tìm hiểu bệnh hoại tử gan tụy trên tôm sú giống

TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm tìm hiểu sự xuất hiện của bệnh AHPNS và sự tương quan của AHPNS và các mầm bệnh khác trên tôm sú giống.. Phát hiện được 6 mẫu có xuất hiện thể ẩn MBV t

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

PHẠM LAN HƯƠNG

TÌM HIỂU BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY

TRÊN TÔM SÚ GIỐNG (Penaeus monodon)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

PHẠM LAN HƯƠNG

TÌM HIỂU BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY

TRÊN TÔM SÚ GIỐNG (Penaeus monodon)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs.Ts ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

2013

i

LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm tạ Thầy, Cô trường Đại học Cần Thơ đã tận tình giảng dạy trong thời gian em học ở đây

Đặc biệt chân thành cảm ơn cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tận tình hướng dẫn

em thực hiện luận văn tốt nghiệp

Cũng xin cảm ơn đến các anh chị ở bộ môn Bệnh Thủy sản và các bạn lớp Bệnh học thủy sản K35 và đã giúp đỡ và động viên trong khoảng thời gian học tập tại trường

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện nhằm tìm hiểu sự xuất hiện của bệnh AHPNS và

sự tương quan của AHPNS và các mầm bệnh khác trên tôm sú giống Sau khi tiến hành kiểm tra 111 mẫu tôm sú giống ở các tỉnh ĐBSCL phát hiện 50%

số tôm bị nhiễm MBV khi soi tươi và tỷ lệ cường độ nhiễm nhẹ, trung bình

và nặng lần lượt là 33%, 12% và 2% Có đến 46% tôm nhiễm một loài vi khuẩn hình cầu, Gram âm Hầu hết tôm của các tỉnh đều bị nhiễm khuẩn cao

từ 31% đến 100% Không phát hiện ký sinh trùng và vi khuẩn qua các mẫu kính phết nhuộm Giemsa Có 16/35 mẫu nhiễm virus chiếm tỷ lệ 46% Tỷ lệ mẫu nhiễm các loại virus MBV, IHHNV, WSSV lần lượt là 17%, 26% và 3%

và không phát hiện YHV/GAV Đặc biệt có hiện tượng nhiễm kép IHHNV Phát hiện được 6 mẫu có xuất hiện thể ẩn MBV trên gan tụy tôm sú giống, 2 mẫu có dấu hiệu hoại tử gan tụy và 2 mẫu xuất hiện cả dấu hiệu của hoại tử gan tụy và thể ẩn MBV khi quan sát tiêu bản mô Biểu hiện của hoại

MBV-tử gan tụy là mất cấu trúc tế bào hay tập trung tế bào máu ở giữa ống gan tụy

Có 2 mẫu tôm có dấu hiệu hoại tử gan tụy bị nhiễm vi khuẩn, 3 mẫu có dấu hiệu hoại tử gan tụy bị nhiễm virus, trong đó có 1 mẫu nhiễm IHHNV, 2 mẫu nhiễm MBV, đặc biệt có một mẫu nhiễm cả vi khuẩn và MBV

iii

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH HÌNH v

DANH SÁCH BẢNG vi

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới 2

2.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam hiện nay 2

2.3 Sơ lược về AHPNS 3

2.3.1 Phân bố và thiệt hại 3

2.3.2 Dấu hiệu bệnh lý 4

2.3.3 Đặc điểm bệnh lý 4

2.3.4 Các nghiên cứu và nhận định 5

2.3.5 Phương pháp phòng và quản lý bệnh 7

2.4 Phương pháp kính phết 8

2.5 Phương pháp PCR 9

2.6 Phương pháp mô học 9

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

3.1 Thời gian thực hiện đề tài 9

3.2 Địa điểm thực hiện 9

3.3 Vật liệu nghiên cứu 9

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 9

3.3.2 Dụng cụ 9

3.3.3 Hóa chất 9

3.4 Phương pháp nghiên cứu 10

3.4.1 Phương pháp nhuộm nhanh phát hiện MBV (Lightner et al., 1983) 10

3.4.2 Phương pháp nhuộm Gram, Giemsa quan sát vi khuẩn 10

3.4.3 Phương pháp mô học (Lightner, 1996) 11

3.4.4 PCR 12

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

4.1 Tỷ lệ cảm nhiễm MBV trên tôm sú giống khi kiểm tra bằng phương pháp soi tươi 20

4.1.1 Tỷ lệ cảm nhiễm MBV trên tôm sú giống ở ĐBSCL 20

4.1.2 Tỷ lệ cảm nhiễm MBV trên tôm sú giống của từng tỉnh 21

4.2 Kết quả kính phết 23

4.2.1 Nhuộm Gram quan sát vi khuẩn 23

4.2.2 Nhuộm Giemsa 25

4.3 Kết quả PCR 25

4.3.1 Kết quả PCR phát hiện MBV, IHHNV, WSSV, YHV/GAV 26

4.4 Kết quả mô học 27

4.5 Sự tương quan giữa hoại tử gan tụy và các mầm bệnh trên tôm giống 32

4.6 Chất lượng tôm giống 33

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34

5.1 Kết luận 34

5.2 Đề xuất 34

PHỤ LỤC 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

v

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Tôm chân trắng ở Việt Nam: tôm bên phải nhiễm AHPNS, tôm bên trái bình thường (nguồn: D Lightner) 4 Hình 2.2 Gan tụy tôm chân trắng teo và nhợt nhạt, biểu hiện của AHPNS (nguồn: D Lightner) 4 Hình 2.3 A: Tế bào gan tụy bị tróc; B: thiếu hoạt động phân bào trong tế bào E; C: không có tế bào B, F và R; D: nhân tế bào trương to; E: Tế bào máu tập trung; và F: nhiễm khuẩn thứ cấp (Nguồn: Eduado và Mohan, 2012 trích dẫn bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012) 5 Hình 2.4 Mô gan tụy dạng hoại tử 1 và 2 (nguồn: Lê Hữu Tài và ctv) 5 Hình 3.1 Minh họa kết quả chạy PCR chẩn đoán YHV/GAV theo kit IQ2000 18 Hình 4.1 Thể ẩn MBV khi soi tươi (40X) 20 Hình 4.2 Vi khuẩn trong mẫu kính phết gan tụy khi quan sát ở vật kính 100X 24 Hình 4.3 Kết quả PCR phát hiện MBV, WSSV, IHHNV, YHV/GAV 26 Hình 4.4 Ống tiểu quản gan tụy còn bình thường hình sao và Ống tiểu quản gan tụy bị hoại tử mất cấu trúc hình sao (10X) 29 Hình 4.5 Các ống gan tụy bị hoại tử mất cấu trúc hình sao (10X) 30 Hình 4.6 Ống gan tụy bị hoại tử mất cấu trúc hình sao (40X) 30 Hình 4.7 Cấu trúc ống gan tụy bị hoại tử với sự tập trung của tế bào máu ở giữa ống gan tụy (10X) 31 Hình 4.8 Cấu trúc ống gan tụy bị hoại tử với sự tập trung của tế bào máu ở giữa ống gan tụy (40X) 31 Hình 4.9 Các ống gan tụy bị hoại tử mất cấu trúc và thể ẩn MBV (10X) 32 Hình 4.10 Các ống gan tụy bị hoại tử mất cấu trúc và thể ẩn MBV (40X) 32

Đồ thị 4.1 Tỷ lệ và cường độ nhiễm MBV trên tôm sú giống có nguồn gốc tại ĐBSCL 21

Đồ thị 4.2 Tỷ lệ tôm sú giống nhiễm MBV của từng tỉnh 22

Đồ thị 4.3 Tỷ lệ tôm nhiễm vi khuẩn của từng tỉnh 25

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1 Trình tự mồi sử dụng trong qui trình PCR phát hiện IHHNV (Yang

et al., 2006) 10

Bảng 3.2 Trình tự mồi sử dụng trong qui trình PCR phát hiện MBV (Belcher and Young, 1998) 10

Bảng 3.3 Trình tự mồi sử dụng trong qui trình PCR phát hiện WSSV (Kimura, 1996 có chuẩn hóa bởi Trần Thị Tuyết Hoa, 2011) 13

Bảng 3.4 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui trình PCR phát hiện IHHNV (Yang et al., 2006) 14

Bảng 3.5 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình PCR phát hiện MBV (Yang et al., 2006) 15

Bảng 3.6 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình PCR phát hiện WSSV (Kimura, 1996 có chuẩn hóa bởi Trần Thị Tuyết Hoa, 2011) 15

Bảng 4.1 Tỷ lệ và cường độ nhiễm MBV trên tôm sú giống có nguồn gốc từ các tỉnh ĐBSCL 21

Bảng 4.2 Tỷ lệ và cường độ nhiễm MBV trên tôm sú giống có nguồn gốc từng tỉnh 22

Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn 23

Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm các mầm bệnh virus trên tôm giống 27

Bảng 4.5 Kết quả chẩn đoán bệnh trên tôm sú giống 32

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

Châu Á là khu vực nuôi trồng và xuất khẩu thủy sản lớn nhất thế giới nhưng nghề nuôi trồng thủy sản nơi đây liên tục gặp phải các dịch bệnh nguy hiểm gây ra những tổn thất to lớn Trong vài thập niên qua một số dịch bệnh như phát sáng, hội chứng đốm trắng, đầu vàng, hội chứng Taura đã từng tàn phá nghề nuôi tôm nước lợ của khu vực Gần đây một căn bệnh mới xuất hiện được gọi là hội chứng tôm chết sớm (Early Mortality Syndrome-EMS) hay còn gọi là hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm (Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome-AHPNS) được báo cáo là đã gây ra thiệt hại đáng kể cho người nuôi tôm ở Trung Quốc, Việt Nam, Malaysia và Thái Lan (Leaño và Mohan, 2012)

Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng nuôi tôm nước lợ chủ yếu của cả nước Trong đó tôm sú là đối tượng nuôi chính từng mang lại nhiều ngoại tệ cho đất nước và góp phần cải thiện đời sống cho nhiều nông dân Những năm gần đây, do việc thả nuôi ồ ạt không có quy hoạch cộng với việc suy thoái môi trường đã làm cho dịch bệnh xuất hiện ngày càng nhiều gây thiệt hại nghiêm trọng, trong đó phải kể đến các bệnh như hội chứng đốm trắng, đầu vàng, bệnh gây kết dính mang, bệnh còi, phân trắng…Trước sự diễn biến phức tạp của dịch bệnh đặc biệt là sự xuất hiện của AHPNS mà đến nay vẫn chưa biết tác nhân càng làm cho nghề nuôi tôm nước lợ gặp nhiều khó khăn

Tôm nhiễm EMS/AHPNS có dấu hiệu hoại tử gan tụy (HTGT) sau khi thả giống từ 10-45 ngày và tỷ lệ tôm chết cao có thể lên đến 100% (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012) Đặc biệt tôm chết rất nhanh sau khi xuất hiện dấu hiệu hoại tử 2-3 ngày (Lê Hữu Tài và ctv, 2012) Có và một vài nơi nông dân thả tôm lặp lại 2-3 lần sau khi cải tạo ao nuôi nhưng tôm vẫn chết Phần lớn tôm chết khi còn nhỏ và chưa đạt kích cỡ thương phẩm Do tác nhân đến nay vẫn chưa được xác định và mức độ nguy hiểm của bệnh nên việc tìm hiểu sự xuất hiện AHPNS trên tôm giống có ý nghĩa quan trọng trong việc chẩn đoán phát

hiện bệnh, đó là lý do đề tài “Tìm hiểu bệnh hoại tử gan tụy trên tôm sú giống (Penaeus monodon)” được thực hiện

Mục tiêu đề tài: Tìm hiểu sự xuất hiện của AHPNS và sự tương quan của

AHPNS và các mầm bệnh khác trên tôm sú giống

Nội dung đề tài: Xác định bệnh AHPNS trên tôm sú giống bằng cách kiểm tra

vi sinh vật trên tôm bằng phương pháp kính phết, mô học và kiểm tra một số virus thường gặp trên tôm bằng phương pháp PCR

2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới

Châu Á là khu vực sản xuất tôm lớn, đặc biệt tôm sú chiếm 46% sản lượng toàn cầu (Theo Thefishsite trích dẫn bởi Phạm Yến, 2009) Các quốc gia dẫn đầu về diện tích và sản lượng tôm nuôi là Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Thái Lan và Việt Nam (FAO, 2010) Tuy nhiên, việc chuyển sang nuôi tôm chân trắng của Trung Quốc và Thái Lan đã khiến loài tôm này trở nên có ý nghĩa hơn trong sản lượng thủy sản nuôi toàn cầu Sản lượng tôm chân trắng

đã tăng mạnh và chiếm 63% sản lượng tôm nuôi toàn cầu năm 2006 Chính điều này đã đưa Thái Lan và Trung Quốc lên vị trí đầu bảng trên thế giới về sản lượng tôm nuôi (Theo Thefishsite trích dẫn bởi Phạm Yến, 2009) Tổng sản lượng tôm nuôi thế giới năm 2012 ước đạt 2,02 triệu tấn, giảm 13% so với

2011 do dịch bệnh EMS và biến đổi khí hậu (Ong Thị Kim Ngân, 2012)

2.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam hiện nay

Trong năm 2010 mặc dù gặp không ít khó khăn nhưng người nuôi tôm trong nước vẫn thu được lợi nhuận Diện tích nuôi tôm nước lợ cả nước trong năm 2010 đạt trên 639.000 ha, bị thiệt hại hơn 60.000 ha và sản lượng đạt gần 470.000 tấn Sản xuất tôm giống đạt 43 tỷ con (Thanh Sang, 2011)

Năm 2011, diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng tăng lên khá nhanh thay thế nhiều diện tích nuôi tôm sú bị dịch bệnh Do đó, dù sản lượng nuôi tôm sú giảm nhưng tổng sản lượng tôm nuôi nước lợ vẫn tăng lên Theo Tổng cục Thủy sản, diện tích nuôi tôm nước lợ cả nước là 656.425 ha, sản lượng đạt 495.657 tấn (tăng 2,71% diện tích và 5,48% sản lượng so với năm 2010) Trong đó, diện tích nuôi tôm sú là 623.377 ha, đạt sản lượng 319.206 tấn (bằng 95,81% năm 2010); tôm chân trắng là 33.049 ha, đạt sản lượng 176.451 tấn (bằng 129,06% năm 2010) ĐBSCL chiếm 91,8% diện tích nuôi tôm cả nước với tổng diện tích là 602.416 ha (bao gồm 588.419 ha nuôi tôm sú và 18.498 ha nuôi tôm thẻ chân trắng) (Thành Công, 2012)

Theo Cục Thú y, trong năm 2011 dịch bệnh đốm trắng đã gây thiệt hại cho 13 tỉnh, thành trên cả nước với tổng diện tích 869 ha; trong đó Ninh Thuận

là địa phương bị thiệt hại nặng nề nhất với 216 ha Bệnh HTGT đã gây thiệt hại nặng nề ở hầu hết các vùng nuôi tôm trọng điểm của cả nước (Đ.T.Chánh, 2012) Dịch bệnh lây lan trên diện rộng tại ĐBSCL khiến cho diện tích nuôi tôm bị thiệt hại lớn nhất từ trước tới nay (97.691 ha) Nghiêm trọng nhất là Sóc Trăng có hơn 25.000 ha tôm nuôi bị mất trắng (Thành Công, 2012) Khi tôm sú đối tượng bị thiệt hại nặng nề nhất thì nông dân có xu hướng chuyển sang nuôi cá kèo và tôm thẻ chân trắng Đây chỉ là những thay đổi nhất thời trước diễn biến khó lường của dịch bệnh, tôm sú vẫn được đánh giá là đối tượng chủ lực trong tương lai (Thành Công, 2012)

Theo báo cáo của Tổng cục thủy sản năm 2012 cả nước có 30 tỉnh thành nuôi tôm nước lợ: diện tích thả nuôi là 658 nghìn ha (bằng năm 2011),

sản lượng 500 nghìn tấn (tăng 0,9% so với năm 2011) Trong đó, diện tích nuôi tôm sú là 619.000 ha (gần bằng năm 2011) đạt sản lượng 310.000 tấn (giảm 6,4%), diện tích nuôi tôm chân trắng là 38.000 ha (tăng 15,7%) đạt sản lượng 190.000 tấn (tăng 7,3%) (Thu Hiền, 2012) ĐBSCL vẫn là vùng nuôi tôm sú chủ yếu của cả nước, chiếm 93,6% diện tích (579.997 ha), 94% sản lượng (280.647 tấn) (FICen, 2012)

Về sản xuất giống năm 2012, nhu cầu giống tôm sú khoảng 35-40 tỷ con, tôm thẻ chân trắng 15-20 tỷ con, trong khi cả nước sản xuất được hơn 37

tỷ tôm sú giống và gần 30 tỷ tôm thẻ chân trắng giống Hiện có 1.529 cơ

sở sản xuất giống (giảm 319 cơ sở) Số lượng giảm so với năm 2011 nhưng quy mô một số cơ sở sản xuất giống lớn hơn (Thu Hiền, 2012)

Năm 2012 nhiều nơi nuôi tôm nước lợ bị dịch bệnh trên diện rộng, gây thiệt hại to lớn Dịch bệnh gồm AHPNS, đốm trắng, đầu vàng… Dịch bệnh xảy ra ở hầu hết các tháng trong năm, mức độ dịch bệnh trầm trọng nhất từ tháng 4 đến tháng 7 (Anh Đức, 2012) Các tỉnh bị dịch bệnh nhiều nhất là: Sóc Trăng, Bạc Liêu, Bến Tre, Trà Vinh, Cà Mau Dù công tác phòng chống dịch bệnh tôm đã được triển khai sớm, nhưng vẫn còn tản mạn, cơ chế quản lý và phối hợp chưa tốt (FICen, 2012) Tổng diện tích tôm bị thiệt hại là 104.000 ha (tăng 3,2% so với năm 2011), trong đó tôm sú là 91.000 ha (giảm 2,2%) và tôm chân trắng là 9.000 ha (tăng gấp 2,25 lần năm 2011) Phần lớn dịch bệnh xảy ra trên diện tích quảng canh cải tiến nhưng vẫn thu hoạch được một phần (Thu Hiền, 2012) Dịch bệnh trên tôm năm 2012 xảy ra trên diện rộng, kéo dài (FICen, 2012) và đến nay vẫn chưa ngừng lại

2.3 Sơ lược về AHPNS

2.3.1 Phân bố và thiệt hại

Theo các nghiên cứu của Lightner et al và Flegel thì EMS/AHPNS xuất hiện ở Trung Quốc (2009), Việt Nam (2010) rồi đến Malaysia (2011) (Lightner et al và Flegel, 2012 trích dẫn bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012) Gần đây bệnh được báo cáo là ảnh hưởng đến tôm ở phía đông Vịnh Thái Lan (Flegel, 2012 trích dẫn bởi Leaño và Mohan, 2012)

Một số tỉnh nuôi tôm ở Trung Quốc như Hải Nam, Quảng Đông, Phúc Kiến và Quảng Tây đã bị thiệt hại hơn 80% trong nửa đầu năm 2011 (Panakorn, 2012 trích dẫn bởi Leaño và Mohan, 2012) Ở Malaysia, EMS/AHPNS bùng phát dẫn đến sự sụt giảm sản lượng tôm thẻ chân trắng từ 70.000 triệu tấn vào năm 2010 xuống còn 40.000 triệu tấn vào năm 2011 (Leaño và Mohan, 2012) Ở Việt Nam, bệnh xuất hiện từ năm 2010 ở ĐBSCL nhưng gây thiệt hại nặng và được báo cáo từ tháng 3 năm 2011 EMS/AHPNS gây ảnh hưởng đến các vùng sản xuất tôm chính như Tiền Gang, Bến Tre, Kiên Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau với tổng diện tích khoảng 98.000

ha Trong tháng 6 năm 2011 diện tích nuôi tôm sú bị thiệt hại ở Bạc Liêu là 11.000 ha, Trà Vinh 6.200 ha (làm mất trên 12 tỷ đồng) và Sóc Trăng 20.000

ha (làm mất 1,5 tỷ đồng) (Mooney, 2012 trích dẫn bởi Leaño và Mohan, 2012) Theo Tổng cục thủy sản hiện tượng tôm chết ở ĐBSCL năm 2011 xảy

2.3.2 Dấu hiệu bệnh lý

Bệnh được ghi nhận xuất hiện trên hai loài tôm sú và tôm thẻ sau khi thả giống 10-45 ngày Bệnh gây tỉ lệ chết cao có thể lên đến 100% Tôm bệnh có dấu hiệu lờ đờ, bỏ ăn, gan tụy teo và nhợt nhạt, ngoài ra tôm còn biểu hiện mềm vỏ, sẫm màu và có đốm đen trên vỏ đầu ngực (Lightner, 2012 trích dẫn bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012) Người ta nhận thấy rằng gan tụy tôm khó bị nghiền bởi 2 đầu ngón tay, tôm sắp chết thường chìm xuống đáy ao và ruột tôm có thể đứt đoạn hay trống rỗng (Lightner, 2012)

2.3.3 Đặc điểm bệnh lý

Lightner (2012) mô tả chi tiết về bệnh lý học của AHPNS là tình trạng thoái hóa của gan tụy tiến triển cấp tính, kèm theo là sự thiếu hoạt động phân bào trong tế bào E, rối loại chức năng ở các tế bào trung tâm của tổ chức gan tụy (tế bào B, F và R), dễ thấy những tế bào có nhân trương to, bong tróc các

tế bào biểu mô hình ống và giai đoạn cuối bao gồm sự tập trung tế bào máu ở giữa ống gan tụy và nhiễm trùng vi khuẩn thứ cấp (Flegel, 2012 trích dẫn bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012) Đặc điểm mô bệnh học tương tự được Prachumwat et al (2012) mô tả khi quan sát mẫu tôm bệnh thu ở Thái Lan (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012)

Hình 2.1 Tôm chân trắng ở Việt

Nam: tôm bên phải nhiễm

AHPNS, tôm bên trái bình thường

(nguồn: D Lightner)

Hình 2.2 Gan tụy tôm chân trắng teo và nhợt nhạt, biểu hiện của AHPNS (nguồn: D Lightner)

Hình 2.3: A: Tế bào gan tụy bị tróc; B: thiếu hoạt động phân bào trong tế bào E; C: không có tế bào B, F và R; D: nhân tế bào trương to; E: Tế bào máu tập trung; và F: nhiễm khuẩn thứ cấp (Nguồn: Eduado và Mohan,

2012 trích dẫn bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012)

Theo Lê Hữu Tài và ctv (2012) dựa trên kết quả nghiên cứu diễn biến của hội chứng HTGT ở huyện Trần Đề (Sóc Trăng) cho biết có hai dấu hiệu hoại tử ở tôm bệnh khi phân tích mô học: dấu hiệu 1 là các tế bào ống gan tụy

bị thoái hóa hoàn toàn và bong tróc vào trong lòng ống, không tìm thấy sự hiện diện của các tác nhân gây bệnh hữu sinh, không có những biến đổi bệnh

lý đặc trưng trên tế bào gan tụy khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử Dấu hiệu 2 là có hiện tượng melanin hóa, viêm quanh các ống gan tụy với sự xuất hiện của vô số tế bào máu và sự hiện diện của trực khuẩn Gram âm trong vùng hoại tử

Hình 2.4 Mô gan tụy dạng hoại tử 1 và 2 (nguồn: Lê Hữu Tài & ctv.,

2012) 2.3.4 Các nghiên cứu và nhận định

6

Năm 2011 tôm chết xảy ra trên diện rộng ở hai tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu với những biểu hiện gan nhũn, teo hoặc sưng Đến năm 2012, tôm chết cũng xảy ra ở các vùng nuôi như Cầu Ngang, Duyên Hải (Trà Vinh), Kiên Lương (Kiên Giang), Bình Đại (Bến Tre) với những biểu hiện về lâm sàn và tổ chức mô học giống như năm 2011 Đại diện cục Thú y cho biết dịch bệnh HTGT năm 2012 xảy ra sớm hơn năm 2011 (tháng 1/2012 đã xảy ra tôm chết) (Cao Thành Trung, 2012)

Trung Quốc cho rằng nguyên nhân gây EMS/AHPNS do độc tố môi trường, Malaysia thì cho rằng do độc tố tảo (Cao Thành Trung, 2012) Vào năm 2011 ở Việt Nam, giả thuyết được đông đảo cho là do nông dược cypermethrin Độc chất này tích tụ lâu trong bùn, khi các yếu tố môi trường bất lợi thì gây nên ngộ độc (Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, 2011) Tổng cục thủy sản cho biết, thuốc bảo vệ thực vật như cypermethrin, deltamethrin, có trong nước và bùn đáy ở hầu hết các ao nuôi tôm ở các địa phương Lượng thuốc bảo vệ thực vật tồn dư trong ao tương đương hoặc cao hơn nồng độ đã gây chết tôm giống trong điều kiện thực nghiệm (Anh Đức, 2012)

Nguyễn Thị Hiền và ctv (2011) qua nghiên cứu cho rằng cypermethrin

có ảnh hưởng đến hiện tượng HTGT dạng 1 của tôm sú nuôi trong nhà kín Tôm đối chứng và tôm chết cấp tính do nồng độ cypermethrin quá cao (0,05 ppb) không có dấu hiệu HTGT dạng 1 Tôm chết bắt đầu có dấu hiệu HTGT dạng 1 vào các ngày 7, 16, 12 lần lượt ở các nghiệm thức cypermethrin nồng

độ 0,01 ppb; 0,01 ppb; 0,001 ppb Tôm chết qua phân tích mô học có tỉ lệ HTGT dạng 1 lần lượt là 13,8%; 14,3%; 42,9% Dấu hiệu hoại tử 1 có biểu hiện các tế bào của ống gan tụy bị thoái hoá, co lại và rơi vào trong lòng ống Các tế bào bị thoái hoá này có thể bị hiện tượng tự hủy do các enzyme nội bào Có những trường hợp toàn bộ các tế bào hình thành nên cấu trúc ống gan tụy bị mất hoàn toàn chỉ còn lại bộ khung là các tế bào nền Dấu hiệu hoại tử 2 trên tôm có dấu hiệu lâm sàng là gan teo, dai và sậm màu, cấu trúc ống gan hoàn toàn biến mất, số lượng các tế bào gan tụy giảm chỉ còn lại sự hiện diện của vô số tế bào máu bao bọc xung quanh khối hoại tử Bên trong khối hoại tử

là các tế bào chết và vô số trực khuẩn Gram âm khi quan sát tiêu bản nhuộm bằng Giemsa và nhuộm Gram Có hiện tượng melanin hoá xung quanh khu vực hoại tử này

Lê Hữu Tài và ctv (2011) phân tích mô bệnh học và siêu cấu trúc của hội chứng HTGT trên tôm nuôi ở ĐBSCL đã cho rằng tác nhân tiên phát gây nên dấu hiệu hoại tử 1 có khả năng là các hoá chất hoặc độc tố trong ao nuôi

Sự nhiễm khuẩn gây nên dấu hiệu hoại tử dạng 2

Nhưng giả thuyết cho rằng cypermethrin gây ra AHPNS vẫn chưa thuyết phục vì AHPNS cũng đã xảy ra ở những nơi mà cypermethrin đã bị cấm sử dụng từ lâu như Thái Lan (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012) và kết quả kiểm nghiệm 14 mẫu nước và bùn trong 5 đợt thu mẫu tại các vùng nuôi tôm của tỉnh Tiền Giang từ ngày 18/4/12 đến ngày 18/5/12 đều không phát hiện dư lượng Cypermethrin (Nga Thi, 2012) Đến giữa tháng 8/2012 tại Hội thảo bệnh HTGT cấp tính ở Bangkok có kết luận cypermethrin không gây AHPNS

sau khi tiến hành thử nghiệm Hội thảo này cũng thông tin thêm là không tìm thấy các loại virus thường gặp như WSSV, YHV, IMNV hoặc TSV khi chẩn đoán bằng PCR

Lê Hồng Phước và ctv (2011) đã nghiên cứu diễn biến của hội chứng HTGT trong ao nuôi tôm thâm canh ở huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng cho thấy HTGT xuất hiện rất sớm trên tôm nuôi (sớm nhất là 17 ngày tuổi) Tỷ lệ xuất hiện HTGT trong ao nuôi có tôm chết dao động từ 9-90%

Theo Chalor Limsuwan (2012) cho biết AHPNS gây chết tôm nuôi ở Thái Lan giai đoạn 15-50 ngày đầu sau khi thả giống và không liên quan gì đến các bệnh khác thường xuất hiện trên tôm (như đốm trắng, đầu vàng, teo gan) Tôm bị AHPNS thường chết trong giai đoạn 15-20 ngày sau khi thả giống (Thành Công, 2012)

Flegel et al., (2012) qua nghiên cứu thấy tôm bệnh ở Việt Nam có sự hiện diện một số vi khuẩn mới (ít nhất 5 loài vi khuẩn, Delftia và Ralstonia thuộc nhóm Burkholderiales), và trên mẫu tôm bệnh có sự hiện diện của bacteriophage Theo Đại học Cần Thơ, một số mẫu thu được khi phết gan tụy trên kính có sự hiện diện rất nhiều vi khuẩn Và hướng nghiên cứu tiếp theo là phân lập loại vi khuẩn gì trên gan tôm bệnh (Cao Thành Trung, 2012)

Nguyễn Văn Hảo (2012) cho rằng AHPNS xảy ra do sự kết hợp của hai yếu tố, đầu tiên là do độc tố làm mất chức năng của gan, sau đó nhóm vi khuẩn Vibrio sẽ xâm nhập gây tôm chết hàng loạt và lan rộng (Thành Công, 2012)

Ban đầu Lightner cho rằng nguyên nhân gây ra EMS/AHPNS là do độc

tố từ môi trường nuôi, thức ăn và vi khuẩn nhưng sau khi tiến hành các thí nghiệm thì ông khẳng định thức ăn và độc tố không gây ra AHPNS Trong một báo cáo của ông vào năm 2012 cũng thông tin rằng gan tụy tôm bị hoại tử

và rối loạn chức năng khi mắc AHPNS Giai đoạn cuối có sự bong tróc các tế bào biểu mô hình ống, tế bào máu ở tập trung giữa ống gan tụy và nhiễm trùng

vi khuẩn thứ cấp (Vibrio spp)

Khi nghiên cứu nguyên nhân gây hội chứng HTGT trên tôm nuôi người

ta nhận thấy tôm giống có chất lượng xấu (nhiễm Vibrio, có dấu hiệu bất thường gan tuỵ, thậm chí đã bị HTGT cấp) và tôm được thả nuôi trong điều kiện môi trường bất lợi (hiện diện của thuốc bảo vệ thực vật, oxy hoà tan thấp,

độ mặn cao, ô nhiễm hữu cơ ) (Nhật Hồ, 2012)

Các nghiên cứu đã được triển khai trên nhiều nhân tố như nguồn giống, môi trường, độc tố, vi sinh vật, dịch tễ nhằm tìm ra nguyên nhân gây bệnh, giải pháp chẩn đoán và phòng trị (Phạm Văn Tuấn, 2012 trích dẫn bởi Cao Thành Trung, 2012)

2.3.5 Phương pháp phòng và quản lý bệnh

Trung Quốc có giải pháp để hạn chế bệnh này là nuôi luân canh, nuôi mật độ thấp (Cao Thành Trung, 2012) Do chưa biết tác nhân gây bệnh nên phòng bệnh tổng hợp là chủ yếu Để hạn chế bệnh HTGT, Viện nghiên cứu

2.4 Phương pháp kính phết

Muốn quan sát rõ hình dạng vi khuẩn thường phải nhuộm màu cho vi khuẩn và quan sát dưới kính hiển vi Phương pháp nhuộm Gram và Giemsa thường được dùng trong thủy sản giúp ta phân biệt, quan sát hình dạng và sự phân bố của vi khuẩn, kí sinh trùng Nhuộm Gram còn giúp phân biệt hai loại

vi khuẩn Gram dương và âm dựa trên sự khác biệt cấu tạo thành tế bào Ngoài

ra nhuộm Giemsa còn được dùng để quan sát và phân biệt các tế bào máu

Kính phết máu tôm được thực hiện bằng cách rút máu tôm, phết lên lame kính rồi soi tươi hoặc nhuộm Gram hay H&E để kiểm tra hình thái hồng cầu, sự hiện diện của vi trùng và kí sinh trùng trong máu (Graindorge và Flegel, 1999 trích dẫn bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011) Những biến đổi như nhân bị co lại thường có liên quan đến bệnh Vibrio hoặc đầu vàng Nhân bị vỡ

và có nhiều thể vùi trong tế bào chất là biểu hiện đặc trưng của sự nhiễm virus YHV Vi bào tử trùng (Microsporidium) cũng thường được tìm thấy trong máu Kính phết mẫu gan tụy, cơ và cơ quan sinh dục được thực hiện bằng cách đặt mẫu lên lame cho vào một giọt dd cố định Davidsion, phết đều, để khô và nhuộm H&E Phương pháp này có thể phát hiện các thể ẩn của virus trong trường hợp tôm bị nhiễm nặng Ngoài ra cũng có thể phát hiện nhóm Vibrio và

vi bào tử trùng (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011)

Phương pháp nhuộm nhanh bằng Malachite green (MG) 0,05-0,1% được Lightner et al đề ra năm 1983 nhằm phát hiện nhanh các thể ẩn của MBV trong vòng 5 phút nhưng có hạn chế là chỉ kiểm tra được những con tôm

bị nhiễm bệnh cấp tính hoặc trước cấp tính trong một quần đàn có tỷ lệ nhiễm cao (Lightner et al., 1989 trích dẫn bởi Quảng Thị Mỹ Duyên, 2009) Kính phết mẫu gan tụy nhuộm bằng Malachite green (Lightner, 1996) hiện đang được sử dụng rất phổ biến để phát hiện virus MBV và HPV ở tôm sú (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011)

Cũng theo Quảng Thị Mỹ Duyên (2009) khi so sánh kết quả phát hiện MBV trên tôm sú bằng phương pháp nhuộm MG, nhuộm H&E và PCR thì cho thấy đối với mẫu tôm giống bị nhiễm MBV nặng khi được phát hiện bằng

3 phương pháp đều cho kết quả dương tính Nhưng đối với mẫu tôm giống bị nhiễm nhẹ hoặc nhiễm vừa thì có sự sai khác nhau về kết quả PCR thì tiện lợi hơn hai phương pháp còn lại vì có thể phát hiện mầm bệnh ở bất kỳ giai đoạn nào Nhưng hai phương pháp nhuộm thì lại có ý nghĩa trong việc chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh, đặc biệt nhuộm MG thì thời gian thực hiện ngắn và đơn giản hơn nhuộm H&E

2.5 Phương pháp PCR

Kỹ thuật PCR là kỹ thuật được phát minh và đặt tên bởi Mullis và các cộng sự năm 1985 dựa trên nguyên tắc tổng hợp một đoạn DNA mới từ mạch khuôn DNA với sự hiện diện của những mồi chuyên biệt, enzyme tổng hợp DNA, các nucleotid tự do, dd đệm theo các chu kỳ nhiệt Đây là kỹ thuật rất nhạy và cho phép xác định nhanh chóng sự có mặt của các gen trong tế bào PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kì lập lại nối tiếp nhau Mỗi chu kì gồm ba bước:

- Bước 1 (giai đoạn biến tính): phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử DNA, thường là 92-95oC trong 30-60 giây Mạch đôi DNA tách ra thành hai mạch đơn tạo điều kiện cho sự bắt cặp các đoạn mồi

- Bước 2 (giai đoạn gắn mồi): trong bước này nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt

độ nóng chảy, các đoạn mồi sẽ bắt cặp mạch đơn DNA khuôn ở vị trí bổ sung Nhiệt độ này dao động từ 45-65oC khoảng một phút Nhiệt độ này có thể thay đổi nếu thay đổi cặp mồi

- Bước 3 (giai đoạn kéo dài): nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất Lúc này các đoạn mồi đã bắt cặp DNA khuôn mẫu sẽ được kéo dài Thời gian bước này tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

Mỗi chu kì trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lặp lại làm tăng gấp đôi mẫu của lần trước Đây là sự lập lại theo cấp số nhân, tối đa là 40 chu

Kỹ thuật mô bệnh học có vai trò quan trọng trọng nghiên cứu bệnh trên các động vật thủy sản đặc biệt là tôm Hầu hết các bệnh thường gặp đều cần chẩn đoán xác định bằng phương pháp này Tuy nhiên nó có những hạn chế nhất định như thời gian chẩn đoán chậm… Phương pháp mô học chỉ nên sử dụng kết hợp với tất cả các dữ liệu về môi trường và sức khỏe tôm để xác định tác nhân gây bệnh (Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003)

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian thực hiện đề tài

Từ tháng 6 năm 2012 đến tháng 5 năm 2013

3.2 Địa điểm thực hiện

Phòng thí nghiệm của Bộ môn Bệnh Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ

3.3 Vật liệu nghiên cứu

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Tôm sú giống được các nông dân từ một số tỉnh ở ĐBSCL mang đến bộ môn Bệnh học thủy sản-Trường Đại học Cần Thơ xét nghiệm

3.3.2 Dụng cụ

- Vợt lưới, pen, kim mũi nhọn, kính hiển vi, eppendorf, ống nhỏ giọt, viết lông dầu, cốc thủy tinh, lame, lamella

- Keo nhựa, khuôn đúc mẫu, cassette, viết chì, sổ ghi chép, găng tay, máy

xử lý mô, máy đúc khối, máy cắt lát mỏng (Microtome), khay nhuộm mẫu, kính hiển vi, tủ lạnh, tủ hút, máy ảnh,…và các dụng cụ cần thiết để làm tiêu bản mô

- Máy chu kì nhiệt, máy so màu quang phổ, pipet tự động, que nghiền, máy lắc, máy ủ, máy li tâm, máy điện di, lò vi ba, cân điện tử, bàn đọc UV, máy chụp hình gel…

Cl2, mồi, nước cất, chloroform, 95% ethanol, nước cất, iso-propanol, agarose,

dd nạp mẫu Loading dye 6X, dd điện di TAE, ethidium bromide,

Trình tự mồi sử dụng trong quy trình PCR

IHHNV I 2814 5'-TAA TGA AGA CGA AGA ACA CGC CGA AGG-3'

I 3516 5'-TGG GTA GAC TAG GTT TCC AAG GGA TGG TT-3'

Bảng 1.1 Trình tự mồi sử dụng trong qui trình PCR phát hiện IHHNV

(Yang et al., 2006)

Tên mồi Trình tự

MBV 361F 5′-TCC AAT CGC GTC TGC GAT ACT-3′

361R 5′-CGC TAA TGG GGC ACA AGT CTC-3′

Bảng 1.2 Trình tự mồi sử dụng trong qui trình PCR phát hiện MBV

(Belcher and Young, 1998)

3.4.1 Phương pháp nhuộm nhanh phát hiện MBV (Lightner et al., 1983)

Chỉ dùng tôm còn sống Số tôm quan sát trên mỗi mẫu là 25-40 con Dùng pen và kim mũi giáo tách giáp đầu ngực của tôm và lấy gan tụy đưa lên lame tán mỏng Nhỏ 1 giọt dd MG lên và quan sát các thể ẩn MBV dưới kính hiển

vi ngay trong vòng 5 phút Các thể ẩn MBV có dạng cầu, đơn lẻ hay kết thành chùm Nhân và giọt lipid của tế bào không bắt màu dưới kính hiển vi

Theo Lightner và Redman, 1983 (trích dẫn từ Thanh Dung, Trần Thị Tuyết Hoa và Phạm Minh Đức, 2008) chia cường độ cảm nhiễm MBV ra làm

với lame rồi kéo một lần từ đầu đến cuối lame Sau khi khô, cố định lame đã phết bằng acid 1% trong 1

phút Tiếp tục để khô

11

3.4.2.2 Nhuộm Gram (Gram, 1884 có chỉnh sửa)

Tiêu bản được nhuộm Gram theo trình tự:

o Bước 1: nhỏ dd Crystal violet (dd 1) Để 1 phút Rửa lại với nước cất cho hết màu tím trên lame Vẩy cho ráo Lưu ý không xịt nước vào ngay vết phết vi khuẩn

o Bước 2: nhỏ dd Iodine (dd 2) lên Để 1 phút Nghiêng lame cho trôi hết dd 2

o Bước 3: tẩy màu bằng cách nhỏ từ từ dd cồn-aceton (dd 3) đến khi giọt nước cuối cùng trên lame không còn màu tím Rửa và vẩy cho ráo nước Lưu ý không nhỏ dd 3 liên tục vì sẽ làm trôi phẩm nhuộm

3.4.3.3 Xử lý mẫu

Quy trình xử lý mẫu mô được cài đặt trong máy xử lý mô tự động gồm các giai đoạn: loại nước, làm trong mẫu và tẩm paraffin (Phụ lục B)

3.4.3.4 Đúc khối

Cho mẫu đã xử lý vào khoang chứa paraffin nóng chảy trên máy đúc khối, để trong paraffin 30 phút Cho một ít paraffin nóng chảy vào khuôn inox,

bỏ mẫu vào và chỉnh cho ngay ngắn Đặt khuôn nhựa có kí hiệu mẫu lên trên Đưa khuôn inox qua ngăn làm lạnh nhanh để paraffin rắn lại

3.4.3.5 Cắt mẫu

Gắn khối mẫu vào máy sau đó điều chỉnh độ dày lát cắt Có thể bắt đầu với những lát cắt 12-16µm, sau khi cắt bằng mặt khối mẫu đến vị trí mong muốn, điều chỉnh độ dày về 2µm

3.4.3.6 Dán mẫu lên lame

Đưa những lát cắt vào khay nước ấm (40-50oC) Chọn những đoạn mẫu mong muốn, dùng lame đã thoa dd Mayer albumin vớt lát cắt ra khỏi nước Sau đó sấy lame mẫu với bàn sấy ở 37oC trong 12 giờ

- Nung nóng các tuýp ở 100°C trong 10 phút

- Để tuýp nguội trong vài phút, sau đó ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 5 phút

- Chuyển 100µl dịch nổi chứa DNA sang tuýp mới có sẵn 200µl cồn 100%

- Trộn đều mẫu, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút

- Bỏ phần dịch nổi và làm khô viên DNA

- Hòa tan viên DNA bằng 500µl nước cất vô trùng

Đo hàm lượng DNA

Hàm lượng DNA của mẫu được xác định bằng máy so màu quang phổ

sử dụng bước sóng 260nm Sử dụng 500µl nước cất để tạo mẫu blank, đo mẫu blank trước khi đo mẫu DNA Dùng 500µl dd DNA li trích (pha loãng với nước cất tỉ lệ 5:495) để đo Đọc kết quả trên máy Tính hàm lượng DNA theo công thức: [DNA] (µg/ml) = Giá trị đo được ở 260 nm x 50 x độ pha loãng

3.4.4.2 Ly trích RNA

- Lắc nhẹ, ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút rồi rút bỏ iso-propanol

- Rửa phần viên bằng 0.5ml methanol 75%, sau đó ly tâm ở 7500 vòng/phút trong 5 phút, sau đó rút bỏ ethanol và làm khô phần viên

- Hoà tan phần viên với nước cất tiệt trùng

Hoà tan RNA

Do các mẫu có nguồn gốc khác nhau có hàm lượng RNA khác nhau,

cần điều chỉnh nồng độ RNA bằng cách hoà tan với lượng nước cất:

3.4.4.3 Thực hiện phản ứng khuếch đại

a Quy trình PCR phát hiện IHHNV (Yang et al., 2006)

- Trộn đều hóa chất theo các thành phần như bảng trên

- Cho 24 µl hỗn hợp vừa trộn vào ống eppendorf 0,5 ml đã được ghi tên

- Thêm 1 µl ADN khuôn hoặc mẫu đối chứng vào mỗi phản ứng

- Thực hiện phản ứng PCR theo chu kỳ nhiệt:

Giữ ở 20oC cho đến khi kết thúc

b Quy trình PCR phát hiện MBV (Belcher and Young, 1998)

Cách chuẩn bị phản ứng

Các đối chứng: Trong mỗi lần khuếch đại nên kèm theo 2 đối chứng

dương (DNA mạch khuôn của MBV) và các đối chứng âm (không có mạch khuôn của MBV và DNA mạch khuôn của tôm)

Mồi 20a2 (20 pmol) 10 pmol 0,5 μl

Mồi 20s9 (20 pmol) 10 pmol 0,5 μl

Taq DNA polymerase (5 UI/μl) 1,5 UI 0,3 μl

Lặp lại chu kì trên 30 lần

72oC trong 5 phút cho kết thúc ở vòng cuối cùng

c Quy trình phát hiện YHV và GAV bằng kit IQ2000YHV/GAV

(thực hiện theo tài liệu hướng dẫn của nhà sản xuất Farming Intelligene Corporation, Đài Loan)

Thành phần hóa chất sử dụng trong quy trình phát hiện YHV và GAV

bằng kit IQ2000YHV/GAV

Gồm có dd đệm cho phản ứng, dNTPs, và mồi chuyên biệt của YHV/GAV

Gồm có dd đệm cho phản ứng, dNTPs, và mồi chuyên biệt của YHV/GAV

DNA moclecular weight marker

848 bp, 630 bp & 333 bp

RNA Extraction Solution

Chuẩn bị hoá chất phản ứng

Phản ứng RT-PCR 1: 8µl/phản ứng

Chuẩn bị các chất cần thiết sau:

- RT-PCR Pre-Mix reagent 7.0µl

- Iqzyme DNA Polymerase 2Ul/µl 0.5µl

- Reverse Transcription (RT) Enzyme Mix 0.5µl

Phản ứng nested PCR : 15µl/phản ứng

Chuẩn bị các chất cần thiết sau:

- Nested Pre-Mix reagent 14µl

- Iqzyme DNA Polymerase 2UI/µl 1µl

- Pipet 8µl RT-PCR cho vào túyp phản ứng 0.2ml đã được đánh dấu

- Thêm 2µl mẫu RNA cần xét nghiệm hoặc mẫu đối chứng vào mỗi phản ứng trộn đều

- Sau khi trộn, mẫu đã sẵng sàng để điện di

Ghi chú: nên sử dụng 10 bản sao/µl mẫu đối chứng cho mỗi lần khuếch đại để kiểm soát độ nhạy của phản ứng Nên dùng Yeast tRNA (kèm theo kit)

để pha loãng mẫu đối chứng dương Cần phải giữ mẫu đối chứng dương ở 20°C khoảng 1 tuần trước khi sử dụng

di, đổ dd TAE 0,5X cho ngập mặt thạch

Quá trình điện di: lấy 10µl mẫu cần điện di trộn đều với 1 giọt dd nạp mẫu (thay đầu tip sau mỗi lần sử dụng) Cho mẫu vào giếng theo thứ tự, kèm theo 1 giếng chứa thang DNA Chạy điện di bằng dòng điện 100-150Volt Ngừng điện di khi màu xanh đậm di chuyển khoảng 1/2 đến 2/3 gel, lấy khuôn ra khỏi bồn điện di và quan sát kết quả với thiết bị chụp và xử lí ảnh gel

3.4.4.5 Đọc kết quả

Đọc kết quả bằng máy đọc gel Dựa vào thang ADN 1kb plus để xác định trọng lượng phân tử của sản phẩm khuếch đại

a Quy trình PCR phát hiện IHHNV

Mẫu hiện lên vạch 703 bp là mẫu dương tính với IHHNV

b Quy trình PCR phát hiện MBV

Mẫu hiện lên vạch 361 bp là mẫu dương tính với MBV

c Quy trình PCR phát hiện WSSV

Mẫu hiện lên vạch 570 bp (ở bước 2) là mẫu dương tính với WSSV

Vạch của mẫu ADN chiết tách tốt (nội chuẩn) là 240 bp

d Quy trình chẩn đoán YHV/GAV theo kit IQ2000

1 Mẫu dương tính và mẫu đối chứng dương hiện ra những vạch trên gel khi chẩn đoán YHV/GAV theo kit IQ2000

Hình 3.1 Minh họa kết quả chạy PCR chẩn đoán YHV/GAV theo kit

IQ2000

- Cột 1: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 2000 bản sao/phản ứng

- Cột 2: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 200 bản sao/phản ứng

- Cột 3: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 20 bản sao/phản ứng

- Cột 4: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 2000 bản sao/phản ứng

- Cột 5: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 200 bản sao/phản ứng

- Cột 6: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 20 bản sao/phản ứng

- Cột 7: Mẫu nhiễm YHV nặng

- Côt 8: Mẫu nhiễm YHV nhẹ

- Cột 9: Mẫu nhiễm GAV nặng

- Côt 10: Mẫu nhiễm GAV nhẹ

- Cột 11: Mẫu âm tính YHV/GAV