng năng suất keratinase đã được nghiên cứu bằng cách tích hợp

Trang 26

nhiễm sắc thể với nhiều bản sao của gen kerA ở B licheniformis và B subtilis

[85]

Phần lớn các báo cáo nghiên cứu sản xuất keratinase đều ở dịch lỏng, gần đây sản xuất các enzyme thủy phân keratin qua quy trình sử dụng môi trường rắn cũng đã được nghiên cứu [86] Parkash và cộng sự [87] đã nghiên cứu sản xuất keratinase bằng các vi sinh vật lên men tĩnh

Keratinase vi sinh vật được coi là chất xúc tác sinh học đầy hứa hẹn cho các mục đích khác nhau, bao gồm các ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi, phân bón, chất tẩy rửa, thuộc da, và các ngành công nghiệp dệt, ngoài ra còn ứng dụng trong dược phẩm và ứng dụng y sinh học [77, 88] Mặc dù vậy, so với các ngành công nghiệp sản xuất enzyme khác thì keratinase vẫn còn trong giai đoạn non trẻ Bảng 1.2 đưa ra các ứng dụng hiện tại và tiềm năng của keratinase

Trang 27

Các keratinase có giá trị phân hủy protein keratin khó tan Chính vì vậy, sự hiểu biết về vi sinh vật sản xuất keratinase và các đặc tính hóa sinh của keratinase sẽ góp phần trong việc quản lý nguồn chất thải keratin trong nông nghiệp một cách hợp lý và hiệu quả Ngoài ra, sử dụng các kerainase làm tăng đường dẫn thuốc, quá trình hydroxyl hóa, sản xuất các film thủy phân bằng sinh học, và sản xuất các nguyên liệu sinh học, đã và đang làm tăng lên các ứng dụng của keratinase, cụ thể như sau:

1.5.1 Tăng hàm lƣợng chất dinh dƣỡng trong thức ăn gia súc

Khi bổ sung các vi khuẩn đã được phân lập và tuyển chọn vào các loại thức ăn thì làm cho thức ăn của gia súc bảo quản được lâu hơn, khi gia súc ăn

sẽ dễ tiêu hoá hơn [3, 24].Trong công nghiệp, phế liệu lông được biến đổi thành lông bị thuỷ phân sử dụng nhiệt độ và áp suất cao Tuy nhiên sử dụng bột lông đã thuỷ phân để thay thế protein có một số giới hạn Khi thêm 6% bột lông đã thuỷ phân vào bữa ăn của gà con làm giảm trọng lượng cơ thể của chúng Tuy nhiên, sử dụng thuỷ phân bột lông bằng vi khuẩn có thể tạo ra sản phẩm thay thế đến 15% protein trong thức ăn gia cầm[26]

Thí nghiệm trên gà, người ta nhận thấy rằng feather lysate, được cân bằng với một số axit amin, có thể thay thế đậu nành như là một nguồn protein tới 70% trong khẩu phần Trong các nghiên cứu khác, bột lông thương mại được ủ qua đêm với Keratinase để tạo ra một phần bột lông thuỷ phân Khả năng tiêu hoá amino acid của bột lông thủy phân với Keratinase ở gà trưởng thành là 82% cao hơn so với bột lông thủy phân thương mại, 60%

Vậy có thể kết luận rằng keratinase có khả năng thuỷ phân và biến đổi bột lông vũ thành nguồn protein có thể tiêu hoá ở mức tối đa là 70% protein khẩu phần trong thức ăn

1.5.2 Tạo phân bón

Với tác dụng của các chủng vi khuẩn này chúng có thể sử dụng làm các loại phân bón vi sinh như: phân vi sinh vật cố định đạm, phân vi sinh vật phân

Trang 28

giải lân, phân vi sinh vật kích thích điều hoà sinh trưởng thực vật, phân vi sinh vật phân giải xenllulo [2]

Dịch môi trường sau khi đã thuỷ phân lông vũ được ly tâm, tinh chế tách chiết đem lại tác dụng kích thích sinh trưởng giúp cây phát triển tốt và chống

chịu tốt với các loại bệnh hại cây trồng

1.5.3 Tạo enzyme trong các ngành công nghiệp

Chủng vi khuẩn Bacillus Licheniformis ngoài tác dụng thuỷ phân tốt hợp

chất keratin trong lông vũ còn có tác dụng quan trọng trong ngành sản xuất hai enzyme proteases và amylases [9, 10] Các enzyme phân giải protein là các enzyme quan trọng nhất trong công nghiệp vì các ứng dụng rộng rãi của chúng trong công nghiệp tẩy rửa, sữa, dược, thuộc da và công nghiệp thực phẩm Keratinase trong môi trường lông kích thích tiết ra ít nhất hai protease kiềm là subtilisin Carlsberg và subtilisin BPN có khả năng chịu nhiệt (35-

37oC) và ổn định trong thời gian dài Hai protease này thuộc nhóm subtilisin Subtilisin Carlsberg là protease vi sinh vật công nghiệp quan trọng nhất, được

sử dụng nhiều trong sản xuất các chất tẩy rửa.Subtilisin Carlsberg có tính đặc hiệu rộng, thủy phân nhiều loại liên kết peptide cũng như các liên kết ester, nhất là những liên kết được tạo thành từ các amino acid thơm Dưới tác dụng của enzyme này, một số triglyceride cũng có thể bị thủy phân như tripropionin

và tributyrin Subtilisin Carlsberg thủy phân từ 30 đến 40% liên kết peptide của casein Subtilisin BPN là một dãy protease ngoại bào và là một lớp enzyme đại diện lớn nhất của dãy protease có cấu trúc đặc trưng là α/β/α và trung tâm hoạt động gồm Ser 221, His 64, Asp 32 Cấu trúc không gian ba chiều của chúng bền vững trong khoảng pH rộng và ngay cả khi có mặt của dung môi hữu cơ Hai protease này đều phân huỷ keratin trong lông thành các peptide ngắn và axit amin, những chất này được vi sinh vật sử dụng làm nguồn cacbon và nitơ

1.5.4 Cải tạo đất

Trang 29

Như chúng ta đã biết hệ vi sinh vật trong đất có tác dụng cải tạo đất rất lớn Nơi nào càng chứa nhiều vi sinh vật thì tại đó đất càng tơi xốp và giàu chất dinh dưỡng Trong thành phần của hệ vi sinh vật đó có rất nhiều chủng vi khuẩn mà chúng ta đã phân lập và tuyển chọn được Khi biết chính xác tên của từng chủng vi khuẩn ta có thể bổ sung vào từng loại đất cây trồng thích hợp [1] Những chủng vi khuẩn được bổ sung sẽ cải tạo đất, làm tăng độ kết dính của đất và làm cho cây trồng được phát triển nhanh hơn vì có nhiều chất dinh dưỡng cần thiết Ngoài ra những vi khuẩn này còn có thể tạo ra tính đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng

1.5.5 Đối với môi trường sinh thái

Hiện nay, với sự phát triển của nghành chế biến gia cầm, đã kéo theo một lượng lớn rác thải lông vũ từ các khu giết mổ và trang trại chăn nuôi Nếu không được xử lý thì lượng rác thải này sẽ gây ra những mùi hôi thối từ khí

H2S làm ảnh hưởng đến cuộc sống của con người và môi trường sống Chúng

ta có thể bổ sung các chủng vi khuẩn đã được phân lập tuyển chọn vào các đống rác ủ để các chủng vi khuẩn này phân huỷ các hợp chất khó tiêu huỷ như lông vũ Đây là ý nghĩa rất quan trọng giúp môi trường được trong sạch và giảm thiểu sự ô nhiễm một cách cần thiết

1.5.6 Tạo hợp chất màu

Một số vi sinh vật như tảo, nấm và vi khuẩn tạo ra các chất màu carotenoid Trong công nghiệp, chúng được sử dụng làm chất màu thực phẩm Cantaxanthin, một xantophyll carotenoid được sử dụng như thức ăn bổ sung cùng với astaxanthin trong công nghiệp gia cầm nhằm cải thiện màu của gà, lòng đỏ trứng gà Cantaxanthin chính là chất màu được các chủng Keratinase.rosea tổng hợp

1.5.7 Ứng dụng trong công nghiệp dược và sản xuất thực phẩm chức năng

Trang 30

Các peptide có hoạt tính sinh học từ keratin có chứa trong các vật liệu như len, da, tóc và lông là một trong những thành phần của thực phẩm chức năng

có giá rẻ và phong phú từ các nguồn tự nhiên Các chuỗi axit amin giàu prolin

có hoạt tính sinh học đượcdùng để phòng chống các bệnh cho con người bao gồm: ngăn chặn sự hình thành khối u, kiểm soát tăng huyết áp và bệnh Alzheimer [24]

PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu

2.1.3 Thiết bị

Các thiết bị được sử dụng đặt tại Phòng Vi sinh vật đất và Phòng Thí nghiệm Trọng điểm, Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.1.4 Môi trường nuôi cấy

2.1.4.1 Môi trường Broth Peptone [16]

Trang 31

Trang 32

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao

2.2.1.1 Lấy mẫu và đo pH đất

 Lấy mẫu

Loại bỏ lớp dất dày 2-3 cm trên bề mặt Sau đó dùng dao hay xẻng để lấy những tảng đất theo độ sâu của lớp đất nghiên cứu Các mẫu đất và lông lấy được cho vào túi li lông tiến hành phân tích ngay hoặc được bảo quản ở 40

C

 Đo pH đất

Cân 18,64 gram KCl và 20 gram đất cho vào bình đựng 250 ml H2O cất

Cân 20 gram mẫu đất cho vào 2 bình tam giác 100ml:

+ Bình 1 cho 50ml nước cất (Đo pH bề mặt) + Bình 2 cho 50ml dung dịch KCl (Đo pH trong đất) Lắc cho tan mẫu với vận tốc 200 vòng/ phút trong 10 phút Sau đó để tĩnh 24h rồi tiến hành đo giá trị pH của đất

2.2.1.2 Phân lập chủng vi khuẩn Chryseobacterium

Từ các mẫu lông thu được, cân 10 gram lông ủ trong môi trường broth peptoneở 24h, 30oC Sau đó lấy 1ml dịch nuôi cho vào 90 ml nước vô trùng

Trang 33

(độ pha loãng 10-1) Dùng pipet vô trùng hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml môi trường nước muối sinh lý vô trùng (độ pha loãng là 10-2

), thay pipet tiếp tục hút 1 ml dung dịch vừa pha loãng sang ống tiếp theo Tiếp tục làm như vậy ta sẽ được các dung dịch pha loãng 10-3

, 10-4, 10-5 , hút 0,05

ml dịch pha loãng trải ra đĩa thạch chứa môi trường III Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3 lần và được nuôi ở 30oC Sau 24, 48 giờ số lượng khuẩn lạc được đếm bằng mắt thường và tiến hành chọn khuẩn lạc theo hình thái riêng

2.2.1.3 Phân lập chủng vi khuẩn Vibrio

Từ các mẫu lông thu được, cân 10 gram lông đưa vào môi trường đệm Phosphate – buffered – Saline (PBS) → lắc 20 - 30 phút, 200v/p Sau đó lấy 1ml dịch nuôi cho vào 90 ml nước vô trùng (độ pha loãng 10-1

) Dùng pipet vô trùng hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml môi trường nước muối sinh lý vô trùng (độ pha loãng là 10-2), thay pipet tiếp tục hút 1 ml dung dịch vừa pha loãng sang ống tiếp theo Tiếp tục làm như vậy ta sẽ được các dung dịch pha loãng 10-3

, 10-4, 10-5 , hút 0,05 ml dịch pha loãng trải ra đĩa thạch chứa môi trường II Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3 lần và được nuôi ở 37oC Sau 24, 48 giờ số lượng khuẩn lạc được đếm bằng mắt thường và tiến hành chọn khuẩn lạc theo hình thái riêng

2.2.1.4 Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus

Từ các mẫu đất thu được ta nghiền nhỏ, cân 10 gram cho vào 90 ml nước

vô trùng (độ pha loãng 10-1) → lắc 30’, 200v/p Sau đó dịch mẫu được xử lý sốc nhiệt ở 80oC trong thời gian 10 phút Dùng pipet vô trùng hút 1 ml mẫu đã được ủ ở 80oC trong 10 phút cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml môi trường nước muối sinh lý vô trùng (độ pha loãng là 10-2), thay pipet tiếp tục hút 1ml dung dịch vừa pha loãng sang ống tiếp theo Tiếp tục làm như vậy ta

sẽ được các dung dịch pha loãng 10-3

, 10-4, 10-5 (pha loãng 9-10 lần), hút

Trang 34

0,05 ml dịch pha loãng trải ra đĩa thạch chứa môi trường I Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3 lần và được nuôi ở 37oC Sau 24, 48 giờ số lượng khuẩn lạc được đếm bằng mắt thường và tiến hành chọn khuẩn lạc theo hình thái riêng

2.2.2 Xác định khả năng thuỷ phân lông vũ

2.2.2.1 Nuôi giống cấp 1 vào môi trường MPA

Cách tiến hành:

- Pha môi trường MPA (đã nêu ở phần 2.1.4.7)

- Dùng que cấy giống, hơ phần đầu của que cấy giống trên trên ngọn lửa đèn cồn cho cháy đỏ rực Sau đó đưa qua đưa lại phần thân của que cấy trên trên ngọn lửa đèn cồn để vô trùng tuyệt đối→ Làm nguội que cấy→ Lấy 1 ít chủng trong ống nghiệm đưa vào các bình môi trường, đồng thời giũ mạnh que cấy

để cho tất cả chủng giống được cấy vào môi trường → Ghi tên chủng và ngày cấy ngoài vỏ bình → Đem đi nuôi lắc qua đêm, ở nhiệt độ 30oC với vận tốc

200 vòng/phút

(Lưu ý: Khi lấy chủng phải thật khéo không được để chạm vào thành ống nghiệm và khi mở nắp bình phải hơ miệng bình môi trường và nút bông qua ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiễm khuẩn)

 Cấy giống cấp 1 vào bình môi trường nuôi lắc có bổ sung lông vũ

Cách tiến hành:

- Pha môi trường nuôi lắc lông vũ (đã nêu ở phần 2.1.4.6)

- Dùng pipet thuỷ tinh lấy 0,5 ml giống cấp 1 cho vào bình môi trường (mỗi bình 1% giống) Mỗi chủng giống cấy vào 1 bình Sau đó đem đi nuôi lắc cùng với bình đối chứng ở 30o

C - 35oC, với tốc độ 200 vòng/phút, trong khoảng thời gian là 3-5 ngày

- Pha loãng và cấy trải giống cấp 1, theo dõi các chủng giống qua các ngày nuôi cấy

 Nhận xét và đo pH của dịch nuôi từng chủng sau khi nuôi cấy

Trang 35

- Đo pH, nhận xét của từng chủng nuôi cấy

- Xác định trọng lượng lông còn lại sau thời gian nuôi lắc (Làm khô lông và cân khối lượng còn lại sau nuôi cấy lắc) → xác định tỉ lệ % về khả năng thuỷ phân lông vũ của các chủng vi khuẩn theo công thức:

BĐ

C BĐ

m

m m

A (%): Tỉ lệ phần trăm về sự thuỷ phân của các chủng

mBĐ: Trọng lượng lông vũ ban đầu

mC: Trọng lượng lông vũ còn lại sau thời gian nuôi cấy lắc

→ Chọn lọc các chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân keratin mạnh nhất (sinh keratinase cao)

2.2.2.2 Xác định mật độ tế bào

Mật độ tế bào vi khuẩn sau khi pha loãng và cấy trải trên môi trường được tính bằng công thức:

Y = a x 20 x 10 n

Y: Số khuẩn lạc thu được trên 1 ml dịch

a: Số khuẩn lạc thu được trên đĩa thạch

20: (1000 µl/50 µl)

10 n : Độ pha loãng mẫu

2.2.3 Lựa chọn môi trường thích hợp cho các chủng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao

Các chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn là những vi khuẩn có khả năng thuỷ phân lông vũ tốt nhất Sau đó đem đi thử nghiệm trên các môi trường khác nhau với mục đích là tìm ra môi trường thích hợp và có giá trị kinh tế Chuẩn bị môi trường để cấy chủng bao gồm: Môi trường giàu dinh dưỡng (môi trường MPA), môi trường dinh dưỡng bình thường (môi trường khoáng)

và môi trường nghèo dinh dưỡng (môi trường nước)

- Nuôi giống cấp 1vào môi trường MPA

Trang 36

Cách tiến hành: các bình môi trường làm như phần phương pháp nghiên cứu

(2.2.2.1)

- Cấy giống cấp 1 vào các bình thử môi trường nuôi lắc có bổ sung lông vũ

Cách tiến hành: làm như phần phương pháp nghiên cứu (2.2.2.1)

2.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên khả năng sinh trưởng của vi

khuẩn thủy phân lông vũ

Các chủng vi khuẩn đã chọn lọc là có khả năng thuỷ phân lông vũ tốt nhất, được thử nghiệm trong cùng môi trường lông vũ trên các khung nhiệt độ khác nhau với mục đích là tìm ra nhiệt độ thích hợp Khi tìm được nhiệt độ thích hợp với từng chủng thì giúp các chủng đó có khả năng thuỷ phân lông vũ tốt nhất

Các chủng được thử trên các khung nhiệt độ là: 25o

C, 30oC, 35oC và 40oC Chuẩn bị giống cấp 1, cấy giống cấp 1 vào các bình môi trường làm như phần phương pháp nghiên cứu (2.2.2.1) Sau đó, pha loãng để đếm mật độ giống cấp 1 sau 3 ngày nuôi lắc Đo pH, nhận xét sự thuỷ phân của từng chủng trên mỗi nhiệt độ sau từng ngày nuôi cấy Cân khối lượng lông còn lại của từng chủng trên các nhiệt độ sau 3 ngày nuôi cấy

2.2.5 Xác định đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn được ria sạch trước 24 h, đưa lên lam kính đã nhỏ sẵn

1 giọt muối sinh lý Đánh tan sinh khối rồi đậy lam men lên Sau đó, các chủng vi khuẩn được đem lên kính hiển vi để nhận biết về hình dạng, kích thước tế bào

Trang 37

2.2.6 Xác định gram âm và gram dương của vi khuẩn

2.2.6.1 Phương pháp Hucker cải tiến

Vật liệu và hoá chất:

Dung dịch tím kết tinh (crystal violet)

- Cân 2g tím kết tinh hoà tan trong 20 ml etanol 95% và 0,8 g amon oxalat hoà tan trong 80 ml nước cất Sau đó trộn hai dịch lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc Bảo quản trong lọ tối, sử dụng vài tháng

Dung dịch Iod:

- Hoà tan 1 g Iod (Iodine) trong 3-5 ml nước cất, thêm 2 g KI (kali iodie) khuấy cho tan hết, cho đủ 300 ml nước cất Bảo quản trong lọ tối

Dung dịch tẩy màu:

Etanol 95% hoặc trộn 70 ml etanol 95% với 30 ml aceton

Dung dịch nhuộm bổ sung:

- Chuẩn bị sẵn dung dịch safannin 2,5% trước khi dùng pha với nước cất theo

tỉ lệ 1: 5, để có được dung dịch 0,5%

Các bước tiến hành:

- Chuẩn bị vết bôi: Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí

- Cố định tế bào:

+ Hơ nhanh vết bôi qua ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần

+ Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong một phút, rửa nước và thấm khô

+ Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong một phút, rửa nước và thấm khô + Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu) rửa nước và thấm khô

+ Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safrannin trong 2-3 phút, rửa nước,

để khô trong không khí

Trang 38

+ Soi kính: Dùng vật kính 100X

Kết quả:

+ Vi khuẩn gram dương bắt màu tím

+ Vi khuẩn gram âm bắt màu đỏ

2.2.6.2 Xác định bằng cách kiểm tra độ kết dính

Lấy một vòng que cấy sinh khối tế bào đã được ria sạch sau 24 giờ cho lên

lam kính đã có 1 giọt KOH 3% Đánh tan sinh khối, trong khi làm tan sinh

khối thì nhấc que cấy để kiểm tra độ kết dính Kết quả:

+ Với các chủng mà độ kết dính nhớt thì kết luận chủng vi khuẩn đó là gram âm (G-)

+ Với chủng mà độ kết dính không nhớt thì kết luận chủng vi khuẩn đó là gram dương (G+

)

2.2.7 Phương pháp phân loại vi khuẩn theo đặc tính sinh hoá

Chủng phân lập được chọn lọc và tiến hành phân loại bằng kit chuẩn sinh hoá API 50 CHB và 20 NE, quá trình phân loại được tiến hành theo chỉ dẫn của nhà cung cấp

 Phương pháp thử API 50 CHB dùng để xác định nhóm vi khuẩn thuộc

Gram dương (G +

)

Đây là phương pháp dùng 49 nguồn carbonhydrat để lên men (API 50

CHB) và nhận biết vi khuẩn Bacillus trong đó có các phản ứng với các chất

biết từ trước, thử các phản ứng và tra bảng đối chiếu với khoá phân loại để tìm

ra tên loài của chủng Chỉ dùng một khuẩn lạc sạch để thử phản ứng 49 phép thử sinh hoá API 50 CHB được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1: 49 phép thử lên men API 50 CHB

thử

Cơ chất

Trang 39

Cách tiến hành:

- Làm ẩm phiến thử bằng nước cất vô trùng

- Hoà tan 1 khuẩn lạc vào 1 ml dung dịch muối sinh lý sao cho độ đục (OD) đạt khoảng 0,3

-Lấy 0,3 ml dịch trên cho vào 5 ml dung dịch muối sinh lý và lấy 0,6 ml cho vào môi trường 50 CHB

- Dùng pipet để cấy huyền phù vi khuẩn từ môi trường 50 CHB/E vào 50 giếng của bộ kit 50 CHB

Trang 40

- Trong quá trình tiến hành không để các bọt khí hình thành trong các giếng thử

- Phủ parafin lên các giếng của bộ kit 50 CHB

- Đặt kit thử vào tủ ấm 30oC, đọc kết quả sau 24 giờ và 48 giờ

- Tra bảng đối chiếu với khoá phân loại để tìm ra tên loài của chủng

 Phương pháp thử API 20NE dùng cho các trực khuẩn gram âm (G

-), không

có nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt

Đây là phương pháp dùng 20 phép thử hóa sinh để nhận biết vi khuẩn gram âm trong đó có các phản ứng với các chất đã biết từ trước, thử các phản ứng và tra bảng đối chiếu với khóa phân loại(bảng chỉ số Analytical Profile Index, 5th edision, BioMerieux S.A, 1992) để tìm ra tên loài của chủng Chỉ dùng 1 khuẩn lạc sạch để phản ứng 20 phép thử hóa sinh được trình bày ở bảng 2.2

Bảng 2.2: 20 phép thử sinh hóa API 20 NE

Khử nitrat thành nitrit/ khi thêm Zn thì khử nitrat thành nito

dihidrolaza

β-D-galactosepyranosit

Tổng hợp β- galactosidaza

Định dạng
Số trang	86
Dung lượng	1,04 MB