Tuy nhiên trong sản xuất hầu hết các nhà máy đều không sử dung glucose tỉnh khiết, đa số đều sử dụng những nguyên liệu rẻ tiền khác như mật rỉ hay sản phẩm từ sự thủy phân tỉnh bột.. Lê
Trang 1Gluconic acid -
GVHD: PGS TS Lê Văn Việt Mẫn
CHƯƠNG 1: NGUYÊN LIỆU
Glueose được sử dụng là nguồn carbon cho hầu hết các loài vi sinh vật sản xuất gluconic acid Tuy nhiên trong sản xuất hầu hết các nhà máy đều không sử
dung glucose tỉnh khiết, đa số đều sử dụng những nguyên liệu rẻ tiền khác như
mật rỉ hay sản phẩm từ sự thủy phân tỉnh bột Nguyên liệu sử dụng trong bài báo cáo là mật rỉ
1.1 Mat ri
Mật rỉ ( rỉ đường ): là phế liệu chứa đựng nhiều đường không kết tỉnh trong sản xuất đường từ mía hoặc củ cải đường Thông thường tỷ lệ rỉ đường trong sản xuất đường mía chiếm 3 - 3.5% trọng lượng mía, tùy thuộc vào giống múa, điều kiện trồng trọt, công nghệ
Thành phần mật rỉ dao động như sau: nước: 15 - 20%, chất khô: 80 - 85%,
trong đó có 60% là đường (40% là đường saccharose, 20% 1a fructose va glucose, còn 40% còn lại là chất phi đường, thành phan cụ thể cho dưới bảng sau:
Bảng 1: Thành phần các hợp chất trong mật rí
Trong mật rỉ luôn có mặt vi sinh vật với mật độ rất lớn, thường gặp nhất là
những vi sinh vật gây màng và gây chua Vì vậy trong sản xuất người ta thường
dùng fluosilicate natri với nông độ 2 %o so với trọng lượng mật rỉ để dễ bảo quản
Trước khi đưa mật rỉ vào sản xuất cần phái qua giai đoạn xử lý mật rỉ để tách tạp chất, đồng thời ức chế hoặc tiêu diệt hệ vi sinh vật có trong mật rỉ Có nhiều quy
trình khác nhau để xử lý mật ri Ví đụ như theo Rehm và cộng sự (1996) thì đầu
tiên mat ri sẽ được pha loãng với nước, sau đó bố sung acid sulfuric và xử lí nhiệt
ở 90°C để ức chế vi sinh vat Tiếp theo, bễ sung phosphate với hàm lượng 1-2%
để tách cặn lắng rồi làm nguội Ở một qui trình xử lí khác, người ta sẽ pha loãng
mật rỉ, gia nhiệt rồi ly tâm để tách bỏ những chất không hòa tan
Trang 3
Trang 21.2 Các phụ liệu khác
1.2.1 Nước: được sử dụng đề pha loãng mật rỉ về giá trị nồng độ chất khô cho quá trình lên men Nước phải đạt các tiêu chuẩn như tiêu chuẩn nước uống
Bảng 2: Chỉ tiêu chất lượng đối với nước dùng để ăn uống,
nước dùng cho các cơ sở dé chế biễn thực phẫm ( QCVN 01:2009/BYT )
E coli hoac Coliform chiu nhiét vi khuẩn /100ml 0
1.2.2 Chất chính pH và acid hóa
- Chỉnh pH của rỉ đường về pH lên men 6.5 dùng tác nhân là H;SO¿,
- Chỉnh pH trong quá trình lên men trong khoáng 4.5 - 6.5 dùng tác nhân trung hòa là CaCO3
- Acid héa dung dich sau lên men để thu sản phẩm dùng H;SO¿
Bảng 3: Các chỉ tiêu của CaCO; và H;SO¿a
Trang 3
Gluconic acid -
GVHD: PGS TS Lê Văn Việt Mẫn
1.2.3 Chất phá bọt
Sự hấp thu oxy của vi sinh vật là một quá trình rất phức tạp, con đường mà
oxy chứa trong một bọt khí phải đi qua đẻ tiếp xúc được với một enzyme chứa
trong tế bào vi sinh vật ở thể lơ lửng trong môi trường bị ngăn cản đo sự tồn tại
của những diện tích tiếp xúc có bề mặt từ vài micromct tới vài milimet, kích thước
của các bọt khí này phụ thuộc chặt chẽ vào tốc độ khuấy trộn của môi trường (tốc
độ khuấy cao đi đôi với kích thước bọt khí nhỏ) Chất phá bọt thực chất là làm giảm sức căng bề mặt của giao diện khí/ lỏng Như vậy, chất để phá bọt phải là một chất hoạt động bề mặt, phá hủy các bọt khí sinh ra góp phần tăng hàm lượng oxy hòa tan trong quá trình lên men
Trong môi trường lên men gluconic acid đo nồng độ glucose trong môi trường lên men lớn, dẫn đến môi trường có độ nhớt cao, khi đó các bọt không khí
dé tái hợp lại thành những bọt không khí lớn hơn (nắm mốc không thể hấp thu)
Dé tránh hiện tượng này trong sản xuất thường dùng ancol amylic 1/80.000 hay
natri oleat 1/25.000 làm chất phá bọt
1.2.4 Các chất đinh dưỡng cho nắm mốc
- Nguồn N: (NH¿);ŠSO¿ hoặc (NH¿);HPO¿,
- Nguôn P: dung dịch H;POa 70%
- Nguôn Mg: MgSO¿.7HO
Trang 5
Trang 4Chương 2: GIÓNG VI SINH VẬT 2.1 Giới thiệu về Aspergillus
Đây là loài nấm mốc hiếu khí Tế bào có vỏ, trong tế bào chất có nhân và
nhân con, có các tiểu thể Khi phát triển tế bảo nắm mốc thành hệ sợi: khuẩn ty ăn
sâu vào cơ chất — khuan ty khí sinh Giống mốc này có hệ khuẩn ty (hệ sợi) không
màu hoặc vàng nhạt Có hai loại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh phát triển trên bề mặt
môi trường và khuẩn ty dinh đưỡng ăn sâu vào môi trường đặc (còn gọi là khuẩn
ty cơ chất) Khuẩn ty phân nhánh có nhiều vách ngăn tế bào Tế bào có hạch nhân
Cuống đính bào tử không phân nhánh dài và thẳng đầu, có nhiều cuống nhỏ Tùy loại có cuống nhỏ 1 tầng hoặc 2 tầng Tất cả cuống nhỏ có hình chai và gọi là tế bào hình chai, khi trưởng thành sinh ra các đính bào tử ở đầu cuống Các đính bào
tử xếp thành chuỗi đài và càng tận cùng càng lớn dần Những chuỗi đính bào tử
xếp đối xứng từng quả tròn trên chớp nang trông như đóa hoa cúc Đính bào tử
điên hình thường hình câu, đơn bào, đa hạch bê mặt xù xì Do cuông sinh bào tử
và đính bào tử có màu sắc nên màu của chúng trở thành màu của khuẩn lạc mốc Các khuẩn lạc của mốc Aspergilfus thường là: vàng, vàng lục, đen, tro, nâu Dic diém cua giéng Aspergillus là giàu các enzyme thủy phân ngoại bào (amylase, protease, pectinase, lipase ) Hiện nay người ta sử dụng rộng rãi loài Aspergilus vào công nghiệp thực phẩm và một số ngành khác đẻ thu acid hữu cơ
và enzyme Một trong những chủng được nghiên cứu kỹ trong phòng thí nghiệm
và các quá trình sản xuất là Aspergilus niger Chủng này trong quá trình phân hủy các glucid có khả năng tích lũy ở môi trường một lượng acid hữu cơ và enzyme khá lớn
2.2 Giới thigu vé Aspergillus niger
< Nhom Aspergillus niger
Gidng Aspergillus
s* Họ Aspergiliaceae
s* Bộ Moniliales
s* Lớp Fưngi imperƒfecti
Vi tri phân loại của Aspergilus niger:
+* Thuộc bộ các khuẩn (Plectascales), họ Aspergillaceae, lop Ascomycetes
* Hội nghị Utrecht năm 1952 công nhận như sau: Ở giai đoạn đỉnh bào tử - giai đoạn phát triển chính của A miger người ta xác định chúng thuộc bộ Moniliales, lop nam bat toàn (Deuteromycetes) Ở giai đoạn hình thành túi bào tử thì chứng thuộc bộ Plecfascales, lớp nam tai Ascomycetes
Trang 6
Trang 5Gluconic acid x
GVHD: PGS TS Lé Van Viét Man
Hinh 1: Nam méc Aspergillus niger
Aspergillus niger phát triển mạnh trên môi trường thach malt va tao thành bào tử dài khoảng 7-10 micromet, khuẩn lạc màu đen, trên những cuống bào tử có
vô số những bào tử Cuống bảo tử có hai phan: phan thứ nhất dài và to, khoảng 2-3
micromet có màu nâu nhạt hay hoàn toàn đen
Chủng nắm mốc này có thể chịu được pH thấp 2.1-2.2, nhiệt độ thích hợp
là 30-33°C va dé phát triển trên môi trường tỉnh bột
Aspergillus niger được dùng rộng rãi trong công nghiệp thực phâm để thu
nhận các acid hữu cơ như citric acid, øluconic acid, fumaric acid Ngoài ra nó
còn ứng dụng để thu nhận các chế phẩm enzyme như: amylase, protease, pectinase, glucoseoxydase
2.3 Tiêu chẵn chọn giống
s* Là chủng nắm mốc thuần khiết, không lẫn các chung vi sinh vật khác s* Khả năng thích ứng cao, sinh sản mạnh
s* Lên men đường glucose với hiệu suất cao, thời gian lên men ngắn, sản
phẩm chính là gluconic acid chiếm tỷ lệ cao
Sau khi lên men dễ tách sinh khối và sản phẩm
Kha nang bao quan dé dàng, các đặc tính di truyền được bảo tồn trong suốt thời gian bảo quản và sử dụng
2.4 Môi trường nuôi cấy
Trong sản xuất gluconic acid môi trường nuôi cấy cần đáp ứng các yêu cầu Sau:
s* Nông độ glucose ở mức cao: 150 — 250gL”
s*' Hàm lượng nitơ thấp: khoảng 20 mM nitơ
“+ Ham lượng phospho thấp
+* Bồ sung thêm các chất khoáng, theo Bern Haure (1928) cần thêm 0.7 — 13
Trang 6Chương 3: QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ
Trong quá trình sản xuất gluconic acid tùy thuộc và tác nhân trung hòa là NaOH hay CaCO:, điều kiện lên men mà sản phẩm thu nhận có thê là các sản phẩm khác nhau như gluconic acid, calcium gluconate, sodium gluconate Vì mỗi sản phẩm đều có những vai trò hệt sức khác nhau trong lĩnh vực dược phầm hay trong lĩnh vực thực phâm
3.1 Sơ đỗ khối
Trong khuôn khổ bài báo cáo chúng tôi có đưa ra 3 quy trình công nghệ
khác nhau dựa theo sản phâm thu nhận
Quy trình công nghệ sắn xuất gluconic acid và calcium gluconate
Trang 8
Trang 8Chương 4: GIẢI THÍCH QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ
4.1 Xử lý mật rỉ
Mục đích:
s* Tiêu diệt hệ vi sinh vật gây bệnh ngoại trừ Bacillus, Clostridium
s* Tiêu diệt / ức chê các vi sinh vật khác trong môi trường
s* Tách các chật không hòa tan trong mật rỉ
s* Vật lý: có sự thay đôi vê gradient nhiệt độ
s* Sinh học: các vi sinh vật bị tiêu diệt
Thiết bị:
Nguyên liệu
với cánh khuấy giúp cho quá trình đảo trộn nguyên liệu
Thông số công nghệ: thực hiện tuần tự theo các bước sau:
s* Pha loãng mật rỉ với nước (45 — 50%)
4 Môi trường được đun nóng đến một nhiệt độ nhất định (90 - 100°C)
s* Giữ ở nhiệt độ đó trong khoảng thời gian 45 — 60 phút
s* Làm nguội đến nhiệt độ cần thiết (33-359C đối với đa số nắm mốc)
4% Sau khi làm nguội nguyên liệu được cho qua thiết bị ly tâm để tách các tạp
chất không tan
Trang 10
Trang 9Câu tạo: thiết bị có dạng hình trụ, bên trong có bô trí các thanh chặn Khi
động cơ truyền động cho rôto bên trong quay, dưới tác động của lực ly tâm các
cấu tử không tan sẽ bị văng ra, giữ lại trên các thanh chặn
s* Hóa lý: sự chuyển pha rắn sang lỏng của các muối vô cơ trong môi trường
hòa tan vào dung dịch khi khuấy trộn
Trang 11
Trang 10Thiết bị: chọn thiết bị trộn có cánh khuấy mái chèo
Mục ích: làm gia tăng lượng tế bào (tăng sinh khối), nhằm tích lũy đủ số lượng
bào tử cần thiết để cấy vào môi trường lên men
Phương pháp thực hiện: trong công nghiệp san xudt gluconic acid quá trình nhân giông vi sinh vật thường được thực hiện băng phương pháp nuôi cấy tĩnh (nuôi cấy theo từng mẻ - batch culture) Nhân giống trên môi trường lỏng rất ít được sử dụng, lý do thời gian nuôi kéo đài và hoạt tính enzyme thường không cao so với
nuôi cây bề mặt
Môi trường thường dùng để nuôi cấy nắm mốc thường là môi trường bán
rấn với thành phân: cám gạo, cám mì, bột ngô, hạt kê, hoặc một số loại hạt, bột
kém chất lượng khác Để làm tăng độ xốp của môi trường, thường trong sản xuất
có trộn thêm các phụ liệu khác như v6 trau (15 20%)
Quá trình nhân giống tiến hành qua nhiều cấp nhân giống trên các khay đựng canh trường đã phối trộn, thực hiện trong phòng muôi cấy
Các biến đổi:
$% Sinh học: trong suốt quá trình phát triển của nắm mốc theo thời gian nhân giống trong môi trường bán rắn, nấm mốc thường trải qua 3 giai đoạn:
»> Giai đoạn 1: kéo đài 10—14h Bào tử bắt đầu trương nở và bắt đầu hô
hấp do đó nhiệt độ phòng nuôi phải được duy tri 28-30°C
> Giai đoạn 2: kéo đài 14-18h Hệ nắm bắt đầu phát triển, quá trình hô
hấp diễn ra mạnh, nhiệt độ phòng nuôi tăng nhanh Vì vậy phải thông gió và đuy trì độ ẩm môi trường khoảng 80 — 90% trong giai đoạn này
Trang 12
Trang 11Gluconic acid
GVHD: PGS TS Lé Van Viét Man
> Giai đoạn 3: kéo đài 10-12h Cường độ hô hấp giảm, nhiệt độ môi trường bán rấn giảm Nắm mốc bắt đầu sinh bào tử
** Vật lý: thành phần môi trường thay đổi, nông độ cơ chất tại mỗi điểm trên
khay nhân giông là khác nhau
Thông số công nghệ:
s* Độ ẩm của môi trường bán ran: 58-60%
+* Nhiệt độ môi trường: 28-30C
s* Thời gian nuôi: 36-72h, theo mỗi cấp nhân giống
‹* Chiều đây của lớp môi trường tốt nhất: 5—10cm
$* Thời gian kết thúc quá trình nhân giống khi thu được số lượng bảo tử cần thiết cho quá trình lên men (do nhà sản xuất đặt ra)
4.4 Lên men Muc dich: chuyén héa glucose thanh gluconic acid
Các biển đổi:
“ Vat ly: quá trình lên men làm cho nhiệt độ trong thùng lên men tăng, cần phải bế trí thiết bị làm mát trong quá trình lên men
s* Sinh học: sinh trưởng và trao đổi chất của nấm mốc, sinh khối tăng trong
giai đoạn đầu, giai đoạn sau quá trình trao đối chất dién ra, hệ quả tạo ra
gluconic acid và các sản phẩm phụ khác
“ Hoa học và hóa sinh: chuyến hóa glucose thành gluconic acid xúc tác enzyme glucose oxydase
Các yếu tô ảnh hưởng: hai yếu tố ảnh hưởng lớn nhất là oxy và pH
# Oxy: là chất nên của quá trình oxy hóa glucose
Gradient néng d6 va thé tich oxy van chuyén qua môi trường ảnh hưởng đến sự chuyển pha của oxy từ thể khí sang thể lỏng Trong quá trình sản xuất
gluconic acid đòi hỏi lượng oxy hòa tan cao, điều này là rất cần thiết cho nam mốc
chuyển hóa các hợp chất hữu cơ trong môi trường (hành năng lượng, sinh tông hợp gluconic acid Ví dụ, khi Sakurai et al tién hành sục oxy với áp suất cao lên xấp xỉ
6 bar kết quả đã duy trì được lượng oxy hỏa tan 150 ppm
Nghiên cứu cũng cho thấy rằng trong sản xuất gluconic acid A niger sử dụng oxy tỉnh khiết nhiều hơn so với khi chúng phát triển ngoài không khí Theo Kapat e: ai: khi khuấy trộn với tốc độ 420 rpm và tốc độ thông khí 0.25 vvm, nồng độ oxy hòa tan lúc nảy là tốt nhất cho sự sản sinh glucose oxidase Theo Lee
et al: dé sin xuất đạt năng suất cao thì phái sử dụng áp, suất sục khí cao (2-6 bar) lúc nảy lượng oxy hỏa tan trong môi trường có thể đạt đến 150 ppm
Nói chung trong quá trình phát triển cia hé soi nam lugng oxy cung cấp không
đều, nguyên nhân đo kích thước của các bong bóng khí ảnh hưởng nhiều bởi độ
nhớt của môi trường nuôi cấy Nên cần theo đõi trong suốt quá trình sản xuất
“> pH: 14 yếu tổ quan trọng trong việc sản xuất glueonic acid vì ở những pH khác nhau A niger cho những sản phẩm khác nhau như: citric acid , gluconic acid va oxalic acid
Trang 13
Trang 12Việc tích lũy các sản phẩm này dựa vào các giá trị pH trung bình Ví dụ pH dưới
3,5 tạo điều kiện cho sự tích tụ citric acid, để sản xuất gluconic acid thi pH = 4,5- 7,0 (pH tối ưu là 5.5) Nghiên cứu của Franke khi thu thập dữ liệu về mức độ hoạt
động của của glucose oxidase ở các cấp độ pH khác nhau và thu được kết quả : 5% (pH=2.0 ) và 35 % (pH= 3.0) hoạt tính, trên nền tảng 100 % ( pH=5.6) hoạt tính
