nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp đến khả năng sinh enzyme ngoại bào manganese peroxidase, phân hủy thuốc nhuộm từ chủng nấm sợi aspergillus sp. fbh11

MỤC LỤC I Đặc điểm cấu trúc và tính chất hoá học của chất diệt cỏ/dioxin và thuốc I.1.4 Thuốc nhuộm và vi sinh vật phân hủy thuốc nhuộm 6 I.1.5 Tổng quan về các phương pháp xử lý nước

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Đặng Thị

Cẩm Hà - Nguyên Trưởng phòng Công nghệ sinh học môi trường - Viện Công nghệ sinh học

- Viện Khoa hoc và Công nghệ Việt Nam Người đã hướng dẫn luận văn cho tôi, cô đã tận tình chỉ bảo, quan tâm, giúp đỡ và dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành công trình này, cung cấp nhiều kiến thức và kinh nghiệm trong nghiên cứu khoa học

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, tận tình chỉ bảo, ủng

hộ của các cán bộ, anh, chị, em tại Phòng Công nghệ Sinh học môi trường như: HVCH Nguyễn Nguyên Quang, TS Nguyễn Bá Hữu, , HVCH Đàm Thúy Hằng, KS Nguyễn Quang Huy, ThS Đào Ngọc Ánh Tôi cũng nhận được làm việc và thực hiện một phần của luận văn tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia về công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy, cô giáo giảng dạy thuộc Viện Sinh thái

và Tài nguyên Sinh vật đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình và bạn

bè đã ủng hộ, động viên giúp đỡ tôi cả về tinh thần và vật chất để tôi có thể hoàn thành luân văn này

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn.!

Hà Nội, tháng 11 năm 2010

Châu Ngọc Điệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác;

Các kết quả và số liệu trình bày trong luận văn là trung thực, chưa được công bố bởi bất kì tác giả nào

Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2010

Học viên

Châu Ngọc Điệp

BOD Nhu cầu oxy hóa sinh học (Biochemical Oxygen Demand)

CB Biphenyl chứa clo

CDD Dibenzo-p-dioxin chứa clo

CDF Dibenzofuran chứa clo

CFU Đơn vị tạo thành khuẩn lạc (Colony-Forming Unit) COD Nhu cầu oxy hóa học (Chemical Oxygen Demand)

DDT 1,1,1-trichloro-2,2-bis (p-chlorophenyl) ethane

PAHs Hydrocacbon thơm đa nhân

NY1 Acid Red 299

NY3 Acid Blue 62

NY5 Acid Blue 281

NY7 Acid Red 266

NY8 Acid Orange 116

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.2 Phân hủy các chất ô nhiễm bởi nấm và các enzyme của chúng 25

Bảng 2.3 Môi trường sàng lọc chủng nấm sợi có khả năng sinh enzyme

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.4 Đặc điểm và cấu trúc hoá học một số thuốc nhuộm 11 Hình 1.5 Con đường phân hủy 2,7-DCDD nhờ nấm mục trắng

Hình 3.3 Mối quan hệ giữa sự phát triển và sinh MnP của chủng FBH11

trên môi trường cao malt sau 8 ngày

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của chủng nấm FBH1 54

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh enzyme

Hình 3.15 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D lên phát triển của chủng FBH11 62

Hình 3.16 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến khả năng sinh enzyme

Hình 3.18 Ảnh hưởng của nồng độ các chất cảm ứng được chọn lọc lên khả

năng sinh MnP của chủng FBH11

Hình 3.24 Hoạt tính MnP của chủng FBH11 trên môi trường nuôi cấy chứa

các màu khác nhau theo thời gian

74

Hình 3.25 Khả năng phân hủy màu thuốc nhuộm của MnP thô từ chủng

FBH11

75

Hình 3.27 Ảnh hưởng của pH đệm lên hoạt tính của MnP từ chủng FBH11 77 Hình 3.29 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ lên hoạt tính của enzyme MnP 79 Hình 3.30 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ lên độ bền của MnP 80

MỤC LỤC

I Đặc điểm cấu trúc và tính chất hoá học của chất diệt cỏ/dioxin và thuốc

I.1.4 Thuốc nhuộm và vi sinh vật phân hủy thuốc nhuộm 6 I.1.5 Tổng quan về các phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm đang

được áp dụng tại Việt Nam

12

I.2 Tình trạng ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam 14

I.3 Tác hại của chất diệt cỏ/ dioxin đối với môi trường và con người 14

I.4.1 Sự phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong môi trường 15 I.4.2 Phân hủy chất diệt cỏ/dioxin và quá trình đồng trao đổi chất ở nấm 15

I.5.3 Phương pháp khử độc bằng công nghệ phân hủy sinh học 19

6 Phân bố của MnP và một số vi sinh vật sinh MnP 26

II.1 Môi trường nuôi cấy và nồng độ các chất ô nhiễm được sử dụng 31

II.1.2 Nồng độ các chất ô nhiễm sử dụng trong nghiên cứu 33

II.2.1 Phân lập nấm sợi trong đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay

Biên Hoà

33

II.2.1.1 Phân lập bằng phương pháp pha loãng 33

II.2.1.2 Phân lập bằng phương pháp làm giàu 34 II.2.2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng nấm 34 II.2.3 Sàng lọc và khảo sát nấm có khả năng sinh tổng hợp enzyme

ngoại bào LiP, MnP và Lac

35

II.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính MnP, LiP và laccase của vi sinh

vật

35

II.2.4.1 Xác định hoạt tính manganese peroxidase 35

II.2.4.2 Xác định hoạt tính enzyme lignin peroxidase 36 II.2.4.3 Xác định hoạt tính laccase 37

II.2.6 Khảo sát các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng phát

triển và sinh MnP của chủng FBH11

38

II.2.9 Phương pháp đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm của chủng

nấm sợi FBH11 và dịch enzyme MnP thô

41

II.2.9.1 Đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm của chủng nấm

sợi FBH11

41

II.2.9.2 Phương pháp tách chiết enzyme MnP thô sinh tổng hợp từ

chủng FBH11 và khả năng loại màu

42

II.2.10 Xác định một số tính chất hóa sinh của MnP thô từ chủng FBH11 43

III.1 Một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 4 chủng nấm sợi FBH11,

III.3 Lựa chọn và tạo điều kiện môi trường thích hợp cho khả năng sinh

trưởng và sinh tổng hợp MnP của chủng FBH11

47

III.3.1 Lựa chọn môi trường thích hợp cho sự sinh tổng hợp enzyme

MnP của chủng FBH11

47

III.3.2 Mối quan hệ giữa sự phát triển và khả năng sinh MnP của chủng

FBH11 theo thời gian

50

III.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH môi trường nuôi cấy đến sự phát

triển và khả năng sinh MnP

51

III.3.3.1 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy 51 III.3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 53 III.3.4 Ảnh hưởng của một số chất ô nhiễm 55

III.3.10 Ảnh hưởng của nồng độ các chất cảm ứng MnSO4 và CuSO4 65

III.4 Khả năng sinh enzyme ngoại bào MnP của chủng FBH11 trên môi

trường rắn

66

III.6 Khả năng loại màu thuốc nhuộm của chủng nấm sợi FBH11 và từ dịch

enzyme MnP thô

70

III.6.1 Khả năng loại màu thuốc nhuộm của chủng FBH11 70 III.6.2 Khả năng loại màu thuốc nhuộm bằng dịch enzyme MnP thô 74

III.7 Một số tính chất của enzyme MnP từ chủng FBH11 76

LỜI MỞ ĐẦU

Có thể nói chiến dịch dùng hóa chất ở Việt Nam là một cuộc chiến tranh hóa học lớn nhất thế giới Trong thời gian hơn 10 năm từ năm 1961 đến năm 1971, quân đội Mỹ đã rải khoảng 100 triệu lít các loại chất diệt cỏ chứa dioxin xuống nhiều vùng miền Trung và miền Nam Việt Nam Các nghiên cứu của nhiều cơ quan khoa học và công nghệ Việt Nam và phân tích một số mẫu tại Cộng hòa Liên bang Nga, Canada, Nhật Bản, các phòng phân tích của Hoa Kỳ cho thấy trong đất tại sân bay Đà Nẵng cũng như Biên Hòa độ tồn lưu của PCDDs, PCDFs, 2,4,5-T, 2,4-D, TCD, DCP, PAHs vẫn còn cao Một số đặc điểm nổi bật là tại sân bay Đà Nẵng đồng phân 2,3,7,8-TCDD

đã phân tích được ở mức khá cao và rất cao chiếm tới 90% tổng độ độc Trong nhiều mẫu đất, tổng độ độc 2,3,7,8-TCDD lớn hơn 99% tất cả độ độc của PCDDs và PCDFs Ngoài ra, hàm lượng 2,4-D và 2,4,5-T vẫn còn ở mức rất lớn

Do vậy, việc nghiên cứu để tìm ra giải pháp tẩy độc các điểm nóng nhiễm chất độc hóa học là một nhiệm vụ hết sức cần thiết Nhóm nghiên cứu các hợp chất khó phân hủy (POP) - Viện Công nghệ sinh học đã và đang tiến hành nghiên cứu và triển khai ứng dụng công nghệ phân hủy sinh học trong các hố chôn lấp tích cực (tức là cô lập, hấp phụ kết hợp với kích thích sinh học) để xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa Trong 11 năm nghiên cứu bằng công nghệ phân hủy sinh học 50-70% tổng độ độc đã bị loại bỏ trong thời gian 2 năm [3] Công trình tẩy độc 3384 m3 đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa bằng công nghệ phân hủy sinh học đã được thực hiện từ năm 2009 và đang trong quá trình quan trắc và đánh giá hiệu quả khử độc

Một trong bốn cơ chế phân hủy dioxin hay POP nói chung, cơ chế xúc tác phá

vỡ cấu trúc của dioxin và các chất vòng thơm khác gần đây đang rất được quan tâm

Vì vậy phân lập và tuyển chọn những chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào để thúc đẩy việc xử lý khử độc đã được nhóm tác giả tiến hành nghiên cứu

Hệ enzyme ngoại bào thường được trong xử lý sinh học đất và sử dụng enzyme ngoại bào cho các quá trình xử lý các chất hữu cơ khác là một định hướng rất quan trọng, chúng có khả năng phá vỡ các liên kết trong các hợp chất hữu cơ hoặc xúc tác chuyển hóa chúng thành các chất ít độc hơn và các dạng dễ phân hủy hơn Nhóm enzyme ngoại bào có vai trò lớn trong quá trình phân hủy các hợp chất khó phân hủy

vi sinh vật bản địa tại đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin là hướng đi có tính khả thi cho việc áp dụng vào xử lý các khu vực đang bị ô nhiễm và là nguyên liệu sinh học cho các quá trình xử lý các chất vòng thơm khác trong đó có thuốc nhuộm

Hiện nay, tình trạng ô nhiễm thuốc nhuộm, màu ở Việt Nam đã trở nên báo động Các nhà máy, hộ gia đình trong quá trình sản xuất vải sợi đã thải trực tiếp nước nhuộm vải sợi ra môi trường mà không qua bất kỳ một phương pháp xử lý nào Ảnh hưởng trực tiếp tới môi trường sống của bộ phận lớn khu dân cư lân cận Do đó, xây dựng các quy trình công nghệ để xử lý nước thải cho ngành công nghiệp này là một trong những ưu tiên ở Việt Nam Song, cho tới nay chúng tôi vẫn chưa tìm thấy một tài liệu nào công bố về phương pháp phân hủy thuốc nhuộm, màu đã được áp dụng thành công trên quy mô lớn ở Việt Nam Vấn đề đặt ra là liệu rằng chúng ta có thể xây dựng một “công nghệ xanh” để áp dụng xử lý triệt để vấn đề ô nhiễm thuốc nhuộm?

Đó là câu hỏi cho các nhà khoa học công nghệ Việt Nam trước thực trạng ô nhiễm màu hiện nay!

Dựa trên những kết quả phân lập các chủng vi sinh vật tại khu vực nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa, một số chủng nấm sợi đã được phân lập tuyển chọn Với mục đích có cơ sở khoa học để ứng dụng một trong ba enzyme ngoại bào

trong xử lý ô nhiễm các chất đa vòng thơm, chúng tôi đã thực hiện đề tài: Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp đến khả năng sinh enzyme ngoại bào manganese

peroxidase, phân hủy thuốc nhuộm từ chủng nấm sợi Aspergillus sp FBH11

Các nội dung nghiên cứu bao gồm:

1, Phân lập, tuyển chọn và sàng lọc các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzyme ngoại bào MnP, LiP và laccase cao từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I Đặc điểm cấu trúc và tính chất hoá học của chất diệt cỏ/dioxin và thuốc nhuộm

I.1 Chất diệt cỏ/dioxin và thuốc nhuộm

I.1.1 Chất diệt cỏ 2,4,5-T

2,4,5-T là tên gọi tắt của axit 2,4,5-trichlorophenoxyacetic (Hình 1.1) Công thức

hóa học là C8H5O3Cl3, khối lượng phân tử 255,49 g/mol

Hình 1.1 Công thức cấu tạo 2,4,5-T

2,4,5-T tinh khiết có dạng tinh thể rắn, không mùi, từ không màu đến màu vàng

nâu nhạt, tỷ trọng 1,8 g/cm3ở 20oC, nhiệt độ nóng chảy là 154÷158oC 2,4,5-T tan ít

trong nước, độ hòa tan trong nước ở 30oC là 238 mg/kg, tuy nhiên 2,4,5-T tan tốt trong

dung môi hữu cơ

Axit 2,4,5-trichlorophenoxyacetic là chất diệt cỏ có độc tính cực mạnh, làm

nhiễm độc thai nhi, gây quái thái, ưng thư và gây nhiễm độc tuyến sinh dục

Theo các nghiên cứu trước đây thì thời gian bán hủy của 2,4,5-T trong đất là 12-59

ngày [16], gần bề mặt nước là 15 ngày [17] Tuy nhiên, đất tại các căn cứ quân sự cũ

của Mỹ ở sân bay Đà Nẵng, Biên Hòa vẫn bị nhiễm 2,4-D và 2,4,5-T với nồng độ rất

cao [20]

I.1.2 Chất diệt cỏ 2,4-D

2,4-D có công thức hóa học C8H6Cl2O3 được Giáo sư Krauss, trưởng khoa sinh

vật trường đại học Chicago tình cờ phát hiện ra vào năm 1941 Chất này khi phun lên

cây lá rộng nó sẽ làm trụi lá trong khoảng từ 24÷48h sau đó cây sẽ bị chết [13] Thông

thường 2,4-D là một tinh thể không màu, nhiệt độ nóng chảy là 129,25oC, độ hòa tan

trong nước ở 20oC là 0,5 g/l [Technical Factsheet on: 2,4 -D] 2,4-D là một chất gây

độc trên diện rộng cho môi trường và con người, làm rụng lá và gây chết cây Các triệu

chứng khi bị nhiễm 2,4-D thường là gây bỏng rát da mắt, phát ban, nôn mửa, chóng

mặt đau đầu, sưng tấy cỏ họng, khó thở… Ngoài ra, các nhà khoa học ở trường đại học

Saskatchewan tiến hành nghiên cứu đối với những người làm việc với 2,4-D cho thấy nguy cơ ung thư non- Hodgkin’s lymphoma tăng lên khi bị nhiễm 2,4-D Người ta còn tìm thấy ảnh hưởng của 2,4-D lên các hormon của tuyến giáp, tuyến sinh dục Nhóm nghiên cứu độc học này chỉ ra rằng, hàm lượng 2,4-D trong tự nhiên có thể làm giảm khả năng biểu hiện của ít nhất ba gene ở người, các gene này có chức năng tổng hợp các protein quan trọng trong hệ thống miễn dịch Các nhà khoa học tại Học viện quốc gia về an toàn sức khỏe Trường đại học West Virginia ở Mỹ đã chứng minh, 2,4-D

làm giảm lượng tế bào tạo kháng thể trong tủy xương của chuột [17]

I.1.3 Các hợp chất dioxin chứa clo (PCDDs)

PCDDs là tên viết tắt của polychlorinated dibenzo-p-dioxins là một tập hợp bao

gồm 75 chất khác nhau thường được gọi với cái tên chung là dioxin PCDDs được chia thành 8 nhóm căn cứ vào số lượng nguyên tử clo ở trong các nhóm chất Nhóm có một nguyên tử clo được gọi là mono-chlorinated dioxin, tương tự với những nhóm có từ 2 đến 8 nguyên tử clo được gọi lần lượt là di-, tri-, tetra-, penta-, hexa-, và octa-chlorinated dioxins Danh pháp hóa học của mỗi chất sẽ thể hiện cả số lượng nguyên

tử clo và vị trí gắn của chúng.Ví dụ 2,3,7,8-tetractchlorodibenzeno-p-dioxin (2,3,7,8 TCDD)

Clx

O

1 2

3 4 4a 5 6

8

7

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của PCDDs

Đặc tính độc đối với người và động vật của các hợp chất dioxin là khác nhau 2,3,7,8-TCDD là chất độc nhất đối với động vật có vú, trong 75 chất dioxin khác thì chỉ có 7 chất là tính độc tương tự như 2,3,7,8-TCDD Độ độc của những chất khác được tính theo đương lượng độc (TEQ-toxic equivalent) của 2,3,7,8-TCDD dựa vào hệ

số đương lượng độc (TEF-toxic equivalent factor) Tổng độ độc của hỗn hợp chất dioxin được đo bằng tổng đương lượng độc của các chất riêng lẽ trong hỗn hợp [13]

Để so sánh mức độ gây độc của các chất, WHO dùng chỉ số TEF để đánh giá (Phụ lục 1)

PCDDs trong tự nhiên được sinh ra từ những lò đốt rác, cháy rừng, cháy nhiên liệu và là sản phẩm phụ của quá trình sản xuất chất diệt cỏ trong công nghiệp [8]

2,3,7,8-TCDD nguyên chất có dạng chất rắn hoặc tinh thể không màu, không mùi Công thức hóa học C12H4O2Cl4, khối lượng phân tử 321,97 g/mol, tỷ trọng 1,643 g/cm3, nhiệt độ nóng chảy 305-307oC (Hình 1.3)

Hình 1.3 Công thức cấu tạo 2,3,7,8-TCDD

I.1.4 Thuốc nhuộm và vi sinh vật phân hủy thuốc nhuộm

Thuốc nhuộm đã tạo ra một cuộc cách mạng trong công nghiệp dệt và thương mại hóa các sản phẩm của nó Sự phát triển của ngành công nghiệp thuốc nhuộm tổng hợp dẫn đến sự xuất hiện của hoá học hữu cơ cổ điển Gần như mọi ngành công nghiệp đều sử dụng chất màu bằng cách này hay cách khác [57]

Nước thải màu từ công nghiệp dệt được đánh giá là loại hình gây ô nhiễm nhất trong tất cả các nghành công nghiệp Có hơn 7000 loại thuốc nhuộm và bột nhuộm khác nhau đang tồn tại và được sử dụng hàng năm Ước tính có hơn 10.000 thuốc nhuộm và chất màu khác nhau thường được sử dụng Tổng sản lượng màu hữu cơ của thế giới lên tới hơn 100.000 tấn/ năm [51] Hai phần trăm màu được tạo ra bị thất thoát trực tiếp vào nguồn nước và hơn 10% sau đó bị mất mát trong quá trình nhuộm màu vải do khả năng hấp thụ kém của chúng vào sợi vải [76] Các màu tổng hợp được phân nhóm theo chỉ số màu (Phụ lục 2)

Thuốc nhuộm được sử dụng rộng rãi trong các ngành dệt (sử dụng trong nhuộm quần áo) công nghiệp và công nghiệp giấy Da và gỗ được nhuộm màu cũng bằng các thuốc nhuộm Thực phẩm thường có màu với thuốc nhuộm tự nhiên hoặc với thuốc nhuộm tổng hợp đã được chấp nhận bởi một cơ quan liên bang (đã được chứng nhận là

an toàn cho người) Thuốc nhuộm cũng được sử dụng để tạo vết sinh học, lông thú, tóc

và thuốc nhuộm đặc biệt được thêm vào nhũ ảnh cho hình ảnh có màu sắc đẹp [57]

Xử lý loại bỏ màu trong nước thải dệt nhuộm là một trong những vấn đề cấp bách hiện nay, bởi vì các loại màu tổng hợp có cấu trúc đa vòng thơm rất khó bị phân hủy bởi các hệ thống xử lý thông thường Chúng không thể loại bỏ triệt để các màu

bền vững và các cặn hữu cơ khác từ các nguồn nước thải [51] Một số phương pháp hóa-lý học đã được sử dụng để loại bỏ màu trong nước thải nhưng các phương pháp này thường có chi phí cao, giới hạn trong việc ứng dụng và tạo ra một lượng bùn lớn Ngày nay, việc sử dụng các kỹ thuật sinh học hiện đại trong xử lý các vấn đề ô nhiễm khác nhau đang trở nên tốt hơn và phân hủy sinh học (bioremendiation) được quan tâm nhiều hơn do tính hiệu quả về lợi ích lâu dài và hầu như không ảnh hưởng có hại đến môi trường Các nhà khoa học công nghệ đã chứng minh được rằng phương pháp này

có tính hiệu quả kinh tế hơn các phương pháp hóa lý [51]

Thuốc nhuộm sử dụng trong công nghiệp thường có nguồn gốc từ tổng hợp hóa học và có cấu trúc phân tử đa vòng thơm làm cho chúng ổn định hơn, khó phân hủy sinh học Các nhóm màu khác nhau như azo, triphenylmethan và phthalocyanine đã làm cho màu của thuốc nhuộm có cấu trúc đa dạng Hơn 50% chúng được sử dụng trong công nghiệp Bên cạnh đó, một điều không mong muốn là các loại nước thải nhà máy dệt, giấy, thuộc da… bị ô nhiễm màu rất cao, hầu hết các màu và các sản phẩm phân huỷ của chúng là độc [47] Ngoài ảnh hưởng đến thị giác và tác động bất lợi do nhu cầu oxy hóa học của màu thuốc nhuộm, nhiều loại màu tổng hợp còn thể hiện tính độc, gây ung thư và đột biến gene Đặc biệt là các màu tổng hợp có lưu huỳnh và các sản phẩm phân hủy liên quan đến chúng có chứa các nguyên tố cấu trúc, đặc tính chưa được biết rõ hay rất hiếm trong tự nhiên; chúng không chỉ có ảnh hưởng xấu đến thẩm

mỹ mà còn kháng lại sự tấn công của VSV và tăng tính độc của nước và đất [75].Nếu như các loại nước thải này không được xử lý mà thải trực tiếp ra môi trường thì sẽ cản trở sự khuyếch tán của ảnh sáng vào nguồn nước gây ảnh hưởng tới khả năng quang hợp của hệ thuỷ sinh thực vật, ô nhiễm nguồn nước sông hồ và nguy hại nhất là ảnh hưởng trực tiếp tới sức khoẻ của cộng đồng dân cư lân cận [47]

Nhóm màu azo là các màu quan trọng và được xác định nhờ sự hiện diện của 1 hoặc nhiều nhóm azo (-N = N-) và tạo thành một lớp màu lớn nhất được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp dệt, giấy, thuộc da, xăng dầu, công nghiệp thực phẩm và

mỹ phẩm [66]

Việt Nam là một nước đang trên đà phát triển, trong đó các ngành công nghiệp may mặc, dệt nhuộm và in ấn đang phát triển rất mạnh Đi đôi với sản lượng và năng suất tăng lên là việc môi trường nước bị ô nhiễm cũng tăng nhưng hầu như ở nước ta vấn đề này chưa được nhiều nhà máy, xí nghiệp hay hộ gia đình quan tâm Tình trạng

ô nhiễm thuốc nhuộm, màu ở Việt Nam đã trở nên báo động Các nhà máy, hộ gia đình trong quá trình sản xuất vải sợi đã thải trực tiếp nước nhuộm vải sợi ra môi trường mà không qua bất kỳ một phương pháp xử lý nào Ảnh hưởng trực tiếp tới môi trường sống của bộ phận khu dân cư lân cận Do đó, xây dựng các quy trình công nghệ để xử

lý nước thải cho các ngành công nghiệp này là một trong những ưu tiên ở Việt Nam Song, cho tới nay chúng tôi vẫn chưa tìm thấy một tài liệu nào công bố về phương pháp phân hủy thuốc nhuộm, màu đã được áp dụng thành công trên quy mô lớn ở Việt Nam Nhưng tiến tới chúng tôi sẽ xây dựng một “công nghệ xanh” để áp dụng xử lý triệt để vấn đề ô nhiễm thuốc nhuộm

Hiện nay việc tập trung vào nghiên cứu các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy sinh học thuốc nhuộm được xem là một phương thức thay thế tốt hơn Một số vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm sợi, xạ khuẩn có thể làm giảm hoặc hấp thụ nhiều loại thuốc nhuộm, ngoại trừ một số nấm đảm có khả năng loại màu rất tốt [44] Nhiều nghiên cứu đáng chú ý đã thông báo về khả năng sử dụng vi sinh vật để xử lý và khử độc vấn đề ô nhiễm màu công nghiệp Sử dụng vi sinh vật phân huỷ và loại màu tập trung vào loại nhóm màu azo, các màu anthraquinone thường khó phân huỷ bởi cấu trúc vòng benzene của chúng [47]

Phân hủy sinh học, đó là công cụ điều khiển ô nhiễm nhằm loại bỏ các chất ô nhiễm trong đất và nước Trong số nhiều cơ chế sinh học loại bỏ màu đã được đăng tải trong các tạp chí khoa học thì hấp phụ sinh học kết hợp với phân hủy sinh học dường như có tiềm năng lớn cho áp dụng quy mô công nghiệp Vi khuẩn phân hủy những màu này cần có sự tham gia của enzyme nội bào trong khi nấm phân hủy chúng bằng các enzyme ngoại bào [77]

Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu dựa trên một vài chủng nấm bao gồm cả nấm phân hủy lignin và không phân hủy lignin có khả năng phân hủy và hấp thụ màu tốt trong nước thải Hầu hết nghiên cứu liên quan đến phân hủy đều tập trung

vào loài nấm đảm Phanerochaete chrysosporium, loài mày được biết đến với khả năng

khoáng hóa một phạm vi lớn các hợp chất khó phân hủy Nhiều chủng nấm khác nhau

đã chứng tỏ khả năng hoạt động của chúng đạt hiệu quả cao trong quá trình loại màu thuốc nhuộm, hầu hết nhóm vi sinh vật này thuộc vào chi nấm mục trắng Thuốc nhuộm được loại bỏ bởi sự hấp phụ của nấm và bị khoáng hóa bởi hệ enzyme ngoại bào (LiP, MnP, MIP, Lac) [77]

năng loại màu của chủng Aspergillus alliaceus 121C với hai màu indigo và congo đỏ

cho hiệu quả rất tốt sau 9 ngày nuôi cấy [26] Nhiều chủng nấm sợi phân hủy gỗ khác

như Aspergillus fumigatus G-2-6 và Aspergillus oryzae cũng thể hiện khả năng loại nhiều màu ở một phạm vi lớn Nấm sợi Aspergillus ochraceus NCIM-1146 thể hiện

hiệu quả loại màu thuốc nhuộm màu xanh lục và xanh cotton khi sử dụng hệ sợi của nấm sau khi nuôi cấy 96 h [62] Sự loại màu và phân hủy màu thuốc nhuộm xanh hòa

bình đậm 25 bởi A ochraceus NCIM-1146 và xác định sản phẩm phân hủy của nó,

cũng như giám sát việc sinh tổng hợp enzyme ngoại bào Lac, tyrosinase và LiP trong

dịch nuôi cấy trong quá trình loại màu đã được nghiên cứu [55] Chủng Pinicillium ochorochloron MTCC 517 trong quá trình phân hủy màu sinh học màu xanh

triphenylmethan ngoài sinh LiP loài nấm này còn sinh laccase, mà không thấy sự xuất hiện của enzyme ngoại bào MnP [65]

Rất ít nghiên cứu thực hiện xử lý loại màu bởi nấm men Chỉ tìm thấy một vài

đại diện nấm men Ascomycetous như Candida zeylanoides, C tropicalis, Debaryomyces polymorphus và Issatchenkia occidentalis thực hiện phân hủy màu

bằng hệ enzyme và loại màu các thuốc nhuộm azo khác nhau [50] Loài nấm men

Debaryomyces polymorphus có khả năng loại được 4 màu Reactive Red M-3BE,

Procion Scharlach H-E3G, Procion Marine H-EXL và Reactive Brillant Red K-2BP với hiệu suất loại màu đạt 69-94% [57, 58]

Độ hoà tan g/l

Azo IN13 637,7 45 560

Azo IN22 1232,0 20 500

Hình 1.4 Đặc điểm và cấu trúc hoá học một số thuốc nhuộm

I.1.5 Tổng quan về các phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm đang được áp dụng tại Việt Nam

Nước thải dệt nhuộm là sự tổng hợp nước thải phát sinh từ tất cả các công đoạn

hồ sợi, nấu tẩy, tẩy trắng, làm bóng sợi, nhuộm in và hoàn tất Theo phân tích của các chuyên gia, trung bình, một nhà máy dệt nhuộm sử dụng một lượng nước đáng kể, trong đó, lượng nước được sử dụng trong các công đoạn sản xuất chiếm 72,3%, chủ yếu là trong công đoạn nhuộm và hoàn tất sản phẩm [58’] Xét hai yếu tố là lượng nước thải và thành phần các chất ô nhiễm trong nước thải, ngành dệt nhuộm được đánh giá là ô nhiễm nhất trong số các ngành công nghiệp [64’]

Các chất ô nhiễm chủ yếu có trong nước thải dệt nhuộm là các hợp chất hữu cơ khó

phân hủy,thuốc nhuộm, các chất hoạt động bề mặt, các hợp chất halogen hữu cơ (AOX

- Adsorbable Organohalogens), muối trung tính làm tăng tổng hàm lượng chất rắn,

nhiệt độ cao (thấp nhất là 40°C) và pH của nước thải cao do lượng kiềm trong nước thải lớn Trong số các chất ô nhiễm có trong nước thải dệt nhuộm, thuốc nhuộm là thành phần khó xử lý nhất, đặc biệt là thuốc nhuộm azo không tan - loại thuốc nhuộm được sử dụng phổ biến nhất hiện nay, chiếm 60-70% thị phần [74’] Thông thường,

các chất màu có trong thuốc nhuộm không bám dính hết vào sợi vải trong quá trình nhuộm mà bao giờ cũng còn lại một lượng dư nhất định tồn tại trong nước thải Lượng thuốc nhuộm dư sau công đoạn nhuộm có thể lên đến 50% tổng lượng thuốc nhuộm được sử dụng ban đầu [64’] Đây chính là nguyên nhân làm cho nước thải dệt nhuộm

có độ màu cao, và nồng độ chất ô nhiễm lớn

Các yếu tố được cân nhắc khi lựa chọn phương án xử lý thích hợp cho nước thải dệt nhuộm là: hiệu quả xử lý, hiệu quả kinh tế, tính chất và lưu lượng nước thải, thành phần và nồng độ các chất ô nhiễm có trong nước thải,

Nhìn chung, phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm được áp dụng phổ biến ở các cơ sở dệt nhuộm ở nước ta hiện nay chủ yếu là 3 phương pháp và thường được ứng dụng riêng rẽ hoặc kết hợp để xử lý nước thải dệt nhuộm là: phương pháp hóa lý, phương pháp oxy hóa bậc cao và phương pháp sinh học

Quá trình xử lý hóa lý với phương pháp keo tụ - tạo bông, tuyển nổi và hấp phụ thu được hiệu quả cao trong việc khử độ màu và giảm nồng độ BOD [26] Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là chi phí hóa chất cao và lượng bùn sinh ra lớn (0,5

- 2,5 kg TS/ m3 nước thải xử lý)

Trong quá trình xử lý nước thải dệt nhuộm bằng phương pháp oxy hóa bậc cao, các chất oxy hóa thường được sử dụng là chlorine (Cl2), hydroxy peroxide (H2O2), và ozone (O3), với Cl2 được đánh giá là chất oxy hóa kinh tế nhất [58’] Nhược điểm của phương pháp oxy hóa bậc cao là chi phí đầu tư và chi phí vận hành cao, không thích hợp để xử lý nước thải dệt nhuộm có nồng độ chất ô nhiễm lớn

Bên cạnh đó, quá trình xử lý sinh học với bùn hoạt tính hiếu khí và kỵ khí cũng

có thể được sử dụng để xử lý nước thải dệt nhuộm với hiệu quả cao, tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là thời gian xử lý dài và hiệu quả xử lý các chất màu là các hợp chất hữu cơ khó phân hủy thấp

Hiện nay, nước thải dệt nhuộm thường được xử lý bằng cách kết hợp các quá trình xử lý sinh học và keo tụ-tạo bông Quá trình xử lý sinh học giúp loại bỏ các hợp chất hữu cơ có khả năng phân hủy sinh học và xử lý một phần các hợp chất hữu cơ khó phân hủy sinh học dưới tác dụng của quá trình sinh trưởng và phát triển của các vi sinh vật, giúp giảm bớt tải lượng hoạt động của quá trình xử lý hóa lý keo tụ - tạo bông Việc bố trí quá trình xử lý sinh học trước quá trình xử lý hóa lý giúp giảm bớt chi phí hóa chất và chi phí xử lý bùn hóa lý

I.2 Tình trạng ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam

Từ năm 1961 đến năm 1971, Việt Nam đã phải trải qua cuộc chiến tranh hóa học lớn nhất trong lịch sử loài người Quân đội Mỹ đã rải khoảng 100 triệu lít các loại chất diệt cỏ chứa dioxin xuống nhiều vùng miền Trung và miền Nam Việt Nam Theo Stellman và cộng sự thì lượng dioxin trong các chất diệt cỏ đã rải có thể lên tới 1000

kg Có tới 20 chất diệt cỏ khác nhau đã được sử dụng trong chiến tranh Việt Nam như chất trắng, chất hồng, chất da cam, chất xanh, chất tím.v.v với nồng độ dioxin khác nhau Hợp chất được biết đến nhiều nhất là da cam ( 50% 2,4,5-T : 50% 2,4-D) [12] Hiện nay tại các sân bay quân sự Biên Hòa, Đà Nẵng, tổng độ độc của 2,3,7,8 TCDD chiếm trên 90% tổng độ độc của PCDDs và PCDFs, có mẫu đất lên tới 99% tổng độ độc, bên cạnh đó hàm lượng 2,4,5-T, 2,4-D vẫn còn rất lớn có mẫu lên đến vài triệu µg/kg đất Ngoài ra, trong những mẫu này còn xác định được một lượng không nhỏ các chất như DCP, TCP, PAHs [13]

I.3 Tác hại của chất diệt cỏ/ dioxin đối với môi trường và con người

Chất diệt cỏ khi phun xuống làm cho các loại cây bị thiêu trụi hết lá, rất nhiều cây

bị chết, môi trường và cảnh quan sinh thái bị thay đổi nhanh chóng Các hợp chất này còn có thể tích tụ trong đất, phân tán trong lớp nước mặt, nước ngầm không khí, tích tụ trong thực vật gây nhiều hiểm họa cho môi trường Tại Việt Nam, chất diệt cỏ được quân đội Mỹ phun tập trung chủ yếu tại các nguồn nước chiến lược và các khu vực dọc rừng Trường Sơn trên một không gian rộng lớn khoảng 17 triệu hecta của miền Nam

Việt Nam Sau nhiều năm chiến tranh đã kết thúc, lượng chất độc còn lại trong môi trường rất lớn, có nồng độ dioxin và 2,4,5-T trong đất và trầm tích rất cao tại các điểm nóng là các căn cứ quân sự cũ của Mỹ [12]

Các thống kê được tiến hành tại bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức đã chỉ ra rằng, trong các bệnh nhân mà họ đã từng phơi nhiễm chất diệt cỏ trong chiến tranh thì tỷ lệ ung thư chiếm 67% Tỷ lệ này là 28% đối với nhóm người không bị phơi nhiễm Cũng trong báo cáo này, trong các năm từ năm 1952-1981, tỷ lệ sẩy thai tự nhiên của sản phụ tại Việt Nam tăng lên cùng với cường độ của quá trình rải chất độc hóa học của quân đội Mỹ tại miền Nam Việt Nam [24]

Dioxin còn là nguyên nhân gây ra hàng loạt bệnh lý như chứng ban clo, sạm da, các loại ung thư phân mềm (hodgkin, lymphoma, sarcoma co trơn v.v…), đa u tủy, các loại ung thư đường hô hấp trên và ung thư phổi, ung thư tiền liệt tuyến, dị tật bẩm

sinh, những rối loạn kéo dài về chuyển hóa gluco và những rối loạn nhẹ của chức năng tuyến giáp, hệ thần kinh trung ương và ngoại biên [24]

I.4 Sự phân hủy chất diệt cỏ/dioxin

I.4.1 Sự phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong môi trường

Trong môi trường dioxin có xu hướng hấp thụ vào trong đất và trầm tích cũng như tích lũy sinh học vào trong cơ thể sống Nghiên cứu của Kao và cộng sự cho thấy, các hợp chất dioxin trong môi trường rất bền vững là do khả năng phân hủy sinh học rất chậm của chúng [39] Tuy nhiên, bằng chứng về sự phân hủy sinh học các chất dioxin chứa clo trong môi trường đã được đưa ra trong một số nghiên cứu trên đất, nước hoặc trầm tích Nghiên cứu mẫu trầm tích cổ thu thấp ở khu vực sông Rhine (Hà Lan) đã công nhận sự biến mất đáng kể các đồng phân dioxin chứa nhiều hơn 4 nguyên tử clo, trong khi đó thời gian bán phân hủy của các hợp chất này là 12 năm [27] Kết quả này cho thấy, sự phân hủy sinh học các hợp chất này trong môi trường diễn ra chậm Một nghiên cứu khác trên trầm tích cổ thu thập ở của sông Queensland, Australia cho thấy, tuổi của trầm tích tỉ lệ với sự tăng thành phần các PCDD chứa ít clo hơn đồng thời tương ứng với sự giảm thành phần các OCDD [32] Các đồng phân chứa ít clo hơn được tích tụ trong các trầm tích cổ, đã được xác định từ quá trình loại clo của hợp chất OCDD nhờ vi khuẩn kỵ khí, các nhà khoa học cũng đưa ra bằng chứng cho thấy thời gian bán hủy tối thiểu của PCDD/PCDF trong các trầm tích cổ từ

biển Bantic khoảng từ 30-170 năm [41]

I.4.2 Phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bởi quá trình đồng trao đổi chất ở nấm

Nấm mục trắng thuộc nhóm nấm đảm là nhóm nấm lớn quan trọng nhất có thể phân hủy hợp chất polymer phức tạp nhất trong tự nhiên như lignin Nấm mục trắng sử dụng các enzyme oxy hóa ngoại bào bước đầu tấn công vào lignin Những enzyme oxy hóa này bao gồm các enzyme ngoại bào lignin peroxidase (LiP) và manganese peroxidase (MnP), chúng có khả năng oxy hóa rất nhiều loại chất ô nhiễm do con người tổng hợp nên, trong đó có cả PCDD/PCDF [31] Nghiên cứu đầu tiên đánh giá

khả năng phân hủy dioxin của nấm mục trắng được tiến hành với loài Phanerochaete chrysosporium Nghiên cứu của Vali và cộng sự đã làm sáng tỏ con đường phân hủy 2,7-DCDD nhờ LiP của P chrysosporium Sau 27 ngày nuôi cấy ở điều kiện thiếu nguồn nitơ, P chrysosporium đã phân hủy 50% 2,7-DCDD với nồng độ ban đầu trong

môi trường là 6,9 mg/l Tác giả đã chứng minh trong điều kiện nuôi cấy này đã cảm ứng sinh enzyme thủy phân lignin LiP và enzyme này tinh sạch xúc tác chuyển hóa 19% 2,7-DCDD thành 4-chloro-1,2-benzoquinone (2CBQ), 2-hydroxy-1,4-benzoquinone (2HBQ) và chlorin [47] Con đường phân hủy 2,7-DCDD bởi nấm mục trắng được trình bày ở hình 1.5 liên quan đến sự oxy hóa do hai enzyme LiP hoặc MnP tạo thành quinone Sau đó chất này bị khử thành hydro quinone hoặc catechol và bị metyl hóa tiếp thành methoxybenzen

Khả năng phân hủy các dioxin chứa clo của nấm mục trắng không giới hạn ở

những đồng phân chứa ít clo P chrysosporium và P sordida có thể loại bỏ 34% đến

48% hỗn hợp PCDD/F chứa nhiều clo sau 7-14 ngày nuôi cấy [70] Ngoài chi

Phanerochaete, một số chi nấm mục khác cũng có khả năng phân hủy dioxin, chủng nấm Phlebia lindtneri, Phlebia sp MG-60 có khả năng khoáng hóa 2,7-DCDD (7

mg/l) thành CO2 với tỷ lệ tương ứng là 5%, 5,2% sau 30 ngày [53] Trong một nghiên

cứu khác Panellus stipticus phân hủy hoàn toàn 2,7-DCDD (2,8 mg/l) sau 40 ngày với

sản phẩm trung gian được xác định là 4CC [63]

Kunichika và đồng tác giả cũng đã chứng minh sự phân hủy đất nhiễm dioxin

bởi nấm Acremonium sp Gần đây một con đường phân hủy dioxin mới của nấm phân

Hình 1.5 Đề xuất con đường phân hủy

2,7-dichlorodibenzo-p-dioxin DCDD) bằng nấm đảm trắng

27-DCDD; (2) 4-chloro-1,2-benzoquinone; (3) 4-chlorocatechol; (4) 2-hydroxy-1,4- benzoquinone; (5) 2-methoxy-1,4- benzoquinone; (6); 4-chloroveratrole; (7); 1,2,4-trihydroxy-benzene; (8) 2- methoxyhydroquinone; (9) 4-hydoxy-1,2- benzoquinone; (10) β-ketoadipic acid

Trích từ nguồn: [72]

hủy vòng ether Cordyceps sinensis A đã được nghiên cứu Nấm này có khả năng phân

hủy DD, 2,3,7-TriCDD và OCDD Loài nấm được nghiên cứu phân hủy DD tạo thành catechol, chất này sau đó được trao đổi chất tiếp đến cis-cis-muconate; trong khi đó phân hủy 2,3,7-TriCDD và OCDD dẫn đến catechol chứa 1-3 clo và catechol không chứa clo Tuy nhiên, các cơ chế phân hủy PCDD/F của chủng nấm kể trên vẫn chưa rõ ràng [63]

Ở Việt Nam, các nghiên cứu khử độc đất nhiễm chất độc hóa học mới được bắt đầu từ năm 1999 Phòng công nghệ sinh học môi truờng (CNSHMT) - Viện công nghệ sinh học đã thực hiện nhiều nghiên cứu và thực hiện xử lý ở nhiều quy mô khác nhau: 0,5 m3; 1,5 m3; 2 m3; 100 m3 và 3.384 m3 Kết quả thu được là đã làm giảm tổng độ độc từ 50-70% sau 2 năm xử lý Hiện nay, trong bộ sưu tập giống VSV phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở Đà Nẵng của phòng CNSHMT, một số chủng đã được định tên bằng cả hai phương pháp truyền thống và xác định trình tự gene 16S

rRNA, 18S rRNA bao gồm Streptomyces sp XKDN11, Streptomyces sp XKDN12, Streptomyces sp XKDN19, Streptomyces sp.XKDNR1, Brevibacillus sp XKDN13, Brevibacillus sp BDNR10, Bacillus sp BDN6, Bacillus sp BU3, Pseudomonas sp BDN15, Pseudomonas sp BDNR1, Pseudomonas sp Setdn1, Paenibacillus sp Ao3, Aspergillus sp FDN9, Aspergillus sp FDN20, Aspergillus sp FDN21, Aspergillus sp FDN41, Curvularia sp FDN22, Trichoderma sp FDNR40 [3, 5, 6, 10, 11, 15, 21]

Các trình tự gene đều được đăng ký trên GenBank Một số gene chức năng tham gia

vào phân hủy chất diệt cỏ/dioxin như tdfA, dioxingenase v.v cũng đã được nghiên cứu

và giải trình tự Một số gene đã được đánh giá số lượng bản sao ngay trong các lô xử

lý tẩy độc như C230, tdfA Các chủng VSV này đều có khả năng phân hủy

2,3,4,7-TCDD hoặc 2,4,5-T, 2,4-D, DBF, PAH v.v ở các mức độ khác nhau như là nguồn cacbon và năng lượng duy nhất hay theo cơ chế đồng trao đổi chất Việc định tên và xác định khả năng phân hủy chất ô nhiễm của các chủng vi sinh vật này góp phần làm sáng tỏ cơ chế và hiệu quả của sự phân hủy sinh học diễn ra trong quá trình xử lý công nghệ phân hủy sinh học đã và đang triển khai để xử lý khử độc ở quy mô 3384 m3 đất tại “điểm nóng” sân bay Biên Hòa, Đồng Nai

I.5 Các phương pháp tẩy độc

I.5.1 Phương pháp tẩy độc bằng nhiệt

Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng nhiệt làm tác nhân chính để khử dioxin, trong quá trình đốt ở nhiệt độ cao khoảng 1.200oC ÷ 1.500oC các hợp chất hữu

cơ sẽ bị biến thành CO2 và hơi nước Các hợp chất hữu cơ khác như chlorine và phosphorus sẽ được thu gom lại nhờ một bộ phận điều khiển đặt trong thân thiết bị Phương pháp này mang lại hiệu quả xử lý dioxin rất cao.Thiết bị đốt lò xoay ENSCO

có khả năng xử lý được 2 ÷ 6,3 tấn đất chứa dioxin/giờ Hiệu quả xử lý 2,3,7,8 TCDD đạt 99,999% Tuy nhiên nhược điểm chính của phương pháp này giá thành xử lý rất cao [42]

I.5.2 Phương pháp quang hóa, hóa học

Phương pháp quang hóa: sử dụng tia cực tím tia γ hoặc ánh sáng mặt trời để gây hiện tượng declo hóa trong phân tử dioxin nhằm tạo ra sản phẩm không độc hoặc ít độc hơn Phương pháp này chỉ đem lại hiệu quả tại lớp đất bề mặt khoảng 0,5 m tùy theo mức độ ô nhiễm của đất Phương pháp này được đánh giá là không hiệu quả

Phương pháp hóa học: sử dụng các loại hợp chất như kiềm hay các hợp chất

amin để thủy phân dioxin với sự có mặt của các chất xúc tác, các tác nhân oxy hóa, declo hóa v.v Phương pháp này tạo ra những sản phẩm ô nhiễm thứ cấp nên không được sử dụng phổ biến trong thực tiễn [17]

Phương pháp oxy hóa: sử dụng các tác nhân oxy hóa mạnh và các tác nhân oxy hóa để thực hiện phản ứng oxy hóa, declo hóa

Nhìn chung các phương pháp vật lý và hóa học đều có những nhược điểm nhất định như giá thành cao, công nghệ phức tạp, gây ô nhiễm thứ cấp Phương pháp khử độc bằng con đường phân hủy sinh học đã được cộng đồng các nhà khoa học ở Việt Nam và trên thế giới đặc biệt quan tâm và nghiên cứu trong những năm gần đây nhờ những ưu điểm như không gây ô nhiễm thứ cấp độc hại, không thay đổi hệ sinh thái, thân thiện với môi trường [17]

I.5.3 Phương pháp khử độc bằng công nghệ phân hủy sinh học

Hiện nay, xử lý chất ô nhiễm theo phương pháp phân huỷ sinh học (bioremediation) là một hướng đi đầy triển vọng trong công tác giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường nói chung và tẩy độc dioxin nói riêng Phương pháp tẩy khử độc bằng công nghệ sinh học bao gồm 3 hướng:

Làm giàu sinh học là việc sử dụng tập đoàn vi sinh vật bản địa đã được làm giàu,

vi sinh vật có khả năng sử dụng chất độc hóa học cần xử lý từ các nguồn khác thậm chí cả những vi sinh vật biến đổi về cấu trúc di truyền để xử lý các điểm ô nhiễm Vi sinh vật được bổ sung vào các bioreactor vẫn chủ yếu có xuất xứ từ vùng ô nhiễm Phương pháp này được nghiên cứu thử nghiệm trong các điều kiện mà ở đó các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến quá trình phân hủy sinh học điều khiển được Cụ thể là sử dụng các hệ thống bioreactor để khử độc

Kích thích sinh học (biostimulation) là quá trình thúc đẩy phát triển tập đoàn vi

sinh vật bản địa có khả năng sử dụng chất ô nhiễm bằng cách thay đổi các yếu tố môi trường cho phù hợp với các điều kiện phát triển của vi sinh vật như mong muốn như nhiệt độ, pH môi trường, nguồn dinh dưỡng v.v

Khử độc bằng công nghệ phân hủy sinh học là một quá trình tự nhiên vì vậy nó được dễ dàng chấp nhận bởi cộng đồng Các sản phẩm của của quá trình phân hủy thường ít độc hơn hoặc bao gồm cacbonic, nước và sinh khối tế bào Hơn nữa quá trình xử lý ô nhiễm diễn ra ngay tại vị trí ô nhiễm mà không cần chuyển chúng qua các môi trường khác nhau Phương pháp này được xem là đem lại hiệu quả kinh tế cao Trên thế giới, phương pháp khử độc bằng phân hủy sinh học đã thành công trên các đối tượng khác nhau như các dung môi tricloethylene, perchloroethylene, các hợp chất polychlorinated biphenyl, benzene, toluene, ethylbenzene, xylene, các hợp chất hydrocacbon đa nhân thơm, các loại thuốc trừ sâu v.v [12]

Tại Việt Nam, Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự đã nghiên cứu tẩy độc dioxin theo các quy mô nghiên cứu khác nhau từ 0,5-100 m3 tại hiện trường ở sân bay Đà Nẵng Trong các nghiên cứu đó tổng độ độc đã giảm từ 50-70% ở các công thức khác nhau trong thời gian hai năm Các tác giả cũng đã phát hiện ra nhiều loài vi sinh vật trong

đó có nhiều loài xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm sợi sinh enzyme ngoại bào như laccase, LiP và MnP Các tác giả cũng cho rằng hai enzyme laccase và MnP đóng một vai trò nhất định trong quá trình phân hủy sinh học các chất có trong đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin Gần đây nhất năm 2009, thực hiện dự án xử lý tẩy độc đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa Đồng Nai ở quy mô 3384 m3 đất

Vật liệu nano để cố định vi sinh vật sinh enzyme và bản thân enzyme thô vào vật liệu là hướng đi mới nhất hiện nay của công nghệ xử lý ô nhiễm các hợp chất đa vòng thơm

Phân huỷ bằng thực vật (phytoremediation): trong phương pháp sử dụng thực

vật lại có 4 dạng khác nhau phụ thuộc vào các điều kiện môi trường và các hợp chất POP mà người ta sử dụng 1 hay tổ hợp của nhiều phương pháp

Trong 3 giải pháp nêu trên thì phương pháp kích thích phát triển và hoạt động trao đổi chất của tập đoàn vi sinh vật tồn tại trong đất nhiễm chất độc hoá học trong đó

có dioxin bị chuyển thành các hợp chất không độc hoặc ít độc hơn mang lại kết quả sớm nhất Nhờ sự chuyển hoá, phân huỷ và khoáng hoá chất độc, đất sau khi xử lý tẩy độc được sử dụng vào các mục đích khác nhau [3]

Phương pháp phân huỷ sinh học không đòi hỏi các điều kiện phức tạp như nhiệt

độ cao, áp suất, quá trình xúc tác v.v Phương pháp này tuân theo qui luật chuyển hoá thuộc chu trình cacbon, nitơ, photpho v.v không gây ô nhiễm thứ cấp, an toàn, thân thiện với môi trường và hệ sinh thái, chi phí thấp do đó rất phù hợp với điều kiện kinh

tế nước ta mặt khác, diện tích đất bị nhiễm độc ở Việt Nam rất lớn nên việc ứng dụng các phương pháp tẩy độc khác như hoá học và lý học khó thực thiện [3]

Bên cạnh những ưu điểm kể trên, phương pháp phân huỷ sinh học cũng có những hạn chế đó là thời gian phân huỷ chậm Do đó, phương pháp phân huỷ sinh học được các nhà khoa học Việt Nam sử dụng kết hợp với phương pháp cô lập, hấp phụ tạo nên công nghệ mới là “ chôn lấp tích cực” Công nghệ này nhằm hạn chế sự phát tán các chất độc trong đất, đồng thời thúc đẩy quá trình phân huỷ dioxin và các chất độc khác bởi tập đoàn vi sinh vật bản địa [3]

Vi sinh vật chuyển hoá dioxin theo các hướng khác nhau, có thể là phản ứng declo ở điều kiện kỵ khí hoặc oxy hoá phá vỡ cấu trúc mạch vòng xảy ta ở điều kiện hiếu khí Hai quá trình trên xảy ra đều có sự tham gia của các vi sinh vật chứa các gen

mã hoá cho các enzyme tham gia trực tiếp vào quá trình phân huỷ hoặc đóng vai trò xúc tác cho quá trình trao đổi chất như enzyme ngoại bào (MnP, LiP và laccase)

Trên thế giới việc ứng dụng hệ enzyme ngoại bào của vi sinh vật vào xử lý ô nhiễm đã có nhiều nghiên cứu, đây cũng là hướng có nhiều triển vọng do rút ngắn được thời gian xử lý và hiệu quả xử lý cao hơn so với khử độc bằng phân hủy sinh học thông thường Những nghiên cứu bước đầu về hệ enzyme ngoại bào ứng dụng vào xử

lý khử độc đã được tiến hành tạo cơ sở cho việc thiết kế công nghệ xử lý các chất ô nhiễm hóa học trong tương lai [7,14,18] Hệ enzyme ngoại bào được quan tâm là hệ enzyme xúc tác với các đại diện là laccase (oxidoreductase), mangan peroxidase và

lignin peroxidase (peroxidase) Đây là những enzyme có khả năng phân hủy nhiều loại chất ô nhiễm hữu cơ có cấu trúc đa vòng thơm khác nhau do tính đặc hiệu cơ chất không cao Trong đó MnP được tập trung trong nghiên cứu này, enzyme này xúc tác quá trình oxy hóa các hợp chất phenolic trong nhóm enzyme phân hủy lignocellucose, MnP được ứng dụng trong công nghệ tẩy độc các hợp chất phenol, các dẫn xuất clo biphenyl, các loại thuốc nhuộm và các loại nước thải v.v [40, 55, 65, 57, 68]

MnP là enzym có chứa nhân Heme (nhân chứa Fe) và có khả năng oxi hóa

Mn2+ thành Mn3+ với chất xúc tác của phản ứng là H2O2

Ở nấm, Mn3+ bền bởi các phối tử là các hợp chất hữu cơ, có bản chất là các axit dicarboxylic như axit oxalic Mn3+ có tính oxi hóa mạnh, oxi hóa được nhiều các hợp chất dạng khử như các hợp chất phenol, các axit carboxylic và các lipid không no

2 Cấu trúc của MnP

MnP là glycoprotein có chứa một phân tử protoporphyrin IX như là một nhóm ngoại, đóng vai trò quan trọng trong quá trình xúc tác của MnP Cấu trúc của MnP tương tự như các peroxidase khác Tuy nhiên, điểm khác biệt trong cấu trúc của phân

tử MnP là cấu trúc trung tâm liên kết với cơ chất Mn2+

Các nghiên cứu về cấu trúc của phân tử MnP từ chủng nấm P chrysosporium

bởi Sundaramoorthy năm 1994 cho thấy, MnP có hai ion Ca2+ đóng vai trò cấu trúc Trung tâm hoạt động của MnP gồm His có mối liên kết hydro với gốc Asp và trung tâm liên kết peroxide gồm His và Arg có hoạt tính xúc tác Trung tâm liên kết với

Mn2+ gồm Asp179, Glu35, Glu39, heme propionate và hai phân tử nước

Hình 1.6 Cấu trúc không gian của enzyme MnP từ chủng nấm P chrysosporium

Cấu trúc phân tử của MnP được thể hiện ở hình 1.6 trên như một chuỗi polypeptide, với nhân heme, cacbonhydrat, một ion Mn2+ và hai ion Ca2+

3 Tính chất hóa sinh của MnP

Phân tử MnP có trọng lượng nằm trong khoảng 38 - 62 Kda, thường là khoảng

43 - 49 Kda

pH hoạt động tối thích và pH làm bền hoạt tính của MnP nằm trong khoảng trung tính Đa số các loại MnP bền trong khoảng nhiệt độ 25 - 40oC [54]

Điểm đẳng điện của MnP phụ thuộc vào nguồn gốc vi sinh vật sinh enzyme, đối với nấm phân hủy gỗ thì pI vào khoảng 3 - 4, còn đối với các loại nấm phân hủy rác thải thì MnP có giá trị pI trong khoảng trung tính [34]

Khi hoạt động nếu có sự tham gia của các phối tử (chelator) như các acid hữu

cơ (oxalic, malonic, acid béo), thiols sẽ tạo phức với MnP và Mn3+ tạo thành các chất

có trọng lượng phân tử thấp với thế oxi hóa khử cao, khuyếch tán tốt trong môi trường

oxi hóa cơ chất (Hatakka et al., 2001, Hensilki et al., 2003) Các ion kim loại tác động

chính làm tăng hoạt tính enzym gồm có ion Mn2+ Fe2+, Cu2+ v.v đặc biệt Mn2+ có tác động ổn định và tăng hoạt tính MnP cũng như LiP và Lac trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật

4 Cơ chế hoạt động của MnP

MnP là enzyme ngoại bào không đặc hiệu, có khả năng oxi hóa nhiều cơ chất qua chất trung gian là Mn3+ Cơ chế xúc tác của MnP được trình bày trong hình 1.7

và Mn3+ Ion Mn3+ được làm bền bởi các phối tử là các axid dicarboxylic, phức chất này có tính oxi hóa mạnh và có khả năng khuếch tán tự do và oxi hóa các hợp chất

phenol, các chất có cấu trúc tương tự lignin (Wariishi et al., 88, 89), chlorolignin có trọng lượng phân tử cao (Lackner et al., 91), chlorophenols (Grabski et al., 98) v.v

Các axit hữu cơ như oxalic, malonic được sinh ra từ P chrysosporium có thể

kết hợp với Mn3+ tạo thành phức hợp bền vững có khả năng kích hoạt MnP Khả năng oxy hóa của MnP có thể tăng nhờ sự có mặt của các chất cảm ứng như thyol hoặc lipit Các hợp chất này sẽ kích thích MnP xúc tác chuyển hóa các hợp chất thơm bao gồm

sự phân hủy trực tiếp lignin tới CO2

5 Ứng dụng của MnP trong phân hủy sinh học

Với vai trò quan trọng như vậy cùng với các nghiên cứu khá đầy đủ về khả năng phân hủy nhiều hợp chất bền vững độc hại thì MnP có triển vọng lớn để ứng dụng phân hủy sinh học và xử lý các khu vực môi trường ô nhiễm nhờ sử dụng các vi sinh vật sinh tổng hợp enzym này cũng như sử dụng nguồn enzyme thô để xử lý một

số điểm nóng cục bộ Đây cũng là enzyme đầu tiên trong ba loại enzyme được nghiên cứu lên men trong các bioreactor và cố định lên vật liệu ứng dụng xử lý loại màu nước

thải dệt nhuộm, tẩy trắng và làm mềm bột giấy v.v (Bogan et al., 1996, Eibes et al.,

2007, López et al., 2006)

Do tính đặc hiệu cơ chất thấp nên MnP có rất nhiều ứng dụng trong phân hủy sinh học các hợp chất mạch vòng có cấu trúc phenolic và tương tự lignin như POPs, PAHs (đại diện là anthracen và pyren), TNT, DDT, các hợp chất mạch vòng chứa clo, dioxin, PCPs, trong công nghiệp giấy với khả năng làm mềm và trắng giấy, loại lignin trong nước thải Trong công nghiệp dệt nhuộm MnP có khả năng loại màu thuốc nhuộm nhà máy dệt như RBBR, Orange C, Poly R 147.v.v [31, 40, 55, 57, 64, 68]

MnP có khả năng phân hủy polyme lignin trong điều kiện in vivo thông qua việc tấn công cấu trúc phenolic của lignin MnP có khả năng xúc tác các phản ứng oxi hóa loại clo hiệu quả hơn LiP (Roy arcand 91) Cả 3 enzym LiP, MnP và Lac đều có

khả năng khử loại clo của các hợp chất phenol chứa nhiều clo Nấm P chrysosporium

có khả năng khử 2,4 dinitrotoluen thành 2,amino-4,nitrotoluene Sau đó MnP của

chủng này oxi hóa demethyl và deamin thành 4,nitro 1,2 benzoquinon [73]

Bảng 1.2 Phân hủy các chất ô nhiễm bởi nấm và các enzyme của chúng

Các màu Azo Lac, MnP Pycnoporus sanguineis Lên đến 60% Polyme sinh học

(giấy, lignin) LiP, MnP Nấm đảm trắng Rất hiệu quả Nước thải tẩy

CCl4, CHCl3 LiP, MnP Phanerochaete

Rất hiệu quả

P chrysosporium, T

versicolor, Inonatus dryophilus

99%

LDS: Hệ thống enzyme phân hủy lignin

6 Phân bố của MnP và một số vi sinh vật sinh MnP

6.1 MnP sinh ra từ nấm đảm

Cho tới nay có khoảng trên 60 loài nấm đảm đã được nghiên cứu về khả năng

sinh MnP như: P chrysosporium, Trametes versicolor, Phlebia radiata, Nematoloma frowardii v.v

MnP được nghiên cứu lần đầu tiên năm 1984 ở loài nấm đảm P chrysosporium Một số gene mã hóa MnP của nấm P chrysosporium đã được công bố là mnp1, mnp2, mnp3, mnp4, mnp5 trong đó 3 gene mnp1 (mã hóa MnP H4) đã được biểu hiện ở A niger và A oryzae, mnp2 (mã hóa MnP H5) và mnp3 (mã hóa MnP H3) được nghiên cứu nhiều nhất MnP tái tổ hợp (từ mnp1 của P chrysosporium) cũng được biểu hiện thành công ở nấm men Pichia Pastoris αMnP1-1 và đã được lên men gián đoạn [49].

Enzym MnP oxi hóa các hợp chất phenolic bằng việc sử dụng cặp oxi hóa khử trung gian Mn2+ / Mn3+ và Mn3+ làm ổn định các phối tử của nấm chẳng hạn oxalic acid và phức Mn3+ oxi hóa các hợp chất phenolic MnP khi có mặt của sodium malnonate,

Mn2+ và H2O2 sẽ xúc tác cắt liên kết Cα - Cβ, Cα oxy hóa và cắt liên kết alkyl - aryl của cấu trúc lignin chứa phenolic beta-1 và beta-O-4 Phức Mn3+ có trọng lượng phân tử thấp sẽ khuyếch tán và oxi hóa các chất trung gian, tấn công cấu trúc phenolic của lignin Hệ thống MnP-lipid đủ mạnh để phân hủy các liên kết Cα-Cβ và beta-aryl các hợp chất có cấu trúc tương tự lignin không có mạch vòng

Nấm Nematoloma frowardii và Stropharia rugoannulata có khả năng chuyển

hóa và phân hủy các sản phẩm được khử từ TNT Chúng khoáng hóa trực tiếp 4A26DNT thành CO2, giải phóng 52% CO2 khi có mặt của chất khử trung gian thiol

(mediator) Nấm N frowardii còn được nghiên cứu có khả năng phân hủy các PAH như phenanthrene, anthracene, pyrenes, fluorene và benzo (a) pyrene ( Sack et al.,

2007)

6.2 MnP sinh ra từ nấm sợi

Cho tới nay chưa có nhiều nghiên cứu về nấm sợi có khả năng sinh MnP Một

số loài được thông báo có khả năng sinh MnP đều thuộc chi Asperillus như A niger, terreus, nendunan (Kluczek-Turpeinen B., 2007)

A terreus LD-1 có khả năng sinh enzyme ngoại bào phân hủy lignin trong đó

có enzyme MnP MnP này phản ứng trong những điều kiện kiềm, enzyme này được tinh sạch có hoạt tính tăng 13 lần so với dịch enzyme thô, hoạt tính enzyme trung bình 0.384 U/mg đối với từng loại cơ chất dùng để xác định Trọng lượng phân tử MnP từ

43 - 44 Kda , có cấu trúc monomeric pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu của MnP từ chủng

và 400C Km của MnP đối với các cơ chất H2O2; 2,6 DMP và Mn2+ lần lượt là 320 pM,

chất đơn giản hơn (Shin et al., 1997, Mei et al., 2008) Chủng nấm sợi A alliaceus

121C được nuôi cấy trong môi trường lỏng chứa màu Indigo và Congo đỏ đã sinh tổng hợp cả 3 loại enzyme Lac, LiP và MnP, tuy nhiên hoạt tính MnP thấp hơn đạt 10-12 U/l [40]

Theo một số nghiên cứu đồng thời tại phòng Công nghệ Sinh học môi trường- Viện Công nghệ sinh học từ nguồn đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin, chủng nấm sợi

Aspergillus sp FDNR14 có khả năng sinh MnP trên các môi trường khác nhau và hoạt

tính MnP tương đối cao, trên môi trường SH1 hoạt tính đạt 538 U/l, cao nấm men hoạt

tính đạt 504 U/l và 29 U/l trên môi trường cao malt Chủng Aspergillus sp FNA1 phân

lập từ đất nhiễm DDT va HCH ở Nghệ An không phát hiện thấy LiP nhưng có khả

năng sinh MnP và Lac lần lượt là 26,9 U/l và 5,4 U/l [1] Chủng nấm sợi Aspergillus

sp FNA33 có quan hệ gần gủi với chủng Aspergillus terreus LD-1, enzyme MnP thu

được có khả năng hoạt động ở điều kiện rất kiềm pH từ 11 đến 12,5 Hoạt tính MnP của chủng FNA33 sau 7 ngày nuôi cấy đạt 434,5 U/l và sau 20 ngày thì hoạt tính giảm

còn 269 U/l [4] Chủng nấm sợi Trichoderma sp FDNR40 trên môi trường SH1 chứa

anthracene cho hoạt tính MnP cao nhất (12,3 U/l), trên môi trường Czapek nghèo thì hoạt tính MnP lại thấp hơn đáng kể cả trên 5 nguồn chất ô nhiễm nghiên cứu, hoạt tính MnP cao nhất đạt 2,2 U/l trên 2,4,5-T [7]

6.3 MnP sinh ra từ vi khuẩn

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật được nghiên cứu khá nhiều về khả năng sinh

MnP Các chi Streptomyces, Norcadia và các đại diện thuộc chi được nghiên cứu nhiều, trong đó các loài thuộc chi Streptomyces được phát hiện nhiều hơn và có khả năng sinh MnP Như S lavendulae REN-7, S viridosporus, S psammoticus, S Reticuli

Đặc điểm enzym MnP của loài xạ khuẩn S psammoticus có hoạt tính tốt nhất

tại pH 7, ở 30 0C Loài xạ khuẩn này sinh tổng hợp MnP tốt nhất với nồng độ MnSO4

là 1,75 mM hoạt tính đạt tới 3060 U/l, khi giảm nồng độ MnSO4 lần lượt là 1,5 mM, 1,25 mM, 1 mM thì hoạt tính MnP giảm theo và hoạt tính tương ứng là 2500 U/l, 1250 U/l, 700 U/l, khi tăng nồng độ MnSO4 là 2,0 mM trong môi trường thì hoạt tính giảm xuống đến 900 U/l [54]

Chủng Streptomyces sp XKDNR1 phân lập từ xử lý đất nhiễm chất diệt

cỏ/dioxin ở Đà Nẵng bằng bioreactor có khả năng sinh MnP với hoạt lực là 33,625 U/l

và LiP 124,7 U/l trên môi trường mà chất cảm ứng là dịch chiết đất chứa dioxin [9] 6.4 MnP sinh ra từ vi khuẩn

Hiện nay chưa có nhiều tài liệu công bố về enzyme ngoại bào thuộc nhóm peroxidase (LiP và MnP) từ vi khuẩn, nhất là các vi khuẩn phân lập từ nguồn ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin

Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng vi khuẩn Brevibacillus sp

BDNR10 phân lập cũng từ bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Đà Nẵng thì hoạt tính MnP mạnh hơn so với LiP và Lac ở trên cả 4 chất ô nhiễm, ngoại trừ dịch chiết đất Trong đó, cao nhất trên môi trường chứa 2,4-D (15,7 U/l) và thấp nhất trên

môi trường chứa 2,4,5-T (0,75 U/l) [7]

Theo công bố của Đặng Thị Cẩm Hà và đồng tác giả (2009), chủng vi khuẩn

Pseudomonas sp BQNR phân lập từ ô nhiễm dầu ở Quảng Ninh cũng sinh tổng hợp

enzyme MnP với hoạt tính đạt 215 U/l Cùng với công bố này, chủng vi khuẩn

Achromobacter sp BQNT2 sinh MnP có hoạt lực rất thấp 3-5 U/l Trên thế giới, hoạt

tính enzyme thủy phân lignin của những chủng mới phân lập ban đầu cũng không cao, chỉ sau khi tối ưu hóa các thành phần môi trường thì hiệu quả sinh tổng hợp enzyme thủy phân lignin mới tăng lên

Gần đây nhất, theo công bố của Nguyễn Quang Huy và cộng sự (2010), sáu chủng vi khuẩn bao gồm BDNP1, BDNP2, BDNP3, BDNP4, BDNP5 và BDNP6 được phân lập từ các công thức xử lý sinh học tẩy độc đất nhiễm chất diệt cỏ tại sân bay Đà Nẵng Khi khảo sát khả năng sinh MnP từ các chủng phân lập được thì chỉ có chủng BDNP6 là không sinh MnP, 5 chủng còn lại đều sinh MnP hoạt tính lần lượt là 10,4 U/l, 7,4 U/l, 3,3 U/l, 17,2 U/l và 9,7 U/l Phân loại chủng BDNP2 bằng kỹ thuật xác định trình tự gen 16S rRNA kết hợp với các đặc điểm hình thái thì nó được xếp vào

chi Klebsiella và có tên là Klebsiella sp BDNP2 Các nghiên cứu trước đây cho thấy, chưa có chủng vi khuẩn thuộc chi Klebsiella phân lập được từ khu đất nhiễm chất độc hóa học tại sân bay Đà Nẵng (Nguyễn Bá Hữu et al., 2008)

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I Vật liệu

I.1 Nguyên liệu

Đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin từ sân bay Biên Hòa được thu thập trộn đều sử dụng là nguyên liệu để phân lập các chủng nấm sợi Chủng nấm sợi FBH11 được lấy

từ bộ sưu tập giống của nhóm nghiên cứu POP thuộc phòng Công nghệ sinh học môi trường - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam để tiến hành trong công trình này

Chủng này đã được phân loại và đặt tên khoa học là Aspergillus sp FBH11 [19]

I.2 Hoá chất

Các hoá chất được sử dụng để nghiên cứu bao gồm các hoá chất nhập từ các hãng hoá chất như: Sigma, Merk v.v

Dịch chiết đất (DC) chứa hơn 99% đồng phân 2,3,7,8,-TCDD; 2,4,5-T; 2,4-D

và các PAHs như: pyrene; anthracene có độ tinh khiết cao dùng để phân tích, đánh giá khả năng phân huỷ các chất ô nhiễm bởi các chủng vi sinh vật

Các hoá chất được sử dụng trong việc xác định hoạt tính enzyme MnP, LiP và Lac như: ABTS; 2,4-DCP (2,4-dichlorophenol); 4-aminoantipyrine; phenol red v.v

13 Các loại màu sử dụng

Bảng 2.1 Các loại màu được sử dụng trong nghiên cứu

Trọng lượng (g/mol)

Độ hòa tan (g/l) λmax

I.3 Thiết bị và máy móc

Nghiên cứu này đã được thực hiện với các thiết bị, máy móc tại phòng Công nghệ sinh học môi trường và phòng Thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học Các thiết bị chính bao gồm: