phát triển hệ thống tái sinh từ mô sẹo phục vụ chọn dòng chịu hạn ở cây đậu tương [glycine max (l.) merrill]

Một trong những công cụ quan trọng của tạo giống bằng công nghệ sinh học là kĩ thuật chọn dòng tế bào soma, với tần suất tạo biến di truyền ngẫu nhiên trong khoảng 10-5- 10-8, nuôi cấy m

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu tương là loại cây trồng chiến lược của nhiều quốc gia trên thế giới Hạt đậu tương có hàm lượng các chất dinh dưỡng cao, chứa 40% - 50% protein, 18% -25% lipit, chứa nhiều loại axit amin cần thiết (lizin, triptophan, metionin, xystein, lozin ) và nhiều loại vitamin (B1, B2, C, D, E, K ), là nguồn năng lượng cần thiết cho cuộc sống con người

Cây đậu tương có thời gian sinh trưởng ngắn, hệ rễ có nốt sần mang vi khuẩn cố định đạm nên cây đậu tương thường được trồng luân canh với lúa và ngô để tăng vụ và cải tạo đất bạc màu Với những giá trị to lớn đó mà cây đậu tương được trồng phổ biến ở nhiều nơi từ vùng ôn đới đến vùng nhiệt đới, từ

550 vĩ Bắc đến 550 vĩ Nam, từ vùng thấp hơn mực nước biển cho đến vùng cao trên 2000m so với mực nước biển với diện tích khoảng hơn 74,4 triệu ha [4], [9] Trong đó, chúng được trồng nhiều nhất ở Mỹ, Braxin, Argentina, Trung Quốc, Ấn Độ

Ở Việt Nam cây đậu tương được gieo trồng ở cả 7 vùng nông nghiệp trên cả nước Các giống đậu tương ở nước ta hiện nay rất phong phú gồm các giống đậu tương nhập nội, giống lai tạo, giống đậu tương đột biến và tập đoàn các giống đậu tương địa phương Các giống đậu tương địa phương đa dạng và phong phú cả về kiểu hình và kiểu gen, đây là nguồn nguyên liệu để chọn tạo giống đậu tương mới cho năng suất và chất lượng phù hợp với mục tiêu chọn giống [9]

Tạo giống đậu tương mới có năng suất cao, kháng bệnh, chống chịu với các điều kiện bất lợi do biến đổi khí hậu luôn được các nhà tạo giống quan tâm Bên cạch các phương pháp truyền thống, phương pháp tạo giống bằng công nghệ sinh học đã và đang là phương pháp mang lại hiệu quả cao trong công tác chọn giống cây đậu tương với các tính trạng mong muốn Ở Việt

Nam, tạo giống đậu tương bằng công nghệ sinh học mới đang bắt đầu được quan tâm nghiên cứu Một trong những công cụ quan trọng của tạo giống bằng công nghệ sinh học là kĩ thuật chọn dòng tế bào soma, với tần suất tạo biến di truyền ngẫu nhiên trong khoảng 10-5

- 10-8, nuôi cấy mô sẹo được xem như là nguồn vật liệu phong phú cho việc chọn dòng tế bào có tính chống chịu ở cây trồng (Lê Trần Bình và cs, 1997) [1]

Vì vậy, phát triển hệ thống tái sinh là một trong các khâu quan trọng trong việc ứng dụng công nghệ sinh học để cải tạo giống theo hướng tăng cường khả năng chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi của cây đậu tương Xuất phát từ lí do trên chúng tôi đã lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sĩ

là: Phát triển hệ thống tái sinh từ mô sẹo phục vụ chọn dòng chịu hạn ở cây đậu tương [Glycine max (L.) Merrill]

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tạo dòng đậu tương từ mô sẹo chịu mất nước bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu điều kiện tối ưu khử trùng hạt sử dụng trong nuôi cấy in vitro

- Khảo sát môi trường tạo mô sẹo phôi hạt đậu tương

- Đánh giá khả năng chịu hạn của đậu tương bằng kỹ thuật thổi khô mô sẹo ở các ngưỡng thổi khô khác nhau: 3, 5, 7 (giờ)

- Khảo sát môi trường tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh

- Sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá sự thay đổi hệ gen của các dòng đậu tương tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước

- Thiết lập sơ đồ hình cây và xác định khoảng cách di truyền giữa các dòng đậu tương nghiên cứu

- Tuyển chọn các dòng đậu tương ưu tú để tiếp tục theo dõi, đánh giá ở các thế hệ tiếp sau

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.1.1 Tình hình sản xuất đậu tương

Đậu tương có tên khoa học là (Glycine Max (L.) Merrill) thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoidace) có bộ NST 2n = 40, có

nguồn gốc từ Trung Quốc là loại cây trồng hàng năm không thấy xuất hiện ở loài hoang dại Các giống đậu tương địa phương của nước ta hiện nay được

du nhập từ Trung Quốc đã từ lâu [4]

Cây đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày, khó có thế tìm thấy loại cây nào có tác dụng nhiều mặt và hiệu quả kinh tế cao như cây đậu tương Về thực phẩm hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao 40% - 50% protein, 18% - 25 % lipit và 20% gluxit [9] Protein của đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong các loại protein của thực vật, có đầy đủ và cân đối các loại axit amin cần thiết Lipit của đậu tương chúa tỷ lệ lớn các axit béo chưa no, có hệ

số đồng hóa lớn (98%), chỉ số iot cao (120- 137) có tác dụng phòng chống bệnh biếu cổ cho người, đặc biệt đối với vùng trung du và miền núi Hạt đậu tương còn chứ nhiều khoáng và có khả năng cung cấp năng lượng khá lớn (4.710kcal), cho nên người ta đã chế biến hạt đậu tương thành hơn 600 sản phẩm khác nhau [9]

Đậu tương là cây trồng lấy hạt, là cây cung cấp dầu quan trọng nhất trong các cây lấy dầu Hiện nay qua thống kê của FAO cho thấy từ năm 1980 trở lại đây sản lượng đậu tương thế giới đã tăng lên 2 lần chủ yếu nhờ vào tăng năng suất và diện tích Trong vòng 20 năm qua diện tích gieo trồng tăng nhanh, năng suất bình quân tăng khá cao 23 tạ/ha Các nước sản xuất đậu

tương đứng đầu thế giới: Mỹ, Brazin, Argentina và Trung Quốc chiếm khoảng 90-95% tổng sản lượng đậu tương trên thế giới [9]

Ở Việt Nam, đậu tương được trồng trên cả 7 vùng nông nghiệp, trong

đó vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn nhất là 46,6%, đồng bằng Sông Hồng 19,3%, vùng Tây Nguyên 11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%, đồng bằng Sông Cửu Long 8,9%, khu Bốn 2,3% và vùng Duyên hải miền Trung 1,6% [9] Cây đậu tương chiếm một vị trí rất quan trọng trong nền nông nghiệp nước ta, đặc biệt là ở những vùng nông thôn nghèo, kinh tế chưa phát triển

Tuy nhiên, việc sản xuất đậu tương ở trong nước vẫn chưa được đầu tư cao, năng suất còn thấp, do vậy nghiên cứu cải tiến các đặc điểm nông học của các giống địa phương và tạo giống mới có năng suất cao, thích nghi với điều kiện sinh thái ở những vùng khác nhau bằng phương pháp truyền thống kết hợp với hiện đại sẽ đáp ứng được yêu cầu của thực tiễn đặt ra và đó cũng

là chiến lược quan trọng về sự phát triển cây đậu đỗ ở nước ta

1.1.2 Đặc điểm sinh học và sinh thái học của cây đậu tương

Cây đậu tương là cây trồng cạn thu hạt, gồm các bộ phận chính: rễ, thân,

lá, hoa, quả và hạt Rễ đậu tương là rễ cọc, gồm rễ cái và các rễ phụ, trên rễ có

nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, có khả năng cố định đạm

của không khí tạo thành đạm dễ tiêu [4] Các công trình nghiên cứu cho thấy những giống có khả năng cộng sinh và có đủ nốt sần thường làm cho hàm lượng protein cao, cho nên trồng cây đậu tương có tác dụng cải tạo đất Thân cây đậu tương là thân thảo, ít phân cành dạng bụi, lá đậu tương là lá kép với 3

lá chét, nhưng đôi khi cũng có 4-5 lá chét Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, có màu tím, tím nhạt hoặc trắng, hoa mọc từ nách lá hoặc ngọn, quả đậu tương thuộc loại quả ráp, thẳng hoặc hơi cong, có nhiều lông khi chín có màu vàng hoặc xám Hạt đậu tương không có nội nhũ

mà chỉ có một lớp vỏ bao quanh một phôi lớn Hạt có hình tròn hoặc bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, ovan vỏ hạt thường nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen đa số là hạt màu vàng Khối lượng hạt rất đa dạng dao động từ 20-400 mg/ hạt Màu sắc rốn hạt ở các giống là khác nhau, đây là một biểu hiện đặc trưng của giống Cây đậu tương có 2 loại hình sinh trưởng: sinh trưởng hữu hạn và sinh trưởng vô hạn, thời gian sinh trưởng thường chia ra nhóm chín sớm, trung bình và muộn

Theo thời gian sinh trưởng, các nhà chọn giống đậu tương cho rằng các giống chín rất sớm (75-90 ngày), các giống chín sớm (90-100 ngày), các giống chín trung bình (100-110 ngày), loại chín muộn trung bình (110-120 ngày), các giống chín muộn (130-140 ngày), các giống chín rất muộn (140-

150 ngày) thời gian sinh trưởng là một yếu tố rất quan trọng để lựa chọn cây trồng luân canh xen vụ Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh Trong tập đoàn giống đậu tương có những giống chỉ trồng vào vụ

hè, có những giống chỉ trồng vào vụ đông, có những giống trồng ở vụ xuân hè

và có những giống trồng thích hợp với vụ thu đông [9]

Các cây họ đậu nói chung, cây đậu tương nói riêng là cây có nhu cầu

về nước cao hơn các loại cây khác và thuộc nhóm cây chịu hạn kém Đó là do trong hạt và cây đậu tương có hàm lượng protein và lipit rất cao, để tổng hợp 1kg chất khô cần 500 – 530 kg nước, trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nước của cây đậu tương cũng khá cao 50%, trong khi đó ở ngô chỉ là 30%, lúa là 20% [9]

Hạn là hiện tượng thường xuyên xảy ra trong tự nhiên dẫn đến tình trạng thiếu nước đặc biệt đối với thực vật Khái niệm về hạn được dùng để chỉ

sự thiếu nước do môi trường gây nên trong suốt quá trình hay trong từng giai đoạn làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tương đối ổn định

trong điều kiện khô hạn được gọi là cây chịu hạn Khi nghiên cứu về đặc tính chịu hạn của cây đậu tương về phương diện sinh lý và di truyền đã cho thấy rằng các đặc tính này liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hóa keo của chất nguyên sinh, đặc điểm của quá trình trao đổi chất Tính chịu hạn của cây đậu tương là tính trạng đa gen Chúng thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau: như

sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chín sớm tương đối, cũng như bản chất di truyền của từng giống có khả năng sử dụng nước tiết kiệm trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây Căn cứ vào đặc điểm này, đậu tương được chia thành hai nhóm:

- Nhóm chịu được mất nước trong từng giai đoạn phát triển của cây

- Nhóm chịu được sự thiếu nước trong tất cả các giai đoạn phát triển của cây

1.2 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG

1.2.1 Cơ sở khoa học của chọn dòng tế bào soma

Cơ sở khoa học đầu tiên của chọn dòng tế bào thực vật là tính toàn

năng của tế bào thực vật Mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đều là

khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Điều này đã được các nhà khoa học chứng minh qua nhiều thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Cơ sở thứ hai là mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm một số lượng lớn các tế bào không đồng nhất Vì thế quần thể tế bào nuôi cấy có thể xem như quần thể thực vật mà ở đó cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gen, kiểu hình và tuổi Khi những tế bào được tái sinh thành cây sẽ thể hiện thay đổi ở mức độ cơ thể Những biến đổi di truyền tự phát xảy ra trong quá trình nuôi cấy mô tế bào được Larkin và Scowcroft (1982) gọi là ―biến di sinh dưỡng‖ hay ―biến dị soma‖ Giải thích về sự xuất hiện biến dị soma trong

điều kiện in vitro có rất nhiều ý kiến khác nhau Theo Skirvin và CS (1994),

sự xuất hiện biến dị soma có thể là sự rối loạn trong phân bào nguyên nhiễm gây ra bởi các chất kích thích sinh trưởng hoặc sự có mặt của một số chất trong môi trường nuôi cấy Sự hình thành biến dị soma cũng có thể là do đột biến về số lượng hoặc cấu trúc nhiễm sắc thể, sự tái tổ hợp trong phân bào nguyên nhiễm[13], sự phát huy tác dụng của các yếu tố di truyền vận động, sự methyl hóa ADN…[1] Các loại mô đã phân hóa tách từ cơ thể thực vật có khả năng tái sinh trực tiếp thành cây, ngoài ra chúng có khả năng phát triển trực tiếp từ tế bào mô sẹo (callus)

Trong các phương thức nuôi cấy phổ biến hiện nay thì nuôi cấy mô sẹo được nghiên cứu trên nhiều đối tượng hơn cả Mô sẹo là loại tế bào chưa phân hóa, phân chia liên tục, có khả năng phân hóa thành phôi, chồi và cây

hoàn chỉnh Mô sẹo được hình thành qua nuôi cấy in vitro từ các cơ quan sinh

dưỡng của thực vật Trong môi trường chứa chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin, điều kiện nuôi cấy thích hợp mô sẹo có thể hình thành và duy trì thông qua cấy chuyển và tái sinh Các mô sẹo sau khi xử lý bởi điều kiện cực đoan thì khả năng sinh trưởng và tái sinh cây tăng lên rõ rệt [35] Nhiều nghiên cứu cho thấy, cây tái sinh từ mô sẹo có những biến đổi di truyền phong phú [16] Tuy nhiên, với mỗi loại cây nhất thiết phải nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy tối

ưu thích hợp cho việc đánh giá hoặc tái sinh cây Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới khả năng tái sinh của cây như nguồn gốc mô sẹo [23], mức bội thể của mô sẹo, thành phần và nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thực vật được bổ sung vào môi trường nuôi cấy Theo Lê Trần Bình và CS (1995) dưới tách động của điều kiện cực đoan ở một mức độ và thời gian nhất định những mô hay tế bào thường chết, những tế bào có sức sống mới sống sót và cho hiệu quả tái sinh cao [3] Để đạt được hiệu quả trong chọn dòng bằng nuôi cấy mô sẹo người ta phải sử dụng các khối mô có kích thước nhỏ và đều nhau nhằm

hạn chế sự chọn lọc không triệt để do kích thước lớn và không đồng nhất của khối mô sẹo ban đầu

1.2.2 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

Hiện nay người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất kích thích sinh trưởng ở thực vật đó là: auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, absixic acid Những chất này được phân thành các nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng sinh lý, tuy nhiên về chức năng nhiều khi chúng có tác động chồng chéo lẫn nhau Còn là một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởng nhất định Trong nuôi cấy mô người ta thường sử dụng ba nhóm chất điều hòa sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin và giberelin

Nhóm auxin là nhóm kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh

lý học thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất Auxin là những hoocmon thực vật có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hóa cơ quan, kiểu tác động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hóa màng

tế bào Chính chức năng này đã được người ta sử dụng và đánh giá hoạt tính của nó, ví dụ bằng cách đo phần kéo dài lá mầm cây yến mạch trồng trong điều kiện tối sẽ biết được hoạt tính của auxin Nhóm auxin bao gồm các chất sau: 2,4 Diclorophenoxyacetic acid (2,4-D), α - Naphtylacetic acid (α-NAA), Indolacetic acid (IAA), trong đó 2,4- D dễ gây độc nhưng có tác dụng kích thích quá trình phân chia tế bào nên thường được sử dụng nhiều nhất [16] α -NAA có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính của enzym và ảnh hưởng mạnh đến quá trình trao đổi nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng các chất trong môi trường, α-NAA có tác dụng tạo rễ cho cây non mạnh hơn các auxin khác [16]

Nhóm giberelin là nhóm được phát hiện qua nghiên cứu bệnh lúa von,

nó tác động làm tế bào dãn và phân chia, làm cây lùn có thể cao được như

ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng Đại diện cho nhóm này là giberilic acid (GA3), chất này được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp

Nhóm cytokinin là nhóm chất kích thích sinh trưởng có tác dụng làm tăng phân chia tế bào Các cytokinin chính được dùng trong nuôi cấy mô là kinetin và 6- benzyl aminopurin (BAP) được phát hiện trong những nghiên cứu liên quan đến nuôi cấy mô

Ethylen là nhóm có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển nhưng gần đây chúng mới được coi là hoocmon thực vật Ethylen thường được sử dụng để làm quả chín đồng loạt ở chuối, ra hoa đồng loạt ở dứa, ảnh hưởng đến quá trình phân bào [16]

Abscisis acid (ABA) thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng, có tác dụng làm tăng cường khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi [16], vì vậy ABA được đưa vào môi trường tái sinh cây và mang lại hiệu quả nhất định

1.2.3 Hệ thống nuôi cấy để chọn dòng tế bào có khả năng chống chịu

Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật chọn dòng tế bào thực vật là hiện tượng các tế bào thực vật khi được nuôi cấy ở tế bào mô sẹo trong điều kiện

in vitro chúng thường có những biến đổi di truyền tự phát, được gọi chúng là

biến dị của tế bào soma (biến dị soma) Xử lý mô sẹo bằng các tác nhân phi sinh học trong điều kiện phòng thí nghiệm cho phép chọn ra những dòng tế bào thích hợp theo định hướng chọn lọc Tuy vậy, đối với mỗi loài thực vật người ta phải nghiên cứu trạng thái nuôi cấy thích hợp cho việc chọn dòng Đến nay đối với chọn dòng tế bào chịu stress ở một số loài thực vật như lúa, lạc, đậu, ngô người ta đã sử dụng một số hệ thống nuôi cấy sau đây:

Nuôi cấy mô sẹo: Mô sẹo là khối các tế bào mô mền có cấu trúc

thấp, chưa phân hóa, phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến động di

truyền cao Mô sẹo thu được bằng nuôi cấy in vitro những cơ quan bộ phận

khác nhau của thực vật như thân, lá, rễ, hoa .trong môi trường chứa chất điều hòa sinh trưởng là nhóm auxin và điều kiện nuôi cấy thích hợp Mô sẹo có thể duy trì trong môi trường nuôi cấy bằng cách cấy chuyển có định

kỳ, tuy nhiên trong thực nghiệm thấy rằng: i) mô sẹo qua cấy chuyển nhiều lần có ảnh hưởng không tốt đến khả năng tái sinh cây; ii) tăng tính biến động di truyền của mô

Các tế bào di truyền có tính ổn định di truyền khá thấp Nhiều tác giả

đã công bố nhận được cây tái sinh từ mô sẹo thông qua nhiều lần cấy chuyển

có sự thay đổi nhiễm sắc thể (dị bội, đa bội) và những biến đổi di truyền khác

Vì vậy việc nhân nhanh và duy trì tính đồng nhất di truyền thông qua nuôi cấy

mô sẹo cần thận trọng đối với nhiều loại thực vật và nhất là chỉ sử dụng mô sẹo sơ cấp để tái sinh cây hoàn chỉnh thông qua con đường tạo phôi vô tính Mặt khác những cây tái sinh từ mô sẹo với những biến đổi di truyền phong phú lại có ý nghĩa trong việc chọn giống và như vậy vật liệu di truyền của cây trở lên phong phú hơn (Lê Trần Bình và CS) [1] [2] [3], (Bùi Bảo Hoàn) [6]

Nuôi cấy tế bào huyền phù: Nuôi cấy tế bào huyền phù là nuôi cấy tế

bào đơn (single cell) hoặc cụm nhỏ tế bào (cell agregate) trong môi trường lỏng Các tế bào này cũng được tạo ra từ mô sẹo có nguồn gốc thân, lá, rễ, hoa, phôi…Muốn thu được những tế bào huyền phù nhỏ, cần sàng lọc liên tục qua các loại sàng có mắt lọc nhỏ (< 0,5 mm) Để đạt được nuôi cấy huyền phù tương đối đều nhau cần phải sàng lọc ít nhất hàng chục lần, như vậy thời gian cần thiết để thiết lập được môi trường nuôi cấy huyền phù ít nhất là 2-3 tháng Đây là điều trở ngại trong nghiên cứu với thực vật vì thời gian nuôi cấy dài các tế bào huyền phù sẽ mất khả năng tái sinh cây Lúc đó việc chọn dòng sẽ gặp khó khăn để ứng dụng cho thực tiễn tạo giống Vì vậy chỉ trong trường

hợp nhất định, khi tác nhân chọn lọc bắt buộc phải tác động lên toàn bộ bề mặt tế bào thì hệ thống nuôi cấy huyền phù mới được áp dụng

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào đơn có ưu điểm trong chọn dòng vì các tế bào có kích cỡ tương đối đồng đều nhau dưới tác động của điều kiện chọn lọc các dòng tế bào sẽ được chọn lọc một cách tương đối triệt để Điều đáng quan tâm là khả năng tái sinh của cây của các tế bào đơn là rất thấp, nhiều nghiên cứu chỉ thu được các dòng tế bào chọn lọc, nhưng không thu được cây tái sinh (Dix và CS, 1990) [33] Mặ dù vậy cũng đã có một số cây tái sinh từ nuôi cấy

tế bào huyền phù đã được công bố như cây lúa, cây thuốc lá…(Bertin và CS, 1995) [27]

Nuôi cấy tế bào trần: Tế bào thực vật bị phá bỏ toàn bộ lớp vỏ bao

bọc (cell wall) chỉ còn lại khối nguyên sinh chất được bao bọc bổi màng nguyên sinh chất được gọi là tế bào trần (protoplast) Tế bào trần có thể tách từ nhiều bộ phận khác nhau của cây nhưng chủ yếu là lá, mô sẹo, tế bào đơn và phôi

Các protoplast sau khi tách được nuôi cấy trong môi trường thích hợp thì tái tạo thành tế bào, phát triển thành mô sẹo và tái sinh thành cây hoàn chỉnh Vì trong giai đoạn chưa có thành tế bào các protoplast rất mẫn cảm với các chất trong môi trường dinh dưỡng vì vậy trong môi trường nuôi cấy giảm bớt các chất vơ cơ

Nhìn chung hạn chế lớn nhất trong nuôi cấy tế bào trần là khả năng tái sinh thấp đặc biệt lầ cây thuộc họ hòa thảo Cho đến nay đã có khoảng 70 loại cây trồng đã tách và nuôi cấy tế bào trần nhưng việc tái sinh chưa được nhiều Tuy nhiên hiện nay, nhiều tác giả tiếp tục công bố những thành công trong nuôi cấy tế bào trần, đặc biệt ở lúa Abdul và cs (1991) tách và tái sinh cây hoàn

chỉnh từ tế bào protoplast từ mô phôi non ở lúa dại (Oryza rufipogon) [22]

Ứng dụng có ý nghĩa nhất của nuôi cấy protoplast là tạo cây soma, tạo cây lai

tế bào chất thông qua dung hợp tế bào trần và hiện nay ứng dụng nhiều là để biến nạp gen.Việc chọn dòng chống chịu sử dụng phương pháp nuôi cấy protoplast còn ít được sử dụng và hầu như chưa có thành công nào đề cập đến vấn đề này

1.2.4 Các phương thức chọn dòng tế bào

Chọn dòng trực tiếp: Thông qua ưu thế về sinh trưởng hay khác biệt

thấy được về mầu sắc có thể chọn dòng tế bào từ quần thể tế bào Tế bào nuôi cấy trong dịch lỏng hoặc mô sẹo đều có thể sử dụng phương pháp này

Mô sẹo được chọn lọc trực tiếp trên môi trường có nồng độ thích hợp của các tác nhân chọn lọc như PGE (polyethylene glycol), NaCl… hoặc xử

lý các tác nhân vật lý (tia rơnghen, tia anpha, tia beta .) với cường độ nhất định Những tế bào sống sót sẽ được nhận biết thông qua quá trình sinh trưởng hay sự khác biệt thấy được về màu sắc Kiểu chọn lọc này được sử dụng nhiều trong chọn dòng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh phi sinh học [15], [31] Ngươì ta có thể chọn lọc theo kiểu bậc thang có hạn chế, bởi

vì các mô sẹo sóng sót sau quá trình chọn lọc là những mô sẹo được trải qua quá trình huấn luyện Vì vậy, có thể chọn lọc các dòng có khả năng chống chịu thực sự cần có các phân tích tiếp theo Phương pháp chọn trực tiếp thường được ứng dụng để chọn dòng chống chịu và những dòng cho sản phẩm thứ cấp

Chọn gián tiếp: Trong trường hợp này, đặc điểm của dòng được chọn

là kết quả biểu hiện khuyết tật của tế bào trên môi trường chứa tác nhân chọn lọc Thí dụ điển hình là chọn dòng thiếu enzym nitratreductaza (NR) Trong môi trường chứa ClO3 những tế bào có chứa NR sử dụng ClO3 như NO3 và khử thành clorit Clorit tác dụng như một độc tố cho nên những tế bào không

có NR mới sống sót [40], [42]

Chọn tổng thể: Các tế bào dị dưỡng thực vật thường được xử lý bằng

phương thức xử lý đột biến và nuôi trên môi trường có nhiều yếu tố dinh dưỡng cần thiết có khi lại chính là yếu tố gây đột biến Ví dụ: đột biến lặn chịu được S-2- aminpethyl cystein xuất hiện sau khi xử lý đột biến phôi nuôi cấy

1.2.5 Tái sinh cây từ tế bào nuôi cấy in vitro

Hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy mô và tái sinh cây là khâu quan trọng đầu tiên trước khi thực sự bắt tay vào công việc chọn dòng tế bào Theo Raghava

và Nabors (1985) để hoàn thiện kỹ thuật này cần chú ý những vấn đề sau:

(1) Nguồn mẫu vật nuôi cấy có các tế bào sinh trưởng với tốc độ nhanh (mô phân sinh, đỉnh sinh trưởng, mô phôi)

(2) Môi trường và điều kiện nuôi cấy: pH, chế độ chiếu sáng, nhiệt độ… (3) Nồng độ và tỷ lệ thích hợp auxin và cytokinin

(4) Số lần cấy chuyển

(5) Tỷ lệ khối mô sẹo với thể tích môi trường

(6) Sự có mặt của các yếu tố bắt buộc ở môi trường chọn lọc [46]

Tái sinh cây được xem là khâu quyết định thành công trong chọn dòng tế bào Nhiều tác giả sau khi chọn được dòng tế bào đột biến từ nuôi cấy mô sẹo

đã không tái sinh được thành cây hoàn chỉnh Đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu khả năng tái sinh cây trên nhiều đối tượng cây trồng có ý nghĩa kinh tế như lúa nước, lúa mỳ, củ cải đường [15], [26] Nguồn gốc mô sẹo là một yếu tố ảnh hưởng lớn đến khả năng tái sinh cây [6],[15] Theo Wong và

CS (1983), mức độ bội thể của mô sẹo cũng là nguyên nhân gây ra sự khác nhau trong quá trình tái sinh cây Mô sẹo đơn bội từ đoạn thân hay mảnh lá của Datura innoxia tạo chồi nhanh hơn mô sẹo cùng loại cây lưỡng bội [26]

Khả năng tái sinh cây chịu ảnh hưởng lớn bởi thành phần và nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thực vật bổ sung vào môi trường nuôi cấy Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo có hiệu quả cao ở nhiều đố tượng cây trồng khi bổ sung các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin Theo

nghiên cứu của Dix (1990), mô sẹo có khả năng phân hóa tốt trên môi trường

MS cơ bản có bổ sung α-NAA (0,4mg/l), BAP (10mg/l) Sau khi chuyển sang môi trường MS cơ bản không có chất kích thích sinh trưởng các mô này vẫn

có khả năng tái sinh cao [33]

Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy, khả năng sinh trưởng và tái sinh cây của mô sẹo sau khi xử ở các điều kiện cực đoan tăng rõ rệt [3], [10], [15], [37] Theo Lê Trần Bình và CS (1995), nguyên nhân của hiện tượng này dưới tác động của các điều kiện cực đoan ở một mức độ nhất định và thời gian nhất định những mô hay tế bào yếu thường chết, còn những tế bào có sức sống cao mới sống sót và cho hiệu quả tái sinh cao [3]

1.2.6 Một số nghiên cứu về đánh giá khả năng chống chịu và chọn dòng

tế bào soma bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã đạt được những thành công nhất định trong việc nghiên cứu khả năng chống chịu của cây trồng Nguyễn Hoàng Lộc (1992) sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo thuốc lá kết hợp với tiền

xử lý abscisic acid, manitol và saccharose đã thu được các dòng thuốc lá SC1, SC2, SC3 có khả năng chịu mất nước trên 90% trọng lượng tươi Adkins và

CS (1995) đã chọn được dòng lúa chịu hạn từ mô sẹo của giống lúa Khao Dawk Mali 105 với việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy PEG 8000 [28] Lê Trần Bình và các cộng sự khác (1995,1998) đã nghiên cứu khả năng chịu lạnh và chịu khô ở mô sẹo lúa của các giống lúa có nguồn gốc sinh thái khác nhau [2], [3]

Bằng phương pháp thổi khô mô sẹo các giống lúa CR203, CH113, Lốc, X11, C70 Đinh Thị Phòng (2001) đã thu được 271 dòng mô và 900 dòng cây xanh có khả năng chịu hạn và làm nguyên liệu cho chọn lọc [30] Nguyễn Thị Tâm (2004) khi xử lý mô sẹo của các giống lúa CR203, CS4, ML107, CN2, ĐH60 ở nhiệt độ cao (400

- 420) đã tạo ra được 197 dòng mô có khả năng

chịu nóng và 520 dòng cây xanh [17] Rudrabhatla Sairam và CS (2005) đã tổng hợp các kết quả nghiên cứu phát triển kỹ thuật tái sinh ở cây một lá mầm

và cây hai lá mầm Các kết quả nghiên cứu tái sinh cây ở đậu xanh từ phôi soma và từ mắt lá mầm phục vụ chuyển gen cũng đã được công bố bởi Jayanti Sen và Spra Guha Mukherjee (1998) [44]

Hiện nay sử dụng kỹ thuật tạo biến dị soma vào việc chọn lọc các dòng

mô sẹo chịu mất nước để tạo dòng đậu tương chịu hạn đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Tuy nhiên, đối với cây đậu tương việc tái sinh

từ ống nghiệm gặp rất nhiều khó khăn, đặc biệt là kỹ thuật tái sinh cây từ mô sẹo Những nghiên cứu tái sinh cây từ phôi non có nguồn gốc từ mô lá mầm đậu tương của Ranch và đồng tác giả (1985) [45], Wennuan Liu và đồng tác giả (1992) [51], đề cập đến hai yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh của phôi soma, xác định nguồn gốc của phôi soma trong hệ thống tái sinh và kết luận việc tạo phôi soma từ lá mầm và hệ thống tái sinh có hiệu quả cao đã được

công bố Nguyễn Thị Thư và đồng tác giả đã nghiên cứu sự tái sinh cây in

vitro qua phôi soma từ lá mầm hạt chưa chín ở cây đậu tương [21], Xiaohui

Song và đồng tác giả (2010) [54] nghiên cứu xác định QTL tiềm ẩn khả năng sinh phôi soma từ phôi non Năm 2009, Chao Yang và đồng tác gỉa đã nghiên cứu sự phát triển phôi soma và tái sinh cây ở các giống đậu tương của Trung Quốc cho thấy trên 98 giống đậu tương có 12 giống có tần số tạo phôi soma

từ 0,0% đến 85,7% được lựa chọn để nâng cao hiệu quả phôi soma và tái sinh thực vật Kết quả cho thấy nồng độ manitol, acid abscisic (ABA) và tuổi cấy phôi đã ảnh hưởng đến hiệu quả tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma, nhưng có

sự khác biệt giữa các kiểu gen của cây đậu tương [30] Muruga Loganathan

và đồng tác giả (2010) đã tái sinh thành công cây đậu tương thông qua phôi soma trực tiếp từ đỉnh chồi của phôi non [43]

1.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD ĐỂ ĐÁNH GIÁ CÁC DÒNG CHỌN LỌC

1.3.1 RAPD

Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phân tích sự đa hình chiều dài các phân đoạn ADN được nhân bản nhờ các mồi ngẫu nhiên có kích thước 10bp, do hai nhóm nghiên cứu của Williams và CS (1990) [52] và Welsh và McClelland (1991) [50] đồng thời xây dựng Đây là một kỹ thuật phát hiện chỉ thị di truyền dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Kỹ thuật RAPD là phương pháp tương đối đơn giản trong đánh giá hệ gen thực vật,

nó không những khắc phục được nhược điểm của phương pháp chọn giống truyền thống mà còn góp bảo tồn nguồn gen cây trồng và nâng cao hiệu quả chọn lọc

Các yếu tố cần thiết để tiến hành phản ứng RAPD bao gồm: ADN khuôn (DNA template); Đoạn mồi (primer): chỉ sử dụng một mồi đó là mồi oligonucleotit có trật tự nucleotit ngẫu nhiên và có chiều dài khoảng 10

nucleotit, trong đó C + G chiếm hơn 60%; ADN - polymerase (Taq polymerase): hoạt động của Taq polymerase phụ thuộc vào Mg2+, nồng độ dNTP, pH, nhiệt độ biến tính ADN; Bốn loại deoxyribonucleotit triphotphat (dNTP): ATP, TTP, CTP, GTP; Ion Mg2+

Phản ứng RAPD được tiến hành qua 3 giai đoạn: (1) Giai đoạn biến tính ADN: ở nhiệt độ 950C trong khoảng 30-60 giây làm cho hai mạch khuôn ADN tách nhau (2) Giai đoạn tiếp hợp mồi: khi nhiệt độ hạ xuống 32-400C mồi tiếp hợp và bám vào sợi ADN khuôn (3) Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được nâng lên 720 C thì các đoạn mồi đã bắt cặp với các mạch đơn sẽ được

kéo dài với sự tham gia của Taq polymerase

Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân đoạn ADN khuôn được nhân lên thành hai, các đoạn ADN được nhân bản trong mỗi chu kỳ lại

được coi là ADN khuôn cho mỗi chu kỳ nhân bản tiếp theo Vậy sau k chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2k

các đoạn ADN giống đoạn ADN khuôn ban đầu RAPD

có thể thực hiện từ 40 - 45 chu kỳ Như vậy, thành phần và các bước của phản ứng RAPD dựa trên cơ sở của phản ứng PCR chỉ khác ở chỗ nồng độ Mg2+

trong thành phần của phản ứng cao hơn, mồi đơn ngắn (10bp) có thể tiếp hợp

ở nhiều vị trí trong ADN và kết quả nhân bản được số đoạn ADN từ hai phân đoạn ADN trở lên Mỗi đoạn ADN được nhân có kích thước 100-5000bp

Sử dụng kỹ thuật RAPD không cần biết trình tự đoạn ADN cần nghiên cứu, quy trình tiến hành nhanh, chỉ cần một lượng nhỏ ADN khuôn và chỉ cần một bộ mồi có thể được sử dụng với các loài khác nhau Kỹ thuật RAPD có ưu điểm ở chỗ sử dụng các mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotit, quá trình nhân bản ADN là ngẫu nhiên Đoạn mồi này có thể bám vào bất kỳ vị trí nào có trình tự nucleotit bổ sung trên phân tử ADN hệ gen Với đặc điểm là ngắn nên xác suất đoạn mồi có được điểm gắn trên phân tử ADN khuôn là rất lớn Tùy vào nhóm, loài thực vật hay vi sinh vật mà các đoạn mồi ngẫu nhiên được thiết kế chuyên dụng Theo lý thuyết, số lượng các ADN được nhân bản phụ thuộc vào độ dài,

vị trí của các đoạn mồi, kích thước và cấu trúc ADN genome Thông thường mỗi đoạn mồi ngẫu nhiên sẽ tạo ra từ 2 - 10 sản phẩm nhân bản [52] Kết quả

là sau khi điện di sản phẩm RAPD sẽ phát hiện được sự khác nhau trong phổ các phân đoạn ADN được nhân bản Sự khác nhau đó gọi là tính đa hình Hiện tượng đa hình các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên xuất hiện là do có sự biến đổi trình tự nucleotit tại vị trí các đoạn mồi liên kết Sản phẩm khuếch đại được phân tích bằng điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide và nhuộm bằng hóa chất chuyên dụng sẽ phát hiện được sự khác nhau trong phổ các phân đoạn AND được nhân bản Vì vậy, tính đa hình thường được nhận ra do sự có mặt hay vắng mặt của một sản phẩm nhân bản [52]

1.3.2 Ứng dụng kỹ thuật RAPD để phân tích các dòng chọn lọc

Hiện nay, kỹ thuật RAPD đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của sinh học phân tử Người ta đã dùng kỹ thuật này để thiết lập bản đồ di truyền phân tử [48], [49], nhận dạng các giống cây trồng, phát hiện quan hệ phát sinh chủng loại đối với nhiều loại cây trồng, đánh giá sự thay đổi genome của các dòng chọn lọc, đánh giá hệ gen của giống và sự đa dạng di truyền của tập đoàn giống [41], [38], [52]

Từ khi ra đời kỹ thuật RAPD đã được ứng dụng rộng rãi cho nhiều đối tượng khác nhau như: đậu xanh, lúa, lạc, chuối, ngô, đậu tương trong việc đánh giá đa dạng di truyền giữa các loài và trong phạm vi một loài [19], phân tích và đánh giá bộ genome thực vật nhằm xác định những thay đổi của các dòng chọn lọc ở mức độ phân tử [15]

Để đánh giá sự thay đổi di truyền của các dòng lúa tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước, Lê Xuân Đắc, Đinh Thị Phòng đã sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên

để chỉ ra sự sai khác ở mức độ phân tử giữa các đối tượng này [5] Đánh giá tính đa dạng của một số giống lạc trong tập đoàn giống chống chịu bệnh gỉ sắt [19], với 11 đoạn mồi ngẫu nhiên, tác giả đã nhận được 109 phân đoạn ADN, trong đó có 66 phân đoạn đa hình, chiếm 60,6% Điều này cho thấy, trong phạm vi của mỗi phản ứng RAPD giữa 33 giống lạc nghiên cứu khác nhau về cấu trúc ADN, mức sai khác từ 4% đến 18% Kết quả phân tích ADN cho thấy các giống lạc ở cùng một vùng địa lý, sinh thái được tập trung thành từng nhóm, giữa các giống chống chịu bệnh gỉ sắt của tập đoàn giống ICRISAT và các giống năng suất trong nước không nằm trong cùng một nhánh Vì thế có thể lựa chọn các cặp bố mẹ mong muốn để phục vụ cho công tác lai giống Với

10 mồi ngẫu nhiên, Nguyễn Thị Tâm (2004) đã cho thấy các dòng lúa chọn lọc tạo ra từ mô sẹo lúa chịu nhiệt giống CR203, CS4, ML107 đã có những thay đổi ở mức độ phân tử [17] Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003) nghiên cứu đa

dạng di truyền của một số giống đậu xanh cho thấy trong 5 mồi ngẫu nhiên chỉ

có 3 mồi RA31, RA45, RA46 cho kết quả đa hình, hệ số tương đồng giữa các giống dao động từ 0,41- 0,80 [18] Tương tự như vậy, để phân biệt các loài phụ đối với lúa và các loại cây trồng như ngô, đu đủ, hành tây, xoài, cỏ đinh lăng nhiều tác giả đã sử dụng kỹ thuật RAPD để thiết lập sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ giữa các đối tượng nghiên cứu

Kỹ thuật RAPD còn là một công cụ rất có hiệu quả trong việc tìm ra các chỉ thị phân tử để phân biệt các giống hay các loài khác nhau Moretzohn

và CS (2004) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của lạc và mối quan hệ với dạng dại của chúng trên cơ sở phân tích các vùng siêu biến của hệ gen [41]

Kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trong những năm gần đây để phân tích di truyền hệ thống sinh học Nó là phương pháp hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền

và lập bản đồ di truyền

Ở đậu tương, Li và cs (2002) đã phân tích 10 giống đậu tương trồng và đậu tương dại ở bốn tỉnh của Trung Quốc đã bổ sung dữ liệu về sự đa dạng chỉ thị phân tử RAPD của các giống đậu tương này [39] Sự đa dạng di truyền

của các cây đậu tương dại (Glycine soja Siebold et Zucc.) ở vùng Viễn Đông

của nước Nga cũng đã được đánh giá ở mức phân tử bởi Seitova và cs (2004) [47] Những nghiên cứu về sự đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể đậu tương ở Hàn Quốc của Gyu-Taek Cho và cs (2008) [30], ở Nhật Bản của Xingliang Zhou và cs (2002) [55], ở Canada của Yong-Bi Fu (2007) [57] đã được công bố Các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật phân tử để đánh giá tính đa dạng di truyền của cây đậu tương của Brown-Guedira và cs (2000) [29], Yiwu Chen và Randall (2005) [56], Yiwu Chen và cs (2006) [56] Ở Việt Nam, Chu Hoàng Mậu và cs (2002) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để phân tích

sự sai khác về hệ gen giữa các dòng đậu tương đột biến với nhau và với giống

gốc, tạo cơ sở cho chọn dòng đột biến có triển vọng [12], Vũ Thanh Trà và cs (2006) đã sử dụng kỹ thuật SSR để đánh giá tính đa dạng di truyền của các giống đậu tương địa phương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt [20]

Giống ĐVN5: Giống đậu tương ĐVN5 được chọn từ tổ hợp lai hữu

tính giữa Cúc Tuyền x Chaing Mai ĐVN5 thuộc nhóm chín trung bình sớm,

có thời gian sinh trưởng 84 ngày ở vụ Đông, 88-92 ngày ở vụ Xuân và vụ Hè Giống ĐVN5 có khả năng sinh trưởng khỏe, chống bệnh khá, chống đổ, chống hạn tốt Giống ĐVN5 có chiều cao trung bình (40,8-77,9cm), số quả trung bình (21- 40,2 quả/cây), khối hạt trung bình (M1000 hạt =140,3-179,7g), hàm lượng protein tương đối cao (37,62%) Giống ĐVN5 cho năng suất cao và ổn định qua cả 3 vụ gieo trồng Xuân, Hè, Đông, năng suất đạt 35-

40 tạ/ha

Giống ĐVN6: Giống ĐVN6 được chọn từ tổ hợp lai hữu tính giữa

AK-03 x DT96 ĐVN6 thuộc nhóm chín trung bình sớm, có thời gian sinh trưởng ở vụ Xuân là 90-92 ngày, vụ hè và vụ đông là 80-84 ngày có thể trồng được cả 3 vụ Xuân, Hè và Đông Giống ĐVN6 sinh trưởng khỏe, cứng cây, chiều cao trung bình từ 40-60cm, chống đổ và chống bệnh tốt, chống hạn kém, khối lượng hạt trung bình (M1000 hạt =170-180g), hàm lượng protein cao đạt 41,5% Năng suất của giống đạt 22-30 tạ/ha

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

2.1.2.1 Hóa chất

Các chất kích thích sinh trưởng: 2,4 Diclorophenoxyacetic acid

(2,4-D), α - Naphtylacetic acid (α-NAA), Giberilic acid (GA3), 6- Benzyl aminopurin (BAP)

Các hóa chất chuyên dụng khác: Ethanol 70% - 100%, khoáng đa

lượng, vi lượng, vitamin, agar, các hoá chất được mua của hãng Invitrogen: dNTP, Buffer, Taq ADN polymeraza, mồi, EDTA, TAE, TE, CTAB

Các hóa chất dùng để phân tích có nguồn gốc từ Anh, Đức, Trung Quốc

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

Hạt đậu tương Tạo mô sẹo từ phôi hạt

Xử lý mất nước mô sẹo Tái sinh cây từ mô sẹo chịu mất nước

Trồng ngoài đồng ruộng

Phân tích hệ các gen của các dòng đậu tương ưu việt của thế hệ R0

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thuộc Khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, phòng thí nghiệm Sinh học phân tử và Công nghệ gen thuộc Viện Khoa học sự sống – Đại học Thái Nguyên Các dòng cây xanh tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước được trồng trong vụ xuân 2010 tại phường Quan Triều, Thành phố Thái Nguyên

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy in vitro và chọn dòng chịu hạn

2.2.2.1 Tạo mô sẹo từ hạt đậu tương

- Khử trùng hạt: Hạt đậu tương được rửa 2 lần bằng nước cất vô trùng

sau đó lắc trong cồn 70% trong 1 phút, rửa sạch bằng nước cất vô trùng rối ngâm trong dung dịch Javen 60% trong 15 phút Sau đó tráng nước cất 3 lần và ngâm trong nước cất vô trùng 2 giờ, thấm khô hạt trên đĩa petri có trải giấy lọc vô trùng

- Tạo mô sẹo: Hạt đậu tương đã khử trùng được tách lấy phôi sau đó

chuyển vào bình tam giác chứa môi trường MS cơ bản, bổ sung 2,4-D (10mg/l, 11mg/l, 12mg/l), saccaroza 3%, agar 0,8%, pH = 5,8 Mỗi bình cấy 18 phôi Nuôi 2 tuần trong tối, 2 tuần dưới ánh sáng đèn trong phòng nuôi cấy với cường

độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy 250

C

± 10 C

Đánh giá tỷ lệ tạo mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy

Số phôi tạo mô sẹo

% tạo mô sẹo = x 100% (2.1)

Tổng số hạt

2.2.2.2 Xử lý mô sẹo bằng thổi khô

Mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy được đặt lên đĩa petri có lót giấy lọc vô trùng và được thổi khô bằng luồng khí vô trùng của box cấy ở các ngưỡng

thổi khô khác nhau, từ 3, 5, 7 giờ Xác định độ mất nước của mô sẹo sau 3,

Wf: khối lượng mô tươi (mg)

Wd: trọng lượng mô sau thổi khô (mg)

2.2.2.3 Chọn lọc mô sẹo sống sót sau xử lý bằng thổi khô và tái sinh cây

Mô sẹo sống sót được chuyển lên môi trường tái sinh cây gồm MS cơ

bản, bổ sung saccaroza 3%, agar 0,8%, BAP(2mg/l, 3mg/l, 4mg/l, pH = 5,8)

Mỗi bình 15 mô, nuôi 3 tuần dưới ánh sáng đèn neon trong phòng nuôi cấy với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy 250

Nt: Tổng số mô xử lý Khả năng tái sinh của cây được đánh giá sau 3 tuần nuôi cấy theo công thức:

Nr

Rc = — x 100% (2.4)

Nsv

Trong đó:

Rc : Tỷ lệ tái sinh cây

Nr : Số mô tái sinh cây

Nsv : Số mô sóng sót được cấy

2.2.2.4 Tạo cây hoàn chỉnh

Các chồi của đậu tương tái sinh có kích thước khoảng 4- 5cm được tách

ra thành từng dòng và cấy chuyển lên môi trường tạo cây hoàn chỉnh gồm: MS

cơ bản, saccaroza 3%, agar 0,8%, bổ sung α-NAA (0,2mg/l, 0,3mg/l, 0,4mg/l),

pH = 5,8 Mật độ cấy 10 chồi trên một bình Điều kiện nuôi cấy như mục 2.2.2.1

2.2.2.5 Ra cây và chế độ chăm sóc

Nuôi cấy trong điều kiện ống nghiệm là cây được phát triển trong điều

vô trùng tối ưu Khi đưa cây ra ngoài ống nghiệm cây phải chịu những tác động bât lợi từ môi trường sống Để tăng khả năng sống của cây thì phải từng bước cho cây làm quen với môi trường sống bên ngoài

Các bước ra cây được tiến hành như sau:

- Khi cây non trong bình nuôi cấy đạt 3 lá, rễ dài từ 3cm - 5cm, dùng panh lấy cây ra khỏi bình cấy, rửa lớp aga bám quanh gốc và rễ bằng nước sạch

- Cây đậu tương được trồng vào khay có chiều sâu khoảng 10cm với giá thể là đất ruộng, phun nhẹ dung dịch MS cơ bản pha loãng 10 lần vào gốc

- Cây đậu tương trồng trong khay được để ở nơi có đủ ánh sáng, tránh mưa và ánh nắng trực tiếp Sau 2 tuần cây con ra rễ mới, đưa ra trồng ngoài đồng ruộng Cây từ ống nghiệm đưa ra trồng ngoài đồng ruộng được trồng từng cây một, gọi là 1 dòng để thu hạt R1

2.2.3 Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu

Phân tích các tính trạng số lượng theo thống kê sinh học Các giá trị thống kê như trị số trung bình mẫu (x), phương sai (2), độ lệch chuẩn (), và sai số trung bình mẫu (S x), với n ≤ 30, α = 0,05 Các số liệu được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình Excel theo Chu Hoàng Mậu (2008) [13]

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử

Tách chiết ADN

Lá của các dòng đậu tương ở thế hệ R0 được đưa từ trong ống nghiệm

ra trồng ngoài đồng ruộng được sử dụng làm nguyên liệu để tách chiết ADN

Phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN tổng số được tiến hành theo

phương pháp của Gawel và CS (1991) [35] Bao gồm các bước như sau: (1)

phá bỏ thành tế bào (xenlulose) bằng tác nhân cơ học với sự hộ trợ của nitơ lỏng; (2) loại bỏ màng nhân và màng tế bào bằng dung dịch đệm CTAB để giải phóng ADN; (3) tủa cặn tế bào và protein bằng hỗn hợp chloroform/isoamyl (24:1); (4) rửa ADN bằng cồn 700

và ly tâm; (5) hòa tan ADN bằng dung dịch TE

Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của ADN

- Bằng quang phổ hấp thụ: Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của

ADN trên máy quang phổ Biomate3 ở bước sóng 260nm/280nm Nồng độ ADN trong dung dịch tách chiết được tính theo công thức:

Nồng độ ADN (ng/µl) = OD260 × 50 × HSPL (2.5)

Độ sạch ADN = OD260 / OD280 (2.6)

HSPL: Hệ số pha loãng

50: Hằng số

OD260: Chỉ số đo được ở bước sóng 260nm

OD280 : Chỉ số đo dược ở bước sóng 280nm

- Điện di trên gel agarose: Dung dịch ADN thu được ở trên đem pha

loãng ở nồng độ 50ng/µl Điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE Sản phẩm điện di ở điện thế 80V trong 30 phút Nhuộm gel bằng ethidium bromide 0,5µg/ml, soi và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím (UV)

Phương pháp RAPD

Phản ứng RAPD được tiến hành theo phương pháp của William và CS (1990) [52] Phản ứng RAPD được thực hiện trong 25µl dung dịch chứa 12,5µl đệm PCR mastermix + 1µl mồi + 1 µl DNA khuôn (50ng/µl) + 9,05

µl H2O Phản ứng RAPD được tiến hành trên máy PCR Amplied Bio Systems (USA/ Singpore)

Sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên được tổng hợp bởi hãng Invitrogen, mỗi mồi dài 10 nucleotide, thông tin về trình tự các mồi sử dụng được trình bày trong bảng 2.1

Phân tích sản phẩm RAPD bằng điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X Sau đó nhuộm gel bằng trong dung dịch ethidium bromide 1%

và chụp dưới ánh sáng đèn cực tím

Xử lý số liệu bằng chương trình NTSYpc

Dựa trên sự xuất hiện hay biến mất của các phân đoạn ADN khi điện di sản phẩm RAPD của các dòng chọn lọc với các mồi ngẫu nhiên để làm cơ sở cho phân tích số liệu

Tiêu chuẩn hóa sản phẩm RAPD theo qui ước:

Số 1: xuất hiện các phân đoạn ADN

Số 0: không xuất hiện phân đoạn ADN

Các số liệu này được xử lý trên máy tính bằng chương trình NTSYpc version 2.0 (Applied Biostatistisc Inc., USA., 1998), để lập ra biểu đồ so sánh

sự khác nhau giữa dòng chọn lọc so với giống gốc ở mức độ phân tử

Bảng 2.1 Trình tự nucleotit của 10 mồi ngẫu nhiên sử dụng trong phân tích

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ CHỌN DÒNG

TẾ BÀO CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO

3.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4 D đến khả năng tạo mô sẹo

Để đánh giá khả năng thích ứng của các giống trong hệ thống nuôi cấy

mô nhằm sử dụng chúng trong việc đánh giá khả năng chịu hạn cũng như mục đích chọn dòng sau này, chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm khảo sát khả năng tạo mô sẹo của các giống nghiên cứu Khả năng tạo mô sẹo được đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy thể hiện ở bảng 2

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4 D đến khả năng tạo mô sẹo

rằng, khả năng tạo mô sẹo không tỷ lệ thuận với nồng độ 2,4 D đối với cả 2 giống ĐVN5 và ĐVN6 Khả năng tạo mô sẹo và số lượng mô sẹo tạo được là những thông số dùng để đánh giá tính thích ứng của giống trong hệ thống nuôi cấy nhằm sử dụng cho mục đích chọn dònư sau này

3.1.2 Khả năng chịu hạn của các giống đậu tương ở mức độ mô sẹo

Để xây dựng quy trình chọn dòng tế bào chịu hạn thông qua thổi khô

mô sẹo, cần xác định ngưỡng thổi khô mô sẹo của các giống đậu tương nghiên cứu Chúng tôi tiến hành xác định khả năng chịu hạn của mô sẹo của các giống đậu tương bằng cách xử lý thổi khô mô sẹo ở các ngưỡng thời gian khác nhau Sau đó, đánh giá thông qua các chỉ tiêu sau: Độ mất nước, tỷ lệ sống sót, và khả năng tái sinh chồi của mô sẹo sau khi xử lý bằng thổi khô

3.1.2.1 Độ mất nước của mô sẹo

Sau khi xử lý mô sẹo bằng kỹ thuật thổi khô ở các ngưỡng thời gian 0, 3,

5, 7 giờ liên tục bằng luồng khí vô trùng của box cấy, theo dõi độ mất nước của mô sẹo của các giống đậu tương nghiên cứu chúng tôi thu được kết quả

ở hình 3.1

Hình 3.1 Tốc độ mất nước của mô sẹo của các giống đậu tương sau xử lý

bằng thổi khô

Độ mất nước của mô sẹo tăng theo thời gian xử lý bằng thổi khô ở tất

cả các giống Tốc độ mất nước cao nhất ở ngưỡng 3, 5 giờ thổi khô: sau 3 giờ thổi khô các giống mất nước từ 43,50% - 62,70%, giống ĐVN6 có độ mất nước cao nhất, ngược lai giống ĐVN5 có độ mất nước thấp hơn là 43,50% Tuy nhiên, ở ngưỡng 5h giống ĐVN6 mất nước tới 79,54%, ngược lại ĐVN5

ở mức 7h chỉ mất tối đa 76,32% Nhìn chung không có sự mất nước đáng kể giữa các giống nghiên cứu Khả năng tạo mô sẹo và chịu mất mất nước của

mô sẹo trong điều kiện cực đoan là thông số phản ánh khả năng chống chịu của giống ở giai đoạn mô sẹo [15] Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đã thu được tương tự kết quả của các tác giả khi nghiên cứu trên thuốc lá [10]

3.1.2.2 Tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau khi xử lý bằng kỹ thuật thổi khô

Chúng tôi đã tiến hành xử lý mô sẹo bằng kỹ thuật thổi khô ở các ngưỡng thời gian 0 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ, sau đó tiến hành chọn lọc mô sẹo chịu mất nước

Khả năng chịu mất nước của mô sẹo được đánh giá thông qua khả năng sống sót của mô sẹo sau khi nuôi phục hồi 3 tuần Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi thấy rằng, những mô bị chết thường có màu đen, nâu hoặc màu trắng, kích thước mô không thay đổi Những mô sống sót thường

có màu xanh sáng, kích thước mô đa số lớn hơn so với trước khi đem xử lý

Tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau khi xử lý bằng kỹ thuật thổi khô là một trong những chỉ tiêu để đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nghiên cứu Kết quả được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Tỷ lệ sống sót của mô sẹo ở các ngưỡng thổi khô khác nhau

Giống Thời gian thổi khô (giờ)

Đối chứng 3 giờ 5 giờ 7 giờ ĐVN5 97,05 ± 0,09 90,09 ± 0,11 61,32 ± 0,22 21,56 ± 0,12

ĐVN6 78,02 ± 0,08 72,01 ± 0,02 23,15 ± 0,09 0

Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, trong cùng một giống tỷ lệ sống sót của

mô sẹo tỷ lệ nghịch với thời gian thổi khô Tỷ lệ mô sẹo sống sót của giống ĐVN5 cao ở hầu hết các ngưỡng thổi khô, cao nhất là ngưỡng thổi khô 3 giờ (90,09%), thấp nhất là ngưỡng 7 giờ (21,56%) Tỷ lệ mô sẹo sống sống sót của giống ĐVN6 ở hầu hết các ngưỡng thổi khô đều thấp, cao nhất là ngưỡng thổi khô 3 giờ (72,01%), ở ngưỡng 7 giờ các mô chết hoàn toàn Tỷ

lệ sống sót có liên quan đến khả năng chịu hạn ở mức độ mô sẹo Những nghiên cứu ở lúa, thuốc lá cho thấy tỷ lệ sống sót của tế bào sau khi bị xử lý bởi các điều kiện cực đoan là một chỉ tiêu để đánh giá sức chịu đựng của tế bào, làm cơ sở cho việc xác định ngưỡng chọn dòng tế bào chống chịu [17], [10] Kết quả nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rằng mô sẹo tạo ra từ giống ĐVN5 có khả năng chịu mất nước tốt hơn mô sẹo tạo ra từ giống ĐVN6 ở tất cả các ngưỡng xử lý bằng thổi khô

3.1.2.3 Tỷ lệ tái sinh chồi của mô sẹo sống sót

Khả năng tái sinh của chồi sau 6 tuần nuôi cấy của các mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng kỹ thuật thổi khô được thể hiện ở hình 3.2

Kết quả cho thấy, hầu hết mô sẹo của các giống sau khi xử lý bằng thổi khô ở các ngưỡng thời gian khác nhau đều giữ được khả năng tái sinh chồi Mô sẹo bị xử lý ở ngưỡng thời gian là 3 giờ có khả năng tái sinh cao hơn so với đối chứng ở cả hai giống (16,14% -11,22% so với 13,35% - 10,29% của đối chứng)

Kết quả hình 3.2 cho thấy, thời gian xử lý càng dài thì tỷ lệ tái sinh chồi càng giảm Giống ĐVN5 có tỷ lệ tái sinh chồi cao hơn so với giống ĐVN6 ở tất cả các nồng độ xử lý (16,14% ở 3 giờ, 10,17% ở 5 giờ, 6,13% ở mức 7

giờ) Giống ĐVN6 có tỷ lệ tái sinh chồi thấp (11,22% ở 3 giờ, 6,56% ở 5 giờ

và mô bị chết hoàn toàn ở 7 giờ xử lý)

Từ kết quả trên thấy rằng, hầu hết mô sẹo của các giống sống sót sau khi xử

lý bằng kỹ thuật thổi khô thường có khả năng tái sinh cao hơn so với những

mô sẹo không qua xử lý thổi khô Theo Lê Trần Bình và cs (1995), nguyên nhân là do khi xử lý cực đoan ở mức độ và thời gian nhất định, những tế bào mẫn cảm đã bị loại bỏ, chỉ còn những tế bào có sức sống cao hơn mới có khả năng sống sót và cho hiệu quả tái sinh cao [2]

Hình 3.2.Tỷ lệ tái sinh cây từ mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô

Từ những khảo sát về khả năng chịu mất nước và khả năng tái sinh của các giống, chúng tôi đã xác định được ngưỡng chọn dòng chịu mất nước của giống ĐVN5 là 7 giờ xử lý thổi khô, ngưỡng chọn dòng chịu mất nước của giống ĐVN6 là mức 5 giờ Tuy nhiên, để khẳng định được chắc chắn đó là ngưỡng xử lý hợp lý, có hiệu quả đối với các giống đậu tương thì cần tiếp tục theo dõi ngoài đồng ruộng, phân tích về di truyền, hóa sinh cũng như kiểm tra về khả năng chống chịu hạn của các thế hệ tái sinh từ các dòng mô chịu mất nước thu được

3.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh cây

Tái sinh cây là một khâu quan trọng trong hệ thống tái sinh in vitro,

môi trường để tái sinh cây cần sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin như IAA, IBA, BAP Trong đó BAP thuộc nhóm kích thích sinh trưởng cytokinin được sử dụng phổ biến trong môi trường tái sinh nhiều loài thực vật, các cây họ đậu nói chung và cây đậu tương nói riêng BAP ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của thực vật,

đặc biệt là sự phân hóa chồi [7] Các mô sẹo sống sót thu được được đưa lên

môi trường tái sinh cây MS cơ bản, bổ sung sucarose 3%, aga 0,8%, BAP(2mg/l, 3mg/l, 4mg/l), pH=5,8 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng

độ BAP tới khả năng tái sinh cây đậu tương từ mô sẹo được thể hiện ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh cây

tỷ lệ tái sinh cây ở ĐVN5 và ĐVN6 là (71,26% và 64,86%), ở nồng độ BAP

là 3mg/l thì tỷ lệ tái sinh là cao nhất ở cả ĐVN5 và ĐVN6 là (80,38% và 74,56%) Khi tăng nồng độ BAP lên 4mg/l thì tỷ lệ tái sinh cây lại giảm chỉ còn (67,30%-56,08%) ở giống ĐVN5 và ĐVN6 Bảng 3.3 cho thấy giống ĐVN5 có tỷ lệ tái sinh cao hơn giống ĐVN6 ở tất cả các nồng độ và cả 2

giống cao nhất ở nồng độ BAP là 3mg/l Kết quả trên cho thấy các giống có khả năng tái sinh là khác nhau

Từ kết quả ở bảng 3.1 và 3.3 có thể rút ra nhận xét khả năng tạo mô sẹo tỷ lệ với khả năng tái sinh Những nghiên cứu của Nguyễn Thị Thư và CS (2007) cho rằng, khả năng tái sinh cây cũng bị ảnh hưởng của nồng độ 2,4 D trong giai đoạn tạo mô sẹo [21], cụ thể ở bảng 3.3 thấy tỷ lệ tái sinh cây là 80,38% đối với giống ĐVN5 và 74,56% đối với giống ĐVN6 với nồng độ 2,4

D là 11mg/l trong môi trường hình thành mô sẹo, trong khi đó tỷ lệ tái sinh cây là 62,39% đối với giống ĐVN5 và 56,08% đối với giống ĐVN6 khi nồng

độ 2,4 D là 12mg/l

Nguyễn Thị Luyện và CS (2009) khi nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh cây ở các giống đậu xanh cũng chỉ ra rằng, các giống đậu xanh nghiên cứu có tỷ lệ tái sinh cây cao nhất và số lượng chồi nhiều nhất khi cây được tái sinh trong môi trường có bổ sung 3mg/l BAP [11]

3.1.4 Ảnh hưởng của nồng độ α-NAA tới khả năng hình thành và phát triển hệ rễ

α-NAA là chất kích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin, có tác động mạnh đến quá trình hình thành và phát triển hệ rễ ở thực vật [16] Các cây tái sinh khi có kích thước 4-5 cm được chuyển lên môi trường tạo cây hoàn chỉnh gồm: MS cơ bản, sucrose 3%, aga 0,8%, bổ sung α-NAA (0,2mg/l, 0,3mg/l, 0,4mg/l), pH=5,8 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ α-NAA đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh được thể hiện qua bảng 3.4

Bảng 3.4 cho thấy tỷ lệ ra rễ của cả giống ĐVN5 và ĐVN6 là tương đối cao ở tất cả các nồng độ NAA nghiên cứu, nhưng tỷ lệ tạo rễ cao nhất ở nồng độ NAA là 0,3mg/l ở cả giống ĐVN5 và ĐVN6 (97,20% và 94,70%) Khi tăng nồng độ NAA lên 0,4mg/l thì tỷ lệ tạo rễ ở cả giống ĐVN5 và ĐVN6 đều giảm (77,00% và 65,00%) Những nghiên cứu của chúng tôi hoàn

phù hợp với kết quả của Nguyễn Thị Luyện (2009), khi nghiên cứu hệ thống tái sinh qua mô sẹo trên cây đậu xanh [16]